A UTILIZAO DO LABORATRIO CLNICO NA INVESTIGAO

DAS ERITROENZIMOPATIAS
Fernando L. A. Fonseca
*
, Patrcia R. Barbosa#, Daniela Raguer#, Jorge Luiz Freire Pinto**, Roseli
Corazzini*** e Roberto Carlos Sallai****





*
Dr. em Hematologia pela FMUSP, Chefe do Lab. de An. Clnicas da FMABC, Prof. de Hematologia
do Curso de Cincias Farmacuticas da FMABC.
#Servio de Ps Graduao USP.
**Farmacutico-Bioqumico do Lab. An. Clnicas da FMABC.
***Me. Em Patologia Geral pela FMVZ-USP, Profa. Do Curso de Cincias Biolgicas do CUFSA,
Autora Coleo Biologia-Projeto Escola Cidadania, Editora do Brasil.
****Me. em Biologia Molecular UNIFESP, Prof. do Curso de Cincias Biolgicas do CUFSA.

Resumo

As eritroenzimopatias so distrbios
do metabolismo eritrocitrio que
causam encurtamento da vida dessas
clulas compremetendo a sua forma e
a sua funo. Exames de rotina
podem ser usados para o auxlio
diagnstico dessas patologias , porm
exames mais elaborados
tecnicamente so poucos utilizados. O
artigo destina-se a informar as
principais alteraes vistas nos
exames de rotina e ainda rene os
mtodos descritos na literatura para a
investigao de enzimas do
metabolismo eritrocitrio.

Palavras-chave: Eritrcitos.
Doenas do sangue - Anemia
hemoltica. Distrbios do metabolismo
- Glicose-6-fosfato desidrogenase.
Distrbios do metabolismo - Piruvato-
quinase.
Abstract

The red blood cells patologies are
diseases of the metabolism that
cause shortening of the life from
these cells and can impaire the
shape and function. Routine
examinations from clinical analyses
can be used to diagnostic of these
diseases, however elaborated
methods are little used. In this
report we proposed to inform the
main alterations in the routine
examinations and to organize the
described methods for searching
the enzymes from red blood cell
metabolism.

Keywords: Red blood cell.
Hematological diseases - Hemolytic
anemia. Metabolic disturbance -
Glucose-6-fhosfhate
desidroghenase. Metabolic
disturbance - Piruvato kinase.

As eritroenzimopatias so conhecidas por provocarem hemlise a partir da
alterao do metabolismo energtico no interior das hemcias. Os distrbios
metablicos mais conhecidos ocorrem na via glicoltica de Embden-Meyerhof
(deficincia da enzima piruvato-quinase) e no shunt do monofosfato de hexose
(deficincia da glicose6fosfatodesidrogenase - G6PD). Dentre as enzimas
eritrocitrias reclamadas pela clnica , destacam-se as seguintes: hexoquinase (HK),
glicerofosfoisomerase, gliceraldedo-3 fosfatoisomerase, fosfofrutoquinase, pirivato-
quinase (PK), glicose-6fosfato-desidrogenase (G6PD), glutation redutase,
fosfogliceratoquinase, glutation peroxidase, adenilatoquinase, triose fosfato
isomerase, desidrogenase ltica.
O encurtamento da vida do eritrcito pode ocorrer por defeito intra ou extra
corpuscular. Assim, dentre as anemias hemolticas que ocorrem por anormalidades
intracorpusculares, esto as do grupo das anemias hereditrias no esferocticas,
cujos defeitos se localizam em leses bioqumicas ligadas sntese deficiente de
enzimas da via glicoltica Embden-Meyerhor ou da vias das pentoses-fosfatos (via de
Warburg-Dickens-Lipman) envolvendo no s os nveis eritrocitrios de enzimas
como tambm os nveis de metablitos intermedirios, coenzimas ou substncias
indiretamente ligadas ao metabolismo da glicose, como o caso do glutation.
A glicose-6-fosfato-desidrogenase regulada por um gene situado no
cromossomo X. Alm de ser ligado ao sexo, o defeito incompletamente dominante:
expressa-se completamente nos homens e nas mulheres homozigotas e em grau
varivel nas mulheres heterozigotas.
So variveis os efeitos da G-6PD, dependendo no s do grau de expresso do
defeito como tambm da variante enzimtica e da raa do indivduo afetado. H
casos onde no h presena de doena hemoltica ou apresentam hemlise crnica
de grau leve independente da ingesto de drogas ou a ocorrncia de hemlise
relaciona-se com a ingesto de drogas (Quadro 1) ou de sementes de Vicia fava
(favismo).


