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Apostila de Aulas Prticas de Bioqumica:

estrutura, propriedades e funes de

Biomolculas para o BC&T

Guia de Normas e Experimentos


3 quadrimestre/2016

Coordenao: Profa. Dra. Iseli Loureno Nantes

Equipe de elaborao: Adrianne M.M. Brito e Juliana Casares Araujo-Chaves

Autores: Ncleo Docente da UFABC

2016

1
Sumrio

AULA CONTEDO
Apresentao e Disposies Gerais do Curso Experimental
Introduo

gua: propriedades fsico-qumicas relacionadas sua estrutura


Experimento 1
e polaridade

Espectrofotometria: Conceitos e Aplicaes


Experimento 2

Propriedades cido-base das protenas e seus efeitos sobre a


Experimento 3
solubilidade das mesmas: Aplicao na purificao de
protenas.

Propriedades de surfactantes e lipdios


Experimento 4

Acares para biologia e materiais avanados.


Experimento 5

Enzima : Catlise enzimtica modulada por nanopartculas


Experimento 6
metlicas

2
Apresentao e Disposies Gerais do Curso Experimental

APRESENTAO
A disciplina Bioqumica: Estrutura, Propriedades e Funes de Biomolculas composta por
aulas expositivas em sala de aula (3 horas semanais), por aulas prticas nos laboratrios didticos (2 horas
semanais) e atividades de estudo e resoluo de problemas pelos alunos, em casa (6 horas semanais). Este
guia traz ao estudante o contedo das aulas prticas, com introduo, objetivos, procedimentos e normas que
regem a execuo destas atividades.

OBJETIVOS E COMPETNCIAS
Os mdulos prticos desta disciplina tm como objetivo apresentar uma sequncia de experimentos
que permitir ao aluno identificar aspectos estruturais, funcionais e de reatividade da gua, protenas,
acares, lipdeos incluindo surfactantes naturais e sintticos, e enzimas. O aluno dever correlacionar as
estruturas com diferentes propriedades biolgicas e de potencial aplicao em novos materiais e tecnologias.
Dentre essas propriedades citamos: formao de agregados supramoleculares, tais como micelas e
lipossomos, sntese e estabilizao de nanopartculas, participao em reaes de xido-reduo,
propriedades catalticas como enzimas e coenzimas, propriedades de captao de energia luminosa,
propriedades de converso de energia. Dentre as aplicaes em diferentes ramos do conhecimento
destacamos o uso ou participao de biomolculas e seus mimticos em: controle de pH em diferentes meios
incluindo o biolgico, transporte atravs das membranas biolgicas, desenvolvimento e terapia de doenas
degenerativas, nutrio, carreamento de frmacos, produo de polmeros quimio, foto e biodegradveis,
bioclulas a combustvel, clulas solares, processos de remediao de danos ambientais, entre outros.
Espera-se que, aps a realizao das aulas prticas, o aluno seja capaz de compreender os conceitos
fundamentais da Bioqumica, fazendo a conexo entre o macroscpico, acessvel aos nossos sentidos, e os
eventos que ocorrem em escala molecular.

AULAS PRTICAS
Existem normas de segurana para o trabalho em laboratrio que devem ser seguidas e respeitadas.
Um conjunto destas normas ser entregue ao aluno no incio das aulas de laboratrio juntamente com um termo
de compromisso (caso no o tenha recebido em disciplina anterior) no qual o aluno se compromete a ler e seguir
as mesmas. Todos os trabalhos em laboratrio sero realizados por equipes de no mximo 5 alunos. Espera-se
que os resultados obtidos sejam obra de um esforo conjunto e que todos os componentes estejam presentes na
hora marcada para o incio das aulas. Haver uma tolerncia de 10 minutos e aps esse tempo os alunos
retardatrios no podero realizar as atividades do dia. A aula ser encerrada no horrio pr-

3
estabelecido, no havendo prorrogao para os alunos que no tenham concludo os experimentos dentro do
prazo previsto por motivos alheios prtica.
IMPORTANTE: No haver reposio de experimentos no caso de falta, ficando o aluno prejudicado com
o aprendizado daquele contedo.

AVALIAO
Para a avaliao das atividades prticas, ser utilizado o contedo do caderno de laboratrio
elaborado individualmente pelo aluno sobre cada experimento. O aluno dever fazer um pr-relatrio no
caderno anteriormente a aula em questo e utiliz-lo para as anotaes durante a aula, bem como as anotaes
referentes discusso dos resultados obtidos. Esse caderno deve ser apenas manuscrito e no poder conter cpia
xerogrfica do caderno dos colegas ou de qualquer outro material. O aluno no poder participar, em
hiptese alguma, da aula prtica sem o caderno de laboratrio contendo o pr-relatrio. O aprendizado
na disciplina de Bioqumica: estrutura, propriedade e funes de Biomolculas ser avaliado continuamente
ao longo da disciplina pelo acompanhamento direto do docente e tambm ao final por meio de provas
tericas e prticas. O componente da teoria da nota final ter peso 7 e o prtico, peso 3. A prova prtica
envolver a execuo de experimentos no laboratrio e resposta a questes propostas durante a execuo.
Alunos com rendimento igual ou superior a 86% obtero conceito A; com rendimento entre 70 e
85%, conceito B; com rendimento entre 56 e 70%, conceito C; de 50 a 55%, conceito D e rendimento
inferior a 50% com conceito F. O aluno reprovado (conceito F) poder fazer EXAME com o contedo
todo do quadrimestre, cuja nota constituir uma nova mdia aritmtica com a mdia quadrimestral
obtida previamente para chegar em seu conceito final.

RECOMENDAES PARA AS AULAS EXPERIMENTAIS

1. obrigatrio o uso de avental (jaleco) no laboratrio; o mesmo deve ser comprido, de mangas compridas
e ser usado fechado (com os botes fechados);

2. No ser permitido fazer a aula de laboratrio usando sandlias, bermudas, shorts ou saia;

3. No permitida a execuo da aula de Transformaes Bioqumicas de bon, culos escuros nos olhos ou
na cabea e fones de ouvido;

4. proibido comer ou beber no laboratrio;

5. Proibido o uso de telefone celular durante as aulas de Transformaes Bioqumicas;

5. Cabelos compridos devem estar devidamente presos;

5. No dia da aula experimental todos devem apresentar um fluxograma individual (PR-RELATRIO) e


feito mo no caderno de laboratrio para dar incio aula, sendo que o mesmo poder ser utilizado durante
a execuo do experimento;
4
5. Evitar ao mximo faltar ou chegar atrasado s aulas prticas para no ser prejudicado;

6. O aluno que faltou em aula prtica ter prejuzo no componente da parte prtica da nota e nos seus
conhecimentos daquele tpico, uma vez que no h possibilidade de reposio da aula;

Modelo de Fluxograma

O fluxograma pode ser feito de maneira esquemtica ou na forma descritiva.

O objetivo fazer com que todos leiam os contedos do experimento e resumam as


atividades experimentais, ou seja, cheguem sabendo exatamente o que ser feito.

Sem o fluxograma no ser permitido realizar a aula experimental.

Modelo de Fluxograma 1: Esquemtico

Experimento 1 Parte 1:

Modelo de Fluxograma 2: Descritivo

5
ORIENTAES PARA O USO DE MICROPIPETAS

A transferncia de volume exato de lquidos fundamental para vasta maioria dos experimentos nas
reas de bioqumica, biologia molecular, qumica, etc. A medio de volume um passo importante em
qualquer laboratrio porque um pequeno erro de pipetagem pode causar um erro significativo no resultado
obtido. Micropipetas so aparelhos designados para a transferncia de pequenos volumes (entre 0,2 a 5000 l)
com mxima preciso. A construo das micropipetas consiste em um corpo anatmico de polipropileno
(autoclavvel) equipado com um boto dispensador e um ejetor de ponteiras no topo, um indicador de volume
na lateral e uma haste para encaixe de ponteiras descartveis na parte inferior. Existem vrios tipos de
micropipetas:
o pipetas monocanal ou multicanal
o pipetas com volume fixo ou com volume varivel
o pipetas com deslocamento de ar ou com deslocamento positivo

Fig. 1. A - Pipeta de Deslocamento Positivo; B - Pipeta Deslocamento de Ar (monocanal) e C - Pipeta


Deslocamento de Ar (multicanal).

Fig. 2. Descrio de uma micropipeta. As micropipetas possuem os componentes indicados na figura pelas
letras de A-V. O boto de ejeo apresenta duas fases de presso cuja ordem ser primeira e segunda na
pipetagem direta e segunda e primeira fase na pipetagem reversa (Veja adiante).
6
Funcionamento de micropipetas com deslocamento de ar
Este tipo de pipetas o mais utilizado, por ser muito verstil. O boto dispensador ligado a um
pisto dentro da pipeta. Ao pressionar o boto, o pisto se move deslocando o ar que por sua vez desloca um
lquido para dentro ou para fora da ponteira. A trajetria de boto dispensador tem dois estgios que podem
ser percebidos por diferena da resistncia de molas que retornam o boto dispensador para posio de
repouso aps ele ser liberado. Os dois estgios permitem fazer a pipetagem usando duas tcnicas diferentes:
a pipetagem direta (esgotamento total) ou a pipetagem reversa (esgotamento parcial). A escolha da
tcnica depende das caractersticas do lquido a ser pipetado (viscosidade, volatilidade, hidrofilicidade) e do
processo da pipetagem (pipetagem nica, titulante ou repetida).
A preciso da pipetagem influenciada por vrios fatores:
- encaixe da ponteira na haste: antes de pipetar, a compatibilidade do tipo de ponteira (fabricante) com o
tipo de haste deve ser verificada para evitar passagem de ar no encaixe. A ponteira deve ser encaixada por
movimento circular que assegura boa vedao entre a ponteira e a haste, alm de maior durabilidade pelo
uso correto da haste. Por estas razes, o encaixe da ponteira por batimentos repetidos de haste na ponteira
deve ser evitado.
- ajuste de volume (pipetas com volume varivel): cada indicador de volume tem uma pequena folga.
Assim, para a maior preciso, o volume deve ser ajustado sempre e somente de um lado (de preferncia, no
sentido horrio). Quando o ajuste ultrapassa o volume desejado, recomenda-se voltar <1/3 da rotao e
ajustar o volume de novo. Para ajustar corretamente o volume, deve ser considerado o erro paraltico; o eixo
da viso tem que ser perpendicular escala do indicador do volume.

Fig. 3. Ajuste de volume em micropipeta.

O volmetro formado por trs dgitos indicadores que so usados para ajustar o volume de lquido a ser
transferido. So lidos desde o alto (dgito mais significativo) at a base (dgito menos significativo). Um
marcador (ponta da seta) usado para ajustar o volume exato ou intermedirio contra a escala dos indicadores da
base. Os dgitos possuem as cores preta ou vermelha para indicar a posio do ponto decimal, de acordo com o
modelo. O volume ajustado girando-se o tambor de ajuste do volume ou o boto da pipeta. O boto

7
da pipeta a maneira mais fcil e rpida de acertar o volume, especialmente quando o operador estiver
usando luvas. O tambor de ajuste deve ser utilizado para se alcanar lentamente o volume desejado.
- a poro imersa no lquido: por causa da compressibilidade do ar, existe uma medida ideal da imerso da
ponta da ponteira que minimiza tais imprecises (Tabela 1).

Tabela 1: Imerso ideal da ponta da ponteira em relao do tipo de ponteira - volume pipetado
Volume (L) Poro imersa (mm)
0,1 - 1 1
1 - 100 2-3
101 - 1000 2-4
> 1001 3-6

- tenso lateral do lquido: os lquidos podem molhar a parede da ponteira, o que pode resultar em perdas de
volume ejetado (parte dele fica nas paredes). A minimizao dessa impreciso consiste em aspirao e
ejeo de lquido sem efetuar a transferncia (no mesmo recipiente). Assim, as paredes j estaro molhadas
a
e o volume da 2 aspirao ser transferido por completo.
- volatilidade do lquido: para diminuir gotejamento do lquido durante a transferncia e quando a natureza
do lquido permite (no corrosivo, no infectante ou no radioativo), o lquido pode ser aspirado/ejetado no
mesmo recipiente vrias vezes at o ar em cima do lquido ser trocado completamente por vapor do lquido.
Cada micropipeta calibrada para o valor indicado (valor terico) corresponder ao valor
efetivamente medido (valor real) na faixa da preciso de micropipeta (erro 2% para pipetas P10, P20,
P100, P200, P1000 e 5% para pipetas P2 e P5000). Porm, com tempo e uso prolongado, os componentes
mecnicos so sujeitos ao desgaste ou disfuno resultante de uso inadequado. Assim, essencial a
verificao da calibrao das micropipetas nas mesmas condies em que so utilizadas no laboratrio. Esta
verificao consiste essencialmente em um conjunto de medies usadas para restabelecer/atualizar a
relao entre o valor indicado e o valor efetivamente medido.
Normalmente, a verificao deve ser realizada nas seguintes situaes:
- aps uma manuteno e/ou troca de peas;
- aps um perodo de uso (~ 1 ano);
- quando a pipeta sofre um dano: queda, contaminao da haste, etc;
- de acordo com orientaes do fabricante;
Empregam-se geralmente trs mtodos de calibrao de pipetas automticas:
1. Mtodo gravimtrico: uma srie de medies do peso de lquido pipetado (considerando a
temperatura, umidade, presso atmosfrica e coeficiente de expanso) posteriormente convertida em
volume. Este mtodo realizado por laboratrios de calibrao especializados.

8
2. Mtodo titrimtrico: uma srie de medies de quantidades de NaOH com concentrao conhecida em
volumes pipetados (sem interferncia da temperatura, umidade ou presso atmosfrica). Exige uma
padronizao das solues envolvidas.
3. Mtodo fotomtrico: uma srie de medies fotomtricas de diferentes diluies de um cromforo com
concentrao conhecida. Este mtodo pode ser facilmente implantado no laboratrio.
Para a anlise dos resultados da calibrao, as sries de medies so convertidas para volume (valor
efetivamente medido) e comparados com volumes ajustados no indicador da micropipeta (valores indicados).
Calcula-se uma mdia (para mesmos volumes) ou regresso linear (para volumes diferentes) desvio padro.

Pipetagem direta (esgotamento total)

a tcnica de pipetagem mais conhecida. Utiliza-se para transferir volumes nicos de lquidos
aquosos ou de lquidos no volteis, no viscosos e no espumantes. O princpio de transferncia de lquido
mostrado na Figura 4.

Fig. 4. Esquema de procedimento usado para a tcnica de pipetagem direta. Linhas pontilhadas representam
o o
as posies de boto de esgotamento: Repouso (linha superior), 1 estgio (linha no meio) e 2 estgio
(linha inferior).

