Manual de Procedimentos

Para Testes Laboratoriais

PROGRAMA NACIONAL DE OOENAS SEXUALMENTE TRANSMlsslvEIS/ AIOS

Manual de Procedimentos
Para Testes Laboratoriais
PROGRAMA NACIONAL OE OOENAS SEXUALMENTE TRANSMISSVEIS/AIOS

"1992 - Ministrio da Sade

secretaria Nacional de Assistncia Sade

Departamento de Programas de sade
Programa Nacional de Controle de DST/AIDS
Esplanada dos Ministrios 810o G Sobreloja

CEP: 70.0sa-900
Tel.: (061) 315-2520
Fu.: (061) 315-2519

1rJl)f8SSO

no BrasiVPrinted ln Brazil

FICHA CATALOGRFICA

Mmcsteno da s.ooe. Sea.tana Nacional de Assistncia l S.de. Departamento de Programas de Sade.

Coordenao Gal de Programas Cllnic:o-Sanitrios. Coordenao do Programa Nacional de Controle

d. Doenas Sexualmente TransmlSslveisJAIOS.

Diagnstico laboratorial das doenas sexualmente transmisslveisIMinisl:rio da Sade, Secretaria Nacional
d. Assist'ncia Sade. Departamento de Programas d. Sade. Coordenao Geral de Programas CllnicoSan~tios, CoordenaAo do Programa Nacional de Controle de Doenas Sexualmente TtansmisslvelSlAIDS Brasnill: Coordenalo do Programa Nacional de Controle de Doenas Sexualmente TransmisslveisiAIDS,
1992.
44 p.: I.

SUMRIO

pg.

APRESENTAO
OBJETIVOS

. . . . . . . . .. . . . . . . . . . .

MDULO 1- DIAGNSTICO LABORATORIAL DA SIFILlS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1. PESOUISA DO Treponema pallldum EM MATERIAL DO PACIENTE. . .

13

1.1. Exame microscpico de campo escuro ........................................

12. Exame por imunolluorescncia direla ........................................

13
13

2. TESTES SOROLGICOS

14

2.1. Testes preliminares, no ~ioos

22. Testes oonf!rmalrios treponmK:os ......................................
2.3. Inte<pretao dos testes sorolglCOS

14
16
19

3. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................

20

MoULO II - DIAGNSTICO LABORATORIAL DA GONORRIA ..............

21

1. COLHEITA DA AMOSTRA CLiNICA ..........................................

25

1.1. ColheIta da amostra na mulher .............................................

12. Colheita da amostra no homem

25

2. EXAME BACTERIOSCPICO DIRETO

2.1. Preparo do esfregao .....................................................
2.2. C_ao pelo Mtodo de Gram . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3. Leitura das lminas .....................................................
3. SEMEADURA DA AMOSTRA CLiNICA

3.1. MeK>S de rottura c:orr'Il.KOeflte usados .......................................

32. TcnICO de semeadura
3.3. Inclbao das placas

26

26
26
27
V
27

27
27
27

4. IDENTIFICAO PRESUNTIVA

28

5. IDENTIFICAO DEFINITIVA

28

6. L1BERAO DOS LAUDOS

29

6.1. Bacteriosoopia
62. Cultura .............................................

29
29

7. PESQUISA DE N. gonorrhoeae RESISTENTE A ANTIBiTICOS BETA-LACTMICOS . .. . . . . .

7.1. Teste iodomlrico rpido.
7.2. Teste acidomtrico rpido

29

. .. . .

30
31

7.3. Tesle da Cefalospor;na cromognica ...................

32

.. . .. . . . . . ..

..

. .. . . . . .. .

8. ESTOCAGEM DE N. gonoohoeae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

32

9. CONTROLE DE QUALIDADE NO LABORATRIO OE DST

33

9.1. Controle de qualidade do Gram

.
9.2. Controle de qualidade do meio de Thayer Martin modificado (TMM)
.
9.3. Controle de qualidade dos carooldratos ........................................
9.4. Controle de qualidade da prova de oxidase ...................................
ANEXO I
ANEXO II
ANEXO III
ANEXO IV

Reagentes para Colorao de Gram ....................................

Meio de Cultura de Thayer Martin Modificado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
Teste de Citocromo-Oxidase
Metabolizao de Carboidratos ................................. ,
,

33
33
36
36

36
37
36
39

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

40

MDULO 11I- DIAGNSTICO LABORATORIAL DE OOENAS DE TRANSMISSO SEXUAL

ND-GONOCCICA

41

1. CANCRO MOLE .....................................................

45

1.1. Coleta da amostra clnica para bacterioscopia ..................................

1.2 Coleta da amostra clnica para cultura .........................................
1.3. Liberao dos laudos .....................................................

45
45
45

2. OONOVANOSE ........................................................

45

2.1. Diagnstico laboratorial

22. Liberao dos laudos ...................................................

46
46

3. VAGINITE POR Gardnerella vaginal is . . . . . . .. . . . . . . ... . ..

3.1. Diagnstico laboratonal ..................................................
3.2. Liberao dos laudos .....................................................

4. TRICOMONiASE

46
46
47

47

4.1. Diagnstico laboratorial ..................................................

4.2. Liberao de laudos

47
47

5. CANDIDiASE .....................................................

47

5.1. Diagnstico laboratafial ...................................................

5.2. Liberao de laudos .....................................................

48

48

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

48

6. DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS DST CAUSADAS POR Chlamydia trachamalis ..

49

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

50

APRESENTAO

A incidncia das doenas sexualmente transmissveis (081) lem aumentado em proporo

verdadeiramente alarmante e se tomado um grave problema de sade pblica em todo o mundo.
necessrio, portanto, conlrollas, j que as DST nao apenas atacam a populaao adulla mas afelam,
tambm. o adolescente. o feto e o recm-nascido.
O controle dessas doenas bastante diHcil em vista de diversos fatores, dentre os quais
destacamos os de ordem social e mdica.

Ao examinar estes fatores, conclu-se que as mudanas nos padrOes de comportamento sexual
e o uso de mtodos contraceptivos tm contribudo para o aumento generalizado das DST. Em adio ao
grande nmero de casos assinlomticos ou nao diagnosticados que persistem como reservatrios,
perpetuando as infeces. Alm do gonococo e do Treponema pallldum, existem muitos outros
microorganismos que s30 transmitidos pelo ato sexual. Varias combinaOes destes microorganismos
coexistem e s30 transmitidas simultaneamente. Portanto, infecOes mltiplas existem e devem ser tratadas
adequadamente. Muitos dos microorganismos respondem bem terapia antibitica, embora recidivas
ocorram. Tendo em vista a ocorrncia de resistncia aos antibiticos, a rotina teraputica deve ser
cuidadosa.
Algumas dessas infecoes podem persistir no estado de latncia, tornandose ativas meses ou
mesmo anos aps a inle<:ao inicial a reinfec30 comum, particularmente entre certos grupos
populacionais.
O controle das doenas sexualmente transmissiveis deve envolver uma equipe mul1idisciplinar,
na qual o especialista em laboratrio responsvel pelos exames laboratoriais necessrios para a
confirma30 elou diferencia30 do diagnstico.
Este fasciculo, que contou, em sua elabora30, com o apoio tcnico dos doutores Mario E.
Camargo, Oalair Antnia Neto de Souza, Oborah Mongagnini. Geni Noceti de lima Cmara e Marta
Antunes de Oliveira, contm tcnicas e procedimentos para o diagnstico dos microorganismos envolvidos
com as doenas sexualmente transmissveis e dirigido especificamente para o pessoal que trabatha na
area de laboratrio.

Lalr Guerra de Macedo Rodrigues

Coordenadora
Programa Nacional de Controle de DST/AIDS

OBJETIVOS
Gerais:
Padronizar OS reagentes e tcnicas usadas no diagnstico das doenas sexualmente transmisslveis;
Criar um sistema nico de dados laboI'atoriais que permita determinar a prevalncia de algumas DST;
Enfatizar a importncia do laboratrio no oontrole das

asr.

Especificos:

Executar os testes laboratoriais recomendados para apoio diagnstico das DST;

Explicar os pl'incpios dos testes utilizados para apoio diagnstico das DST;
Interpretar os resultados dos lestes laboratoriais;
Registrar e analisar os dados obtidos;
Liberar adequadamente os resultados laboratoriais;
Implantar controle de qualidade no laboratrio de osr.

MODULO I
DIAGNOSTICO LABoRATDRIAL DA SIFllIS

SiFILlS
Doena causada pelo Treponema pallidum, transmitida sexualmente, por vla placentna a, eventualmente, por transfuso de sangue. A leso lnicia~ protosifiloma oucancro dt.rO, uma UI09rao indolor de
bordas endurecidas, Que aparece de 2 a 6 semanas aps o contgio e desaparece aps cerca de 2 meses.
Esquematicamente. a essa lase de sirilis primria segue-se a de sltilis secundria, com erupo cutnea
papular, leses mucosas e reao ganglionar. Em seguida a infeco entra em 'ase de latncia, chamada
precoce no pnmelro ano de doena e tardia depols desse perodo. Anos dep)IS pode se manIfestar a sllilis
terciria, com ~ pnoopalmente carcltovasculares ou de sIstema net'VOSO central.