Tipo Medicamento
Antimicrobianos
Cloranfenicol,
furacina,
furadantina
Sulfonas/Sulfonamidas
Sulfanilamida,
gantrisin,
dapsona.
Analgsicos
cido
acetilsaliclico,
acetaminofeno.
Antimalricos
Primaquina,
atabrina.
Miscelnea
Naftalina,
vitamina K, cido
ascrbico.

Quadro 1 - Lista Parcial de algumas substncias que podem provocar crise
hemoltica aguda em pacientes com deficincia de G-6PD


A deficincia da G-6PD afeta mais de 200 milhes de pessoas no mundo, mas
felizmente apenas uma parcela delas tem manifestaes clnicas. A doena foi
inicialmente descrita em negros norte-americanos que tomavam primaquina para o
tratamento ou profilaxia de malria. Embora a ocorrncia espordica deste defeito
tenha sido descrita em grande nmero de populaes das mais diversas regies do
mundo, a deficincia tem prevalncia elevada e maior interesse populacional entre
negros e em certas regies do Mediterrneo. Sua prevalncia em negros norte-
americanos de 12-15 %, entre italianos de 1.3-2 % (mas atinge 14-48 % na
Sardenha). Como conseqncia desta distribuio, a doena ocorre no Brasil em
descendentes de mediterrneo (especialmente italianos) e entre negros e pardos.
Distinguem-se trs principais variantes clnicas da doena. O tipo negro foi o
primeiro descrito, sendo observado em soldados americanos de raa negra que
apresentavam anemia hemoltica de intensidade varivel ao ingerirem primaquina ou
outras drogas antimalricas. Observou-se depois que a deficincia de G-6PD, atingia
tambm outras raas e exibia larga distribuio geogrfica (tipo no negro). Uma
terceira variante clnica observada em lactentes homozigotos ou heterozigotos
para a deficincia de G-6PD, sob a forma de ictercia neonatal no relacionada com
ingesto de drogas.
Alm da hemlise induzida por drogas, os indivduos susceptveis podem sofrer
hemlise aguda por infeces virticas ou por acidose grave, clinicamente as causas
mais comuns.
A investigao laboratorial das anormalidades enzimticas em geral compreende
a avaliao qualitativa (testes de Brewer, imunoflurorescncia e ascorbato-cianeto) e
quantitativa da G-6PD (teste de Beutler). Alm disso, deve ser feita a eletroforese da
G6PD em acetato de celulose e, nos casos que revelarem alterao, pode ser
realizado o estudo molecular desta enzima. Nos casos sem alterao, devem ser
avaliadas as demais enzimas eritrocitrias.
Quando a avaliao da atividade enzimtica realizada, quer seja quanti ou
qualitativamente, necessrio lembrar que os reticulcitos so mais ricos em
enzima; deste modo, se a avaliao for realizada aps uma crise hemoltica, o
indivduo pode apresentar reticulocitose, o resultado pode ser normal; da mesma
forma, em paciente com anemia hemoltica crnica, o resultado tem que ser
considerado em relao ao nmero de reticulcitos encontrados na circulao.
Finalmente preciso enfatizar que a transfuso com hemcias normais pode elevar
artificialmente o resultado da dosagem de G-6PD de um indivduo deficiente.

Avaliao Laboratorial :
Hemograma: As hemcias podem estar normais ou ligeiramente aumentadas de
tamanho. Reticulocitose pronunciada, mesmo em presena de anemia moderada.
Leuccitos e plaquetas normais. Muitas vezes podemos encontrar no sangue
perifrico hemcias mordidas (bite cells), ou seja, que exibem uma ou mais falhas
em sua periferia. Estas clulas so possivelmente resultantes da remoo dos
corpsculos de Heinz pelo bao.
Fragilidade Globular Osmtica: Normal.
Eletroforese da Hemoglobina: Normal.
Prova de Coombs: Normal.
Mielograma: Acentuadssima hiperplasia da srie eritride.
Prova para Corpsculos de Heinz: So grumos de hemoglobinas desnaturadas
que se precipitam dentro da hemcia, sendo facilmente demonstrveis com corantes
vitais (p.ex., violeta de metila). So vistos em muito maior nmero nos pacientes
esplenectomizados, pois so removidos do sangue pelas clulas macrofgicas do
bao.