Pipetagem reversa (esgotamento parcial)

uma tcnica de pipetagem pouco conhecida. Recomenda-se fortemente o uso desta tcnica em casos de
pipetagem de lquidos viscosos, volteis e espumantes. Uso da pipetagem reversa em casos de pipetagem
repetida de um volume do mesmo lquido (por exemplo, em dosagens de protena amostra e curva padro)
pode melhorar a confiabilidade do mtodo at 10 vezes.
9
A transferncia de lquidos por esta tcnica resulta em um volume que sobra na ponteira aps da
transferncia que pode ser uma desvantagem no caso de lquidos caros ou de volume limitado. Porm, a
grande vantagem consiste em ejeo de lquido viscoso ou espumante, onde praticamente impossvel
realizar o esgotamento total (da tcnica direta). Caso de lquidos volteis, a transferncia do lquido pode ser
acompanhada por gotejamento do lquido fora da ponteira (vapor do lquido voltil expande o ar dentro da
pipeta). A tcnica da pipetagem reversa garante um volume de reserva na ponteira que permite a
transferncia de volume correto at de lquido bastante voltil.
O princpio de transferncia de lquido mostrado na Figura 5.

Fig. 5. Esquema de procedimento usado por a tcnica de pipetagem reversa. Linhas pontilhadas representam
o o
as posies de boto de esgotamento: Repouso (linha superior), 1 estgio (linha no meio) e 2 estgio
(linha inferior)

10
Experimento 1 gua: propriedades fsico-qumicas relacionadas
sua estrutura e polaridade

Abstract

The peculiar structure of water molecule is responsible for the properties of this solvent which are
crucial to the existence of life on earth in terms of modulating the structure and function of biomolecules as
to control the climate. The properties of the water which determine the behavior of biomolecules are also
used for technological applications and for this reason, the study of these properties is relevant to many
areas of knowledge. In this lesson, we will study the formation of aqueous SDS and CTAB micelles, anionic
surfactants and cationic respectively, influenced by the ionic strength of the medium with different
concentrations of NaCl. In sequence, we will see the ability of the micelles have to kidnap the methylene
blue dye and modulate the state of aggregation and optical properties thereof.

Resumo

A estrutura peculiar da molcula de gua responsvel pelas propriedades desse solvente que so cruciais
para a existncia de vida na Terra tanto em termos de modular a estrutura e funo das biomolculas quanto ao
controle do clima do planeta. As propriedades da gua que determinam o comportamento das biomolculas
tambm so utilizadas para aplicaes tecnolgicas e por essa razo, o estudo dessas propriedades relevante
para diversas reas do conhecimento. Nessa aula, estudaremos a formao de micelas aquosas de SDS e CTAB,
surfactantes aninico e catinico, respectivamente, influenciadas pela fora inica do meio com diferentes
concentraes de NaCl. Em sequncia, veremos a capacidade que as micelas possuem de sequestrar o corante
azul de metileno e modular o estado de agregao e as propriedades ticas do mesmo.

Introduo

As propriedades da gua so de fundamental importncia para a vida na Terra porque determinam a


estrutura e funo das biomolculas, a associao dessas em agregados supramoleculares funcionais tais
como as membranas biolgicas, os complexos proteicos, os ribossomos e os cromossomos. A gua tambm
importante para a vida na Terra, pois regula o clima do planeta. Alm disso, o crescente desenvolvimento e
novas aplicaes da nanotecnologia e nanobiotecnologia dependem do domnio do conhecimento sobre as
propriedades da gua como agente fundamental para a construo e modulao das propriedades dos
agregados supramoleculares naturais bem como os desenhados e construdos pelo homem.
A molcula de gua possui a densidade eletrnica distribuda de forma desigual na estrutura molecular.
Dentro de uma estrutura tetradrica (Fig. 1), dois cantos do tetraedro so ocupados pelos orbitais moleculares

11
no ligantes (par de eltrons no compartilhados) do tomo de oxignio e os outros dois so ocupados pelos
tomos de hidrognio.

Fig. 1. Estrutura molecular da gua inserida em uma estrutura tetradrica e frmula estrutural da gua com o
valor do ngulo entre os hidrognios que se desvia do valor esperado de 109,5 do carbono tetradrico com
3
hibridizao sp .
Os tomos de hidrognio na estrutura da gua formam um ngulo de 104,5 que difere do valor
3
esperado de 109,5 do carbono tetradrico com hibridizao sp . Esse valor de ngulo entre os hidrognios
explicado pela regra de Bent (Bent, 1961) segundo a qual em uma molcula AX2 e AX3, o tomo central
ligado a multiplos grupos hibridizar de modo que orbitais com maior carter s estaro direcionados para
substituintes eletropositivos e orbitais com maior carter p estaro direcionados para os substituintes mais
eletronegativos. Um exemplo bem conhecido o da molcula de gua em comparao com o dimetil ter,
metanol e difluoreto de oxignio.

1
Tabela

ngulo de ligao entre os


Molcula
substituintes

111
Dimetil ter

107-109
Metanol

104.5
gua

Difluoreto de 103.8
oxignio

1 Tabela extrada de HENRY A . BENT AN APPRAISAL OF VALENCE-BOND STRUCTURES AND HYBRIDIZATION


IN COMPOUNDS OF THE FIRST-ROW ELEMENTS. Chemical Reviews, 1961, Vol. 61(3), pp.275-311.
12
2
Em adio, as ligaes O-H so polarizadas devido alta eletronegatividade do oxignio . Assim,
um lado da molcula de gua carrega uma carga parcial ( ) de -0,6 unidades e o outro lado positivamente
carregado de forma correspondente (Fig. 1). Essa separao espacial entre as cargas d molcula de gua
as caractersticas de um dipolo eltrico, de tal modo que, essas molculas se atraem como magnetos e
estabelecem ligaes de hidrognio (Fig. 2). Sendo assim, ao contrrio do que acontece com metano (Fig. 3)
-30
que no dipolar (momento de dipolo 0 C.m), para vaporizar a gua (momento de dipolo 6,2.10 C.m)
necessrio colocar grande quantidade de energia para romper as pontes de hidrognio. Disso decorre a
1,2
enorme discrepncia entre os pontos de ebulio da gua ao nvel do mar (100C) e do metano (-162C) .

Fig. 2. Representao de duas molculas de gua ligadas por ligaes de hidrognio.

Fig. 3. Estrutura molecular do metano.

A polaridade da gua a torna um excelente solvente para ons e um indutor da formao de agregados
supramoleculares de molculas surfactantes. Surfactantes com uma cauda apolar, como o SDS (surfactante
aninico, Fig. 4) e o CTAB (surfactante catinico, Fig. 4) quando presentes em gua em concentrao acima
da CMC (concentrao micelar crtica) organizam-se como micelas aquosas (Fig. 5). Quando misturados
com gua e solventes orgnicos em propores de cerca de 1/10 podem formar as chamadas micelas
reversas (Fig. 5).

Fig. 4. Estruturas do SDS (esquerda) e CTAB (direita).


13
Fig. 5. Micela aquosa e micela reversa, mostradas esquerda e direita repectivamente, sendo a gua
representada em azul e o solvente orgnico em amarelo.

Surfactantes com duas caudas apolares tais como os fosfolipdios organizam-se em meio aquoso como
bicamadas e formam vesculas uni ou multilamelares. O tipo de estrutura formada determinado pela
geometria da molcula do lipdio anfiptico (Figura 6). Lipdios com uma nica cadeia carbnica, como sabes
de detergentes, devido a forma cnica e afilada de suas molculas, formam, preferencialmente, micelas. Nesta
estrutura esfrica, as cadeias carbnicas organizam-se no interior, isolando-se da gua, e os grupos polares
posicionam-se na superfcie externa, interagindo com o solvente.

Fig. 6. Diferentes agregados supramoleculares formados por molculas anfiflicas em meio aquoso e que so
termodinamicamente favorveis. A parte hidrofbica dos anfiflicos em meio aquoso organiza a gua ao seu
redor em uma estrutura semelhante ao clatrato, o que diminui a entropia da gua. A agregao das molculas
anfiflicas pelas pores hidrofbicas exclui essas partes do contato com a gua de tal forma que aumenta a
entropia da gua, sendo portanto, um processo com valor negativo de variao de energia livre de Gibbs. O
valor negativo da energia livre de Gibbs vem do ganho de entropia da gua, pois o processo endotrmico (
G = H T S). Maiores detalhes, veja nos livros textos da bibliografia indicada. Figura inspirada em Jan
Koolman, Klaus-Heinrich Roehm. Color Atlas of Biochemistry; Thieme, 2004, pag.29.

14
As micelas e os lipossomos possuem a capacidade de sequestrar molculas hidrofbicas como o corante
+
azul de metileno (MB do ingls, methylene blue) e modular o estado de agregao e as propriedades ticas do
3
mesmo . O corante possui uma estrutura molecular de baixa polaridade e se associa a micelas e no ao
+
monmero de um detergente, ou seja, micelas formadas pelos surfactantes aprisionam molculas de MB .
As micelas de SDS, um detergente aninico, formam uma interface carregada negativamente e tem maior
afinidade pelo MB (catinico) que o CTAB (catinico). Assim, para modular esse processo necessrio
considerar a razo micela/corante.

Fig. 7. Estrutura de surfactantes, do azul de metileno, de micelas e da associao do corante com as micelas
na forma de monmero e dmero. a- modelo de preenchimento das estruturas de lauril sulfato (esquerda) e
CTAB (direita), b estrutura do azul de metileno, c micela aquosa, d micela aquosa com monmero de
azul de metileno, e- micela aquosa com dmero de azul de metileno.

A relevncia do estudo de surfactantes na disciplina de Bioqumica: estruturas, propriedades e


funes de biomolculas no BCT-UFABC est no diversificado emprego dessas molculas na rea biolgica
alm das aplicaes nas indstrias: farmacutica (nanoformulaes do tipo microemulso), cosmtica e txtil
at inibidores de corroso e indstria do petrleo. Essas aplicaes so devido s propriedades fsico-qumicas
dos surfactantes tais como detergncia, emulsificao, lubrificao, capacidade espumante, molhabilidade,
solubilizao e disperso de fases. A palavra surfactante derivada da contrao da expresso surface active
agent, a qual em sentido literal significa agente de atividade superficial. Os surfactantes so molculas com
caractersticas anfiflicas, ou seja, possuem na mesma molcula uma poro hidroflica ou polar,
4
denominada cabea, e uma cadeia hidrofbica ou apolar, a cauda .

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Um surfactante tpico possui estrutura R-X , onde R uma cadeia carbnica variando de 8 a 18
tomos (normalmente linear) e X o grupo hidroflico. Dependendo da caracterstica do grupo X, os
tensoativos podem ser classificados como no-inicos (neutros) e inicos. Os surfactantes inicos contm
uma cabea hidroflica com carga lquida postiva (catinicos), negativa (aninicos) ou zero (zwitterinicos).
Os exemplos mais clssicos so o SDS (dodecil sulfato de sdio) que apresenta carga negativa no seu grupo
sulfato e o CTAB (brometo de cetil trimetil amnio) que possui carga positiva no seu grupo trimetilamnio.
Os surfactantes aninicos contm geralmente um dos quatro grupos hidroflicos solveis (carboxilato,
sulfonato, sulfato ou fosfato). Os surfactantes no-inicos no contm carga, mas apresentam grupos
altamente hidroflicos na parte polar. Em geral, a poro polar da molcula formada por polioxido-etilenos
ou grupos glicosdeos (Ex.: Brij, Triton X-100, Tween CxEy, dodecyl-SDS- D-maltosdeo, digitonina) e esse
tipo de surfactante no se dissocia em ons hidratados em meio aquoso. As propriedades hidroflicas so
observadas pela hidratao dos grupos amida, amina, steres e hidroxilas. Os surfactantes anfteros
(zwiterinicos) so os nicos que apresentam propriedades combinadas de surfactantes inicos e no-
inicos, de acordo com o pH do meio. Como os no-inicos, no apresentam uma carga lquida; tm baixa
condutividade e mobilidade eletrofortica; e no se ligam em resinas de troca-inica (Ex.: CHAPS, SB 3-10,
5
ASB) .

Conforme explicado na legenda da Figura 6, as molculas anfiflicas tendem a se agregar


espontaneamente em meio aquoso de tal forma a excluir suas pores hidrofbicas do contato com a gua. A
agregao dos surfactantes em micelas e bicamadas aumenta a entropia da gua, sendo portanto, um
processo entropicamente dirigido que leva a um valor negativo de variao de energia livre de Gibbs ( G =
H T S). Os surfactantes quando em meio aquoso, acima de uma determinada concentrao, formam
micelas e outros agregados, sendo que a poro lipoflica das molculas fica orientada para o interior da
micela enquanto os grupos hidroflicos ficam na parte externa da micela em contato com a gua. Foras
eletrostticas concentram compostos inicos junto superfcie de micelas enquanto compostos lipoflicos
adentram espontaneamente ao centro micelar. A faixa de concentrao onde ocorre a formao das primeiras
micelas denominada concentrao micelar crtica (CMC). A determinao da CMC pode ser realizada por
uma variedade de mtodos, alguns estudos tm relatado este parmetro com base nas medidas de tenso
superficial, condutividade eltrica, intensidade de espalhamento de luz, intensidade de fluorescncia e
titulao turbidimtrica.
Uma caracterstica importante da micela a existncia de um equilbrio dinmico entre o agregado e
molculas livres de surfactante em soluo. Portanto, a micela uma estrutura dinmica. A sada de um
monmero que integra uma micela ocorre na escala de tempo de milionsimo de segundos e sua recaptura ocorre
8
a velocidades similares quelas provindas de processos controlados por difuso (por volta de k = 10
9 -1 -1
10 mol L s ). Uma vez que a estrutura da micela no esttica, sua forma e seu tamanho variam com o
tipo de surfactante utilizado, alm da temperatura, concentrao e composio do surfactante, fora inica e
pH, podendo adquirir configurao esfrica, cilndrica ou planar (discos ou bicamadas).
16
Utilizados largamente na indstria, a maioria dos surfactantes encontrados hoje no mercado derivada
de petrleo e pode causar graves problemas no meio ambiente, principalmente em ecossistemas aquticos. Em
ambientes com excesso de surfactantes nota-se acmulo de espuma nos rios, diminuio de oxignio dissolvido
na gua e da permeabilidade da luz. Alm disso, esses compostos interferem em processos biolgicos, como o
ciclo do nitrognio, e sua degradao pode aumentar as concentraes de compostos xenofbicos (estranhos a um
organismo ou sistema biolgico) e causar a morte de organismos. Nesse contexto, e procurando por uma nova
concepo de produtos a ser considerada no desenvolvimento de biorrefinarias e pela consolidao de novas
plataformas tecnolgicas no cenrio nacional, vrios estudos tm sido realizados com o objetivo de fazer a
produo biotecnolgica de biossurfactantes utilizando leveduras, como agentes de fermentao, e subprodutos
6
agrcolas e da agroindstria, como fontes de carbono . Um exemplo de uso inovador de biossurfactantes a sua