11

1. PESQUISA DO Treponema pallidum EM MATERIAL DO PACIENTE

Na sifjlis recente o T. pallidum pode ser detectado por exame microscpico, de campo escuro ou de
imunofluorescncia, no exsudato da leso primria, em material de leses secundrias, principalmente de
mucosas, e em material de puno ganglionar. Em recm-nascidos com sfilis congnita, pode ser encontrado em exsudato nasal e de nasofaringe.
1.1. Exame microscpico de campo escuro
1.1.1. Coleta do material

De uma coleta adequada depende o bom xito da pesquisa. limpar cuidadosamente a superfcie da
leso com gaze umedecida em soluo fisiolgica, evitando sangramento. Coletar o exsudato lmpido que se
forma na leso, tocando-o dlretamente com uma lmina de microscopia ou transfenndo-o para esta ala bacteriolgica ou com capilar.
1.1.2. Observao microscpica:
O material, entre-lmina e lamnula, examinado imediatamente por microscopia de campo escuro. No
caso de alguma demora para o exame, a lamnula pOOe ser grudada sobre a lmina, com parafina. A lmina
pOOe ser conservada temperatura ambienle e o exame realizado at 1 ou 2 horas depois. Verificar a exala
centralizao do condensador de campo escuro e as condies de Iluminao, o que pOOer ser feito previa
mente com um preparado contendo um raspado de gengivas em uma gola de soluo salina. Este material
habitualmente contm espiroquetas de Treponema denticols, biotlpo microdentium
Observar os preparados com obJetiva seca (40x a 6Ox) e os organismos SUSpeItos com objetiva de
Imerso. O T. pallidum um esplroqueta delicado, com 6~m a 10 f.l.m de comprimento e forma de saca-rolhas com espirais apertadas, Intensamente mvel. Apresenta movimentos de translao para frente e para
trs e movimentos de rotao sobre o eixo longitudinal.
1.1.3. Interpretao:
Sendo adequada a coleta, o exame microscpico de campo escuro, de material de prolosifiloma, de
grande sensibilidade, com POSItiVidade maior do que 95%. Resultados negativos no excluem sfilis e devem
ser repelidos diante de uma suspeita clnica da doena. Exames negativos podem ser causados por limpeza
da leso com gua e sabo, pela ao local ou Sistmica de drogas trep:memicidas, ou verificados em
leses de maiS longa durao. Em leses bucaiS h nsco de resultados positiVOS falsos pela presena de es
plroquetas no patogniCOS, de morfologia semelhante.
1.2. Exame por imunolluorescncia di reta
O material a examinar pOOe ser delicadamente distendido sobre lminas de microscopia. cerca de 10f.l.I
para uma rea de lcm2 e seco ao ar. As lminas devem ser processadas no mesmo dia ou fixadas em acetona por 10 minutos e conservadas em congelador at a realizao do exame, podendo ser enViadas, em geIo, a laboratriOS adequadamente eqUipados para o lesle.
Para o exame, os preparados so incubados por 30 minutos com conjugado fluorescente especfiCO para
o T. pallidum, em geral um anllcorpo monoclonal marcado. MaiS Simplesmente, pode-se Incubar sobre os

13

preparados um soro sifiltico de alto ttulo, adequadamente dilufdo e prevIamente absorvido com ~Absorvente
para FT A-ABS~. DepoiS de lavadas, as lmInas so incubadas com conjugado antl 19G humana. oomo para o
teste FT A-ABS. DepoIs de montados com glicenna-aJcahna e lamlnula, os preparados so examinados em
mIcroscopIa de fluorescncia, como para o teste FTA-ABS. Nos testes pOSItiVOS so observados treponemas
ntensamente fluorescentes.
A tcnica de ImunollUOfescncla permite o exame do matenaJ mesmo depols de alguns dIas de colhido.
Alm dISSO, fornece resultados especficos que possibilitam a diferenciao entre o T. pallidum e treponemas no patognICOS eventualmente presentes. que no so corados.
2. TESTES SOROLGICOS
2.1. Testes preliminares no treponmicos:
Estes testes detectam anttrorpos anh-lipidicos que se formam no paciente infectado em resposta a matena! lipoldlCO, libertado tanto de suas prpnas clulas lesadas como dos treponemas.
Os testes antl-liptdlCOS utIlizam um antigeno btologicamente lnespecfico, a card.oli~na (difosfatidl~lice
rol), fosfolptde presente em tecKlos animaiS e extrado do c:orao de bat, qual se associam a lecitina e o
colesterol. Representados pelo teste do VDRL e suas variantes, so maes de floculao, mas h tambm
o teste de fixao do compM3mento, hoje de utIlizao multo limitada.
A sensibilidade e a especlfk:ldade destes testes so BlUstadas seglJldo as propores dos ~
tes do antgeno e as caracterlshcas da. suspenso anhgrllca utilizada. bem c:cmo da tcnica de execuo do
teste, que deve ser ngorosamente seguk1a. Variaes tanto do antigeno como da tcnica, por pequenas que
paream, podem aumentar stgnificativamente as porcentagens de resultados faJ5O-pOSltivos e faJscrnegatlws, que freqentemente passam despercebidos ao laboratonsta
2.1.1. Teste do VDRL em lminas
2.1.1.1. Equipamento e material necessrios:
-

centrifuga, para separao dos soros;

banho-maria, ajustado a 569C :!; 1QC;
agitador tIpo Kline, com 180 :!; 2 rotaes por minuto, com amplItude de 2 cm;
microscpIO com objetiva de 10 aumentos;
lminas ou placas de vidro transparente. com reas circulares demarcadas com anis de 14mm de
dimetro intemo, ou placas com escavaes circulares, lipo Kline;
tubos de ensaio;
pipetas de 1mi em centsimos e de 5ml em dcimos;
seringa tipo LU8f, de lml ou 2m1;
agulhas calibre 18, sem bisei, fornecendo 60 :!; 2 gotas por mililitro. (Adapte a agulha a uma pipeta
ou seringa de 2ml, graduadas, e conte o nmero de gotas correspondentes a 1mi de gua ou de 50-kJo salina).
2. 1.1.2. Reagentes:

- Antgeoo VORL de boa procedrda;

- Soluo salina lamponada (SSTJ, com pH 6,0

0,1

Composio:
10,Omt
Cloreto de sdio ......................
Fosfato dlssdi<x) anidro
0,37g
Foslato monopotsslGO anKlro .........
O,17g
Formaldeldo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,5m1
g.Ja deslllada para .... ............
10ll0m1
Confenr o pH. ConseNW em frasoos com tampa de rosca.

14

- Soluo salina a 0,9% - Dissolver 9g de NaCI em gJa destilada para 1lXX)m1.

2.1.1.3. Soros controle
Soro reagente, soro fracamente reagente e soro no reagente, testados contra padres respectIvos de
um laboratrIO de refernCia.
2.1.1.4. Procedimento
Soros:
Aquecer em banho-maria a 56C 1C por 30 minutos. Se ulllizados depois de 4 horas desta mati-

vao, aquecer novamente a 56C por 10 minutos.

Suspenso antignica:
Pipetar OAml de SST em frasco de 30ml, com rolha de vidro, redondo, de lundo plano. Gota a gota, adi
clonar por 6 segundos, 0,5m1 de antgeno, contido na metade inferior de uma plpeta de 1mi, graduada, enquanto se imprime ao Irasco, delicado movimento de rotao sobre uma superfcie plana. Na ltima, gota,
esvaziar a pipeta. Continuar a rotao por mais 10segundos. AdiCionar ao frasco 4,1 mi de SST, arrolhar e agitar, por movimentos verticaiS, cerca de 30 vezes em 10 segundos. No devem ser preparados volumes mert<>res de suspenso antignica. No caso de maior nmero de testes, podem ser preparados volumes dobrados,
mas no maiores. A suspenso antignica deve ser utilizada no mesmo dia. Entretanto, h relerncia de boa
preservao distribuindo-a em alquotas, que podem ser conservadas em congelador por at 30 dias e utilizadas totalmente quando degeladas.
Teste qualitativo:

Os soros e os reagentes devem estar temperatura ambiente, que para a realizao do teste dever li
car entre 23C e 29C. Colocar 50....1de soro inativado na rea circular da lmina (este volume deve ser rlgaroso, a partir de pipeta automtica de 50.... 1 ou de pipeta de VIdro de 0,1 mi, graduada). Adicionar 1 gota
(1/60ml) da suspenso antignica ImprimIr rotao lmina por 4 minutos (180 r.p.m., amplitude 2cm). Ler
imediatamente em microscpio com objetiva 10x e ocular 10x. Floculaes com partculas grandes ou mdias correspondem a soros reagentes, pequenas a soros fracamente reagentes e partculas antignicas
bem dispersas ou apenas levemente grosseiras, a soros no reagentes. Ocasionalmente, soros fortemente
reagentes apresentam resultado negativo, em conseqnCia a uma reao de prozona. Por este motivo,
sempre deve se incluir nos testes diluies de soro a 1:10 em soluo salina, que resultaro reagentes nos
casos de reao de prozona.
Testes quantitativos:
Preparar diluies dobradas do soro diretamente na lmina, por adio e transferncia a volumes sucessivos de 50....1 de soluo salina, desprezando-se 50 ....1da ltima diluio. Toma-se como titulo a ltima diluio nitidamente reagente (no fracamente reagente).

Teste do VOA L em lquido cefaloraqueano (LCR)

As amostras de LCR a testar so previamente centrilugadas mas no inalividas.

Diluir a suspenso antignica a 1:2 com soluo salina a 10% (dissolver 10g de NaCI em gua destila-

da, completar para 1ooml). Misturar delicadamente, aguardar 5 minutos. No utilizar depois de 2 horas. O
teste feito em lminas escavadas, com cavidade de 16mm de dimetro e 1,75mm de profundidade, estan00 as amostras e a suspenso antignica com temperatura ambiente (239C a 299C). A 50.... 1de LCR, adicio-

15

nar 1 gota de 10..,.1 (0,01ml) da suspenso antignica. Esta deve ser gotejada com agulha de calibre 22 fornecendo 100 :t 2 gotas por mililitro. Agitar as lminas por 8 minutos de rotao (180 :t 2 r.p.m.) e ler ao mi
croscpio. As amostras reagentes podem ser tituladas em teste quantitativo realizado com diluies dobra
das do LCR em soluo salina a 0,9%.
2.2. Testes confirmatrios treponmicos
Estes testes detectam anticorpos suscitados por determinantes antignicos do T. pallidum. Inicialmente foi desenvolvido o teste de Imobilizao do Treponema (TPI), oonsiderado como paci'o, mas que no
utIlizado para fins de rotina. Para exames de rotina, utiliza-se o teste de imunofluorescncia (FTAABS), oom
100000as de T. pallidum fixadas em lminas de microscopia, e o teste de mlcroemaglutinao (MHATP), com
hemcias recobertas com componentes antignicos do T. pallidum
2.2.1. Teste FTA-ABS
Sobre as lminas com treponemas, incubam-se os soros, previamente absorvidos. Para revelar os anti
corpos eventualmente fixados sobre os treponemas, as lminas, depois de lavadas, so incubadas com um
oonjugado de anticorpos anli-globulinas humanas com fluorescena Para os soros reagentes, os treponemas
se mostram fluorescentes ao exame por microscopia de fluorescncia. Para que o teste seja especfico,
necessrio afastar as rea8s de anticorpos, presentes no soro, oontra antgenos ~de grupo", comuns a treponemas no patognicos que ocorrem no organismo humano. Para esse fim, estes anticorpos so bloquea
00s pela adio prvia, ao soro, de um "AbsoNente" que contm os antgenos de grupo.
A sensibilidade do teste depende de numerosos fatores, relacionados com o equipamento de microscopia fluorescente, a reatividade do antgeno, as caractersticas e diluio do conjugado fluorescente, a execuo e leitura corretas do teste, bem como de um reagente "absorvente" satisfatrio. Desse modo, o teste
FTAABS deve ser rigorosamente padronizado em cada laboratrio com o auxlio de soros controle.
2.2.1.1. Equipamento e material necessrios:
- microscpio de fluorescncia, de transiluminao ou de epiiluminao, com filtros para fluorescena e
com campo escuro;
- estufa bacteriolgica a 3~;
- caixa plstica com tampa, para incubao das lminas em ambiente mido;
- lminas de microscopia de 1mm de espessura, oom reas circulares de 5mm de dimetro;
- laminulas 24 x 60;
- cubas de Coplin para lavagem de lminas.
2.2.1.2. Reagentes:
-

suspenso antignica de T. pallidum cepa Nichols, liofilizada;

acetona, p.a.;
conjugado fluorescente anti IgG humana;
reagente absorvente;
soluo salina tampanada oom fosfatos 0,01M, pH 7,2 (PBS);
soluo estoque de ~ul de Evans a 0,01 g%;
PBS com Tween 80 a 1%;
glicerina alcalina (9 partes de glicerina, uma parte de tampo car1Jonato-blcarbonato de sdio, O,SM,
pH 8,5).
22.1.3. Soros controle

a) soro reagente;
b) soro no reagente;