Tcnica:
Reativos:
Cristal violeta........................2.0 g
gua destilada ..................100 mL

Cloreto de sdio ..................0.73 g
gua destilada ..................100 mL

Para uso, mistura-se pequenas pores das solues, em partes iguais.

Procedimento:
Mistura-se uma gota de sangue (0.1 mL), sobre uma lmina, com 0.025 mL de
cristal violeta.
A mistura feita com os cantos de uma lamnula, que cobrir a preparao.
A leitura pode ser realizada aps 5 minutos.

Interpretao:
Os corpsculos de Heinz aparecem como pequenas incluses purpricas na
margem das clulas vermelhas, no corando os reticulcitos.
Certas drogas e a presena de hemoglobinas instveis so responsveis pelo
aparecimento dos corpsculos de Heinz.





Testes de Triagem para Deficincia de G6PD

1 Teste do Ponto Fluorescente (BEUTLER, 1979).
Reagentes:
D-glicose-6-fosfato (G6P), 10 mmol/L. Dissolva 305 mg do sal dissdico, ou a
quantidade equivalente ao sal potssico em 100 mL de gua.
NADP
+
, 7.5 mmol/L;
Saponina, 750 mmol/L
Tampo Tris-HCl, pH 7.8;
Glutationa oxidada (GSSG), 8mmol/L. Dissolva 49 mg de GSSG em 10 mL de
gua.
Sangue total (EDTA), 10 mL.
Mistura-se os reagentes na seguinte proporo:
2 volumes de G6P;
1 volume de NADP
+;
1 volume de saponina;
3 volumes de tampo;
1 volume de GSSG;
2 volumes de gua.
A soluo estvel a 20C por 2 anos e por 2 meses se conservado a 4C.
Aliquotar a soluo (100 L) em tubos e manter a 20C.

Princpio:
A formao de NADPH no sangue, em presena deG6PD pode ser visvel sob
luz UV.

Mtodo:
Adiciona-se 10
L do sangue total a uma alquota (100 L) da soluo de G6P
e NADP e homogeneza-se. Aplica-se uma gota desta soluo num papel de filtro
(Whatman N 1) logo aps a mistura e aps 5-10 minutos. Colocar sob luz Ultra-
Violeta (UV). Se houver presena de G6PD, o NADP convertido a NADPH. Este
fluorescente sob luz UV, enquanto que o NADP no.

Interpretao:
Ponto fluorescente Presena de G6PD.
Ponto no fluorescente ausncia ou pouca G6PD.


2 Teste da Reduo da Metahemoglobina (BREWER, 1962) Teste qualitativo
para deficincia de G6PD.
Reagentes:
Nitrito de Sdio, 180 mmol/L;
Dextrose, 280 mmol/L. Dissolva 5 g de dextrose e 1.25 g de NaNO
2
em 100
mL de gua.
Azul de Metileno, 0.4 mmol/L. Dissolva 150 mg de cloridrato de metiltionina
em 1 litro de gua.
Sangue total (EDTA), 0.5 mL.

Princpio:
O nitrito de sdio converte a hemoglobina a metahemoglobina. Quando o azul
de metileno adicionado reao e incubado, este estimula a via da pentose
fosfato em indivduos que apresentam nveis normais de G6PD, reconvertendo a
metahemoglobina a hemoglobina.

Mtodo:
Marca-se 3 tubos de ensaio grandes como positivo, negativo e teste.
Procede-se da seguinte forma:


Positivo Negativo Teste
Soluo de
Nitrito/Glicose
10 mL ------- 10 mL
Soluo de Azul de
Metileno
------- 10 mL 10 mL
Sangue em EDTA
100 mL 100 mL
100
mL


Incuba-se a 37C por 3 horas. Adicionar 10 mL de gua destilada. Fazer a
leitura entre 5 e 10 minutos comparando o tubo teste com os demais. O tubo
positivo apresentar colorao acastanhada pela formao de metahemoglobina. O
tubo negativo apresenta colorao avermelhada (vermelho vivo), uma vez que o azul
de metileno reconverteu a metahemoglobina a hemoglobina novamente.

