-; __ 0_

:- A R T I G O O R I G I N A ~
A C T A M D I C A PO R T U G U E SA 2003; 16: 65- 69
,
E S F E R O C I T O S E H E R E D I T A R I A -
~ ,
P R E V A L E N C I A D O S D E F I C E S P R O T E I C O S
,
D A M E M B R A N A D O E R I T R O C I T O
E U SA G R A N J O ,PE D R O M A N A T A , N O M I A T O R R E S,LU R D E S R O D R I G U E S, FT I M A FE R R E I R .\,
R O S\VI T HA BA U E R LE .. A LE XA N D R E QU I N T A N I LHA
Servio deHematologia C lnica. Hospital de S. J oo. Porto. I nstituto de C incias Biomdicas A bel Salazar, Porto.
Servio de Hematologia. C entro Hospitalar de C oirobra. C oimbra, Servio de Hernatologia, Hospital de M atosinhos, M atosinhos.
Servio de M edicina I nterna. Hospital deViana do C astelo. Viana do C astelo
A E sferocitose Heredittia (E H) uma anemia
hemoltica congnita que resulta de alteraes
quantitativas e/ou qualitativas das protenas da
membrana do eritrcito. A fimde identificar as
alteraes proteicas eprocurar relacion- I as com o
fentipo clnico estudaram- se 25 famlias com
E sferocitose Hereditria (E H), da regio N orte de
Portugal, pela tcnica de eJ ectroforese emgel de
poJ iacriJ amida (SD S- PA G E ). N as 25 famlias
estudadas detectaram- se 18 com uma reduo
primria deanquirina, sendo que 16 apresentavam
ummodo detransmisso dominante, uma era
recessiva enuma no foi possvel demonstrar o
modo detransmisso. E mcinco famlias foi
encontrada uma reduo primria de banda 3, todas
comumpadro dominante. E ncontrou- se ainda
uma famlia comreduo deprotena 4.2
(esferocitose leve) com transmisso recessiva e
uma outra com reduo primria de espectrinas
(esferocitose leve) emque no foi possvel
demonstrar o modo transmisso. D e 15 doentes
com dfice de anquirina, estudados numa situao
depr- esplenectomia, dez tinham uma esferocitose
leve (um dos quais comhemlise compensada) e
cinco tinham umfentipo de esferocitose
moderada. N as famlias com dfice debanda 3, dez
indivduos foram tambm estudados numa situao
pr- esplenectomia, sendo que sete apresentavam
uma esferocitose leve (dois dos quais tinham uma
hemlise compensada) e trs uma esferocitose
Recebido pura publicao: 117 de Janeiro de 2(}02
H E R E D I T A R Y S P H E R O C YT O S I S
- P R E V A L E N C E O F E R YT H R O I D
C YT O S KE L E T A L P R O T E I N D E F E C T S
T he authors studied the relative prevalence of
erythroid cytoskeletal protein defects and their
relationship with the clinical course ofHereditary
Spherocytosis (HS) in 39 Portuguese patients of
N orth ofPortugal (25 families), T his study showed
that, intheN orth ofPortugal, HS is primarily due to
anquirin deficiency (72%), followed by band 3
(20%). T hese findings are similar to thepublished
data inother C aucasian populations. A nquirin
primary defects have been difficult to diagnose
before splenectomy, due to high reticulocytes
counts.
Key Words: Hereditary Spherocytosis, haemolytic mil/em;". red-cell
membrane protein, SDS-PA GE. protein defciency.
65
E LI SA G R A .."J "J Oet al
moderada. N as 25 famlias estudadas verificou- se
uma predominncia do dfice deanquirina (72%)
seguido pelo dfice debanda 3 (20%), protena 4.2
(4%) e de espectrinas (4%). E stes resultados esto
assim de acordo \om estudos previamente
realizados. ct~~~
Palavras-chave: Esferocitose Hereditria. anemia hemolitica; proteinas da
membrana dI) ernrcuo, SDS-PAGE. dijice pnneico.
INTRODUO
A E sferocitose Hereditria (E H) aanemia hemoltica
congnita mais comum dos C aucasianos. R esulta de
alteraes quantitativas e/ou qualitativas das protenas da
membrana do eritrcito. C aracteriza- se por uma anemia de
gravidade varivel, comictercia intermitente, presena de
esfercitos no esfregao de sangue perifrico, fragilidade
osmtica aumentada, esplenomegalia ecom uma resposta
"favorvel esplenectomia- SPL 1.