aplicao no combate ao mosquito Aedes aegypti. Pesquisas tem demonstrado que o biosurfactante causa a morte
de larvas do mosquito Aedes aegypti porque o composto interage com o sifo respiratrio das larvas, deixando a
regio formada por molculas apolares, com umidade controlada e protegida pelo exosqueleto suscetvel
interao com a gua. Com isso, as larvas do mosquito sofrem asfixia. Alm disso, a presena do biossurfactante
na gua onde o mosquito depositou seus ovos altera e dificulta o equilbrio hidrosttico das larvas, o que as leva a
ter um gasto energtico exacerbado e morte por afogamento. Nessa mesma linha existe a perspectiva de utilizar
biossurfactantes para o combate de outras doenas tropicais negligenciadas, como a leishmaniose e a
esquistossomose.
O SDS (dodecil sulfato de sdio ou lauril sulfato de sdio), utilizado nos experimentos dessa aula, um
detergente aninico e agente umectante efetivo tanto em solues alcalinas quanto cidas. Na rea biolgica
possui uma variedade de aplicaes, sendo a mais comum o seu uso para solubilizao de protenas e lipdios.
Para solubilizao de protenas, o SDS deve ser usado em sua concentrao micelar crtica (CMC), sendo
tambm um poderoso desnaturante de protenas. H estudos comparando o SDS com outros detergentes com
relao solubilizao de lipdios e protenas e seus efeitos sobre a atividade enzimtica. Como muitos
protocolos exigem a remoo do SDS de amostras proticas, vrios mtodos de remoo do SDS por
+
cromatografia por troca inica tm sido descritos. Em alguns, o corante azul de metileno (MB ) pode ser usado
para determinar a quantidade remanescente de SDS aps remoo por cromatografia por troca inica. Alm dessa
+
aplicao, o MB utilizado como bactericida e fungicida; colorao temporria para examinar RNA ou DNA
sob o microscpio; agente fotossensibilizador para a terapia fotodinmica (TFD) de tumores, infeces e
parasitoses; indicador redox em qumica analtica e na indstria txtil. Devido ao seu uso na indstria textil o
+
MB , assim como outros corantes, um problema ambiental na gua de efluentes. Solues de diferentes
+
concentraes de MB , associado ou no a surfactantes, apresentam diferentes tonalidade de azul, relacionada a
predominncia de dmero ou monmero. A tonalidade royal indica predominncia de dmeros do corante e a
tonalidade cyan indica predominncia de monmero do corante. A mudana de cor conforme o estado de
agregao decorre do fato de que a agregao afeta a estrutura molecular, que por sua vez, afeta os nveis de
energia dos orbitais moleculares e assim, os comprimentos de onda de luz que so
17
absorvidos e transmitidos. A ampla utilizao justifica o uso de SDS e do azul de metileno nos experimentos
didticos 1 e 2.

Objetivo Geral

Este experimento didtico tem como proposta fazer com que os estudantes entendam as propriedades fsico-
qumicas da gua relacionadas sua estrutura e polaridade e sua influncia na formao de agregados
supramoleculares de surfactantes que so capazes de sequestrar molculas hidrofbicas e interferir no estado
de agregao e propriedades das mesmas. Ao manipular as solues e fazer transferncias de volumes
devem adquirir conhecimento e desenvolver a habilidade no uso correto de micropipetas e modos de
pipetagem dos lquidos.

Objetivos Especficos

Mais especificamente abordaremos o efeito dos estados de agregao nas propriedades ticas de um corante,
o azul de metileno (Fig. 7), promovidas por altas concentraes do mesmo e associao a micelas.
Adicionalmente veremos que a carga do surfactante pode influir na afinidade por determinadas molculas.

Materiais

10 tubos de ensaio, por grupo, para Parte 1 (identificar como 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 1B, 2B,3B, 4B e 5B ,
conforme a Tabela 1)
6 microtubos Eppendorfs de 2 mL por grupo (Parte 2)
Suporte para tubos e para microtubos
1 unidade de micropipeta automtica de volume varivel por grupo ( P10, P20, P100, P200, P1000)
Ponteiras
1 bquer de 50 mL
Papel absorvente
Fita crepe para identificao dos tubos e Eppendorfs ( a equipe tcnica pode fazer a
identificao prvia)
Soluo de NaCl (Cloreto de sdio M.M. 58,5 g/mol) a 1,14 mol/L. Para 10 mL de soluo estoque
utilizar uma massa de 0,6669 g.
Soluo de SDS ( Sodium dodecyl sulfate / C12H25NaO4S , M.M. 288 g/mol ) a 40 mmol/L. Para 10 mL
de soluo estoque utilizar uma massa de 0,1152 g
Soluo de CTAB (N-Cetyl-N,N,N-trimethyl-ammioniumbromid / C19H42BrN ,M.M. 364,46 g/mol) a
40 mmol/L. Para 10 mL de soluo estoque utilizar uma massa de 0,1458 g
Soluo de Azul de Metileno (Methylene Blue / CHClNS, M.M. 319,85 g/mol ) a 500 mol/L.

gua deionizada
Agitador Vrtex
18
Papel de alumnio

Procedimento

Para as pipetagens utilize a micropipeta de volume varivel disponvel para o seu grupo ( P10, P20, P100,
P200, P1000) que seja adequada para a transferncia de volume exato do lquido.

Parte 1

A turma dever ser dividida em grupos e cada grupo dever preparar as amostras A (sem sal) e B (com sal).

1) Posicione os tubos no suporte e numere-os na seguinte ordem: 1A, 2A, 3A, 4A e 5A e outra fileira 1B,
2B, 3B, 4B e 5B.
2) Nos tubos de 1A a 5A e de 1B a 5B, coloque os respectivos volumes de gua deionizada recomendados
para cada tubo, conforme Tabela 1.
3) Em seguida adicione os volumes de soluo estoque de NaCl, 0, 35, 175 e 350 L respectivamente nos
tubos 2B a 5B.
4) Por fim adicione os respectivos volumes indicados da soluo estoque de SDS nos tubos 2A a 5A e 2B a
5B para as concentraes finais de 16, 8, 4 e 1.5 mmol/L.
5) Aps a adio do detergente em todos os tubos, agitar individualmente, manualmente e depois no agitador
Vrtex, e observar a formao de espuma (vide Fig. 8). Anotar (Tabela 1) e fotografar por grupo (A e B).

Tabela 1 Volumes de adio referentes Parte I do experimento 1 gua.

Amostra A (Sem sal) B (Com sal)

1A 1B
2A 3A 4A 5A 2B 3B 4B 5B
(controle) (controle)
Reagente

gua 2 mL 1200 L 1600 L 1800 L 1925 L 2 mL 1200 L 1565 L 1625 L 1575 L

Soluo NaCl 35 L 175 L 350 L


- - - - - - 0
(concentrao) (20 mM) (100 mM) (200 mM)

Surfactante SDS 0 800 L 400 L 200 L 75 L 0 800 L 400 L 200 L 75 L

(concentrao) (0) (16 mM) (8 mM) (4 mM) (1,5 mM) (0) (16 mM) (8 mM) (4 mM) (1,5 mM)

Formao de espuma

19
SDS 8 mM SDS 8 mM
NaCl zero NaCl 200mM
(2mL) (2mL)

Fig. 8. Exemplo de resultado esperado. Efeito da fora inica sobre a CMC de um detergente. O tubo da esquerda
contm 8 mmol/L de SDS em gua deionizada o que equivale ao valor da CMC do detergente e o tubo da direita
possui a mesma concentrao de SDS em soluo de NaCl 200 mmol/L. Nessa concentrao a CMC do
detergente cai para 1 mmol/L. Quando um detergente atinge a CMC, observa-se brusca queda na tenso
superficial da gua. Importante notar que concentraes acima da CMC favorecem a formao de espuma, mas
esse mtodo de avaliao da CMC no tem preciso. Para determinar valores precisos de CMC deve-se recorrer a
medidas de variao da tenso superficial da gua. Exemplos de determinao de CMC podem ser encontrados
em vrios trabalhos como a referncia a seguir: Braz. arch. biol. technol. vol.57 no.2
Curitiba Mar./Apr. 2014.

Parte 2 .

A turma dever ser dividida em 6 grupos e cada grupo dever preparar somente as solues relacionadas a
+
uma determinada concentrao de azul de metileno (MB , do ingls, methylene blue) conforme Tabela 2, ou
seja, Grupo A (Aa e Ab) ou Grupo B (Ba e Bb) ou Grupo C (Ca e Cb).

1) Nos microtubos Eppendorf, prepare solues com concentraes finais de SDS de 0, 1.5 e 16 mmol/L e
de CTAB com 0, 0.75 e 8 mM, nos volumes indicados na Tabela 2 referente ao seu grupo (A, B ou C),
identificando-os respectivamente como 1a, 2a e 3a, e 1b, 2b e 3b e o nome do grupo (Exemplo: B1a).
2) Em seguida, adicione a soluo de azul de metileno (MB) nos Eppendorfs, de acordo com o indicado para
seu grupo: Aa e Ab q.s.p. 5 M; Ba e Bb q.s.p. 50 M ; Ca e Cb q.s.p. 150 M.
(Ateno para os volumes indicados para o seu grupo!)
3) Observe a colorao das solues e fotografe na ordem 1, 2 e 3.

Todas as amostras da Parte II desse experimento devem ser guardadas, no laboratrio, para
utilizao no Experimento 2.

20
Tabela 2 Volumes de adio referentes Parte II do experimento 1 gua.

Grupo A q.s.p. 5 M de MB

Amostra SDS (Aa) CTAB (Ab)

2a 3a 2b 3b
1a 1b
(1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente

gua 1980 L 1905 L 1180 L 1980 L 1942,5 L 1580 L

Surfactante 0 L 75 L 800 L 0 L 37,5 L 400 L

Azul de Meliteno 20 L 20 L 20 L 20 L 20 L 20 L

Grupo B q.s.p. 50 M de MB

Amostra SDS (Ba) CTAB (Bb)

2a 3a 2b 3b
1a 1b
(1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente

gua 1800 L 1725 L 1000 L 1800 L 1762,5 L 1400 L

Surfactante 0 L 75 L 800 L 0 L 37,5 L 400 L

Azul de Meliteno 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L

Grupo C q.s.p. 150 M de MB

Amostra SDS (Ca) CTAB (Cb)

2a 3a 2b 3b
1a 1b
(1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente

gua 1400 L 1325 L 600 L 1400 L 1362,5 L 1000 L

Surfactante 0 L 75 L 800 L 0 L 37,5 L 400 L

Azul de Meliteno 600 L 600 L 600 L 600 L 600 L 600 L

21
Fig. 9. Exemplo de resultado a ser obtido. Em cada foto, os tubos Eppendorfs da esquerda contm 0, 1,5 e
16 mM de SDS e os da direita contm 0, 0,75 e 8 mmol/L de CTAB. Nas foto da esquerda, centro e direita,
as concentraes de azul de metileno so respectivamente, 5, 50 e 150 mmol/L. Observar as diferenas de
tonalidade de azul. A tonalidade royal indica predominncia de dmeros do corante e a tonalidade cyan
indica predominncia de monmero do corante.

Anlise dos dados

As anotaes e fotos de cada grupo (A, B e C) da Parte 2 devem ser compartilhadas.

1- Descreva as caractersticas da espuma formada nos tubos 1A a 5A e 1B a 5B e explique.

2- Qual a C.M.C. do SDS e do CTAB em gua sem adio de sal ?

3- Aps analisar a estrutura do MB, as fotos e as observaes dos grupos A, B e C, indique e explique qual
(quais) ficaram com a colorao cyan ou royal em todas as condies (presena ou no de surfactante e tipo
de surfactante). Fundamente sua discusso com base na hidrofobicidade.

Referncias Bibliogrficas

1.VOET, D. Bioqumica. 4 edio. Artmed. 2013.


2.LEHNINGER, D. Princpios da Bioqumica. Terceira edio, RR Donnelley, 2002.
3. JUNQUEIRA, H.C.; SEVERINO, D.; DIAS, L.G.; GUGLIOTTI, M.S.; BAPTISTA, M. S. Modulation of
methylene blue photochemical properties based on adsorption at aqueous micelle interfaces. Phys. Chem. Chem.
Phys,(4) 23202328, 2002.

4. MANIASSO, N. Ambientes micelares em qumica analtica. Quim. Nova, Vol. 24, No. 1, 87-93, 2001.

5. NITSCHKE, M.; PASTORE, G.M. Biossurfactantes: propriedades e aplicaes. Quim. Nova, Vol. 25, No. 5, 772-
776, 2002.

6. SILVA, S. S. Biossurfactantes como molculas versteis: um novo conceito de produtos para biorrefinarias e
combate s doenas tropicais negligenciadas fase 1: seleo de leveduras, produo fermentativa e caracterizao
fsico-qumica. Disponvel em: http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/90924/biossurfactantes-como-moleculas-versateis-
um-novo-conceito-de-produtos-para-biorrefinarias-e-combat/. Acesso em 26 de ago. 2016.

7. M. Li et al. Accelerated methylene blue (MB) degradation by Fenton reagente exposed to UV or VUV/UV light in
an innovative micro photo-reactor. Applied Catalysis B: Environmental 187, 8389, 2016.

22
Experimento 2 Espectrofotometria: Conceitos e Aplicao

Abstract

The light absorption phenomenon directly by macromolecules or by chromophores formed by


secondary reactions is used for the spectral characterization and/or quantification of these substances
through spectrophotometry. The purpose of this experiment is to present the technique of spectroscopy at the
UV-vis range applied to Biochemistry using the Lambert-Beers law and qualitative measurements by the
analysis of a dye monomer and dimer composite spectra. To this class, it will be used direct absorbance at
280 nm and the colorimetric Biuret method for albumin quantification. The extinction coefficient () of
albumin at 280 nm and of the Biuret chromophore will be calculated by fitting a curve of absorbance
intensity versus protein concentration. The calculation of the absorbance intensity at wavelength of
maximum absorbance of dye monomer and dimer will provide to the students the identification of the
experimental conditions that change the equilibrium between these species.