Interpretao:
Amostra normal colorao vermelha;
Amostra deficiente em G6PD colorao castanha.


3 Teste do Ascorbato-Cianeto (JACOB, 1966).
Reagentes:
Ascorbato de Sdio, 10 mg. Dispense 10 mg de ascorbato de sdio e 5 mg de
glicose num determinado nmero de tubos. Os tubos devem ser tampados e
estocados por tempo indeterminado a 20C.
Cianeto de Sdio, 500 mg pH 7.0. Dissolve-se 500 mg de NaCN em 50 mL de
gua e adicione 20 mL de tampo fosfato iso-osmtico, pH 7.4. Neutralize-se a
soluo (para pH 7.0) com 2 ml/L HCl e o volume acertado para 100 mL. Esta
soluo estvel indefinidamente a 20C.
Sangue total (EDTA), 5 mL.

Princpio:
Quando o cianeto de sdio e o ascorbato de sdio so adicionados amostra
de sangue, a catalase inibida pelo cianeto e h a formao de perxido de
hidrognio pela oxidao do ascorbato e da oxihemoglobina. O perxido gerado,
converter a oxihemoglobina a hemicromo e metahemoglobina, a menos que este
seja reduzido pela glutationa peroxidase. A reao requer a glutationa como doador
de prtons. Em deficientes de G6PD h diminuio da glutationa.




Mtodo:
Em um tubo de ensaio contendo o ascorbato, coloca-se 2,0 mL de sangue e
adiciona-se 2 gotas da soluo de cianeto. Mistura-se por inverso e incuba-se a
37C por 4 horas.
O tubo Invertido e observa-se a colorao na parede do tubo. A cor escura
do sangue est relacionada deficincia de G6PD. Amostras normais, mantm sua
colorao avermelhada.
*OBS.: Mtodo no especfico para G6PD.


Testes para Deteco de Deficincia de G6PD

1 Teste Quantitativo de G6PD (BEUTLER, 1984).
Reagentes:
Tampo TRIS-HCl 1M, EDTA 5mM, pH 8.0;
MgCl
2
, 0.1 M;
NADP
2
mM;
Hemolisado 1:20;
G6P 6 mM;
gua bi-destilada.

Mtodo:
Prepara-se o hemolisado utilizando-se 3 mL de sangue colhido em 1 mL de
ACD. Determina-se a concentrao da hemoglobina no hemolisado.
A amostra preparada da seguinte forma:
Incuba-se a 37C por 10 minutos. Acrescenta-se 100 mL de G6P 6mM ao
tubo de amostra, para desencadear a reao. A variao da densidade ptica (DO)
por minuto acompanhada em espectrofotmetro, em 340 nm a 37C.






Branco Amostra
TRIS-HCl 1M, EDTA 5mM, ph 8.0 100 L 100 L
MgCl
2
, 0.1 M 100 L 100 L
NADP 2 mM 100 L 100 L
Hemolisado 1:20 100 L 100 L
gua bidestilada 680 L 580 L

Incuba-se a 37C por 10 minutos. Acrescenta-se 100 mL de G6P 6 mM ao
tubo de amostra, para desencadear a reao. A variao da densidade ptica (DO)
por minuto acompanhada em espectrofotmetro, em 340 nm a 37C.

Clculo:
AE = D DO/min x 10
5
> UI/gHb/min. a 37C
E x V x Hb
Onde:

AE Atividade Enzimtica
DO/min Variao da densidade ptica por minuto;
Hb concentrao da hemoglobina no hemolisado em g/dL;
E coeficiente de extino molar da coenzima NADP
+
(6.22);
V volume de hemolisado em mL, utilizado no sistema;
10
5

correo da hemoglobina no hemolisado em gramas por 100 mL de sangue.

VALORES DE REFERNCIA:
12.1 2.09 UI/gHb/min. a 37C.