16

c) soro de reatividade mnima (1 +);

d) SOfO positivo falso. testados contra soros de um laboratriO de referncia.
2.2.1.4. Procedimento:
Preparo das lminas:
Reconstituir a suspenso liofi1izada de treponemas segundo as instrues do fabricante. Homogeneizar
delicadamente, com pequena seringa e agulha fina, para disperso completa dos treponemas. que deve ser
rootrolada por microscopia de campo escuro. Colocar uma gota da suspenso em cada rea circular da l
mina, aspirando todo o excesso, ficando uma pelcula de lquido sobre toda a rea (lminas bem limpas e
desengorduradas). Acertar a diluio final da suspenso para se obter de 30 a 40 treponemas por campo mi
croscpico (45x).
Secar as lminas ao ar por 15 minutos. imergi-Ias em acetona por 10 minutos (esta fixao opcional),
secar, embrulhar em papel e conservar a -2QQC at o uso. A reatividade de cada lote de lminas deve sef verificada atravs de testes com os soros controle.
Teste:
Retirar as lminas do congelador e aquec-Ias ligeiramente com jato de ar quente, para impedir condensao de gua do ar ambiente.
Diluir os soros, inalivados, a 1:5 com o reagente absorvente (0,05ml de soro + O,2ml de absorvente).
Misturar bem, transferir uma gota (30","1) de cada soro diluido para uma rea correspondente da lmina. Incluir
os soros controle reagente. de reao mnima, e no reagente, diludos segundo as instrues que os acom
panham, bem como uma rea apenas com soluo salina, para controle do conjugado. Incluir tambm o soro
controle falso-positivo, contendo apenas antiCOlPOS de grupo, no especficos. Este soro deve ser Includo diludo a 1/5 em soluo salina, que deve resultar positivo, e diludo a 1/5 em "absorvente", que deve resultar
negativo. Incubar as lminas em cmara mida a 37'1C por 30 minutos. Lavar em P8S corrente por 5 segunoos, imergir em cubas com PBS por 5 minutos, duas vezes, escorrer e secar com jato de ar quente ou entre
folhas de papel de filtro, delicadamente, sem atrito.
Adicionar a cada rea, uma gota de conjugado diludo, segundo o ttulo. em PBS-Tween 80 com azul de
Evans a 1mg% (diluir a soluo estoque de azul de Evans a 1:10 em PBS-Tween 80). Incubar novamente por
3) minutos a 379C, lavar as lminas em P8S como acima e, em seguida, rapidamente, em gua destilada.
A diluio de uso do conjugado deve ser determinada no prprio laboratrio e para cada tipo de teste
em que for utilizado. Para esse fim, titula-se um soro reagente com diluies crescentes do conjugado (litulao em 81000 00 chess-titration). OCOlTer que, para as maiores concentraes do conjugado sero 0bservados titulos constantes para o soro, mas que a partir de certa diluio em diante, sero progressivamente
menores. A diluio de uso do conjugado dever estar na zona de reatividade mxima, que fornece os titulos
mais altos do soro, imediatamente antenor diluio que pl"ecede a queda de ttulos.

No exemplo da figura 1, observa-se realividade mxima at a diluio de 1:200 do conjugado, reoomendando-se utilizar nos testes a dilUIo de 1:100. EeVidente que nessa diluio no dever haver qualquer c0lorao nas reaes controle. como soro no reagente ou apenas com o diluente, observandcrse reao de
(1 +) com o soro controle de reatividade mnima.

Leitura dos testes:

Os preparados devem ser examinados sob luz branca, em campo escuro, para confirmao da presena
de treponemas, e em seguida por fluorescncia Para os soros reagentes, atribuem-se valores de (1 +) a (4+)
reao, segundo a intensidade da colorao, tendcrse como referncia as reaes de um soro rontrole fortemente reagente (4+) e do soro controle de reabvidade mnima (1 +). Reaes duvidosas (), de treponemas no limiar da viSibilidade, de colorao mUlto discreta e sem brilho, ou negativas (O), em que os trepone-

17

Tnulodo soro

1.600

800

400

200

100

25

50

100

200

400

800

DiluiO do
conjugado

Fig. 1 - Titulao do CooJugado

mas no so visualizados fluorescncia embora observados ao exame de campo escuro, correspondem a

soros no reagentes. Testes com (1 +) ou (~) devem ser repetidos em nova amostra de soro, para confirmao do resultado.
Expresso dos resultados do teste FT AABS
Leitura

Intensidade de fluorescncia

Resultado

4+
3+
2+

Muito intensa
Intensa

1+

Equivalente ao oontrole de reatividade mnima

Realividade mnima

Colorao no limiar de visibilidade

Ausente

No reagente

<1+ (~)
O

Reagente

Moderada

2.22. Teste de microemaglutinao (MHATP)

Em placas plsticas de microtitulao, diluies de soros previamente tratados com reagente absorvente para remover reaes inespecficas, so incubadas oom suspenso de hemcias recobertas com antgenos
do T. pallidum Para os soros reagentes observa-se aglutinao das hemcias, que fonnam um tapete nas
paredes das cavidades da placa Para os soros no reagentes as hemcias no se aglutinam e depositam-se
oomo um boto no fundo das cavidades.
Dois tipos de reagentes so mais oomuns. O teste ~SeraTekTreponemaJ Antibody~ (Ames Division, Mi
les Laboratories, Inc., USA) utiliza hemcias de carneiro em suspenso liofilizada e placas com cavidades de
fundo redondo. O teste "Hemapalhdum- (Biolab Diagnstica S/A, Brasil), emprega hemcias de aves em

18

suspenso lquida e placas com cavidades cnicas. A execuo. leitura e interpretao dos testes devem
obedecer rigorosamente s instrues oos fabricantes. Contanoo com reagentes j padroniza:1os na ongem,
o teste MHATP no solicita os cuidados de padronizao que o teste FTA-ABS exige em cooa laboratrio e
assIm est menos sujeito a variaes Inter-Iaboratrios.
2.3. Interpretao dos testes sorolgicos
Os testes de cardiolipina tm elevada sensibilidade, de cerca de 70 a 80% na sfilis primria e praticamente total nas sfilis secundria e latente recente. J na sfilis tardia, sintomtica ou no. a sensibilidade fica em torno de 70%. Alm das vantagens de fcil execuo e baixo custo. os testes de cardiolipina permitem
o acompanhamento da teraputica, atravs das variaes de ttulos e mesmo negativao. Entretanto, estes
testes esto sujeitos a resultados positivos falsos, as chamadas reaes fal~itivas biolgicas, observadas em vrias patologias em porcentagens que variam de 3 a 40% ou mais. Desse modo, com freqncia
seus resultados positivos precisam ser confirmados pelos testes treponmicos, cuja especificidade da ordem de 99%. Os testes de cardiolipina so, pois, considerados como de primeira linha na sorologia da sfilis,
enquanto que os testes treponmicos. de maior custo e complexidade. devem ser utilizados somente como
testes confirmatrios de testes lipidicos positivos. Outra eventualidade para seu uso nos casos clinicamente ~uspeitos de sfilis tardia com testes de cardiolipina negativos, fase da doena em que os testes treponmicos mostram sensibilidade de 98% ou mais.
Desde que os anticorpos treponmicos tendem a permanecer mais longamente do que os antIcorpos
lipdicos e quando respondem teraputica o fazem muito lentamente, no h interesse em sua titulao.
Assim, somente realizam-se testes treponmicos qualitativos.
O quadro 1 indica as interpretaes possiveis dos resultados de testes sorolgicos para a sfilis.
necessrio ter em mente que os resultados dos testes sorolgicos fornecem resultados de probabilidade que juntamente com os dados clinicos iro contribuir para o diagnstico. Tambm, os testes atuais no
permitem distinguir entre sfilis ativa (tratada ou no) e sfilis inativa (adequadamente tratada).
QUADRO 1
SFILIS -INTERPRETAO DE RESULTADOS SOROLGICOS
Testes

Concluso

De Cardiolipina

Treponmicos

Reagente

Reagente

Sfilis

Reagente

No reagente

Teste

No reagente

Reagente

Sfilis primria
Sfilis tardia
Sfilis tratada
Teste fal~negativo (prozona)
Teste falSQi>OSitivo

No reagente

No reagente

Ausncia de sfilis
Sifilis pr-sorolgica

19

fat~positivo

biolgico

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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20

MDULO II
DIAGNSTICO LABORATORIAL DA GDNORR~IA

21

GONORRIA

Doera de transmlssiCl sexual causada pela bactria Neisseria gonorrhoeae, epidmica. incidncia
elevada entre adolescentes e adultos jovens. Apesar de ser uma doena infecciosa pnmariamente do trato
lX'Og8Oital, pode 8vauir piYa ccmpIicaes tais corro sapingites. bartolinites, epKlfdimites. abcessos parill&trais e disseminar sob a fama de a1rites. leses OJtneas e septicemia. A N. gonorrhoeae pode ainda inlectar as mucosas anal, do orofaringe e da oonjuntiva

23

MDULO II
DIAGNSTICO LABORATORIAL DA GONORRIA

1. COLHEITA DA AMOSTRA CLNICA

o diagnstico laboratorial da gonorria, depende da demonstrao de diplOCOC:OS Gram-negalivos em

esfregaos CO(ados e da identificao da N. Gonorrhoeae em meios de cultura especificos.
A eficcia do diagnstico depende de como a amostra foi colhida, preservada, transportada e semeada
1.1. Colheita de amostra na mulher
1.1.1. Canal endocervical ( o melhor local para colheita):
a) Introduzir o espculo vaginal esterilizado, umedecido com gua; no usar lubrificantes porque estes

b)
c)
d)

e)

inibem o crescimento dos gonococos;

remover o muco cervical com algodo esterilizado, sustentando-o com uma pina;
introduzir o "swab~ (zaragataa) esterilizado no canal endocervicaJ; girar delicadamente, aguardar 10 a
30 segundos e retirar;
semear a amostra em meio de cultura (tipo Thayer Martin), ou conlonTl8 o caso, acondicionar em
meio de transporte (tipo Amies);
repelir o procedimento com novo "swab" (zaragatoa) e fazer dois esfregaos em lminas j)feviamente limpas e identificadas.