Resumo

O fenmeno de absoro de luz diretamente por macromolculas ou cromforos formados por reaes
secundrias usado para a caracterizao espectral e/ou quantificao dessas substncias por espectrofotometria.
Este experimento didtico tem como proposta apresentar a tcnica de espectrometria de absoro eletrnica na
faixa de espectro eletromagntico UV-vis aplicada Bioqumica para realizar medidas quantitativas de acordo
com a Lei de Lambert-Beer e medidas qualitativas por meio da observao da relao monmero/dmero em
agregados supramoleculares de um corante. Para esta aula, sero obtidos espectros de absoro de uma soluo
de concentrao desconhecida da protena albumina para dosagem dessa diretamente a 280 nm e pelo mtodo do
Biureto. O coeficiente de extino () da albumina a 280 nm e o do cromforo do
Biureto sero calculados por meio do ajuste de uma curva padro de intensidade de absorbncia em funo
da concentrao do cromforo. Tambm sero obtidos espectros de absoro de solues de trs diferentes
concentraes do corante azul de metileno combinadas com trs diferentes concentraes dos surfactantes
SDS e CTAB. A diferena na absoro entre monmeros e dmeros facilita o clculo da concentrao de
cada espcie presente em soluo e permite uma estimativa qualitativa da concentrao relativa de dmeros e
monmeros na soluo, o que ser observado pelos estudantes em diferentes condies experimentais.

23
Introduo

O termo medida fotomtrica foi definido originalmente como o ato de medir a intensidade da luz,
independente do comprimento de onda (energia). A maioria dos instrumentos tem, contudo, mecanismos
para isolar uma faixa estreita de comprimentos de onda do espectro. Os instrumentos que usam filtros para
esse propsito so referidos como fotmetros de filtro ou colormetros e os que utilizam prismas ou grades
de difrao so chamados de espectrofotmetros.

Comprimento de onda refere-se distncia entre dois picos da propagao da luz que ocorre na
forma de onda, e essa distncia normente dada em nanmetros (nm). A radiao eletromagntica inclui
desde a energia radiante dos comprimentos de onda curtos dos raios aos comprimentos de onda longos das
ondas de rdio. O termo luz usado para descrever a energia dos comprimentos de onda visveis ao olho
humano e queles limtrofes. O olho humano capaz de detectar comprimentos de onda entre 380 e 750 nm,
entretanto espectrofotmetros so capazes de medir tambm comprimentos de onda mais curtos (ultra-
violeta, UV) ou mais longos (infra-vermelho, IV) (Fig. 1).

Fig. 1. Espectro eletromagntico evidenciando a faixa dos comprimentos de onda visveis.


(fonte: http://www.arq.ufsc.br/labcon/arq5656/Curso_Iluminacao/07_cores/luz_01.htm
e http://www.wordpress.com/2009/03/teoriadacor_01.jpg).

A espectrofotometria um dos mtodos pticos de anlises mais usados nas investigaes bioqumicas
(Fig. 2). O espectrofotmetro um instrumento que permite comparar a intensidade de luz absorvida ou
transmitida por uma soluo que contm uma quantidade desconhecida de soluto, em relao a quantidade
conhecida da mesma substncia. Todas as substncias podem absorver energia radiante, como por exemplo, a
gua que absorve fortemente na regio do IV. A absoro das radiaes ultravioletas, visveis e infravermelhas
dependem da estrutura molecular e caracterstica para cada substncia qumica. Quando a luz atravessa uma
soluo de determinada substncia, parte da energia absorvida (absorbncia). A cor das substncias se deve a
no absoro (transmitncia) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando

24
transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas no absorvidos. Esse fenmeno pode ser
usado para quantificao de substncias por meio da intensidade de absorbncia em um comprimento de
1
onda especfico, com base em uma curva-padro, utilizando-se da Lei de Lambert-Beer .

Fig. 2. Esquema ptico simplificado de um espectrofotmetro. (fonte: http://www.ufpa.br/ccen/quimica/espect2.jpg)

Fundamentao Terica

Considere um feixe de luz incidente com intensidade Io passando por uma cubeta contendo uma soluo
de uma determinada substncia que absorve luz de certo comprimento de onda (Fig. 3). A intensidade do feixe de
luz transmitido (I) ser sempre menor que Io, sendo que a transmitncia (T) definida como uma relao entre a
intensidade da luz transmitida e a intensidade da luz incidente (Lei de Beer).
T = I/Io

Fig. 3. Esquema demonstrando a incidncia de um feixe de luz em uma cubeta


e sua transmitncia.
(fonte:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/04/Beer_lambert.png/300px-
Beer_lambert.png)

medida que aumentamos a concentrao da substncia em soluo, a transmitncia varia em


relao inversa ao logaritmo da concentrao. Em conseqncia disso, pode-se definir um novo termo,
absorbncia (A), que ser diretamente proporcional concentrao. Portanto,

A = log I/Io = log T


A = log 1/T

25
Dessa forma, a absorbncia direta e linearmente proporcional concentrao. Esta varia tambm de
forma direta com o caminho ptico (dimetro interno) da cubeta, ou seja, se dobrarmos o caminho ptico
mantendo a concentrao constante, teremos um valor de absorbncia duas vezes maior. Essa relao
frequentemente referida como Lei de Lambert-Beer:

A = a.b.c

Onde A = abosrbncia, a = constante de proporcionalidade (absortividade ou coeficiente de


extino), b = caminho ptico (em centmetros) e c = concentrao. Como os valores de A so
adimensionais, a unidade de so as recprocas daquelas para b e c. Quando b = 1 cm (geralmente ) e c
-1
expresso em mol/L ou molL , a constante pode ser chamada de absortividade ou coeficiente de extino
molar ( , epsilon) e constante para dado comprimento de onda, temperatura, pH, solvente, etc.

Assim, a proporcionalidade direta entre absorbncia e concentrao pode ser usada para a
determinao da absortividade de uma dada substncia em determinada condio experimental por meio de
realizao de uma curva-padro. Para a construo dessa curva, solues de concentraes conhecidas da
substncia devem ser preparadas e as absorbncias determinadas no comprimento de onda adequado.
Posteriormente, essa absortividade pode ser utilizada para quantificao dessa substncia em uma soluo,
2
cuja concentrao desconhecida . Esse o princpio utilizado para medidas quantitativas obtidas pela
Espectroscopia UV-visvel.

A Espectroscopia UV-visivel tambm pode ser usada para anlise qualitativa de substncias, como ser
+ +
feita nessa aula com o azul de metileno (MB , do ingls, methylene blue). O MB um corante tiaznico com
aplicaes variadas. Foi sintetizado pela primeira vez para ser usado como corante de tecidos durante o perodo
de grande expanso da indstria txtil europeia sendo que, atualmente, a gua residual do processo de tingimento
de tecidos representa um problema ambiental mundial. largamente utilizado como um indicador redox em
qumica analtica: solues desta substncia so azuis quando em um ambiente oxidante, mas tornam-se incolores
+
quando expostas a um agente redutor. O MB tambm desempenha papis importantes na microbiologia e
farmacologia h tempos, sendo muito utilizado para corar os organismos vivos; como colorao temporria para
examinar RNA ou DNA sob o microscpio; para o tratamento metemoglobinizante, isto , converte
3+ 2+
metemoglobina (Fe ) a hemoglobina (Fe ); como bactericida e fungicida. Ultimamente uma inovao de uso
+
teraputico tem tido sucesso na medicina e na veterinria: o MB tem sido utilizado como agente
fotossensibilizador para a terapia fotodinmica (TFD) de tumores, infeces e parasitoses. Essa terapia utiliza a
aplicao de um corante na rea a ser tratada, seguida de irradiao com luz de comprimento de onda longo que
penetra melhor nos tecidos. A luz promove excitao eletrnica do corante que transfere sua energia ao oxignio
molecular do meio e o converte em uma espcie altamente oxidante, o oxignio singlete, que leva morte do
4
tecido tumoral ou do agente infeccioso .
26
+
A cor caracterstica do MB causada pela forte banda de absoro na regio espectral de 550-700 nm,
sendo seu espectro de absoro dependente da concentrao. Em soluo aquosa o corante azul de metiletno
encontra-se em equilbrio entre as formas monmero e dmero. O equilbrio encontra-se deslocado para a forma
monomrica e dimrica, respectivamente em baixas e altas concentraes do corante. Monmeros e dmeros tem
espectros de absorbncia distintos: monmeros tem intensidade mxima em 664 nm (
-1 -1
=85,000M cm ) e dmeros em 590 nm (Fig. 4). A diferena na absoro entre monmeros e dmeros
facilita o clculo da concentrao de cada espcie presente em soluo. A intensidade relativa dos picos
indica em qual direo o equilbrio esta deslocado. A razo entre a absorbncia a 580 e 665 nm (A580/A665) d
uma estimativa qualitativa da concentrao relativa de dmeros para monmeros, assim d uma estimativa de
+
qual forma do corante prevalece no meio. Em soluo, o estado fundamental do MB forma dmeros com
-3 -1
uma constante de associao de 4 1 x 10 M e que podem ser favorecidos pelo aumento da fora inica
e presena de micelas em determinadas razes de corante/surfactante. A interao corante-surfactante tem
sido estudada devido a sua grande relevncia para a indstria de tingimento e fotografia.
3,4
A forma agregada de azul de metileno possui peculiares propriedades fotoqumicas . Quando os
dmeros so expostos luz branca ou vermelha observa-se a separao de carga dos pares, pois o triplete

oxidante e oxida seu par com formao do par radicalar formado pelo corante reduzido com um eltron (MB ) e
2+
o corante oxidado com menos um eltron (MB ). Dessa forma, o rendimento quntico de produo de oxignio
singlete cai bastante para as formas agregadas. A forma reduzida com um eltron absorve luz em 420 nm e
possui pKa = 9,0. Essa espcie pode transferir o eltron ao oxignio do meio e gerar on superxido ou
prontamente dismutar para a forma reduzida com dois eltrons, ou seja, a forma leuco (MBH) e o estado
+ 2+
fundamental MB . O ction radical do azul de metileno (MB ) absorve em 520 nm.
O princpio que faz a fotoqumica interessante o uso da luz como uma fonte de energia para promover
reaes qumicas. Em comprimentos de onda de luz () especficos, a energia pode ser absorvida por
determinadas molculas, levando-as a um estado molecular excitado no qual, devido conformao menos
estvel ficam propensas a reagirem com outras molculas. A maior parte das reaes qumica realizadas em
laboratrio utiliza a faixa espectral visvel ao olho humano (vis), ultravioleta (UV) e infravermelho (IR) prximo.
Molculas excitadas podem perder sua energia atravs das propriedades fsicas ou por participar de reaes
qumicas. Para quantificar cada um destes processos, utilizam-se as medidas dos rendimentos qunticos (). O
a razo entre o nmero de ftons incidentes em uma amostra para um especfico processo pelo nmero de ftons
absorvidos ou nmero de molculas do produto formado por unidade de tempo pelo nmero de ftons absorvidos
por unidade de tempo. A fim de compreender o comportamento fotoqumico quando interage com biomolculas,
+
em particular com membranas, as propriedades do MB foram estudados em solues de SDS e CTAB em

vrios trabalhos como a referncia a seguir: Helena C. Junqueira et al. Modulation of methylene blue
photochemical properties based on adsorption at aqueous micelle interfaces.
Phys. Chem. Chem. Phys.(4) 23202328, 2002.

27
1.0

Absorbance Normalized
0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
400 500 600 700 800

Wavelength (nm)

+
Fig. 4. Espectro UV-visivel de MB em gua obtido com 25 (azul claro) e 250 (azul escuro) M do corante.
O inserto mostra a colorao diferenciada das solues com elevada porcentagem de dmero (azul royal) e
de monmero (azul turqueza).

O processo fotoqumico se inicia com a absoro de um fton por uma molcula com a qual encontra
condio de ressonncia. A energia do fton absorvida pela molcula no estado fundamental (S0) leva ao
deslocamento de um eltron de seu orbital ligante para um orbital anti-ligante desocupado de mais alta
energia, o que leva a molcula ao estado eletronicamente excitado singlete S1 ou Sn, dependendo da energia
de excitao ou do solvente. Deve ser ressaltado que uma molcula pode atingir o estado eletronicamente
5,6,7
excitado, na ausncia de luz, um processo conhecido como Fotoqumica no Escuro . Nesse caso, o estado
8
eletronicamente excitado resulta de uma reao qumica (clivagem trmica de um dioxetano , por exemplo)
10
ou bioqumica (reao da luciferina catalisada pela enzima luciferase dos vagalumes , por exemplo). A
molcula no estado eletronicamente excitado pode ter diferentes rotas de decaimento para o estado
fundamental (processos fotofsicos). Os processos fotofsicos possveis so: converso interna (SnS1 +
calor) quando a molcula encontra-se em estado excitado Sn acima de S1, fluorescncia (S1S0, sendo que
S1 pode ter sido atingido por excitao a partir de S0 ou por converso interna), cruzamento intersistemas
(S1T1 ou S2T2 e T2T1, via converso interna), como esquematizado na figura 5. Outra possibilidade,
vlida especialmente para o estado eletronicamente excitado triplete que possui tempo de vida relativamente
longo, o suficiente para colidir com outras molculas ainda no estado excitado, a reao fotoqumica. Portanto,
h transies que resultam em emisso de ftons (fluorescncia, F ou Fluo e fosforescncia, P ou Phos); as
transies sem a emisso de ftons, isto , aquelas em que a desativao se d atravs de processos de liberao
de calor para o ambiente; processos de absoro de radiao eletromagntica produzindo estados eletrnicos e
vibracionais excitados (S2 ou Sn); processos de desativao molecular de estados eletrnicos e vibracionais
excitados atravs de processos radiativos ou no radiativos (S1 e T2).

28
Fig. 5. Diagrama de Jablonski: esquerda, para uma molcula genrica aps interagir com um fton em
condies de ressonncia; direita, especificamente para as formas monomrica e dimrica do azul de
11
metileno .
A Terapia Fotodinmica, tambm conhecida como PDT (da sigla em ingls, Photodynamic Therapy),
fotorradiao, fototerapia ou terapia fotoqumica, uma modalidade de tratamento mdico que vem apresentando
timos resultados para o tratamento de cncer, infeces, parasitoes e queimaduras e vem se destacando em
relao s terapias tradicionais (cirurgia, quimioterapia e radioterapia), pois diferentemente dessas terapias no
apresenta os graves efeitos colaterais j que o efeito localizado e seletivo. A PDT visa a destruio localizada
do tecido vivo tumoral, do agente infeccioso ou do tecido danificado por queimaduras, por meio do disparo de
mecanismos de morte celular. No caso de infeces bacterianas, fngicas e virais o tratamento fotodinmico em
geral promove a inativao fotodinmica de micro-organismos (PDI). Assim, tem sido objeto de investigao
para desinfeco de sangue, guas ou superfcies. Alm disso, fotoinativao microbiana tem sido indicada como
alternativa para reduzir o uso abusivo de antimicrobianos e, como consequncia, diminuiria o desenvolvimento
da resistncia microbiana, principalmente nas reas de dermatologia, otorrinolaringologia, oftalmologia,
neurologia, gastroenterologia, urologia e odontologia. Essa terapia se baseia no emprego de um corante fotoativo,
o fotossensibilizador (substncia no txica) que combinado com irradiao em baixas doses de luz visvel de
comprimento de onda adequado, ativado ao estado eletronicamente excitado e portanto, com potencial pro-
oxidante. Quando no estado excitado triplete, e na presena de oxignio, pode reagir com molculas vizinhas por
transferncia de eltrons ou hidrognio, levando produo de espcies reativas de oxignio: superxido,
perxido de hidrognio e radical hidroxila (reao do tipo I) ou por transferncia de energia ao oxignio (reao
1
do tipo II), induzindo a produo do oxignio singlete ( O2) (Fig.6). Todas essas so espcies altamente reativas,

capazes de danificar lipdeos, cidos nucleicos e outros componentes celulares, tendo como consequncia a morte
celular. O oxignio singlete, capaz de reagir com proteinas da membrana celular de micro-organismos, enzimas
do citoplasma e destruir material gentico. A principal vantagem dessa terapia quando aplicada s bactrias que
devido

29
existncia de mltiplas mecanismos improvvel o desenvolvimento de resistncia bacteriana ao tratamento. O
dano causado depender da quantidade de oxignio singlete produzido e da concentrao do PS.

