Centro Universitrio Fundao Santo Andr

Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras

CURSO: CINCIAS BIOLGICAS

MICROBIOLOGIA
Atividades Prticas
4 ANO

NOME:

N:

Profa. Dra. Mrcia Zorello Laporta

2007

Sumrio
Parte A

Normas de segurana no laboratrio de Microbiologia ...................................................................... 2

Atividade 1 Tcnica da Colorao de Gram ................................................................................... 3
Atividade 2 Colorao de Cpsula ................................................................................................ 6
Atividade 3 Colorao de Esporos ................................................................................................ 8
Atividade 4 Colorao de BAAR (Mtodo de Zielh-Neelsen) ............................................................ 10
Atividade 5 Colorao de Espiroqueta........................................................................................... 12
Atividade 6 Estudo de microrganismos ......................................................................................... 15

NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

As aulas prticas no laboratrio de microbiologia tm como objetivos possibilitar ao aluno
a aprendizagem das tcnicas comumente utilizadas, o desenvolvimento da capacidade de
formular hipteses e interpretar resultados e possibilitar o conhecimento e a utilizao de normas
de segurana exigidas neste tipo de laboratrio.
Nessas aulas, so utilizadas uma grande variedade de bactrias, algumas potencialmente
patognicas para o homem, principalmente quando em meios de cultura. Portanto, essencial
seguir as normas de segurana estabelecidas para um laboratrio de microbiologia, a fim de se
evitar contaminao dos estudantes, professores e funcionrios.
1. Use sempre avental dentro do laboratrio. No o utilize fora do laboratrio.
2. Mantenha cabelos longos sempre presos.
3. Desinfete a bancada de trabalho no incio e trmino de cada aula prtica.
Para essa finalidade, utiliza-se lcool 70%. Com este procedimento, os microrganismos
que poderiam contaminar a rea de trabalho so removidos.
4. Lava as mos ao entrar e sair do laboratrio e sempre que suspeitar de contaminao.
5. No coma, beba, fume, aplique cosmticos, mexa em lentes de contato ou coloque
objetos (lpis, dedo etc) na boca, procedimentos eficientes de autocontaminao.
6. Tenha cuidado ao utilizar o bico de gs. Ao acender, verifique se no existem
substncias inflamveis por perto. Ao trmino da aula, desligue corretamente o gs.
7. Flambe alas, agulhas e pinas antes e aps o uso. A correta flambagem dos materiais
evita a formao de aerossis, um dos meios mais eficientes de contaminao.
8. No utilize pipeta sem a devida proteo de algodo. Isso evita que voc seja
contaminado se estiver pipetando uma cultura bacteriana em meio lquido.
9. No coloque materiais contaminados (pipetas, lminas etc.) sobre a bancada.
Estes materiais devem ser colocados em recipientes apropriados que sero dispostos em
cada bancada.
10. Siga as normas de uso dos aparelhos. O microscpio um instrumento de trabalho
valioso e deve ser manipulado cuidadosamente.
11. Avise ao professor, imediatamente, caso ocorra qualquer tipo de contaminao ou
outro tipo de acidente.
12. Lembre-se que voc responsvel pelo material que receber.

ATIVIDADE 1
TCNICA DA COLORAO DE GRAM
INTRODUO
A colorao de Gram uma das principais tcnicas utilizadas para a visualizao microscpica da
forma e dos arranjos dos diferentes tipos de bactrias. Considerado um mtodo diferencial,
permite classificar as bactrias em Gram positivas ou Gram negativas, de acordo com as
propriedades tintoriais da clula bacteriana.
OBJETIVOS
Aprender a realizar a colorao de Gram e compreender porque determinadas bactrias se
comportam como Gram positivas ou Gram negativas.
MATERIAL
material retirado da boca
iogurte
fermento
Fleischmann
(fermento
biolgico) ou fungo Saccharomyces

cerevisiae

culturas bacterianas em caldo e em gar

nutriente
lminas de vidro

ala de inoculao
cotonetes
reagentes para a colorao de Gram
(violeta de genciana, lugol, lcool 95,
fucsina ou safranina)
recipiente para a colorao de Gram