1.1.2. Canal anal

a)
b)
c)
d)

Introduzir o ~swab" (zaragatoa) esterilizado no canal anal;

girar o "swab~ (zaragatoa) de um lado para outro, deixando 10 a 30 segundos nessa regio;
fazer como na letra d do item 1.1.1;
repetir o procedimento caso O"swab (zaragatoa) toque nas fezes.
M

1.1.3. Canal uretral (a cultura Indicada em casos sugestivos de urelrite elou em pacientes adultas
sem endocrvice, submetidas histerectomia).
a) comprimir a uretra, pressionando oom o dedo mdio atravs da parede vaginal, de modo a expulsar
a seaeo das glndulas para-uretrais.
Usar "swab" (zaragatoa) esterilizado para obter a amostra.
b) proceder como no item 1.1.1, letras d e e.
1.1.4. Canal vaginal (a cultura indicada para crianas quando se torna Impossvel a obteno de
amostra do endocrvice).
a) introduzir o Mswab" (zaragatoa) na vagina, girar delicadamente, deixando nessa regio durante 10 a
30 segundos, retirando em seguida;
b) proceder como no item 1.1.1, letras d e e.

25

1.1.5. Orofaringe (a cultura recomendada quando h suspeita de infeco gonoccica disseminada

e em indivduos que praticam o sexo oral).
a) aplicar o ~swab" (zaragatoa) na farll'lge posterior e nas cnptas tonsllares;
b) proceder como no item 1.1.1, letra d

1.2. Colheita de amostra no homem

1.2.1. Canal uretral
a) realizar uma anti-sepsia de glande e meato uretral extemo com auxilio de gaze esterilizada umedecida em soluo fisiolgica esterilizada;
b) introduzir o ~swab" (zaragatoa) na uretra cerca de 1 a 2cm, girando-o delicadamente, retir-lo a seguir;
c) preparar dois esfregaos, identificando-os cOfretamente;
d) colher amostra para cultura, conforme O item 1.1.1, letra d, caso haja suspeita clnica de resistncia
a antibiticos.
Obs.: Havendo dificuldades de se recuperar a N. gonorrhoeae das amostras citadas, utilizar uma ou mais
das seguintes alternativas para cultura e bacterioscopia:
- sedimento do primeiro jato da primeira urina da manh;
- secreo uretra! obtida introduzindo "swab" 1-2cm na uretra, girando-o de um lado para outro.

2. EXAME BACTERIOSCPICO DIRETO

o exame bacteriosc6pico direto feito da amostra clnica recm-colhida do paciente. um exame presuntivo, mas que pode ter valor de diagnstico em uretrites gonoccicas, sobretudo a masculina; ern todas as
demais manifestaes da gonorria faz-se necessrio o exame compf"Obatfio da cultura.
2.1. Preparo do Esfregao
A lmina de vidro para microscopia deve estar limpa, desengc>fdll'ada sem arranhes e previamente
identificada:
realizar o esfregao da secreo, cuidando-se para obedecer as margens da lmina (figura 5);
fazer um esfregao homogneo no denso, girando o "swab" (zaragatoa) delicadamente sobre a superficie central da lmina (figura 5);
deixar secar temperatura ambiente;
passar a lmina trs vezes sobre a chama do bico de 8unsen, para lix-lo, no permitindo que a lmina aquea excessivamente.
Figura 5
Preparo do Eslregao

/r---==/~=====~:::::"

____/l/.-IL..----'-:argL

~/==,==/=====!II

26

da

Lm,,"

22 CoIOfao pelo mtodo de Gram (Anexo I: Prepa'"o dos Reagentes):

cobnr o esfregao com aistal ~oleta por 1 mil"lJto;

lavar em gua corrente;
colocar a soluo de lugol por 1 miruto;
lavar em gua corrente;
descorar com lcool- acetona 1:1;
lavar em gua corrente;
cobnr o esfregao com soluo de fuccjna 1: 1O durante 30 segundos;
lavar rapidamente em gua corrente. Deixar secar temperatlJa ambiente.

2.3. leitura das lminas:

examinar o esfregao ps colOl'ao de Gram, utilizando a objetiva de Imerso (alm8nto de 100 x) do
mittoscpio;
observar vrios campos mlCfoscplros, para se ter uma \I1so global da amostra;
anotar em livro de regIStro apropriado as estruturas morfolintonaJS observadas (micmorganismos e
clulas), quantlllC8tldo-as;
liberar os laudos, conforme onentao assinalada no item 6, deste Manual.

3. SEMEADURA DA AMOSTRA CLNICA

3.1. Meios de cultura comumente usados:

Thayer-MartlO mOOificado (Anexo 02);
Martin-LewIs.

As placas de Petri (80 x 15mm), contendo meio de cultura, devem ser guardadas 49C (refrigerador)
sempre protegidas em saco plstICO. Elas devem ser colocadas com a tampa da placa voltada para baixo e
devem ser usadas antes da data de expirao.
Antes da Incubao das amostras, as placas devem estar temperaI... arrb4enle (22-259(;).

32. Tcnica de Semeadura:

girar o ~swab~ (zaragatoa) na superfCie do meio em forma de Z (figura 01);
usar uma ala bacteriolgica de platina, espalhar o material semeado na placa. fazendo estrias pr6xtmas umas das outras (fig.xa 2).

3.3. Incubao das Placas:

colocar as placas, com as tampas para baixo, em cmera mida de mlCt'Oaerofilia (5 a 10% de CO.t)
ou em -jarra da vela-. Utilizando a -jarra da vela- fechar a lata hennetlCllT'ler'lte, contendo no seu interIOr uma vela acesa e uma chumao de algodo embeb+do em gua (figura 3).

27

w~.~...::
.','.'.':.~.':;.~:.'."':":
,o'::' '.:;:. ~..'

Incubar as placas na estufa a 35-369C, durante 24 a 48 horas.

4. IDENTIFICAO PRESUNTlVA

Examinar o aspecto morfolgico das colnias;

No isolamento recente, as colnias de gonococos geralmente so brilhantes. mueides, acinzenta-

dos, de tamanho varivel;

Realizar o teste de cilocrol'Tl(H)xidase (anexo 03);
"pescar" uma colnia, fazer esfregao e corar pelo mtodo de Gram;
o resultado presuntivo, informar que a bactria isolada pertence ao gnero Neisseria. se o teste de
oxidase for positivo e a bacterioscopia revelar presena de cocos Gramnegalivos na CU1t1l'8.
5. IDENTIFICAO DEFINITIVA

Dividir uma placa de Thayer Martin em quatro quadrantes. Repicar em cada quadrante, uma colnia
da Neisseria isolada para o resultado presuntivo (figura 04);
incubar por 24 a 48 horas. a temperatura de 35 a 3G9C;
fazer esfregao do material de cada quadrante e corar pelo mtoclo de Gram;
na leitura da bacterioscopia ps colorao de Gram, verificar se a cultlJ'a est pISa, pela presena
exclusiva de cocos Gram-negativos;
realizar o teste de metabohzao de carboldratos (anexo 04);

28

Figura 4
Repicagem na placa dividida em quadrantes

O resultado definitivo informar que a bactria isolada. no meio de Thayer Martin, a Neisseria gonormoeae. porque metabalizou apenas o carboidrato glicose.

6. LIBERAO DOS LAUDOS

6.1. Bacterioscopia
6.1.1. Resultado negativo
Informar o seguinte: "No foram encontraoos diplcx:ocos Gram-negativos ao exame bacterioscpico ps
colorao de Gram.
6.1.2. Resultado positivo
No resultado positivo importante informar a quantidade de diplococos Gram-negativos e o nmero de
lelK:Citos polimorfonucleares por campo. Assim: MPresena de numerosos (ou vrios, ou alguns, ou raros) di
p10c:0c0s Gramnegalivos intracelulares (eJou extracelulares). Polimorfonucleares acima de 30 por campo (ou:
entre 20-25 pie; entre 15 a 20 pie; entre 10 a 15 plc; entre 5 a 10 pie e abaixo de 05 por campo)".
Poder-se- liberar um laudo mais detalhado relatando a visualizao de outras formas microbianas, c0mo: cocos Gram-posilivos, Bacilos Gramnegativos, Bacilos Gram-positivos, estruturas leveduriformes, etc.
6.2. Cultura
6.2.1. Resultado negativo
Dizer que no houve crescimento de Neisseria gonorrhoeae em meio de T. Martin aps 48 horas de
obse<vao.

622. Resultado positivo

Carimbar o laudo, assim: Crescimento de Neisseria gonorrhoeae.

7. PESQUISA DE N. Gonorrhoeae RESISTENTE A ANTIBiTICOS BETA-lACTMICOS

Vrios testes laboratoriais para deteco de N. gonorrhoeae resistente penicilina e seus anlogos,
tm sido empregados em exames de rotina Os testes acidomtrico, iodomtrico e da cefalosporina cromognica so especficos para a deteco da enzima Beta-Iaetamase. O teste da difuso em gar, utililizan
do-se discos de antibiticos em coocentra8S padronizadas (Mtodos de KirbyBauer) pode revelar r&

29

sistncia bacteriana a antibiticos, o que correlaciona-se com a presena da Betalactamase no microorganismo testado (Haemophylus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus), entretanto,
este teste dever ser confirmado atravs de um dos trs mtodos para a pesquisa da enzima Beta-lactama-

se.