Teste de Triagem para Piruvato Quinase (PK)

1 Teste do Ponto Fluorescente (BEUTLER, 1984).
Princpio:
A piruvato quinase catalisa a fosforilao do ADP em ATP pela
fosfoenolpiruvato (PEP) com a formao do piruvato. Este reduz o NADPH presente
a NAD com a formao de lactato. A diminuio da fluorescncia sob UV indica a
presena de PK.


Teste para Deteco de Deficincia de Piruvato Quinase (PK)

1 Teste Quantitativo de PK (BEUTLER, 1984)
Reagentes:
Tampo TRIS-HCl 1M, EDTA 5mM, pH 8.0;
KCl, 1M
MgCl
2
, 0.1 M;
NADH 2 mM;
ADP 30mM;
LDH 60U/mL;
PEP 50 mM;
Hemolisado 1:20;
gua bi-destilada.

Princpio:
A PK catalisa a fosforilao da adenosina difosfato (ADP) a adenosina
trifosfato (ATP) pelo fosfoenolpiruvato (PEP). A velocidade de formao do piruvato
medida pela oxidao do NADH na reao da lactato desidrogenase.

Mtodo:
Prepara-se o hemolisado utilizando-se 3 mL de sangue colhido em 1 mL de ACD.
Determina-se a concentrao da hemoglobina no hemolisado.
Procede-se amostra da seguinte forma:






Branco Amostra
TRIS-HCl 1M, EDTA 5mM, ph 8,0 100 L 100 L
KCl, 1 M 100 L 100 L
MgCl
2
, 0.1 M 100 L 100 L
NADH, 2 mM 100 L 100 L
ADP neutralizado, 30mM ------ 50 L
LDH 60U/mL 100 L 100 L
Hemolisado 1:20 20 L 20 L
gua bidestilada 380 L 330 L

Incuba-se a 37C por 10 minutos. Acrescenta-se 100 mL de PEP 50mM a
ambos os tubos. A variao da densidade ptica (DO) por minuto acompanhada
em espectrofotmetro, em 340 nm a 37C.

Clculo:
AE = D DO/min x 10
5
> UI/gHb/min E x V x Hb 37C

Onde:
DO/min Variao da densidade ptica por minuto;
Hb concentrao da hemoglobina no hemolisado em g/dL;
E coeficiente de extino molar da coenzima NADH

(6.22);
V volume de hemolisado em mL, utilizado no sistema;
10
5
correo da hemoglobina no hemolisado em gramas por 100 mL de sangue.

VALORES DE REFERNCIA:
15.1 1.96 UI/gHb/min. a 37C.


Deteco Molecular para G6PD e PK
O material utilizado para este tipo de deteco o DNA genmico isolado de
leuccitos do sangue perifrico por procedimento padro. Inicialmente so
pesquisadas as principais mutaes, j que a nossa populao possui um alto ndice
de miscigenao tornando praticamente impossvel determinar a origem dos
pacientes.
J foram descritas aproximadamente 78 variantes relacionadas diretamente
relacionadas com as mutaes da G6PD. As principais variantes so:
Variante Mediterrneo
O principal estudo da variante mediterrneo se d atravs da anlise da
substituio de uma citosina por uma timina (CT) levando substituio de uma
serina (Ser) por uma fenilalanina (Phe) na posio 188.
Variante A-
O principal estudo da variante A se d atravs da anlise de duas substituies
uma guanina por uma adenina e uma adeninda por uma guanina, nas posies 202
e 68 respectivamente.
Para a Piruvato Quinase foram detectadas cerca de 47 mutaes e a anlise
baseada pricipalmente em delees de bases ou mutaes por splicing. A principal
mutao encontrada est relacionada com a deleo de uma citosina (C) na
isoenzima L da piruvato quinase.
Alm da anlise do DNA genminco diretamente por PCR (reao em cadeia da
polimerase), as mutaes podem ser estudadas por clonagem de cDNA,
sequenciamento e SSCP. De acordo com a necessidade de diagnstico ser
empregado uma ou mais tcnicas.


REFERNCIAS

BEUTLER, E. G6PD deficiency. Blood, New York, v. 84, n. 11, p. 3613-3636, Dec.
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DACIE, J. V.; LEWIS, S. M. Investigation of the hereditary haemolytic anemias. In:
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LUKENS, J.N. Anemias hemolticas hereditrias associadas a anormalidades da
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