A s protelnas do esqueleto proteco interagem com a
bicamada lipdica e com as protenas transmembranares
fornecendo assim membrana do eritrcito rigidez e
integridade (Figura 1). A lteraes de determinadas
protenas da membrana como a anquirina, espectrinas,
banda 3 e protena 4.2 esto na origem da diminuio da
resistncia osmtica dos esfercitos. A microvesiculao
destas clulas resulta na perda de rea de superfcie sem
qualquer reduo substancial de volume celular. O s
esfercitos perdem resistncia, elasticidade e capacidade
de deformao, reduzindo a sua capacidade de atravessar
os orifcios entre as clulas endoteliais, assim como as
clulas que formam a parede dos cordes esplnicos e da
polpa vermelha dos seios esplnicos, verificando- se uma
congesto acentuada desta ltima. A descida do pH,
glicose e A T P, bem como a elevada concentrao de
radicais livres produzidas pelos macrfagos adjacentes
agravam a leso damembrana dos eritrcitos.
A s alteraes moleculares subjacentes doena so
muito heterogneas.
A anquirina a protena que promove a ligao do
esqueleto proreico bicamada I ipidica atravs de
interaces com a protena transmembranar banda 3. O
defeito mais comum nos indivduos com E H deve- se a
alteraes nesta protena. N os dfices deanquirina podem
existir redues secundrias de espectrinas eprotena 4.2,
sendo opadro dehereditariedade autossmico dominante
omais frequeore-
A banda 3 medeia interaces dentro do esqueleto
membranar via ligao com as protenas 4.2 e4.1 ecoma
anquirina pelo terminal amino do domnio citoplasmrico.
I ndivduos com dfice de banda 3 tm redues prot.eicas
naordemde20 a40%, comdfices secundrios deprotena
4.2. O padro detransmisso dominante eoquadro clnico
de uma anemia ligeira ou moderada. N os portadores de
deficincia de banda 3, observam- se no esfregao de
sangue perifrico, alguns eritrcitos com a forma de
"cogumelo". E stes eritrcitos so muito especficos neste
subgrupo da esferocitose hereditria e desaparecem ps-
esplenectomia.
D eficincias deprotena 4.2 eespectrinas somais raras,
sendo o padro de hereditariedade autossmico recessivo
e dominante, respectivamente".
D o ponto de vista fenotpico, a expresso da E H
tambm muito heterognea, podendo variar de formas
assintornticas at situaes clnicas de anemia grave, Fig. } - Prutcinas da membrana do eritrcto:
6
E SFE R O C I T O SE HE R E D T T R T A - PR E VA LN O A D O S D FT C E S PR O T E T C O S D A M E M BR A N A D O E R T T R C T T O
M A T E R I A L E M T O D O S
Foram estudados 39 doentes (deidade compreendida 6
meses - 77 anos; 24 pacientes do sexo masculino e 15 do
sexo feminino) comE .H., pertencentes a25 faml iasdoN orte
dePortugal.
N a rotina bematolgica, os hemogramas foram
realizados numcontador automtico para determinao dos
diversos parmetros hematolgicos e os esfregaos de
sangue perifrico, corados pelo mtodo deM ay- G runwald
G iemsa,
O estudo daresistncia osmtica foi realizado por dois
mtodos: teste da fragilidade osrntica dos eritrcitos em
gradiente de solues salinas (FO ) e o teste de lise pelo
glicerol acidificado (A G LT ).
A sprotenas damembrana do entrcito foram extradas
por I ise hipotnica segundo o mtodo de D odge et a1.
6
,
posteriormente quantificadas pelo mtodo deLowry etal.
7
.
D epois de solubilizadas as protenas da membrana foram
estudadas pela tcnica de electroforese em gel de
poliacrlamida (SD S- PA G E ), em gradiente linear 5- ]5%,
Laemmli'', eemgradiente exponenciaI 3.5- 17%, Fairbanks
et a1.
9
. O pedi I e1ectrofortico das membranas corado
com C oomassie Blue, procedendo- se de seguida anlise
proteica por densitornetria (I mage M asrer E lite lD , version
2.01 da Pharmacia Biotech), A anlise quantitativa das
protenas da membrana expressa pela razo de cada
protena relativamente banda 3.
R E SU LT A D O S
O diagnstico de E H realizado combase nos dados
clnicos e nos parmetros laboratoriais: parmetros
hematolgicos, percentagem dereticulcitos, esfregao de
sangue perifrico, fragilidade osmtica, doseamento de
bilirrubinas (Quadro I ) .