Esta pesquisa dever ser feita a partir de cultura pura e jamais diretamente das secrees.
labofatrio dever possuir cepas controles. positivas e negativas, que devero ser testadas juntamente com as cepas dos pacientes em estudo.

7.1 Teste lodomtrico rpido

Penicilina Sdica ou Penicilina G Potssica
Adicione Penicilina sdica ou Penicilina G potssica em p a um tampo fosfato recente para obter s0luo com concentrao final de 6.000 UVml. Pequenas pores desta soluo podem ser distribudas em
pequenos tubos e guardadas na temperatura de "209C. No utilizar oongeladores "frost-free". Pequenas
pores podem ser descongeladas e usadas pelo perodo de uma semana
Tampo de Fosfato pH 6.0
SOluo A: KH,PO

Agua destilada

. 0,9079
100ml

Soluo B: Na2 HP04 O,946g

gua destilada
100ml
Misture 87,7ml da Soluo A e 12,3ml da Soluo B. Esta soluo estvel por vrias semanas temperatura ambiente.
Soluo de Penicilina
Penicilina (p) ..............................
O,5g
Tampo fosfato
. 83,OmI
Concentrao de 6.000u/ml. Esterilize a soluo de penicilina atravs do filtro O,22-u

ou 0,45u.

Soluo do amido
Amido ........................................
1,09
gua destilada esterilizada ........................... 1oo.0m1
Misture o amido com gua destilada e ooloque em banho maria at o amido se dissolver. Guarde no refrigerado< !lO< at 02 dias.
SoluAo de lodo
lodo ...........................................
2,039
Iodeto de potssio ..............................
5329
gua destilada esterilizada
. 1oo.0m1

Dissolva os. ingredientes em gua destilada. Annazene em garrafas escuras. Prepare soluo nova se

oouver prec1pllaAo.

30

Teste
1. Dispense 0,1 mi da soluo de penicilina em um tubo pequeno ou mlCl'~aca.
2. Remova as cok;rllas puras do microorganlsmo e faa uma suspenso na soluo de penicilina MIsture por 30 segundos e deixe a mIstura permanecer IX!"" 1 hora em temperatura ambiente a fim de
que a Beta-Iactamase quebre o anel Beta-lactmlCO. O H. influenzae e a N. gonorrhoeae normalmente no requerem 1 hora de incubao, mas os estafllococos requerem.
3. Achctone 3 gotas da soluo de amido, suspenso e misture bem.
4. AdICione 1 gota do iodo oom pipeta PasteLr. A soluo ri se tomar escura devido a reao do iodo
oom o armdo. Caso o lOdo seja adicionado prematuramente a reao enzimtica pode parar gerando
resultado falso-negatlVO.
5. AgIte a mistura IX!"" 1 minuto. A desco6orao rpida Indica pnxkJo de B-lactamase. Se a soluo
permanecer escura. o teste negativo.
6. Faa o teste usand:> o con~ positIVO e negativo.
Vantagens:

resultado rpido;
reagentes disponveIS e baratos;
fcil de fazer.
culh...-a OliglnaJ pode ser usada caso haja oolnlas Isoladas de N. gonorrtloeae;
fcil de ler.

Desvantagens:
mUitas lases;
reagentes instveis;
no pode testar secreo uretral, vaginal e cervical diretamente.
7.2. Teste acidomtrico rpido
1. Prepare soluo de vermelho de fenol a 0,5%. Dissolva 1.0g de vermelho de fenol em 3Om1 de
NaOH 1N q.s.p. para 200ml rom gua destilada
2. Adicione 2.0ml da soluo vermelho de fenol em 16.6ml de gua destilada esterilizada.
3. Coloque esta soluo em um frasco contendo 20 milhes de unidades de penicilina G potssica
necessrio tamponar; muitas preparaes contm tampo citrato, o que adequado para o teste.
4. Adicione NaOH gota aps gota at que pH seja 8.5. A soluo se tomar vermelha escura.
5. Dividir a soluo em aliquotas pequenas, congele a -2Q9C.
Teste

1. Coloque O,SrnI para 0,1ml do substrato de penicilina em um tubo pequeno. Remova vrias colnias
oom a aJa e faa uma soluo turva no substrato.
2. se a cultura produzir Beta-Iactamase a soluo se tomar amarela A mudana da cor ooorrer em 1
mmuto.
3. Faa o teste usando lMT1 controle positivo e um controle negativo.
Vantagens:
resultado rpido e possvel no mesmo dia se a culhxa estIVer pronta;
reagente disponvel e barato;
fcil de fazer;

somente uma lase;

31

 reagente menos estvel do que o teste iodomtrico;

placas original podem SElf usadas caso haja colnias isoladas.
Desvantagens:
requer ajustamento correto do pH;
o ponto final algumas vezes difcil de definir.
7.3. Teste da Cefalosporina Cromognica
1. Dissolva 10mg da cefalosporina 87/312 em lml de dimetrylsulfoxido (DMSO). Oiluir com PBS (pH
7.0) a uma concentrao de 5OOgIml. A soluo estvel na temperatura de 4 - 109C durante vrias
semanas.
Prepare o PBS (pH 7.0) da seguinte maneira:
SOluo A: ~H2PO~
Agua destilada

. 0,9079
looml

Soluo B: Na,HPO. . ..... 0.946g

gua destilada
looml
Misture 392ml da soluo A (fosfato monopotssico) com 6O,8ml da soluo B (fosfato dissdioo).
Teste

1. Coloque 0,05011 do substrato de cefalosporina em um tubo pequeno ou lITla microplaca.

2. Usando a ala bacteriolgica remova colnias do microorganismo a ser testado. Faa uma sus
penso densa na soluo de cefalosporina
3. Misture por 1 minuto. ObselVe se h mudana de cor aps 10 minutos, e aps 1 hora
4. O teste lX>Sitivo indicado pela mudana de COI" do substrato de amarelo para vennelho. Cepas de
N. gonorrhoeae e H. influenzae produtores de Betalaetamase, normalmente produziro mudana
de COI" em menos de 10 minutos.
5. Faa o teste com controles positivos e negativos.
Vantagens:

pode ser usado no trabalho de campo, simples, fcil de fazer;

reagentes so estveis;
resultados disponveis no mesmo dia da roltura;
o teste pode ser feito nas placas de agar.

Desvantagens
dificuldade para encontrar a cefalosporina cromognica.

8. ESTOCAGEM DE NElSSERIA GONORRHOEAE

Repicar a cultura pura obtida no meio de Thayer Martin Modificado (TMM) em placa de agar chocola
le;
Incubar por 24 horas, a 35 - 3G9C;
Fazer esfregao e Gram para confinnar a pureza da cultura;

32

a} Cultura padro:
semear a cultura padro no agar chocolate; incubar a 35 - 369C durante 16 - 20 horas em CO 2 ;
preparar uma suspenso do crescimento bacteriano em 0,5mt de caldo trypticase e mistlJ'a- bem; adicionar 0,2ml desta suspenso em 4,5ml do mesmo caldo. MIsturar bem para formar uma suspenso

homognea;
ajustar o aparelho para uma opacidade que cai entre 45% % 5% (transmisso de luz) em 530nm, ou
a equivalente ao n9 2 da escala padro de McFarland;
preparar as diluies de cada cultura (45% 5%) da suspenso lestada
Preparar uma suspenso densa em quatro partes de caldo TSB e uma parte de glicerina, misture
bem. Distribua alquotas de 0,5 a 1mi em tubos apropriados para estocagem;
Congelar a -7Q9C;
Repica- as amostras estocadas aps 6 meses, em gar chocolate. No use o meio de TMM para rEr
cuperar amostras congeladas, mas gar chocolate enriquecido e sem inibicb"es.

9. CONTROLE DE QUALIDADE NO LABORATRIO DE DST

9.1. Controle de qualidade do Mtodo de Gram

Microorganismos necessrios:
Neisseria gonorrhoeae;
Staphycoccus epidermidis.
Procedimento:
1.
2.
3.
4.
5.

colocar uma gota de soluo fisiolgica na lmina;

retirar uma colnia suspeita de N. gonorrhoeae e fazer o esfregao;
repetir os itens 1 e 2, usando a colma suspeita de S. epidermidis;
corar os esfregaos pelo Gram;
observar no microscpio a morfologia e colorao:
N. gonorrhoeae = cocos Gram - negativos;
S. epidermidis cocos Gram - positivos.

6. caso a colorao no seja especifica, verifique os reagentes e reavalie a tcnica de elaborao do

esfregao elou da colorao.

92. Conlrole de qualidade do meio de Thayer Martin Modificado (TMM)

Microorganismos necessrios:

Cepas-padro de Neisseria gonorrhoeae dependentes de CO 2 ;

Neisseria meningitidis;
Proteus sp;
Escherichia col~
Staphylococcus epidermidis;
Neisseria sicca;
Cndida albicans.

33

Meios de cultura utilizados:

Agar chocolate;
Thayer Martin Modificado;
Caldo TryptlCilS8 de Soja (TSB)
Procedimento:
determinar a DiluIo tlma do lnculo (001) para cada mtCfOOl'ganlsmo a ser lestado (o inculo dever f~ 50 a 100 cotnlas no gar chocolate, usando ala bacteool6goca de 3mm).
Exemplo:
TUBO
N'
1

2
3
4
5

TSB

SUSPENSO DA CULTURA

4,5ml
4,Sml
4,5m1
4,5m1
4,5ml
4,5m1

0,5ml
0,5ml
0,5ml
O,5m1
O,5m1
O,5m1

da suspenso a (45%
do tubo 1
do tubo 2
do tubo 3
do tubo 4
do tubo 5

:t

DILUiO DO INOCUlUM
5%)

1:10
1:100
1:1000
1:10.000
1:100.000
1:1000.000

(1l),')
(10')
(10')
(10")
(10')
(10")

a) loocular as placas de gN chocolate usando uma ala de 3rnm pMa cada diluIo;
b) examinar as ptacas aps 16 - 20 horas. A diluIo de 1<t3 00 1<t' satisfatria para grande parte
dos mK:roorganlsmos;
c) loocular a ptaca conlr06e do ooyo lote de T. Martin Moclificado com uma ala bactenolgca de 3mm;
d) repeti" o pnx:edll1l8flto em ptacas de agar chocolate com as mesmas diluIeS para verihcar a viabt
hdade do metO;
e) Incubar em atmosfera de C02, a 35-369C por 24 - 48 horas;
f) examinar as culturas, comparar o aescllnento, a inibIo do crescimento, a reao de oxlctase na
placa controle e nas outras placas, registrando lodos OS dados em fichas apropriadas;
g) se necessrio revisar os achados e determinar se o novo meio reune os cnlnos de aceitao.