PROCEDIMENTO
1 Preparo dos esfregaos
Para material em meio lquido (iogurte, fermento em gua, cultura bacteriana em
caldo).
Com auxlio da ala de inoculao previamente esterilizada, colocar 2 - 3 alquotas da amostra
em uma lmina de vidro.
Espalhar bem sobre a superfcie da lmina, fazendo movimentos circulares. Deixar secar ao ar.
Flambar a ala na chama do bico de gs antes de recoloc-la em seu lugar.
Para material em meio slido (culturas bacterianas em placa)
Com auxlio da ala de inoculao, previamente esterilizada, colocar uma gota de soluo
salina na superfcie de uma lmina de vidro.
Flambar a ala, deixar esfriar e coletar uma alquota da cultura bacteriana.
Misturar na gota de soluo salina, fazendo uma suspenso homognea. Deixar secar ao ar.
Flambar a ala na chama do bico de gs antes de recoloc-la em seu lugar.
Para material retirado da boca
Friccionar a superfcie da mucosa oral com um cotonete estril. Fazer um esfregao com o
material coletado, na superfcie de uma lmina de vidro, com movimentos circulares. Deixar
secar ao ar.
2 Fixao dos Esfregaos
Aps a secagem, fixar os esfregaos, passando as lminas cerca de 3 vezes sobre a chama do
bico de gs.
Deixar esfriar e corar.
3 Colorao de Gram

 Colocar a lmina no recipiente para a colorao de Gram.

Cobrir o esfregao com soluo de violeta de genciana. Aguardar 1 minuto e desprezar o
corante no recipiente.
Cobrir com lugol, aguardar 1 minuto, e desprezar o corante no recipiente.
Inclinar a lmina, gotejar lcool etlico a 95% at que no haja desprendimento de corante.
Lavar a lmina rapidamente em gua corrente.
Cobrir com fucsina ou safranina. Aguardar 30 segundos e lavar a lmina. Secar com papel
toalha sem esfregar a lmina.
Observar ao microscpio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de leo mineral na
lmina e focalizar com objetiva de imerso.
Desenhar as bactrias observadas considerando o tipo de colorao (Gram + ou -), a forma e
o arranjo das clulas.
Aps o uso, a objetiva de imerso deve ser limpa com papel absorvente.
RESULTADOS
Desenhe o que voc observou

iogurte

cultura bacteriana em placa

fermento

cultura bacteriana em caldo

material retirado da boca

Complete o quadro a seguir.

Material
iogurte

Morfologia

Arranjo

Gram

fermento
cultura em caldo
cultura em placa
material da boca

DISCUSSO
1. Complete o quadro a seguir, descrevendo o que ocorre na colorao de Gram.
Bact ria
Soluo
cristal violeta

Gram +

Gram -

lugol
lcool
fucsina

2. Como voc explica o comportamento das bactrias G + e G - na colorao de Gram?

3. As bactrias do gnero Mycobacterium no se coram pelo mtodo de Gram. Qual seria uma
explicao para esse fato?

4. Sabe-se que se ocorrer um aquecimento exagerado no momento da fixao do material, as

bactrias G+ passam a se comportar como G-. Qual seria uma explicao para esse fato?

5. Em geral, os corantes bsicos como violeta de genciana, safranina e fucsina, no penetram em

clulas vivas. Qual a relao entre esta informao e as etapas que voc seguiu para realizar a
colorao de Gram?

6. Sabe-se que quando em culturas velhas, bactrias G+ podem se comportar como G . Voc
acha que bactrias G na mesma situao poderiam se comportar como G+? Justifique.

ATIVIDADE 2
COLORAO DE CPSULA
INTRODUO
Certas bactrias Gram + e Gram - produzem cpsula, camada viscosa, externa parede
celular. Essa estrutura no constitui carter morfolgico permanente, aparecendo somente sob
certas condies de cultura. A cpsula constitui um dos antgenos de superfcie das bactrias e
geralmente formada por polissacardeos e mais raramente por protenas. A cpsula pode ser
visualizada por colorao negativa onde estruturas que no so coradas, so visualizadas contra
um fundo escuro.
OBJETIVOS
Aprender a realizar a colorao para cpsula e compreender o princpio dessa tcnica.
MATERIAL

culturas recentes de bactrias

vermelho congo 25 mg/mL
cido hidroclordrico 0,15 mol/L-1
fucsina de Ziehl-Neelsen
lminas de vidro
ala de inoculao

PROCEDIMENTO (Mtodo de White modificado)

Colocar 1 a 2 gotas de vermelho congo na extremidade de uma lmina de vidro.
Coletar uma alada da cultura bacteriana e misturar no vermelho congo.
Com auxlio de outra lmina de vidro, espalhar a mistura por toda a lmina, formando uma
pelcula fina.
Aquecer chama fracamente para secar.
Cobrir o material com cido hidroclordrico.
Retirar o excesso do cido, e aquecer rapidamente, passando a lmina sobre a chama.
Cobrir o material com fucsina de Ziehl-Neelsen por 10 a 15 segundos.
Retirar o excesso de corante e secar delicadamente com papel toalha.
Observar ao microscpio.
RESULTADO
Desenhe o observado e coloque legendas.