Quadro 1 - Classificao da Esferocitose Hereditria
cr(Q)~t
1
f:3 dependentes detransfuses. N a forma tpica, os doentes
apresentam uma anemia moderada desde o perodo neo-
natal, esplenomegalia ereferemuma histriafamiliar deE H.
A anemia muito bem tolerada, sendo contudo perceptvel
~ nos propsitos aictercia conjuntival ea esplenomegalia.
.!6 N aE H deexpresso ligeira, ograudeanemia leve, podendo
- 'j ahemlise ser totalmente compensada. D o ponto de vista
~ laboratorial, dereferir queabilirrubina sricaepercentagem
de reticulcitos normal ou ligeiramente aumentada.
G eralmente, os portadores deste tipo de E H detectam- se
durante os perodos de infeco por mononucleose
infecciosa, g~ralmente com aumento marcado da
esplenomegalia eemsituaes deinfeco por parvovrus
19, que leva auma supresso da eritropoiese medular- '.
O s portadores assintomticos so diagnosticados no
decorrer deestudos famil iaresdedoentes comaforma tpica
~ de esferocitose, D o ponto de vista laboratorial, a
~ concentrao de hemoglobina, bilirrubina total, e
~ percentagem de reticulcitos, normal. A penas a
..l:::.- fragilidade osmtica eritrocitria estaumentada, por vezes
O itpenas aps incubao a 37C .
O s pacientes comaforma grave deE H so dependentes
de transfuses e a esplenectomia s corrige a anemia
arcialmente. E st associada a dfces muito acentuados
deespectrinas, compadro dehereditariedade recessiva, e
nas deficincias combinadas de anquirina e espectrinas.
~~.J N o presente estudo osautores analisaram aprevalncia
<.. J \'""'~""' ..- do dftce proteico em 39 indivduos, estabelecendo uma
correlao comofentipo clnico edeterminao dopadro
de hereditariedade.
1t~1'lI bi ..
J 'oml;,J 11- J 5 O S- l;;! 06 ' "
<h
(WdL)
fttiull6titl)S f"J 13
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~
Perifericu reduzido poiquilocitose
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gllir' .Ilnouc D i.'.tnU ama1fC D i...nntarn01lC D istintamente M an:adammtr;
incubaio
aum;,2uada aumentada eumcuada DUlnOOUufa aum01l nda
. J r c
Fonte: Adaptado de Patrick. G. Gallugher, Bernord G. Forget ,L'!.
Porm muitas vezes o diagnstico tem- se revelado
bastante difcil, mesmo com a ajuda dos parmetros
laboratoriais, sendo necessrio recorrer tcnica de
electroforese emgel de poliacrilamida (SD S- PA G E ) para
determinar asalteraes moleculares subjacentes doena.
N as 25 famlias estudadas 18 possuam uma reduo
primria de anquirina, sendo que 16 tinham umpadro de
transmisso autossmico dominante, uma um padro
autossmico recessivo e ainda uma outra em que no foi
possvel identificar otipo detransmisso. E m5 famlias foi
encontrada uma reduo primria de banda 3, todas com
umpadro dominante. E ncontrou- se aindauma famlia com
reduo deprotena 4.2, comtransmisso recessiva, euma
famlia comreduo primria deespectrinas emquenofoi
possvel demonstrar o modo transmisso (Quadro I l).
O fentipo clnico daE H muito heterogneo, podendo
variar de formas assintomticas at situaes clnicas de
67
E LI SA G R A N J O etal
Quadro JJ - Padro de hereditariedade na Esferocitose
Hereditria
D i"''"
_ 3 I
1~ I~o
"","riaa
...- .
M orI odc
D omm.nr, D orninant~ R ccessvc :"lo llT VO O i) l'oJ lfovadu R scessivc
rraasrnissh
..-
S 16 I I I 1
'nd!vidus. J O 25 I J I J
anemia grave. A s alteraes moleculares subjacentes
doena so tambm muito hcterogncas. A correlao das
alteraes proteicas, que ocorrem na membrana do
eritrcito, com o fentipo clnico empacientes estudados
pr- esplenecromia referenciado no Quadro I H. N os
Quadro JIl - Correlao do dfice da protelna da mem-
brana do eritrocito e o fentipo clnico.