Outros microorganismos
Para os demais microorganlsmos (Proteus sp, E. coli, S. epidermidis, N. sicca. C. albicans), basta
utlhzar a diluio 10.3 00 10' (escala,,9 2 de McFarland); faa oomo est indicado nas lelras C, d, e, da cul
tura padro. Estes miaoorganlsmos devero ter aescimenlo inibido no meio de TMM.

92.1. Preparo da Escala Padro de McFarland

1. Coloque 10 tlb:ls em lJTl8 estante, marqu&OS de 1 alO.
2, AdIClOllO a segUinte quanUdado da soluo cloreto de bno (1%):
Tubo n2
Tubo n9
Tlbo n9
Tubo n9

O,lml
0,2rrj
O,3m1
0,4ml
O,5m1

2
3
4

Tubo n9 5
TuIxl n9 6
Tubo n9 7
Tubo n9 8

O,6m!
O,7m!

Tubo n' 9
Tubo n9 10

O,Bml

O,6m1
l,OmI

34

3. Adicione em cada tubo quantidade suficiente de soluao de cido sulfrico (1%) at completar 10ml

de soluo.
4. Feche bem os tubos e ~ com parafina
5. Quando o pr8CIpllado de "" branca (sulfato de bno) se forma" em cada tubo, a densidade deles

ser dJferente.
6. A densidade de cada tubo corresponde aproxImadamente ao S8Qlunte rnero de bactrias por mil:

N01
NO
NO
NO
NO
NO
NO

N'
NO

N9

JOO.lXXl
2
6OO.lXXl
3
9OO.lXXl
4
1200.lXXl
5
1.500.lXXl
6
1.800.lXXl
7
2.100.lXXl
2.400.lXXl
8
9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2.700.000
10 .. .. . .. .. . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . .. . .. .. 3.lXXl.OOO

Notas:
Quando a curva acnna for usada para comparar OU ajustar suspenso bacteriana em caldo, prepare s0luo de cido sulfunco a (1%) no mesmo caldo.

Os tubos devem ser do mesmo lamartD.

TESTE PARA CRESCIMENTO

ai Cultura padro
ORGANISMO CEPA

NO 001

MEIO AMBIENTE NOVO MEIO

VIABlUDADE
24hs
48hs 24hs
AC
48hs

CO,
DEPEN

OXIlASE

1. N. gorooIloeae
2. N. gorooIloeae
3. N. gorooIloeae
4. N. gorooIloeae
5.N.gonontloeae

6.N.gooorrhoeae
7. N. gonorrhoeae
8. N. menlngltidis
TESTE PARA INIBiO DE SAPRFITAS
b) Outros microorganismos

MICROORGANISMO
CEPA

VIABlUDADE
AC

00

1. Proteus spp
2. E. coli

3. S. epidermidis
4. N. sicca
5. C. albicans
Responsvel pelo lesle:

Data

35

MEIO CONTROUE

NOVO CONTROlE

9.3 Controle de qualidade dos Carboidratos

Mlcroorganlsmos necessrios:

Neisseria gonoohoeae;
Neisseria meningitidis;
Neisseria laetmica;
Neisseria sicca.

Procedimentos:
pl'"eparar 4 baterias contendo os seguintes acares: glicose, lactose, Ievulose (frutose), maltose e
sacarose;
semear em cada bateria uma das neissarias acima;
incubar a 35-3~C, pCN' 24 horas, sem tenso de CO2 ;
anotar a utilizao de acar em cada bateria resultado dever ser o seguinte:

- N. gonorrhoeae
- N. meningitidis
- N. lactmica
N. sicca

= glicose +
= glicose e maltose

= glicose, maltose e lactose ou (ONPG) +

= glicose, levulose, maltose e sacrose +.

9.4. Controle de qualidade da prova de oxidase

MicrOCX'ganismos utilizados:
Neisseria sp;
Staphylococcus sp.
Aspecto do reagente:

Sem sinais visves de oxidao.

Procedimentos:
pingar uma gota do reagente de oxidase em duas tiras de papel de filtro;
em uma das tiras passar uma colnia de neisseria sp e, na outra, uma colnia de Staphylococcus
sp, com auxlio de uma ala de platina (no utilizar ala de niquel cromo ou similar);
o teste ser considerado satisfatrio se aparecer cor rosada na tira contendo Neisseria sp e nenhuma alterao de cor na tira contendo Staphylococcus sp.

ANEXO I
REAGENTES PARA COLORAO DE GRAM

1. Soluo de CristalVioleta modificada por Hucker,

Soluo A:
2,0g

Cristal Violeta
lcool etlico PA

2Om1

36

Soluo B:
Oxalato de amnia
gua deslllada

O,Sg
BOmI

Aps 24 horas, misturar a soluo A com a soluo B. Estocar em garrafas de vidro de ror mbar.
2. Soluo de Lugol (soluo estoque).
lodo P.A......................................
Iodeto de potssio
gua destilada

1,09
.
2,09
. 200ml

Colocar O iodo e o Iodeto dentro de um graal, adiCionar o lodo e triturar IX>'" 10-30 segundos. Adicionar
1mi de gua destilada, triturar, acrescentar mais 5ml de gua destilada, triturar, adicionar lOmI de gua desttlada e triturar. Colocar a soluo de todoIiodeto de potSSIO numa proveta e completar Ovolume para 200m!.
Guardar em frascos l"{lbar.
Para uso, dilUir a soluo estoque em 1:15 de gua destilada.
3. lcool - Acetona:
lcool etilico PA
250m!
Acetona P.A. ........................................ 250ml
Misturar e estocar em frasco de vidro.

ANEXO II
MEIO OE CULTURA DE THAYER MARTIN MODIFICADO (TMM)
Preparao (1 litro)
1. Preparar a soluo de hemoglobina a 2% da seguinte maneira; suspender 1Og de hemoglobina desidratada em 500ml de gua destilada, misturar bem por 10 minutos. Filtrar a soluo de hemoglobina
atravs de gaze;
2. Pesar 36g do meio base para gonococo (GC) e 10g de gar pUrifiCado, misturar, suspender em 500m1 de
gua destilada. Levar ao banho-maria fervente para clarificao do agar;
3. Autoclavar a soluo de hemoglobina e o meio GC agar, em frascos separados, a 121 9C, por 15 minutos;
4. Esfriar o material a uma temperatura de 5S9C, mantendo-o em banho-maria regulado;
5. parte, reconstituir a soluo de antibiticos VCNT (Vancomicina, colistina, nistatina e lrimetropina) em
gua destilada esterilizada e deixar repousar durante 20 minutos;
6. ReconstitUir o suplemento VX com o liquido reldratante; agitar bem para se obter soluo homognea;
7. Assepticamente, adicionar 10ml dos antibiticos, 10ml do suplemento VX, 5ml de soluo de glicose a
2,5% esterilizada (por vapor fluente ou filtrao), ao meio base GC agar, misturando suavemente;
8. Acrescentar a soluo de hemoglobina no meio GC agar, delicadamente para se evitar formao de b0lhas. Homogeneizar. Medir o pH, que deve ser de 7,2 0,2;
9. Distribuir 15 a 20ml do meio TMM em placas de Petri;
10. Deixar as placas em temperatura ambiente por uma noite. Retirar uma amostragem de cada lote e incubar em estufa a 23-2f1C e 35-JG9C por at uma semana;
11. Acondicionar as placas em sacos plsticos e estoc-Ias em refrigerador por at 3 semanas;
12. Preencher a Ficha de Controle de Qualidade do Meio de TMM e anotar os dados sobre o leste esterilidade e aparncia do meio. (ver abaixo).

37

FICHA DE CONTROLE DE QUALIDADE

Thayer Martin Modificado

NO do lote:
Dala do

Data do teste
Data 00 resultado

preparo
INGREDIENTES

MARCA
GC-Base

MARCA

NO DO LOTE

NO DO LOTE

VCN

gar
Hemoglobina
Suplemento VX

DEXTROSE

TESTE DE ESTERILIDADE
INCUBAO POR UMA SEMANA

23 - 27"C

35 - :J69C

AC

AC

APAR~NCIA
CONSIST~NCIA"
HOMOGENEIDADE"
UMIDADE"
OUTROS
(ESPECIFICAR)

pH a 56'C
( ) ( )
( ) ( )
( ) ( )

MEIO~
( ) ACEITVEL
( ) No ACEITVEL
DATA DE EXPEDIO

" (+): adequada

(-): InadeqUada

c = Crescimento; AC = Ausncia de crescimento

Nome da pessoa que realizou o teste

ANEXO III
TESTE DA ENZIMA CITOCROMO-OXIDASE

Os citOCfomos so hernoprotelnas que contm feITO e aluam corno o ltimo estgio da cadeia respirat~
ria aerbia, transferindo hidrognio (ellrons) ao oxignio, com loonao de gua. As Neisserias e as muitas espcies de Pseudomonas so oxidase - positivas.
A prova de citocromo-oxidase utiliza certos reatlvos que prodJzem cor e que aluam como receptores de
eltrons, substituindo o oXignIO. A parafenllechamma lrcolor no estado reduzido. mas em presena de CIi:X:rOrl"O-OXidase. o OXignio atmosfrico se oxida e oogina cor rosada
Reagente:

soluo de hldroclorelo de dlmetll-parafenodiamlna a I%. Esta soluo deve ser preparada mensalmente e conseMlda a 49(; (refl'igefa::klr) em frasco mbar.
Procedimentos: (tcnica indlreta)

pingar uma gota do reagente de atoct'OlTl()-()xidase em l.JTla tira de papel de filtro;

retirar uma colnia e espalhar na lira do papel de filtro;
a reao ~ltlva ,machala oom o Sllrglmento de colorao rosa no local onde se espalhou a colnia.

Obs.: utilizar ala de platina no teste.

38

Controles:
positivo: Pseudomonas aerurginosa
negativo: Escherichia coli.