Fig. 6 . A- proliferao anormal de tecido. B- mecanismo de fotosensibilizao e C de morte celular. D-


ao do PS na PDI.

J foi observado que as interfaces de micelas carregadas negativamente induzem a formao de dmero
de sensibilizadores de carga positiva e so capazes de deslocar um mecanismo de sensibilizao tipo II para um
1
tipo I, praticamente abolindo a gerao de O2. Estes achados so relevantes para PDT, em que o sensibilizador
reage em contato direto com membranas, que podem variar desde membranas ligeiramente negativas, como a
citoplasmtica, a altamente negativa, como a membrana mitocondrial interna. Alm disso, os corantes catinicos
tambm interagem com o DNA que possui carga negativa. As interfaces carregadas negativamente podem alterar
o mecanismo e eficincia de sensibilizao de fotosensibilizadores de carga positiva. Portanto, mudando a via
fotoqumica tambm desloca o mecanismo e a eficincia de danos celulares.
5
Outro aspecto da fotoqumica que aparece nos sistemas biolgicos a Fotoqumica no Escuro que
tem sido aplicada em kits para dosagem de ATP com diferentes finalidades. Nesse caso, utiliza-se a reao
enzimtica dos organismos bioluminescentes, sendo o vagalume, o mais conhecido. O mecanismo geral
apresentado abaixo.

30
Observem que o mecanismo envolve etapas intermedirias de ligao com AMP (um nucleotideo)
formao de dioxetano (etapa d) que sofre clivagem espontnea e gera oxiluciferina no estado
eletronicamente excitado singlete que decai, nesse caso, exclusivamente de forma radiativa. A cor da luz
emitida depende da forma isomrica que decai ser o ismero ceto ou enol (etapa f).

Em relao fotoqumica, vale ressaltar que o Prmio Nobel de Qumica de 2008 esteve
relacionado a descoberta da Protena Verde Fluorescente (GFP) uma protena brilhante de guas-vivas,
um dos organismos mais interessantes da bioqumica atual. Esses estudos permitiram que pesquisadores
iluminassem tumores cancergenos em crescimento, mostrassem o desenvolvimento do mal de Alzheimer no
11
crebro ou o crescimento de bactrias nocivas, entre outras aplicaes .

5,12
A fotoqumica apresenta inmeras aplicaes biolgicas e tecnolgicas tais como sntese
14
qumica, produo de biocombustveis (envolve a fotossntese ), converso de energia (clulas solares),
fotografia, sinalizao de estradas com tintas fosforescentes, iluminao de ambientes, telas de televisores e
14
computadores (OLEDs), entre outras . Esses aspectos justificam a incluso do presente tpico no BC&T da
UFABC.

Objetivo Geral

Introduzir os conceitos de espectrofotometria ao aluno utilizando como exemplo a dosagem de


protenas em uma amostra por mtodo direto, ou seja, pela intensidade de absorbncia a 280 nm e pelo
mtodo indireto do Biureto; em ambos os casos com aplicao da Lei de Lambert-Beer. Observar mudanas
espectrais que acompanham alteraes no estado de agregao do corante azul de metileno e assim, entender
que a espectroscopia de absorbncia tambm fornece informaes qualitativas a respeito das molculas.

Objetivos especficos

1. Obter o espectro de absoro UV da albumina decorrente da presena de aminocidos aromticos e de


2+
cistina, assim como o referido espectro visvel do complexo formado entre os ons Cu presentes no
reagente de Biureto e as protenas.

2. Utilizar valores de absorbncia no comprimento de onda de absorbncia mxima de concentraes


conhecidas de uma soluo para a elaborao de uma curva-padro e determinao do coeficiente de
extino dos cromforos para aplicao da Lei de Lambert-Beer na quantificao das substncias.

3. Calcular a concentrao de uma soluo de albumina e dessa soluo acrescida de biureto.

31
4. Observar o espectro de absoro de solues do corante azul de metileno (MB) em trs diferentes
concentraes que interferem com seu estado de agregao e em trs concentraes dos surfactantes SDS e
CTAB relacionadas com a CMC dos detergentes. O uso de surfactantes catinicos e aninicos tambm
fornecer informaes sobre a influncia da carga da interface das micelas na associao com outras
molculas.

Materiais

Soluo-problema de BSA (Bovine serum albumin albumina bovina) com concentrao


desconhecida ( = soluo estoque) (128M)
Reagente de Biureto
H2O destilada
1 unidade de micropipeta automtica de volume varivel por grupo ( P10, P100, P200, P1000)
Ponteiras
Estante com 3 tubos de ensaio
Bquer de 50 mL
Espectrofotmetros de varredura (operado pelos tcnicos de laboratrio e utilizado para o mtodo
direto de dosagem de BSA e para as amostras da Aula 2) e de bancada (operado pelos alunos e
utilizado para o mtodo do biureto)
Cubetas de quartzo e cubetas de plstico de caminho ptico 1 cm e cubeta de vidro de caminho
ptico 0,1 cm
Papel absorvente macio para limpeza das cubetas
Amostras preparadas pelos alunos na Aula 2 Experimento 1 gua = Grupo B (50 M de
MB com SDS) amostras B1a, B2a e B3a)

Observao: o reagente de Biureto composto por CuSO4 0,15 % (m/v), tartarato de sdio e potssio
0,6 % (m/v) e NaOH 0,75 mol/L. Este reagente no deve ser guardado por mais de 30 dias, devido a
possibilidade de precipitao do cobre na forma de xidos ou sais insolveis. Porcentagem m/v refere-se
massa do soluto, em grama, usada para preparar 100 mL de soluo, isto , 0,15 g de CuSO4 para 100 mL de
soluo.

Parte 1 : Medidas quantitativas obtidas pela Espectroscopia UV-Vis


Albumina e Albumina+Biureto

15
Nesses experimentos determinaremos a concentrao de uma soluo de albumina por dois mtodos de
forma comparativa: diretamente pela absorbncia de seus aminocidos aromticos e cistinas a 280 nm (mtodo

32
2+
direto) e pela formao de complexos com Cu presentes no reagente de biureto e que absorvem luz com
mximo em 550 nm (mtodo do Biureto).

1. Mtodo direto. Nesse mtodo, a quantificao da concentrao de albumina feita pela contribuio de
absorbncia dos seus resduos de aminocidos aromticos (tirosina, fenilalanina e triptofano) e tambm dos
resduos de cistina.

Procedimento
A turma dever ser dividida em dois ou trs grupos dependendo do nmero de alunos presentes. Dever ser
utilizado um espectrofotmetro de varredura. A aquisio dos espectros e a manipulao da cubeta devero
ser feitas por um tcnico de laboratrio ou pelo professor. Os alunos devero acompanhar o procedimento.

1) Cada grupo dever diluir, em um tubo de ensaio, 200 L da soluo-problema de BSA em 1800 L de
gua deionizada. Reservar essa soluo diluda.
2) Utilizando um espectrofotmetro de varredura, operado pelo tcnico de laboratrio, dever ser feito o
branco em uma cubeta de quartzo de caminho ptico 1 cm, utilizando 2 mL de gua deionizada e lendo na
regio espectral de 240 a 320 nm, com 1 nm de intervalo de . Discutir a funo da leitura do branco.
Aps a leitura, a gua dever ser descartada.
3) Adquirir o espectro da soluo-problema de BSA concentrada.
Analisar o espectro obtido, verificando se a intensidade de absorbncia no ultrapassa o valor de 1 e se
apresenta uma banda bem definida com pico em 280 nm (verificar se no estourou o espectro).
Obs: Aps a aquisio retire a soluo contida na cubeta e guarde-a em um tubo de ensaio, pois essa soluo
ser reutilizada no Mtodo do Biureto.) Lave muito bem a cubeta utilizada com soluo de detergente e
posteriormente gua em abundncia, para que no fique contaminada.
4) Utilizando a amostra previamente diluda 10 vezes (tem 1 desse procedimento) fazer uma nova leitura.
Comparar o espectro obtido nesse item com o obtido no item 3(soluo concentrada) e discutir qual deles
confivel.
Obs.: salve ambos os espectros (BSA e BSA diluda), pois esses dados devero ser plotados e
compartilhados com os demais grupos.

Anlise dos dados

1) Calcule a concentrao da soluo-problema de BSA.


Para dosagem direta de protenas utilizam-se valores de absorbncia no comprimento de onda de
absorbncia mxima de concentraes conhecidas de uma soluo para a elaborao de uma curva-padro, a
partir dessa determinado o coeficiente de extino molar do cromforo e ento aplicada a Lei de Lambert-

33
Beer para a quantificao da substncia de interesse. Assim, voc dever construir uma curva padro da
albumina utilizando os dados da tabela a seguir (obtidos previamente por colaboradores da disciplina em
cubeta de caminho ptico de 0,1 cm) para plotar um grfico de absorbncia em 280 nm (eixo y) em funo
da concentrao de albumina em M (eixo x). A partir desse grfico determine o valor de em 280 nm
(contribuio conjunta dos aminocidos aromticos).

Concentrao albumina (M) Concentrao albumina (M) Absorbncia em 280 nm


0 0
20 0,0787
40 0,1547
60 0,2443
80 0,3414
100 0,3887
120 0,4750
140 0,5426
160 0,6217
180 0,7016
200 0,7632

Usando o valor de em 280 nm obtido (coeficiente angular), calcule a concentrao de albumina nessa
soluo problema, aplicando a equao de Lambert-Beer = . . . Lembre-se que a concentrao encontrada na
leitura feita em aula foi da AMOSTRA DILUIDA e que preciso calcular a concentrao da AMOSTRA
CONCENTRADA.

Dicas: Cdil = A / ( x l)

Cdil x Vsoluo = Coriginal x Vretirado do estoque

Conforme pode ser verificado, de acordo com a equao de Lambert-Beer (equao de reta), a
intensidade de absorbncia em 280 nm deve aumentar linearmente com a concentrao de albumina. O ajuste
linear do grfico de intensidade de absorbncia (A), em 280 nm, versus concentraes conhecidas de albumina,
em concentrao molar (C), X caminho tico de leitura (l), em cm, fornece o valor da constante de absortividade
molar () do cromforo, no caso, a contribuio simultnea dos resduos aromticos e de cistina.
Deve-se ressaltar que o aumento linear da absorbncia da albumina em funo da concentrao se restringe
a condies de concentraes relativamente baixas nas quais no h agregao significativa das molculas
de protenas. A formao de agregados a partir de determinadas concentraes leva a perda da linearidade
do grfico a partir de dada concentrao, visto que o agregado se comporta como outro cromforo, com
propriedades distintas do monmero.

2) Compare os espectros da amostra concentrada e diluda e discuta qual deles mais confivel. Qual seria a
outra alternativa para no saturar a fotomultiplicadora caso no fosse possvel diluir a amostra?

34
3) Plote os resultados das amostras diludas de seu grupo e dos demais grupos do laboratrio e discuta
possveis discrepncias de dados. (Houve amostras diludas de forma inadequada? Seu grupo chegou
prximo ao valor correto da concentrao de BSA do estoque?)

2. Mtodo do Biureto. Esse mtodo utilizar igualmente a lei de Lambert-Beer. A nica diferena que nesse
mtodo, cria-se um novo cromforo na molcula de albumina capaz de absorver na regio visvel do espectro
eletromagntico, no caso com pico mximo de absoro em 550 nm. Esse cromforo resulta da complexao do
cobre presente no reagente com as ligaes peptdicas e assim, independe do tipo de protena.

Procedimento.

Observao: A aquisio dos espectros da soluo BSA+biureto dever ser realizada pelos prprios alunos
em ESPECTROFOTMETRO DE BANCADA, no de 550 nm, utilizando cubeta de plstico de caminho
ptico de 10 mm (1 cm). Desse modo, a turma dever ser dividida em grupos, estando a quantidade desses
na dependncia do nmero de equipamentos disponvel.
1)Em um tubo de ensaio identificado prepare o branco com uma soluo de gua+biureto (1,5 mL de gua
destilada + 1,5 mL de Biureto ).
2) Em outro tubo de ensaio prepare a soluo BSA + biureto, colocando 0,5 mL de soluo de albumina
(utilize o BSA estoque que seu grupo guardou do mtodo direto) no tubo e acrescente 1 mL de gua
destilada. Aps agitao manual delicada, adicionar 1,5 mL do reagente de Biureto e tornar a agitar.
3) Aps 5 minutos, fazer a aquisio do espectro de absoro no visvel dessa soluo, de forma pontual em
550 nm. Anote o valor de absorbncia encontrado.
ATENO, fazer a leitura da absorbncia do branco antes da leitura da amostra BSA + biureto.

Anlise dos dados

Para dosar albumina pelo mtodo do biureto voc utilizar a constante de absortividade molar de 15.100
-1 -1
M cm obtida a partir de uma curva padro de albumina que reagiu com o biureto (Figura 7).

35
1.0
0.9 Concentraoes

Albumina-Biureto
(cubeta 1cm)
20M

0.8 0.5
40M
60M
80M
100M

0.7 120M
140M
160M
180M

0.6

or

ci
A
200M

b

n

a
s
0.5

A550
0.0

0.4 400 450 500 550 600


Comprimento de onda (nm)
650 700

0.3
0.2
0.1 Albumina_Biureto (cubeta 1cm)
-1 -1
= 15.100 M .cm
0.0 550nm

0 1 2 3
6 -1 -1
C .l . 10 M cm

Fig. 7. Curva padro de albumina determinada pelo mtodo do biureto. O inserto mostra os espectros do

cromforo Biureto-Albumina, os quais forneceram os valores de absorbncia em 550 nm usados na

construo da curva padro.

1) Determinar a concentrao da soluo-problema albumina+biureto, utilizando os dados obtidos.


Lembre-se que a BSA nessa soluo-problema est diluda na proporo de 1 para 6.