E sfeT O dt ese leve
(I 1C :mli..,.o
.........- )
E of.nocltos.. "'ve
/be.wa;.. E af.rociw semoderada
- J 'l"'Y'b)
D fice
protriao
......,
ftl'ou:ftla4.1
Fig. 2 -lJfu:e de , , , , 1 1 II4 3. Ge1linear - U!mmJi (A), Gel-L7CJU'lIEncil-
Fairbank.< (8). Ctr - 01/111'11("; J - PrtlluisiUl (tlifice de 22% de balla 3); 1,3 -
fha.< do p'''p,i,<it'' (dfice de 22 li19% respectivamente); ,,- esposa d"
propt.'~ito (.~em alteraes das proteino da membrana).
C tr PI O ;: c c
I
PtN 4 ~ i
" " i,
'I
I
I
Fig. 3 - Difice deI""teina
4.2 (12%). Gel lmear
U!BI., tA). Prop
PrIJpsitil; Ctr - Controlo.
Quadro TV- Prevalncia do dfice da protena da mem-
brana do critrcito nos doentes estudados ps-
esplenectomia.
T empo ps- esplenectomia
D tice proteico
>1 anoe< 10 anos >10 anos
A nquirina 6 5
~ E spectrina
pacientes com dfice de banda 3, verificou- se que
apresentavam redues primrias de 11 a25% (Figura 2).
A penas foi analisado um nico paciente com dfice de
protena 4.2 comuma reduo primria de12%(Fig.3). U m
paciente com dfice de anquirina foi estudado numa
situao de pr- esplenectomia eps- esplenectomia (com
uma reduo primria de anquirina- 28% e com redues
secundrias de espectrinas- 24% eprotena 4.2- 5%).
D oze doentes foram analisados na situao ps-
esplenectomia (Quadro I V). N os que apresentavam dfice
deanquirina, areduo destaprotena variou de 16 a50 %,
com redues secundria de espectrina de 11- 19% e
protena 4.2 de4- 3 1%(Fig.4).
N o nico paciente analisado ps esplenectornia com
dfice de ~espectrina o dfice encontrado foi de 11%.
D I SC U SSO
D e forma a aprofundar mais o conhecimento sobre as
doenas demembrana do eritrcito easua prevalncia na
regio N orte de Portugal, estudaram- se 39 indivduos
pertencentes a25 famlias, comE H. Foi utilizada atcnica
deelectroforese emgel depoliaerilamida para identificar as
alteraes quantitativas e/ou qualitativas das protenas da
membrana do eritrcito. A amostragem estudada
Fig. 4 - Dfice de anourna. GeJ linear - Laemmli (A), GeJ exponencial -
Fairbanks (B). Prop. - Prnf':'\l(); Ctr - Controlo. Deficincia primria de
anourino (21%), secundrias de e.peclrintlS (ll%) I! protelna 4.1 fll%).
&
E .I )FE R O C rrO SE HE R E D I T R I A - PR E VA LN C I A O O S D FlC E S PR O T E I C O S D A M E M BR A N A D O E R I T R C I T O
essencialmente de adultos com fentipo clnico de
E sferocitose leve que foram observados na consulta por
complicaes da doena: crises hemolticas associadas a
infeces, clculos vesiculares e/ou renais, ou por estudo
familiar dopropsito.
N este grupo de indivduos estudados verificou- se que
odfice proteico mais comum foi deanquirina. O dfice de
anquirina no entanto dificil deidentificar, pela tcnica de
SD S- PA G E , nos indivduos que no foram
esplenectomizados, j que nesta situao normal
encontrar- se uma ligeira reticulocitose que o bastante
para mascarar Q dfice primrio. N estes casos, em que o
dfice primrio est mascarado existem porm redues
secundrias das protenas de ligao: protena 4.2 e
espectrinas, que so indcios de uma reduo primria de
anquirina. A confirmao dodfice deanquirina possvel,
pela mesma tcnica, nos indivduos que foram
esplenectomizados, N os doentes com dfice de anquirina
eredues secundrias deprotenas 4.2 eespectrinas, estas
revelaram- se mais acentuadas nos pacientes com quadro
clfnico de esferocitose moderada.
Foram ainda encontradas, para alm de redues de
anquirina, redues debanda 3, protena 4.2 eespectrinas.
A prevalncia dos dfices, assim como o modo de
transmisso hereditria encontrado, esto de acordo com
estudos previamente publicados.
D evido amostragem ser muito pequena emcada grupo
de dfice proteico, no foi possvel estabelecer uma
correlao entre a percentagem do dfice proteico e o
fentipo clnico. Porm a tcnica utilizada neste estudo
mostrou- se muitotil, como ferramenta deauxlio, emalguns
casos de difcil diagnstco- ".