Cultura A

Cultura B

DISCUSSO
1. Por que a tcnica denominada colorao negativa?

2. Qual a forma das bactrias em A? E em B?

3. Se eu fizer colorao para cpsula o que posso dizer sobre o Gram da bactria?

ATIVIDADE 3
COLORAO DE ESPOROS (COLORAO DE SCHAEFFER-FULTON)
INTRODUO
O esporo ou endsporo bacteriano uma clula de parede espessa formada no interior de
algumas bactrias. muito resistente ao calor, dessecao e outros agentes qumicos e fsicos,
sendo capaz de permanecer em estado latente por longos perodos e, em seguida, germinar,
dando origem a uma nova clula vegetativa. O esporo formado por vrios envoltrios. O
primeiro, mais externo, fino, formado por protenas, denominado exosprio. Abaixo do
exosprio fica a capa do esporo, formada por vrias camadas de protenas ricas em ligaes de
dissulfetos, resposveis pela resistncia do esporo a agentes qumicos e fsicos. Mais
internamente fica o crtex do esporo, formado por camadas de peptidioglicano. Abaixo do crtex
localiza-se o protoplasto ou ncleo do esporo formado pela parede celular, citoplasma, material
gentico etc, provenientes da clula vegetativa.
Os esporos so difceis de serem corados pois os corantes geralmente no atravessam a
parede do esporo a no ser que seja utilizado o calor, como na colorao de Schaeffer-Fulton.
OBJETIVOS
Aprender a realizar a colorao de esporos e compreender o princpio dessa tcnica.
MATERIAL

cultura bacteriana em meio slido

cultura de solo em meio lquido e slido
verde malaquita
safranina
lminas de vidro
ala de inoculao

PROCEDIMENTO (mtodo de Wirtz-Conklin)

Preparar esfregaos em lmina das culturas bacterianas.
Secar ao ar e fixar pelo calor.
Corar a quente, com soluo aquosa de verde malaquita, aquecendo at a emisso de
vapores, durante 6 minutos.
Lavar suavemente em gua corrente.
Corar com safranina, por 30 segundos.
Lavar suavemente em gua corrente.
Secar ao ar e observar ao microscpio.
RESULTADO
Desenhe o observado com legendas.

Cultura bacteriana em meio slido

Cultura de solo

DISCUSSO
1. Em qual cor visto o esporo? E a clula vegetativa? Explique como isso ocorre.

2. Por que essa colorao feita a quente?

3. A clula vegetativa retm o verde malaquita aps a 1 lavagem com gua? E o esporo?

4. Qual a funo da safranina?

5. Qual a razo de utilizarmos cultura de solo?

6. Qual a diferena bsica entre uma clula vegetativa e um endsporo?

ATIVIDADE 4
COLORAO DE BACTRIAS LCOOL CIDO RESISTENTES (MTODO DE ZIEHLNEELSEN)
INTRODUO
Esta colorao permite a visualizao de um grupo restrito de bactrias que possuem uma
parede celular constituda de lipdeos complexos (cidos graxos cidos miclicos - e ceras) em
grande concentrao, provavelmente responsveis pela propriedade de resistncia ao lcool
cido. Quando os lipdeos so removidos pelo ter, perde-se esta propriedade. Assim, durante a
colorao, a fucsina se fixa firmemente a esses lipdeos, no sendo removida durante a lavagem
com lcool cido.
OBJETIVOS
Aprender a realizar a colorao de esporos e compreender o princpio dessa tcnica
MATERIAL

BCG (bacilo de Calmette e Guerin) Mycobacterium bovis

material retirado da boca
fucsina de Ziehl-Neelsen
lcool-cido clordrico
azul de metileno
lminas de vidro
ala de inoculao
cotonete estril

PROCEDIMENTO

Preparar esfregaos dos materiais em lmina de vidro, secar ao ar e fixar pelo calor.
Cobrir o esfregao com fucsina de Ziehl-Neelsen e aquecer em chama at a emisso de
vapores. O aquecimento no deve ser muito drstico, a ponto de ferver o corante, mas
apenas at ligeira emisso de vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos.
Lavar a lmina em gua, suavemente.
Cobrir com lcool-cido clordrico, por um minuto.
Lavar a lmina com gua.
Cobrir o esfregao com azul-de-metileno, durante um minuto.
Lavar a lmina com gua, secar e observar ao microscpio com a objetiva de imerso.

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RESULTADO
Desenhe o observado e coloque legendas.

BCG

Material retirado da boca

DISCUSSO
1. Complete os espaos no quadro a seguir.