2) Na figura abaixo, esquerda observa-se o grfico da absorbncia em funo do comprimento de onda de


vrias concentraes de albumina, e direita da mesma figura, est plotado o grfico semelhante
correspondente a albumina + biureto. Em que se baseia o Mtodo do Biureto para a dosagem de protena
e porque utilizada uma banda de absoro diferente em ambos os mtodos?
0.8
Concentraoes Albumina Concentraoes
Albumina-Biureto
(cubeta 0.1cm)
(cubeta 1cm)
20 M 20 M
0.6 40 M 40 M
60 M
sor

nci
Ab

60 M
b

0.5
a

80 M
200 M
A
b

b

n

a
s

c
r

80 M 100 M
120 M
0.4 100 M 140 M
120 M 160 M
180 M
140 M
160 M
0.2 180 M
200 M

0.0
300 400 500 600 0.0
400 450 500 550 600 650 700
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)

3) Relacione as vantagens e desvantagens do mtodo do biureto em relao a outros mtodos para dosagem
de protenas. Utilize o artigo Determinao de protenas totais via espectrofotometria: vantagens e
15
desvantagens dos mtodos existentes .

36
Parte 2 : Medidas qualitativas obtidas pela espectroscopia UV-Vis
Solues de Azul de Metileno com surfactante

Nessa parte da aula sero usadas as amostras preparadas no Experimento 1. Somente as amostras
com ndice B (maisculo) devem ser lidas no espectrofotmetro de varredura em cubeta de caminho ptico
de 1 mm (0,1 cm). Entretanto todas as amostras devero ser analisadas visualmente em relao s diferenas
de tonalidade de azul, relacionando-as a predominncia de dmero e monmero. A tonalidade royal indica
predominncia de dmeros do corante e a tonalidade cyan indica predominncia de monmero do corante. A
mudana de cor conforme o estado de agregao decorre do fato de que a agregao afeta a estrutura
molecular, que por sua vez, afeta os nveis de energia dos orbitais moleculares e assim, os comprimentos de
onda de luz que so absorvidos e transmitidos. Monmeros e dmeros tem espectros de absorbncia
-1 -1
distintos: monmeros tem intensidade mxima em aproximadamente 664 nm ( =85,000M cm ) e dmeros
em 590 nm. A razo entre a absorbncia a 580 e 665 nm (A580/A665) d uma estimativa qualitativa da
concentrao relativa de dmeros para monmeros. Observe a colorao das solues referentes ao seu
grupo e compare com os grupos cuja concentrao de MB diferente, relacionando cor da soluo, estado
de agregao e aspecto do espectro apresentado. Espectros de absorbncia obtidos de todas as condies
preparadas no Experimento 1 esto disponibilizados no apndice a seguir.

Procedimento para obteno dos espectros de varredura. Essa parte do experimento ser executada por um
colaborador da disciplina e acompanhada pelos alunos. As solues devem ser lidas na sequncia especificada na
Tabela 2, em cubeta de vidro ou quartzo com caminho ptico 0.1 cm, aps realizar o branco.
Aps a leitura, voltar com a soluo para o respectivo Eppendorf.

Importante: fazer a IDENTIFICAO DE CADA AMOSTRA, atente para o nome marcado em cada

Eppendorf e na Tabela 2, que devem ser o mesmo.

Configurao do equipamento:
Regio espectral de 350 a 750 nm, Escala e unidades : auto
de leitura de 1 em 1 nm

Observao: Combinar com o professor responsvel pela turma como os dados obtidos nessa aula sero
disponibilizados aos alunos (espectro de BSA de concentrao desconhecida e das solues de azul de
metileno com surfactante.

37
Tabela 2 - Dados para orientao da identificao e ordem de leitura dos espectros de varredura das
amostras da parte 2 do Experimento 2 .
Cubeta Identificao da amostra Nmero do arquivo Check list
Branco : gua destilada
0,1 cm
B1a
(vidro ou
B2a
quartzo)
B3a

ATENO: para auxiliar no estudo das aulas 1 e 2, na anlise dos dados e resoluo dos exerccios,
interaja com o objeto de aprendizagem espectroscopia uv-vis medidas qualitativas, desenvolvido
especificamente para essas aulas, por Adrianne M. M. Brito e pelo NTE-UFABC e disponibilizado no
site da biblioteca da UFABC.

ANLISE DOS DADOS

1 . Plotar os grficos absorbncia X comprimento de onda e analisar a razo entre os picos de absoro das
formas monmero e dmero em cada condio, conforme modelos no apndice

APNDICE

Em soluo aquosa o corante azul de metiletno encontra-se em equilbrio entre as formas monmero e
dmero. O equilbrio encontra-se deslocado para a forma monomrica e dimrica, respectivamente em baixas e
altas concentraes do corante. Mesmo em condies onde predomina a forma monomrica, pode-se deslocar o
equilbrio para a forma dimrica com o uso de detergentes como o SDS. Conforme mostrado na figura 1,
+
monmeros e dmeros de MB tm espectros de absoro distintos: monmeros tem intensidade mxima em,
aproximadamente, 664 nm e dmeros em 590 nm. A intensidade relativa dos picos indica em qual direo o
equilbrio esta deslocado. Na presena do detergente SDS a razo entre a concentrao de micelas e
concentrao do corante ir determinar se as molculas do corante permanecero distribudas isoladamente ou
em pares no interior das micelas e isso pode ser monitorado por espectroscopia UV-visvel. Portanto, em
+
presena de SDS, a predominncia de dmero ser dependente da concentrao relativa de MB e SDS.
Conforme mostrado na fig. 1, mantendo fixa a concentrao do corante, em concentrao de SDS relativamente
baixa o espectro observado com pico em 580 nm, referente a forma dimrica. Por outro lado,

38
em concentrae relativamente altas de detergente o espectro observado com pico em 665 nm referente a
forma monomrica do corante.

Fig. 1. Espectro de absoro de soluo de MB+ com concentraes de 1 e 50 mM de SDS (linha


B
contnua, [MB+] = 30 M) e espectro de absorbncia de monmero e dmero de soluo de M + (linha
3
pontilhada)

Para analisar esses espectros e os espectros obtidos nessa aula, importante entender algumas
3
consideraes . Micelas aquosas so entidades dinmicas e a estrutura micelar est em equilbrio com os
monmeros da soluo e com a monocamada de surfactante na interface ar/gua. A presena de um sal na
soluo diminui a repulso eletrosttica entre os monmeros na interface e consequentemente diminui a
CMC (efeito da fora inica sobre a CMC de um detergente, visto no Experimento 1- parte 1). Esse efeito
+
observado apenas com altas concentraes do soluto (mM). Em uma soluo de surfactante e corante MB ,
dependendo da carga do surfactante, e consequentemente das interaes eletrostticas, bem como da razo
molar entre esses, pode ocorrer ou no formao de complexos que mudam as propriedades de ambos e o
+
equilbrio da soluo. O MB , sendo positivamente carregado tem uma forte atrao pelo SDS e tem sido
sugerido que essa interao muda o equilbrio da soluo de SDS e os complexos formados tm uma
grande tendncia a ficar na interface (menor repulso entre monmeros e menor solubilidade em gua). Em
+
soluo de SDS e MB , a CMC alcanada com menores concentraes de SDS, em relao ao surfactante
3 +
puro. J foi observado que quando a concentrao do MB aumentada de 0 para 45 M, a CMC de SDS
diminui de 7 mM para 70 M conforme pode ser observado na figura 2A. Assim, concentraes em
+
micromolar de MB so suficientes para mudar a CMC em duas ordens de magnitude, o que indica que o
+
MB facilita a formao das micelas.
A diferena na absoro de monmeros e dmeros facilita o clculo da concentrao de cada espcie
na soluo. A razo entre a absorbncia a 580 e 665 nm (A580/A665) d uma estimativa qualitativa da
concentrao relativa de dmeros em relao a monmeros. A fig. 2B extrada da referencia 3, mostra como
varia a razo monmero/dmero de uma soluo de azul de metileno titulada com concentraes crescentes
de SDS. Nesse trabalho a razo monmero/dmero foi medida por espectroscopia de absorbncia e
39
fluorescncia. O monitoramento da formao de dmeros por fluorescncia se baseia no fato de que o
monmero fluoresce e o dmero, no. Portanto quanto mais agregado houver no meio menor a razo
fluorescncia observada com uma dada concentrao de detergente / fluorescncia inicial sem detergente
(IF/f580). Na figura 2B, a curva com smbolos quadrados mostra a razo da absorbncia 580nm/665nm em
funo da concentrao de SDS. O aumento da concentrao de SDS, abaixo da CMC forma agregados pr-
micelares que aprisionam molculas de corante aos pares e isso leva ao aumento progressivo da razo
580nm/665nm concomitantemente com a diminuio progressiva da IF/f580 (inserto da fig. 2B). A partir de
determinada concentrao de SDS acima da CMC, o aumento do nmero de micelas no sistema leva ao
progressivo aumento da ocupao das micelas por monmeros do corante o que faz cair progressivamente a
razo 580nm/665nm e subir a razo IF/f580. Como o corante no tem afinidade por CTAB que positivamente
carregado, a razo 580nm/665nm no muda em funo da concentrao desse detergente (smbolos redondos
3
na Fig. 2B) .

B
A

+
Fig. 2 . A- concentrao micelar crtica do SDS em funo da concentrao de MB . Com o aumento da
+
concentrao do MB de 0 para 45 M, ocorre a diminuio da CMC de SDS de 7 mM para 70 M. B-
+
razo dos valores de absorbncia de MB (8 M) em 580 e 665 nm em funo da concentrao de SDS () e
3. +
CTAB () Para solues de SDS e MB , a A580/A665 aumenta em funo do aumento da concentrao de
SDS at aproximadamente 3 mM e ento comea a diminuir, indicando aumento da concentrao de dmeros
em relao a monmeros, o que confirmado pela medida de intensidade de fluorescncia (IF/f580) mostrada
no inserto. A linha pontilhada na vertical representa a CMC do SDS (0,96 mM). Para soluo de CTAB e
+
MB no h alterao na A580/A665. A CMC foi determinada por medida de tenso superficial do sistema.

+
Para explicar os espectros das solues de SDS com MB foi utilizada medidas de tenso superficial e
a teoria termodinmica de formao micelar (modelo de pseudo-fase) associadas a uma modelagem
matemtica que descreve a ligao e dimerizao de molculas de corantes em solues micelares. Esse
modelo emprega as equaes de balano das massas, da relao entre a concentrao micelar local e a
concentrao analtica de cada espcie envolvida, bem como da constante de dimerizao na fase micelar.

40
Representao grfica do Experimento 2 Parte 2: Medidas qualitativas obtidas
pela Espectroscopia UV-Vis para a soluo de Azul de Metileno com surfactante.

Espectros padro de cada condio experimental mostrados de forma comparativa.

Observao : ao analisar os espectros atente para o fato de que cada espectro sobreposto ao outro foi
plotado em uma escala diferente na ordenada (y), portanto as intensidades no so comparativas. O eixo y
correspondente a cada grfico est na mesma cor da linha do grfico. Na legenda est indicado a concentrao
do surfactante (SDS ou CTAB) e do corante (MB), o nome da amostra preparada em aula (por exemplo,
A1a) e o caminho ptico da cubeta na qual foi realizada a medida (caso no tenha indicao, o caminho
ptico 1 cm).
Os espectros a seguir correspondem aos dados otidos de todas as solues manipuladas na parte II do
Experimento 1. Observem a forma e localizao dos picos das bandas de absoro de acordo com a
+ +
concentrao de MB , na ausncia de surfactante (isto , soluo de MB somente), conforme mostrado na
Figura 4 e na Figura 10 e a seguir relacione-os a presena de MB na forma de monmero ou de dmero (Figura
3). Em seguida observem a forma e localizao dos picos das bandas de absoro de acordo com a concentrao
de MB, na presena das diferentes concentraes de surfactante SDS ou CTAB. Lembrem-se que monmeros e
dmeros tem espectros de absorbncia distintos e a razo entre a absorbncia a 580 e 665 nm (A 580/A665) d uma
estimativa de qual forma do corante prevalece no meio. Atentem para o fato de que o corante se associa a
micelas e no ao monmero do detergente, ou seja, micelas formadas pelos surfactantes
+
aprisionam molculas de MB . As micelas de SDS, um detergente aninico, formam uma interface
carregada negativamente e tem maior afinidade pelo MB (catinico) que o CTAB (catinico). Assim, na
moduo desse processo necessrio considerar a razo micela/corante conforme representado na Fig. 3 e
para uma estimativa qualitativa de qual forma do corante prevalece no meio necessrio a observao do
espectro de absoro no qual deve-se considerar a razo A580/A665 .

+
Fig. 3. Representao MB em micela de SDS na razo 1:1 (forma monomrica do corante) e 2:1
(forma dimrica do corante).

41
0,30
0_SDS_5uM_MB_A1a 0,7
0,20 0_SDS_50uM_MB_B1a (cubeta 0.1)
Monmero
0,25 0_SDS_150uM_MB_C1a (cubeta 0.1) 0,6

Dmero
Absorbncia 0,15 0,20 0,5

0,4
0,15
0,10
0,3
0,10
0,2
0,05
0,05
0,1

0,00 0,00 0,0


450 500 550 600 650 700 750

Comprimento de onda (nm)

Fig. 4 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5uM ,
50uM e 150uM, sem surfactante (0_SDS).

0,35
0,2
0,10 Monmero
0,30
Dmero
0,08 0,25
Absorbncia

0,20
0,06
0,1
0,15
0,04
0,10

0,02 1.5_SDS_5uM_MB_A2a
1.5_SDS_50uM_MB_B2a (cubeta 0.1) 0,05
1.5_SDS_150uM_MB_C2a (cubeta 0.1)
0,0 0,00 0,00
450 500 550 600 650 700 750
Comprimento de onda (nm)

Fig. 5 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50
M e 150 M e concentrao de 1,5 mM do surfactante SDS.

42
16_SDS_5uM_MB_A3a
16_SDS_50uM_MB_B3a (cubeta 0.1)
1,2
0,4 16_SDS_150uM_MB_C3a (cubeta 0.1)

0,3
1,0

0,3
0,8
Absorbncia

0,2
0,6
0,2

0,4
0,1
0,1
0,2

0,0 0,0 0,0


450 500 550 600 650 700 750 800 850
Comprimento de onda (nm)

Fig. 6. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50
M e 150 M e concentrao de 16 mM do surfactante SDS.

5uM_MB_0 SDS_A1a
0,20 5uM_MB_1,5mM_SDS_A2a
0,2
5uM_MB_16mM_SDS_A3a 0,3

0,15
Absorbncia

0,2

0,10 0,1

0,1
0,05

0,00 0,0 0,0


600 800
Comprimento de onda (nm)

Fig. 7 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 5 M e
concentra-es de 0 mM, 1,5 mM e 16 mM do surfactante SDS.