ANEXO IV
METABOLlZAO OOS CARBOIORATOS
A N. gononfloeae uma bactria aerbia que realiza a gliclise atravs da via aerbia ou via metablica de Entner-Douderoff, oxidando a glicose em 6 - fosfogluconato e 2 - ceto - 3 - desoxi - 6 - fosfogluconato, at a formao de cido pirvico. uma reao produtora de energia (ATP) que requer oxignio molecular como receptor final de hidrognlo (eltrons). Entre os carboidratos testados para identificao definitiva
das neisserias. a glicose nico metabalizado pela N. gononfloeae.
1. Preparo dos carboidratos
Em cinco bales numerados adicionar lOOml de gua destilada em 4,3g do meio base desidratado CTA (Cystine trypticase Agar). Misturar e aquecer, at a dissoluo do agar (darificao), em banho-maria;
Adicionar em cada balo um tipo especfico de carboidrato a 1%: glicose, lactose, levulose.
maltose e sacarose;
Distribuir em tubos de rosca de 12 x 12Omm;
Esterilizar por filtrao ou vapor fluente (l()()9C, durante 30 minutos, em autoclave com a
vlvula aberta).
2. Inoculao dos carboidratos
1. Preparar uma bateria contendo os cinco tipos de acares (glicose, lactose, lewlo58, ma~
tose e sacarose), identificando o exame;
2. Inocular uma colnia de Neisseria suspeita, certificando se proveniente de cultura pura;
3. A inoculao deve ser feita em profundidade, no mnimo lcm abaixo da superfcie do meio,
com auxlio de uma ala bacteriolgica;
4. Incubar temperatura de 35-J69C, por 24 e 48 horas. dispensvel a tenso de CC:;
5. Na metabolizao de carboidratos, haver produo de cidos que sero percebidos pela viralJem no indicador de vermelho para amarelo;
6. A prova ser considerada positiva para Neisseria gonorrhoeae se apenas a glicose for
metabolizada.

39

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1.

2.
3.
4.

5.

6.
7.

FRANCH1NI, M.: Procedimentos Laooratoriais no Controle das Doenas Sexualmente

Transmissveis (OSl). Braslia, Instituto de Sade do Distrito Federal, 1983, 1'9. 89.
JACOBS, N.F., KRAUS, S.J.: Gonococcal and nongonococcal urelhfitis in men: Clinical anel
laboratory Oiferentiation Ann Intem. Med., 82:7, 1975.
KONEMAN, e.v. et cels. Diagnstico Microbiolgico. Panamericana, Buenos Aires, Argentina, l'
00., 1983, p. 266267. 386-393.
PHILLlPS, /.: Beta Lactamase producing penicilin resistan: gonococcus. LanceI2:637, 1976.
SIMMOUS, P.D.: Evaluation of lhe carlr and first voided urine 5OOimen! in lhe diagnosis Df

urethritis. sexo Transm. Dis. 5:39. 1978.

U.S. Department of Health and Human Services. Public Hea"h Service. Centers for Disease
Control- Criteria aOO Techniques for the diagnoses of Gonormea 1983. 4 p.
U.S. Department Df Health aOO Human Services. Pubfic Health Service. Centers for Disease
Controf. Procedures for use by the /aboratory in the isofation and identification Neisseria
gonorrhoeaea. 1983, 38 p.

40

MDULO 111
DIAGNSTICO LABORATORIAL OE DOENAS DE
TRANSMISSO SEXUAL NO-GONOC6cICA

41

DIAGNSTICO LABORATORIAL DE DOENAS DE

TRANSMISSO SEXUAL NCl-GONOCCICA
Corriqueiramente, um servio laboratorial voltado para o diagnOstico de Doenas Sexualmente Transmissveis (05T) atende, essencialmente. os casos de gonorria e sfilis. No entanto, dentro de um contexto
de sade pblica, no se pode desprezar 00 passar para plano secundrio o diagnstico das demais OSlo
Estas Doenas Sexualmente Transmissiveis seriam aquelas responsveis por uretrites, vaginites, wl
\O-vaginites, cervicites, leses e ulceraes na genitria.
verdade que algumas destas doenas exigem tcnicas de diagnstico laboratorial sofisticadas e onerosas, tal como ocorre no linfoganuloma venreo. Vale a pena ressaltar, porm, que muitas delas, seno a

maioria, utilizam-se de recursos simples, senslveis e confiveis. o que ocorre, por exemplo, no uso de bacterioscopia fresco para sugerir uma candidiase ou trichomoniase. A to usual colorao segundo Gram, p0der nos orientar no diagnstico tanto de um cancro mote quanto numa vaginite por Gardnerella vaginalis.
O importante que busquemos implantar novas tcnicas de diagnstico ou aperfeioar as existentes,
lB'a que se possa, eletivamente, oontribuir para o oontrole das Doenas Sexualmente Transmisslveis, em
nosso Pafs.

43

1. CANCRO MOLE
o canao rroIe uma doena de transmisso sexual, cup agente etlolglco, o Haemophylus ducreyi
produz uma ulcerao dolorosa, sumamente contagIOSa, geralmente localizada na genltlia externa.
1.1. Colela da amostra clnica para bacterioscopia:

limpar a lcefa com soluo fisiolgica esterilizada;

colher matenal da regIo ulcerada com auxlIO de um swab- (zwagatoa).
realizar esfregaos (2 a 3), utilizando lminas limpas e secas;
secar temperatlM'a ambtente;
oorar pelo Mtodo de Gram.

1.2. Colela da amostra cllnica para cultura:

Utilizar amostra clnica colhida como paTa bactenoscopt8. semear em agar chocolate enriquecido com
os falOfBS V(NAO) e X (hermna) ou Agar de LevinthaJ e incubar por 24 a 48 horas a 359<:, em atmosfera de 5
a 10% de C02 (cmara de miaoaerofiha). A identificao da bactna se faz pela prova de requerimento de
falores (X OU V) e pela hemlise em agar sangue. A bactria pode crescer bem na gua de rondensao do
meIO de cultura

1.3. Liberao dos laudos:

1.3.1. Bacterioscopia:
A colorao pelo Gram poder revelar pl'esena da bactria nas leses ulceratlvas, quando se obserVar
diminutos bacilos Gram-negativos pieomorficos agrupados com freqncia no interiOf dos leuccitos polimcrfonucleares. Extracetulannente, o Heamophylus poder formar cadeias ou paliadas.

1.3.2. Cultura

o H. ducreyi utiliza o fatar X e gook das cepas produzem hem6lise em gar sangue de ovin:>o

2. OONOVANOSE

uma Infeco usualmente transmltKia pelo oontato sexual. causada peta bactria Calymmatobacterium granulomatis. uma doena de evoluo crmca e de buxa oontaglOSKiade; caracteriza-5e pela presena de ndlJlos StJx:utneos, ganuk>matosos, ulcerados, lndoklres 8 autCHncx:ulveIS; as les6es gerall'T'l8r'l-"
te so encontradas na genltJia. regto perianal e regIo IngUinal.
provvel que a donovanose possa ser transmhda na ausnaa de oontato sexual.

45

2.1. Diagnstico Laboratorial

2.1.1 Bipsia das leses:

Para exames hlstopatolgloos.

2.1.2. Esfregao das leses:

Corados pelo Glemsa ou Wright.

2.1.3. Cultura das leses ou do aspirado dos linfonodos:

o bacilo

C. granulomatis de difcil cultivo. porm pod&se utilizar o

Dient e Brownell base de gemas de ovos frescos.

metO

de cultura descnto por

2.2. Liberao dos laudos

o corrum do diagnstico laboratorial da donovanose dado pelo resultado dos exames bacterioscpices (cortes histolgICOS e esfregaos corados), considerados posItIVOS QUando se visualiza cfulas mooonudeares endoteliais (macrfagos) contendo agrupamentos do bacilo, chamados corpsculos de Oonovan.
3_ VAGINITE POR Gardnerella vaginalis

A G. vaginalis um bacilo Gram-flegativo ou Gram-lbil, pleomr1ICO que normalmente pode

sef

en-

contrado na vagina da mulher adulta, mas que poder ser agente etIOlgICO de vaglnlles ou vaglllOseS. Gef31mente, a G. vaginalis encontra-se associada a bactnas anaE!fblas. (Baeteroides. Mobiluncus ou cocos
anae<btos).

3.1. Diagnstico laboratorial

3.1.1. Teste do hidrxido de polssio:

Em uma lmina de vidro, pIngar uma ou duas gotas de secreo vaginal;

acrescentar uma ou duas gotas de KOH a 10%, misturar com ala bacteriolgica ou palito de madel'
ra;
sentir o odor peixe, que despreendido pela presena de aminas volteis metabollzadas pelas
bactnas anaerblas. Este cheiro caracterstico d como POSItiVO o teste para Gardnerella
3.12. Teste do pH:

A secreo vaginal mostrar uma acidez em tomo de 4,5.

3.1.3. Bacterioscopia do esfregao de secreo vaginal:

Cora' o esfregao pelo Mtodo de Gram;

Observar a presena de clulas-guia ou clulas-ehave (clue cells): clulas epitehals robertas por
diminutos bacilos Gram-negativos (ou Gram-lbeis);
Observar a ausncia ou reduo dos lactobacilos.

3.1.4. Cultura de secreo vaginal:

Utiliza-se
~

l'lleK)

constltuOO de

de cultura seletivo para G. vaginalis como o descnto por Greeowood e colaboradores,

lXJl8 base (aga' ColurrtMa) acresoda de peptona rnefO 3 a 1% de sargue humano a

46

5%, alm de uma soluo de citrato-fosfato-gtioose. A G. vaginalis produz hem6lise Beta

Para Identificar a bactria. utiliza-se provas bioqumicas complementares como o teste da oxidase, catalase, mobilidade, nitrato e metabolizao de carboidratos, entre outros.
3.2. Liberao dos laudos
Em laboratrios de sade pblica, o oomum utilizar o resultado da bacterioscopia (j)(esena de olulas-<:have com reduo ou ausncia de lactobacilos), associado ao resultado positivo do teste de KOH e me-dio do pH em tomo de 4.5, para estabelecer o diagnstico presuntivo deste tipo de vaginite. A identificao
definitiva da G. vaginalis dada pelo crescimento em meio seletivo e pelas provas t)joquimicas comple-mentares.
4. TAICOMONASE
Doera causada pelo protozorio Trichomonas vaginalis na regio ul'OiJ8nital feminina e masculina

uma vulvovaginite muito comum em mulheres adultas.