C O N C L US O
O s autores salientam que este estudo evidenciou que a
deficincia proteica mais comum nos doentes comE H no
N orte de Portugal de anquirina, seguida de banda 3,
protena 4.2 ef3- espectrina., o que est de acordo com a
bibliografia
1
1- 14.
AGRADECIMENTOS
O s autores agradecem aLetcia R ibeiro eaJ os Barbot
avaliosa contribuio clnica ecientfica, aHelena A lmeida,
Sra. D . U mbelina R ebelo, Sr. Lus R elvas eSr. E lsio C osta a
excelente colaborao tcnica, es Sras. D . Susana C atou
e D . A na D avid apreparao do manuscrito.
O estudo das protenas da membrana do eritrcito fo-
ram realizados no laboratrio daU nidade de Hematologia
M olecular do C entro Hospitalar de C oimbra.
B mL T O GR A F rA
1. D E LA U N A Y J , A LLO lSI O N , M O R L L, C A R .R E G : La
splrrocyrose hre ditaire en 1995: I 'apport de I a gntique
molculaire. Hmatologic 1995; 2: 115- 22
2. T SE WT E T LU X SE : R cd blood cell mcmbrane disorders. Br J
Haematol. 1999; 104:2- 13
3. LE SLE Y J , M lC HA E L J A : E rythroid band 3 variants and disease.
Bailliercs C lin Haematol. 1999; 12 (4):637- 654
4. A G R E P, A ST M O S A , C A SE LLA lF, M C M lLLA N C : I nheritance
partem and clinical response to splenectomy as a ret1ection of
erythrocyte spcctrin deficiency in hereditary spherocytosis, N E ng
J M ed. 1986; 315:1579- 83
5. T O SHI BA S, D A lSU KE U , SHlN - I C HI R O S, KE I J I H, SHlJ N ZO
C , T O HR U K: Pancytopenia with hemophagocytosis secondary to
parvovirus B 19 infection in a family with hereditary spherocytosis.
Pediatr lnt. 1999;41 :561- 564
6. D O D G E , J T et ai: T he prepararion and chemical characteristics
of hemoglobin- free ghosts of human erythrocytes A rch Biochern
Biophys. 1963;100:119- 130
7. LO WR Y O H, R O SE BR O U G H J N , FA R R A L, R A N D A LL RJ :
Protein measurements with me Folin reagent. J Biol C hem. 1951;
193:265- 275
8. LA E M M Ll U K: C leavage of srructural proteins during the as-
sembly of the head of bacteriophage T4 . N ature, 1970;227:680-
685
9. FA I R BA .N KS et ai: E lectrophoretic analysis of lhe major polypep-
tides of the human erythrocyte mernbrane. Biuchernistry, 1971;
10:2606- 2671
10. M A N A T A I ), A LM E I D A H, R E BE LO U , BA lO A , G R A N J O E ,
R T BE mO M L: E stdio de I as protenas de I a membrana dei glbulo
rojo en I a poblaci6n portuguesa - experiencia de I a U nidade de
Hematologia M o1ecuI ar, Haematologica. 2000; 85 supl 3:38
11. HA SSO U N H, PA LE K 1: Hereditary spherocytosis: a review of
lhe clinical and molecnlar aspects of lhe disease. Blood R ev. 1996;
10: 129- 47
12. C O ST A FF, A O R E P, WA T KI N S rc( aI : Linkage of dominant
hereditary spherocytosis to the gene for the erythrocyre rnem-
brane- skeleton protein ankyrin. N E ngl J M ed. 1990;323:1046- 50
13. l.A N C I O T T T M , PE R U T E LLT P, VA l.E T T O A , orM A R T T N O
D , M O R ! PG : A nkyrin deficiency is the most commou defect in
dominam and non dominam hereditary spherocytosis.
Haematologica. 1997;82:460- 2
14. G R A N J O E , M A N A T A P, A LM E I D A ct ai: Hcrcditary sphcro-
cytosis and elliptocytosis in the north of Portugal. I nt J Hematol
2000. n sup 1:121
J 5. G A LLA G HE R PG . FO R G E T BG : Hcrcditary sphcrocytosis, c1-
liptocytosis, and relatcd disorders. I n: Beutler E , Lichtman M A ,
C oller BS, Kipps rr,Seligsohn U . Williams Hematology. 6th rev,
N cw York: M acG raw- Hill. 2001:503- 518
69