43
50uM_MB_0 SDS_B1a
50uM_MB_1,5mM_SDS_B2a
0,30
0,12 50uM_MB_16mM_SDS_B3a
0,4

0,25 0,10

0,3
0,20 0,08
Absorbncia

0,15 0,06
0,2

0,10 0,04

0,1
0,05 0,02

0,00 0,00 0,0


500 600 700 800
Comprimento de onda (nm)

Fig. 8 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 50 M, e
concentraes de 0 mM, 1,5 mM e 16 mM do surfactante SDS. O espectros obtidos dos dados adquiridos
durante a aula a partir das amostras preparadas pelos alunos deve ser semelhante a esse, considerando as
amostras B1a, B2a e B3a.

150uM_MB_0 SDS_C1a
150uM_MB_1,5mM_SDS_C2a
0,7 150uM_MB_16mM_SDS_C3a
0,35

0,6 1,0
0,30

0,5 0,8
0,25
Absorbncia

0,4
0,20
0,6

0,3 0,15
0,4
0,2 0,10

0,2
0,1 0,05

0,0 0,00 0,0


500 600 700 800
Comprimento de onda (nm)

Fig. 9. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 150 M, e
concentraes de 0 mM, 1,5 mM e 16 mM do surfactante SDS.

44
0_CTAB_5uM_MB_A1b
0,20 0_CTAB_50uM_MB_B1b (Cubeta 0.1)
0,7
0_CTAB_150uM_MB_C1b (Cubeta 0.1)
0,25
0,6
0,15
0,20
0,5
Absorbncia

0,15 0,4
0,10
0,3
0,10
0,2
0,05
0,05
0,1

0,00 0,00 0,0


450 500 550 600 650 700 750 800
Comprimento de onda (nm)

Fig. 10. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 5 M, 50
M e 150 M e concentrao de 0 mM do surfactante CTAB.

0.75_CTAB_5uM_MB_A2b
0.75_CTAB_50uM_MB_B2b (Cubeta 0.1)
0,3
0.75_CTAB_150uM_MB_C2b (Cubeta 0.1) 0,7
0,25

0,6

0,20
0,2 0,5
Absorbncia

0,15 0,4

0,3
0,10
0,1
0,2

0,05
0,1

0,00 0,0 0,0


450 500 550 600 650 700 750 800
Comprimento de onda (nm)

Fig. 11. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50
M e 150 M e concentrao de 0,75 mM do surfactante CTAB.

45
8mM_CTAB_5uM_ MB_A3b
8mM_CTAB_50uM_MB_B3b (cubeta 0.1)
0,30
8mM_CTAB_150uM_MB_C3b (cubeta 0.1) 0,7
0,25
0,25 0,6

0,20 0,5
0,20
Absorbncia
0,15 0,4
0,15
0,3
0,10 0,10
0,2

0,05 0,05
0,1

0,00 0,00 0,0


450 500 550 600 650 700 750 800
Comprimento de onda (nm)

Fig. 12 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50
M e 150 M e concentrao de 8 mM do surfactante CTAB.

5uM_MB_0_CTAB _A1b
0,20 5uM_MB_0.75mM_CTAB_A2b 0,30
5uM_MB_8mM_CTAB_A3b
0,25
0,25
0,15
0,20
0,20
Absorbncia

0,15
0,10 0,15

0,10
0,10
0,05
0,05 0,05

0,00 0,00 0,00


500 600 700 800
Comprimento de onda (nm)

Fig. 13. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 5 M, e
concentraes de 0 mM, 0,75 mM e 8 mM do surfactante CTAB. O grfico obtido dos espectros
adquiridos durante a aula a partir das amostras preparadas pelos alunos deve ser semelhante a esse,
considerando as amostras A1b, A2b e A3b.

46
50uM_MB_0_CTAB (cubeta 0.1)_B1b
50uM_MB_0.75mM_CTAB (cubeta 0.1)_B2b
50uM_MB_8mM_CTAB )cubeta 0.1)_B3b
0,3

0,25 0,25

0,20 0,20
0,2
Absorbncia

0,15 0,15

0,10 0,10
0,1

0,05 0,05

0,00 0,0 0,00


500 600 700 800
A

Fig. 14 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 50 M e
concentraes de 0 mM, 0,75 mM e 8 mM do surfactante CTAB.

150uM_MB_0_CTAB (cubeta 0.1)_C1b


150uM_MB_0.75mM_CTAB (cubeta 0.1)_C2b
0,7
150uM_MB_8mM_CTAB (cubeta 0.1)_C3b 0,7
0,7
0,6 0,6
0,6
0,5 0,5
0,5
Absorbncia

0,4 0,4
0,4

0,3 0,3
0,3

0,2 0,2 0,2

0,1 0,1 0,1

0,0 0,0 0,0


500 600 700 800
Comprimento de onda (nm)

Fig. 15. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 150 M e
concentraes de 0 mM, 0,75 mM e 8 mM do surfactante CTAB.

47
MB_5uM_SDS_0_A1a
1,0 MB_50uM_SDS_0_B1a (cubeta 0.1)
MB_150uM_SDS_0_C1a (cubeta 0.1)
1.5mM_SDS_5uM_MB_A2a
1.5mM_SDS_50uM_MB_B2a (cubeta 0.1)
1.5mM_SDS_150uM_MB_C2a (cubeta 0.1)
16mM_SDS_5uM_MB_A3a
16mM_SDS_50uM_MB_B3a (cubeta 0.1)
16mm_SDS_150uM_MB_C3a (cubeta 0.1)
Absorbncia

0,5

0,0
500 550 600 650 700 750 800 850
Comprimento de onda (nm)

Fig. 16. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) e do surfactante SDS nas diversas
concentraes.

0_CTAB_5uM_MB_A1b

0,6 0_CTAB_50uM_MB_B1b (Cubeta 0.1)


0_CTAB_150uM_MB_C1b (Cubeta 0.1)
0.75mM_CTAB_5uM_MB_A2b
0.75mM_CTAB_50uM_MB_B2b (Cubeta 0.1)
0.75mM_CTAB_150uM_MB_C2b (Cubeta 0.1)
Absorbncia

8mM_CTAB_5uM_ MB_A3b
0,4 8mM_CTAB_50uM_MB_B3b (cubeta 0.1)
8mM_CTAB_150uM_MB_C3b (cubeta 0.1)

0,2

0,0
550 600 650 700 750 800 850
Comprimento de onda (nm)

Fig. 17 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) e do surfactante CTAB nas
diversas concentraes.

48
Tabela 1 - Volumes de adio referentes s amostras apresentadas nos grficos

Grupo A q.s.p. 5 M de MB

Amostra SDS (Aa) CTAB (Ab)

2a 3a 2b 3b
1a 1b
(1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente

gua 1980 L 1905 L 1180 L 1980 L 1942,5 L 1580 L

Surfactante 0 L 75 L 800 L 0 L 37,5 L 400 L

20
Azul de Meliteno 20 L 20 L 20 L 20 L L 20 L

Grupo B q.s.p. 50 M de MB

Amostra SDS (Ba) CTAB (Bb)

2a 3a 2b 3b
1a 1b
(1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente

gua 1800 L 1725 L 1000 L 1800 L 1762,5 L 1400 L

Surfactante 0 L 75 L 800 L 0 L 37,5 L 400 L

200
Azul de Meliteno 200 L 200 L 200 L 200 L L 200 L

Grupo C q.s.p. 150 M de MB

Amostra SDS (Ca) CTAB (Cb)


2a
3a 2b 3b
1a (1.5 mM) 1b
(16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente 4 mL

gua 1400 L 1325 L 600 L 1400 L 1362,5 L 1000 L

Surfactante 0 L 75 L 800 L 0 L 37,5 L 400 L

Azul de Meliteno 600 L 600 L 600 L 600 L 600 L 600 L

49
Cyan Cyan

Royal

Fig. 18 . Fotos das solues referentes Tabela 1 e aos grficos apresentados. Em cada foto, os tubos
Eppendorfs da esquerda contm 0; 1,5 e 16 mmol/L de SDS e os da direita contm 0; 0,75 e 8 mmol/L de
CTAB. Nas fotos da esquerda, centro e direita, as concentraes de azul de metileno so respectivamente, 5,
50 e 150 mmol/L. Observar as diferenas de tonalidade de azul. A tonalidade royal indica predominncia de
dmeros do corante e a tonalidade cyan indica predominncia de monmero do corante.

Exerccios

1) Analise os grficos apresentados para o surfactante SDS, os quais esto todos representados na Figura 16, e as
imagens da Figura 18. Considere os espectros A, B e C mostrados abaixo, que correspondem a diferentes condies de
solues aquosas de azul de metileno (MB) e indique o estado de agregao predominante e a tonalidade de cor da
soluo correspondente a cada espectro.

A-Estado de agregao e B-Estado de agregao e C-Estado de agregao e


tonalidade da cor. tonalidade da cor. tonalidade da cor
_________________________ _________________________ _________________________
_________________________ _________________________ _________________________

0,35
0,2 C
0,10 A B 0,30

0,08 0,25
Absorbncia

0,20
0,06
0,1
0,15
0,04
0,10

0,02 1.5_SDS_5uM_MB_A2a
1.5_SDS_50uM_MB_B2a (cubeta 0.1) 0,05
1.5_SDS_150uM_MB_C2a (cubeta 0.1)
0,0 0,00 0,00
450 500 550 600 650 700 750
Comprimento de onda (nm)

Obs: Ao analisar os espectros desconsidere a intensidade de absorbncia, est sendo feita uma anlise
apenas qualitativa. Cada espectro sobreposto ao outro foi plotado em uma escala diferente na ordenada (y),
portanto as intensidades no so comparativas. Os valores do eixo y correspondente a cada grfico esto na
mesma cor da linha do grfico.

50
Considere as condies listadas abaixo, em relao s possveis combinaes quanto concentrao de MB
(baixa ou alta em relao a induo de sua prpria agregao ou para modificar a CMC do SDS),
concentrao de micelas (excesso ou no) e a razo micela/corante (forma monomrica ou dimrica do
corante na micela), e indique para cada uma delas a caracterstica de seu respectivo espectro, ou seja, se ser
semelhante ao espectro A, B ou C.

a- 50 microM azul de metileno em gua:___________________________


b- 50 microM azul de metileno em 1.5 mM SDS:____________________
c- 50 microM azul de metileno em 16 mM SDS:____________________
d- 5 microM azul de metileno em gua:____________________________
e- 5 microM azul de metileno em 16 mM SDS: _____________________
f- 150 microM de MB em gua:__________________________________

Desafio: Explique o que levou a amostra de azul de metileno 150 microM em 1.5 mM SDS apresentar mais
monmeros do que a amostra de menor concentrao do corante, ou seja, 50 microM em 1.5 mM SDS.

2) Um analista recebeu uma amostra de albumina bovina (BSA) e precisou determinar a concentrao da
soluo antes de fazer os ensaios necessrios. Para isso, fez uma anlise por espectroscopia UV-Visvel
(espectrofotmetro de varredura) seguindo o protocolo:
A- adicionar gua em uma cubeta de caminho ptico 1 cm e fazer o branco;
B- descartar a gua e adicionar a amostra concentrada na mesma cubeta. Fazer o espectro da
amostra. O resultado encontrado foi um espectro muito ruidoso (Figura 17 , linha preta).
Aps observar esse resultado, o analista resolveu diluir 8 vezes a amostra (125 L de amostra + 875 L de
gua deionizada) e fazer uma nova leitura usando a mesma cubeta (Figura 17, linha vermelha).

Concentrada
Diluida
4.0

3.5

3.0
Absorbncia

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

240 260 280 300 320


Comprimento de Onda (nm)

2
Fig. 17. Direita: Espectros UV-Vis de BSA em gua. Linha preta: amostra concentrada. Linha vermelha:
Amostra diluda. Esquerda: valores de absorbncia das amostras concentrada e diluda nos devidos
comprimentos de ondas (wavelength).
-1 -1
Sabendo que a BSA tem 280nm = 38360 M cm . Calcule a concentrao original da amostra de BSA e
explique de forma sucinta por que ela precisou ser diluda.

Referncias Bibliogrficas
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espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes. Qum. Nova 21(6):787-793, 1998

49
Experimento 3 Propriedades cido-base das protenas e
seus efeitos sobre a solubilidade das mesmas: Aplicao na
purificao de protenas.

Abstract

This educational experiment has the purpose of making the students of Biochemical
Transformations understand that the side chains of the amino acid residues contribute to the
properties of a protein. The basic properties of proteins depend on their amino acid composition
and may be useful for separation and purification thereof using techniques that exploit the net
charge of a protein as a function of pH. A strategy for the purification of a protein is the
precipitation at the pH in which the net charge of the protein is zero (pI). One can use different
strategies to precipitate proteins at the pI such as the use of organic solvents or the polymer
polyethylene glycol. At the pI, the solubility of a protein can be increased by adding salt
constituting the salting-in phenomenon. At pH higher than pI, a protein can be precipitated by
the addition of salt at high concentrations (salting out). The specific pI values of each protein
can also be used to separate a mixture of proteins by electrophoresis and electrofocusing.

Resumo

Este experimento didtico tem como proposta fazer com que os estudantes de
Bioqumica: estrutura, propriedades e funes de Biomolculas entendam que os aminocidos
constituintes de uma protena contribuem para as propriedades das mesmas por meio de suas
cadeias laterais. As propriedades cido-base das protenas dependem de sua composio de
aminocidos e podem ser usadas para separao e purificao das mesmas por meio de tcnicas
que exploram a variao de carga de uma protena em funo do pH do meio. Uma tcnica de
purificao de protenas a precipitao no pH no qual a carga lquida da protena igual a
zero (pI). Pode-se utilizar diferentes estratgias para precipitar protenas no pI como por
exemplo o uso de solventes orgnicos ou o polmero polietilenoglicol. No pI, a solubilidade de
uma protena pode ser aumentada pela adio de sal constituindo o fenmeno de salting-in. Em
pH diferente do pI, uma protena pode tambm ser precipitada pela adio de sal em altas
concentraes (salting out). Os valores de pI especficos de cada protena tambm permite
separar uma mistura de protenas por meio de eletroforese e eletrofocalizao.

50
Introduo

Aminocidos

Em qumica, um aminocido qualquer molcula que contm simultaneamente grupos


1,2,3,4
funcionais amina e cido carboxlico. Em bioqumica , este termo usado como termo
curto e geral para referir os -aminocidos, ou seja, cidos carboxlicos em que as funes amino
esto ligadas s posies (ou posio 2 em relao carboxila).