4.1. Diagnstico laboratorial
4.1.1. Teste do pH vaginal:
Geralmente o pH vaginal estar acima de 5,0. Para fazer o teste, basta oolher uma gota de secreo
vaginal e coloc-Ia numa tira de papel universal de medio de pH.
4.1.2. Exame direto a fresco:
Duas a trs gotas de secreo vaginal ou uretral horrogeneizada em 0,1 a 0,2ml de soluo fisiolgica.
Colocar uma gota da mistura numa lmina, oobrir com lamnula e observar ao microscpio em objetiva de
10x e 4Ox.
4.1.3. Exame citolgico (Papanioorau)
Realizado da secreo vaginal.
4.1.4. Cultura de secreo vaginal, uretral ou prosttica
Em servio pblico no se justifica muito o cultivo de T. vaginal is, uma vez que onera e atrasa os resultados laboratoriais. Um dos meios de cultivo indicado o de Lash ou o de Feinberg, base de hiolizado
de caselna enriquecido com soro.
4.2. Liberao dos laudos

Secreo vaginal ou uretral com pH acima de 5,0, associada presena de trichomonas mveis no
exame direto fresco eloo presena de trichomonas coradas pelo Papanicolau, estabelece o diagnstico labJratorial da trichomonlase.

5. CANDIDASE
Vulvovaginite muito oomum, sobretudo em mulheres grvidas, causada por uma levedura: Cndida aibicans. A candidase pode QCOfTer por transmisso sexual, por contaminao a partir do sistema gastrointestinal onde habitualmente encontrada a levedura.

47

5.1. Diagnstico laboratorial

5.1 1 Esfregao da secreo vaginal.
Que dever ser corado pelo Mtodo de Gram ou pelo Mtodo de G.emsa.

5.1.2. Bacterioscopia direta fresco:.

DIlUIr uma gola da secreo vaginal em uma gota de soluo fiSIOlgICa ou KQH a lMo. Cobrir com
laminula e observar ao mlCf'OSCPlO 00 aLmento de 4Ox.

5.1.3. Cultura e identificao da espcie:

Q meio mais sImples para crescimento de leveduras o Sabouraud. A identificao pode ser feita pela
loonao do tubo germinativo e provas complementares, como a de fennenlao e assimilao de carboidratos e a produo de clamidosporos em gar farinha de milho (Iub).

5.2. liberao dos laudos

A presena de leveduras, fortemente coradas pelo Gram (Gram-positivos) 00 esfregao vaginal, ou a
observao de estruturas leveduriformes no exame microscpico fresco, bastante sugestivo de
candidase
Na impossibilidade do labortono posSUIr recursos para realIZao de provas complementares maiS apuradas, que IdentIficaro a C. albicans e grande vanedade de leveduras, recomenda-se a seguinte prova para
observao do tubo gemllnatlvo:
retirar uma poro de l.rTla colma Isolada de levedura, utilIZando ala bactenolglCa;
suspender em 0,5011 de soro humano ou de coelho, em tubo de ensaKl. Homogeneizar;
Incubar o tubo a 379C por 3 horas, no mximo;
retirar uma gota da suspenso levedura - soro e coloc-Ia sobre uma lmina limpa Cobnr com Iami
nula;
observar ao microscpIO (aumento de 4Ox) a presena de tubo germinativo caracterstico de C. albicanSo

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

1.

FILHO, Jos Trindade Donovanose ln' Doenas Sexualmente Transmissveis, 21 ed Editora

Cuhura Mdica, RIO de Janeiro, 1987, p 85-90,

FINEGOLD, M S & BARONI, E.t Geros calymmatobaclerlJm ln: lJiagnostic MlCroOOlogy, Seventh
edltion, Bay1ey aOO Scott's, Unitoo States of Amarica. 1982, p. 565-566,
Genital aOO sexually transmitted palhogens, p. 295-296
KONEMAN, EW ,ALLEN, S D , DOWELL; UR & SOMMERS, H M Haemophylus ln Diagnstico
Microbiolgico, Panamericana, Buenos Aires, Argenllna, 11 00 . 1983. P 250-251

3
4

Identificaan de las Jevaduras, p 455.

4B

6. DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS DST CAUSADAS POR Chl.mydi.lr.cham.li.

sao

As clamdias, atualmente. CllSSlficadas como bactrias,

parasitas obfigalnos de ctulas eucaritl
cas(5). Nilo possuIndo certos composlOS envolvIdos na produo de energIa, dependem do aparato energll00 da clula hospedeira para o desenvolvimento do seu ctclo biolgICO.
Podemos identificar duas formas distintas nesse Ciclo: o corpsculo elementar (CE) e o corpsculo reticular (CR). O CE, com 0,3.,. de dlametro, a forma infectante e que resiste ao meio extracelular. Ao penetrar
na clula, ele se diferencia em CA (11L de dimetro), que a forma replicativa e metabolicamente ativa Ao
se dividir o CR d origem a outros corpsculos reticulares que posteriormente se diferenciaro em corpsculos elementares. O CA a forma estritamente intracelular e nao infectante. As incluses inlracitoplasmticas
correspondem aos conjuntos de partculas do ciclo biolgico da clamdia(7).
Diferentes sorotipos de Chlamydia trachomalis esto relacionados com o linlogranuloma venreo e
outras afeces genilCHJnnnas e oculares, sendo os agentes mais importantes na ellologia das uretrites no
plOCCicas no homem(6). Na mulher, esto relacionados pnncipalmente s cervicites(3), endometriles,
doena Inflamatria plvica e suas complicaes. Na gravidez, as infeces por c1amdia podem c0mprometer a Integridade do concepto, causando conjuntivite de Incluso, pneumonia e outras Infeces do trato resplratno( 1).
6

Isolamento e Cultura
Pelas suas exigncias energhcas, as c1amdlas no podem ser Q.Jlllvadas em meios artlfici8ls, sendo
Impresclndivel a UllllZao de SiStemas VIVOS, tais como linhagens continuas de clulas.
A tcmca de isolamento e Q.lItura o teste mais sensivel e especfico pata o dlagnstl(X) das Infeces
por Chlamydia trachomatis{2~ exigIndo uma infra-estrutura laboratorial para o cultivo de clulas. por isso que os laboratrios de virologla tm, em geral, melhores condies de realizar esta tcnica do que os laboratnos de bacteriologia.
Desde a colheita do matenal clinico com "swab~ de aluminio com ponta de algOOo, at a inoculao
em monocamadas de clulas McCoy tralados com 5-lado 2jeoxluridlna, CUidados devem ser tomados para
que o matenal colhido e passado para o meio de transporte (meio mnimo de Eagle modificado, com soro fetal bovino 5-10%, gentamicina 2O,...glml, vancomicina 10....glml e fungizona 2,5,...gJml) seja acondicionado em
gelo e que no ultrapassem 12 horas entre a colheita e a Inoculao. Para armazenar as amostras, na impossibilidade de inocul-Ias Imediatamente, necessriO mant&las rongeladas a -7rfJC.
DepoIS de Inoculadas com o matenal clnico, as mooocamadas so centnfugadas por 1 hora a 2.000+g,
a temperatura ambiente.
~ a Incubao a 379C por 48 horas. as monocamadas so fixadas pelo metanol por 10 minutos e
podem ser coradas pelo Glemsa, iodo ou por corantes lmunofluorescentes (conJugados), para a pesqUisa das
ncIUSEIS que C01'espondem a ooI6n!as Intracltoplasmhcas de C. trachomatls.
Os preparados corados pelo GtemS3, quando examInados em moaoscpto de campo escuo perrmlem
identificar as incluses como estruturas alaranjadas ou amarelas brilhantes num fundo azulado.
Pela colorao com o iodo (lugof), as incluses contendo gllcognKJ se coram de castanho esaxo, c0ntra um fundo amarelo. sendo examinadas em miaoscplO comum de campo claro.
Na tcnica de llnunolluorescncia indireta os preparados so incubados em cmara mlda com um soro
<I"ltH:lamidla, por 30 minutos a 379C, depois lavados com PBS, Incubados (30 mln/379C) com um conjugado
antl-Imunoglobulinas espcie-especfico, diludo em azul de Evans; aps serem lavados novamente com o
PBS, os preparados so montados com glicenna tamponada (pH 9,6) e examinados em microscpio de fluorescncia. As incluses aparecero como massas justanucleares fluorescentes, amarelo-esverdeadas, contra
um fundo escuro ou avennelhado.

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Sorologia
Os testes sorolgicos paTa o diagnstico das infeces por clamidia tm valor limitado. Os anticorpos
sricos persistem por longos perodos e a deteco de antiCOfPOS numa nica amostra de soro de um paciente pode indicar apenas exposio prvia ao microorganismo. Soros pareados so difceis de se obter, porque
as infeces podem ser, freqentemente, assintomticas ou ter um longo perodo de incubao. Populaes
de alto risco tm altos ndices de cicatriz sorolgica e nas cHnicas de DST so detectados antiCOfPOS em cerca de 25% dos homens e 6(}70% das mulheres, dos quais no havia sido isolada a clamdia(2).
O teste sorolgico mais utilizado a imunofluorescncia indireta Este teste tem maior valor para estudos soroepidemiolgicos.
Exames diretos do material clfnico
O exame direto de raspados de conjuntiva para a identificao das incluses de clamfdia um mtodo
to sensvel quanto o isolamento, para o diagnstico das infeces oculares no recm-nascido.
O exame direto do material genital para o diagnstico das infeces por clamdia tem valor limitado(2).
Para o exame direlo preparada uma lmina do material clnico que pode ser corada e examinada miaoscopicamente paTa a pesquisa das incluses. As coloraes mais amplamente usadas so a de Giemsa e
a imunofluorescncia Entretanto, estas tcnicas variam em sensibilidade e aplicabilidade, devendo ser utilizadas com extremo cuidado.
O exame citopatolgico de esfregaos acto e endocervicais corados pelo mtodo de Papanicolau tem
sido utilizado para o diagnstico das cervicites por C. trachomatis. A tcnica pouco sensvel, devendo ser
usada apenas como um mtodo de diagnstico presuntivo para confirmao por outras tcnicas mais sensveis, tais como a imunofluorescncia direts, usando antioorpos monoclonais, a tcnica de imunoperoxidase(4) ou o isolamento em cultura celular.

REFER~NCIAS BIBLIOGRFICAS

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A reecUao deste manual contou com a colaboralo da Organlzalo PanAmerlcana de Sade,

Organlzalo Mundial de Saude, atravs do Projeto AMlBRAlCDS~10NDI88I89 e do CNPq.

proibido o uso para tlns comerciais

Brasilia 1992