Solues em ordem de
aplicao
1 Fucsina de Ziehl
2 lcool - cido clordrico

Reao e aspectos da bactria

BAAR
BNAAR
Bactrias coradas em _______

Bactrias coradas em _______

A fucsina ______________
nos componentes da parede
celular e o lcoolcido____________________

A fucsina ______________
nos componentes da parede
celular e o lcoolcido____________________
A clula fica_______________

A clula fica_______________
3 Azul de metileno

A clula visualizada
em__________porque______

A clula visualizada
em_________porque______

2. As coloraes podem ser classificadas em:

a) Simples, qundo ocorre a aplicao de um nico corante que cora a clula inteira;
b) Diferencial, quando utiliza uma combinao de corantes, o que permite observar
diferenas qumicas entre as bactrias;
c) Estrutural, quando cora apenas uma parte da clula, o que possibilita diferenci-la das
demais.
Como voc classificaria a colorao de Ziehl-Neelsen de acordo com as informaes acima?
Justifique.

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ATIVIDADE 5
OBSERVAO DE ESPIROQUETAS
INTRODUO
As espiroquetas so bactrias espiraladas, delgadas e flexveis. Amplamente distribudas
na natureza, muitas so encontradas na cavidade oral humana e algumas podem causar doenas
como a sfilis, a leptospirose e a doena de Lyme. Esses microrganismos podem ser observados
ao microscpio em preparaes a fresco ou pela tcnica de Fontana-Tribondeaux, em que sais de
prata impregnam a superfcie da bactria tornando-a mais espessa. Espirilos e espiroquetas tem
pouca afinidade pelos corantes comumente empregados e coram-se fracamente. Quando
tratados com sais de prata, as espiroquetas podem ser visualizadas em marrom-escuro ou negro
contra um fundo castanho-amarelado.
MATERIAL

material retirado da boca

material retirado do aqurio
cultura em gar semi-slido (Proteus sp.)
soluo fixadora
lcool absoluto
mordente (soluo de tanino)
soluo de nitrato de prata amoniacal
gua destilada
lminas de vidro
cotonete estril
ala de inoculao

PROCEDIMENTO
1. Colorao pela tcnica de Fontana-Tribondeaux

Fazer um esfregao com material retirado da mucosa bucal em uma lmina e secar ao ar
(no fixar pelo calor ).
Com auxlio da ala de inoculao, preparar um esfregao da cultura bacteriana em meio
semi-slido.
Cobrir o material com soluo fixadora, durante 30 seguntos. Desprezar, cobrir novamente
com a soluo fixadora, durante 30 segundos.
Cobrir o material com lcool absoluto, desprezar o excesso e deixar evaporar.
Cobrir o material com soluo de tanino (mordente) e aquecer a lmina at a emisso de
vapores, durante 30 segundos.
Lavar em gua destilada.
Cobrir o material com soluo de nitrato de prata amoniacal, durante 10 a 15 segundos. A
seguir, aquecer ligeiramente a lmina, at o desprendimento de vapores, por 30 segundos (a
preparao deve adquire a cor marrom).
Lavar em gua destilada.
Secar delicadamente com papel-filtro.
Observar com objetiva de imerso.

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2. Preparao a fresco

Colocar 1 a 2 gotas de gua de aqurio em uma lmina e cubrir com lamnula.

Observar com objetiva de imerso.

RESULTADO

Desenhar o observado com legendas.

Material da boca

Material retirado de aqurio

Cultura bacteriana em
meio semi-slido

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DISCUSSO
1. Qual o princpio da colorao para espiroquetas?

2. Qual o objetivo da preparao fresco de espirilos?

3. Aps ter realizado as atividades de colorao das bactrias, monte uma tabela com os
seguintes dados:
- nome da colorao;
- microorganismo utilizado;
- corantes utilizados;
- tipo de colorao (considere as informaes da atividade 4).

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ATIVIDADE 6
ESTUDO DOS MICRORGANISMOS
INTRODUO
Microrganismos podem ser encontrados no solo, gua, no interior e nas superfcies dos seres
vivos. Nesta atividade, voc dever elaborar um procedimento que permita pesquisar
microrganismos presentes em diversos hbitats microbianos.
OBJETIVO
Possibilitar ao aluno a oprtunidade de elaborar um procedimento que permita estudar
microrganismos presentes em diversos materiais.
MATERIAL
4 placas com gar nutriente
1 frasco com 100mL de soluo salina
30g de terra de jardim
1 cotonete estril

PROCEDIMENTO
(Considere o material disponvel e o que foi abordado nas aulas anteriores para detalhar o
procedimento a ser seguido nessa aula)

RESULTADOS
Anote os resultados obtidos e explique-os.

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