Na natureza existem cerca de 200-300 aminocidos, entretanto, somente 21 so utilizados


para a sntese de protenas (aminocidos proteinognicos) e outros aparecem como intermedirios
de vias metablicas. Dentre estes, 8 so chamados aminocidos essenciais, isto , no podem ser
sintetizados pelo organismo humano, e precisam ser obtidos a partir dos alimentos de origem
animal ou vegetal. Os demais so chamados de no essenciais. H um aminocido, a taurina, que
est presente nos organismos superiores, mas no na constituio das protenas.


Aminocidos essenciais (no sintetizados pelo organismo humano): isoleucina, leucina,
lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina.

Aminocidos no-essenciais (sintetizados pelo organismo humano): arginina, alanina,


asparagina, cistena, glicina, glutamina, histidina, prolina, cido asprtico, cido
glutmico, serina e tirosina.

Contudo, esta classificao no pode ser tomada como algo geral para todos os
organismos superiores e em todas as etapas de seus ciclos de vida. Em crianas, por exemplo,
os aminocidos cistena, tirosina, histidina e arginina so considerados semi-essenciais uma vez
que as etapas metablicas para sintetizar estes aminocidos no esto completamente
desenvolvidas. Portanto, esta classificao de essencial e no-essencial no reflete a
importncia destes -aminocidos, uma vez que, todos os 21 -aminocidos so necessrios na
constituio de protenas e peptdeos, conseqentemente, de toda a matria viva.
O aminocido mais simples a glicina (Figura 1), e possui apenas um tomo de hidrognio em
sua cadeia lateral. A alanina vem a seguir, com um grupamento metila. Cadeias laterais
hidrocarbnicas maiores so encontradas na valina, leucina e isoleucina. A prolina tambm tem
uma cadeia lateral aliftica, mas difere dos outros membros do conjunto dos vinte por sua cadeia
lateral ser ligada tanto ao nitrognio quanto ao tomo de carbono . Esta resultante estrutura

51
cclica influencia fortemente a arquitetura das protenas. Trs aminocidos com cadeias laterais
aromticas fazem parte do conjunto dos vinte. A fenilalanina contm um substituinte fenila
ligado a um grupamento metileno. O anel aromtico da tirosina contm uma hidroxila, o que torna a
tirosina menos hidrofbica do que a fenilalanina. O triptofano tem um anel indlico ligado a um
grupamento metileno. Dois aminocidos, serina e treonina , contm hidroxilas alifticas, o que as
tornam muito mais hidroflicas e reativas. Vamos agora aos aminocidos com cadeias laterais muito
polares, sendo altamente hidroflicos. A lisina e a arginina tm cargas positivas em pH neutro. A
histidina pode no ter carga ou t-la positiva, dependendo de seu ambiente local. As cadeias laterais
da arginina e da lisina so as mais longas no conjunto dos vinte.

O O O O O
H2N S
OH OH OH OH OH
NH2 NH2 NH2 NH2 NH2

L-isoleucina L-leucina L-lisina L-metionina L-fenilalanina

O O O O
OH O
H2N
OH OH OH OH
OH

NH2 NH2 HN NH2 NH2 O


NH2
L-treonina L-valina L-triptofano L-alanina L-aspargina

O O O O O O O
HO
OH HS OH HO OH H2N OH OH
O NH2 NH2 NH2 NH2 NH2

cido L-asprtico L-cistena cido L-glutmico L-glutamina glicina

O O O NH O O
H
N
HO OH N OH OH H2N N OH OH
NH2 H NH
NH NH
2 HO 2 HN 2

L-serina L-prolina L-tirosina L-arginina L-histidina

Fig. 1. Estrutura dos 20 L-aminocidos encontrados em protenas. O vigsimo primeiro


aminocido, no representado aqui a selenocistena. Nesse aminocido, o tomo de enxofre da
cistena substitudo por um tomo de selnio.

Existem dois aminocidos com cadeias laterais cidas, o cido asprtico e o cido glutmico.
Esses aminocidos so geralmente chamados de aspartato e glutamato para salientar que suas
cadeias laterais tm, quase sempre, cargas negativas no pH fisiolgico. A glutamina e a
asparagina so derivados no carregados de glutamato e aspartato que contm uma amida
terminal em vez de um carboxilato. Sete dos vinte e um aminocidos tm cadeias laterais
facilmente ionizveis. Um tomo de enxofre est presente nas cadeias laterais de dois

52
aminocidos. A cistena contm uma sulfidrila (-SH) e a metionina possui um tomo de enxofre
em uma ligao tioter (-S-CH3). Ambas as cadeias laterais que contm enxofre so
hidrofbicas. Deve-se destacar que a maioria destes aminocidos presentes em protenas possui
pelo menos um centro quiral definido com estereoqumica (S) com exceo da cistena que
(R) (notaes de Cahn-Ingold-Prelog) e da glicina que no possui centro quiral (Figura 1);
ainda, todos os aminocidos comuns em protenas so freqentemente denominados L-
aminocidos, baseados na nomenclatura do gliceraldedo (configuraes de Fisher). Estas
caractersticas conferem a estes compostos uma grande diversidade qumica e estrutural,
permitindo que estes possam constituir uma gama enorme de diferentes protenas com
diferentes arranjos espaciais e as mais diversas funes (Figura 2).
Alguns autores relatam que para formar uma protena necessria uma cadeia com mais de
70 aminocidos. J os peptdeos (fragmentos de protenas) podem ser formados por dois ou
mais aminocidos.

1
Fig. 2. Esquema representativo dos diferentes nveis de estrutura protica da hemoglobina

FUNDAMENTAO TERICA

Propriedades cido-base dos aminocidos e protenas

Os aminocidos na forma livre possuem, no mnimo, dois grupos ionizveis, que so os


grupos -carboxlico e -amino. Alguns aminocidos possuem um terceiro grupo ionizvel na
cadeia lateral. Os aminocidos com cadeias laterais com grupos ionizveis tais como lisina,
arginina, glutamato, aspartato, histidina, cistena e tirosina so os responsveis pelas
propriedades cido-base das protenas. Ao se fazer a titulao de um aminocido com uma base
forte na escala de pH de zero a 14, o aminocido atuar como um tampo e apresentar
alteraes de carga lquida de sua estrutura conforme ilustrado abaixo.
53
O O O O O O
- - -
O O
OH -
OH - -
OH - -

HO OH HO O O O O O
+
+ NH NH2
+ NH 3

NH3 3

Zwitterion -1 -2
+1
O O
O O
H - H - -
+ OH + OH N -OH N O -

N OH N O -
O
+ + NH+ NH2
N
NH3 NH3 N 3

N N H H
H H
+2
+1 Zwitterion -1
O - O - O
- +
O

+ OH H3N - OH OH HN
HN HN 2 -

3 2 -
OH O O O
+ + + +
NH NH3 NH NH3
3 3

+2 +1 Zwitterion -1

Assim, os aminocidos atuam como tampes duplos ou triplos. Abaixo temos o exemplo da
curva de titulao da histidina na qual se observa a mxima capacidade tamponante exibida por
esse aminocido em 3 faixas de pH: de 0,8 a 2,8, de 5 a 7 e de 8,2 a 10,2.

Fig. 3. Curva de titulao da


histidina.

Quando os aminocidos estabelecem as ligaes peptdicas, suas cadeias laterais no


perdem as propriedades de ionizao, porm, podem ter seus valores de pKa bastante alterados
devido vizinhana de outros grupos carregados. Assim, em um peptdeo ou em uma protena,
os grupos ionizveis sero o N-terminal, o C-terminal e as cadeias laterais ionizveis dos
aminocidos. Abaixo vemos o efeito da titulao, com uma base forte, de um peptdeo formado
pelos mesmos 3 aminocidos mostrados acima. Nesse caso, verificamos que a carga lquida
tambm varia com o pH do meio e em um determinado pH o peptdeo tambm ficar na forma
zwiterionica.

54
- -
O H OH O H O O H O
+ + + O
H3N H ON H3N H ON H3N H N
N O N O N O

OH- OH-
+ + +
HN HN HN
NH NH NH
O
O OH OH O O-
+ + +
+3 NH3 +2 NH3 +1 NH3

OH-

- -
O H O- O H O O H O
+ +
H 2N H O N HN H O HN H O N
N O 3 N N O 3 N O

N OH- N OH- N

NH NH NH
- -
O O O O- O O

+
NH2 NH2 NH3
-2 -1 Zero

Fig. 4. Formas inicas formadas durante a titulao de glutamilhistidinillisina com base forte.

No ponto isoeltrico, uma protena apresenta carga lquida igual a zero e essa
propriedade pode ser utilizada para separar e purificar protenas. Uma estratgia bastante usada
em protemica a eletrofocalizao na qual uma mistura de protenas colocada em uma
matriz (fita) que apresenta diferentes valores de pH ao longo de sua extenso. Ao submeter a
amostra, nesse meio, a uma diferena de potencial, as protenas migraro para o polo oposto ao
de sua carga lquida no pH da regio de partida e estacionaro na regio da fita no qual o pH
igual ao seu pI. Em seguida, efetua-se a separao das protenas de mesmo pI e massas
moleculares diferentes submetendo a amostra a uma eletroforese em sentido perpendicular
(Fig.5). Essa tcnica chamada de eletroforese bidimensional.

Fig. 5. Eletroforese

bidimensional.

A precipitao de protenas pode ser induzida por: adio de sais (Precipitao salina),
adio de solventes, variao de pH (Precipitao isoeltrica) e adio de polmeros sintticos.
Esse ltimo parece ter efeitos diferentes quando combinado com variao de pH e adio de
sais e o mecanismo ainda no est totalmente elucidado. Sais se dissociam em soluo aquosa e
competem com as protenas pela gua de solvatao. Em baixa concentrao salina, a
55
solubilidade das protenas aumenta, pois os ons do sal ajudam a reforar a camada de
solvatao (salting in). Em alta concentrao salina, a solubilidade das protenas diminui pois
os ons do sal competem pelas molculas de gua disponveis para formar a sua prpria camada
de solvatao (salting out). Sais com nions divalentes so mais eficientes do que os
monovalentes na precipitao de protenas. Solventes miscveis com a gua diminuem a
constante dieltrica do meio e desorganizam a camada de solvatao das protenas. Os mais
utilizados so etanol e acetona. Protenas colocadas em meio com pH igual ao seu pI tendem a
precipitar, pois tendo carga neutra, suas molculas no se repelem e tendem se agregar.

A C

B D

Fig. 6: Solubilidade da albumina modulada pelo pH do meio, de valor abaixo, igual e acima de seu pI
(4,7) e pela adio salina (dois diferentes sais em diferentes concentraes). Em A, solues de
albumina bovina (BSA) em tampo acetato de potssio nos valores de pH indicados nos tubos, ou seja,
3, 4,7 e 7,0, respectivamente nos pares de tubos, 1/4, 2/5 e 3/6; em B, temos os tubos nas mesmas
condies descritas para o quadro A, com a diferena que 0,37 g de KCl e 0,40 g de sulfato de amnio
foram adicionadas os tubos 1, 2, 3 e 4, 5, 6, respectivamente. Em C e D as condices so idnticas s de
B, exceto pelas concentraes de sal adicionadas que foram 0,74 g de KCl e 0,80 g de sulfato de amnio
(C) e 1,11 g de KCl e 1,20 g de sulfato de amnio (D).

Fig. 7: Solubilidade da albumina em valores de pH do meio abaixo, igual e acima de seu pI (4,7), e modulada
pela adio do polmero sinttico polietilenoglicol na ausncia e presena de sais de nions monovalentes e
divalentes (cloreto de potssio e sulfato de amnio, respectivamente): Cada tubo de ensaio contm 1,5 mL de
soluo de albumina bovina (BSA) em tampo acetato de potssio nos pHs 3, 4,7 e 7 e 0,5 ml de soluo de
PEG 4000 40%, seguida da adio de 0,74 g de KCl e de 0,80 g de (NH4)2SO4.

No pI, uma protena apresenta a mais baixa solubilidade em meio aquoso e pode ser
facilmente precipitada pelo uso de solventes ou do polmero polietilenoglicol. Os fatores que
56
governam a precipitao da albumina pelo polmero sinttico polietilenoglicol (PEG) foi
5
previamente investigado por Ingham (1978) para determinar as bases moleculares da precipitao

de protenas por polmeros sintticos. A concentrao de PEG 4000 requerida para precipitao da
albumina foi mnima no ponto isoeltrico da protena. Porm, o aumento da concentrao de sal
desviou para valores mais altos a quantidade de PEG necessria para precipitao no pI. Efeito
oposto do sal foi observado em pH abaixo do pI. Assim, essa propriedade pode ser explorada no
processo de separao e purificao de protenas. Se tivermos, por exemplo, uma mistura de duas
protenas sendo uma com pI = 4 e outra com pI = 7, podemos nos valer do uso de PEG para separ-
las. Se ajustarmos o pH para um valor igual ao pI de uma delas e adicionarmos PEG, a protena que
esteja no pI ir precipitar em grande quantidade e a outra protena permanecer em soluo. O uso
de polietilenoglicol para precipitao de albumina no pI e o efeito de sal na solubilidade da
albumina ser o tema da presente aula.

Objetivo

Verificar o efeito da adio de polietilenoglicol sobre a solubilidade da albumina


modulada pelo pH do meio (abaixo, igual e acima de seu pI), em condies de baixa e alta fora
inica, para tanto, ajustaremos o pH da soluo de protena com KOH.

Materiais

Por grupo (para os 6 tubos de ensaio)

3,0 mL de soluo aquosa de PEG (polietilenoglicol) 4000 40%,


14 mL de tampo acetato de potssio (H3CCOOK) (0,2 M) preparado com cido actico
glacial
2,5 mL BSA (Bovine serum albumin albumina bovina) (270 mg/mL),
Soluco de KOH (hidrxido de potssio) (1 M)
Soluo de HCl (1M)
2 copos de Becker de 10 mL cada, um identificado como com PEG e outro pH 3
1 copo de Becker de 25 mL.
1 basto de vidro
1 estante para tubos de ensaio com 6 tubos numerados de 1 a 6,
Pipetas automticas de 10000, 1000, 200 e 10 L com respectivas ponteiras,
Medidor de pH (pHmetro).

Uso coletivo
KCl (cloreto de potssio),
Papel de alumnio (para pesar o KCl),
Balana,

57
Observaes para os tcnicos de laboratrio
Soluo aquosa de PEG a 40% : Em um bquer, pesar a massa de PEG 4000,
correspondente a 40% para o volume total da soluo desejada (ex. 100 mL de soluo,
adicionar 40 g de PEG 4000). Nesse recipiente adicionar um pouco de gua, observando
o limite do volume total da soluo e solubilizar o PEG 4000 sob aquecimento a 50 C e
agitao. Transferir o volume para o balo volumtrico e completar com gua.
O tampo acetato de potssio (200mM) preparado com cido actico glacial e titulado
com KOH ou KCl at o valor de pH desejado. Vale ressaltar que o tampo acetato de
potssio possui pKa 4,7 e portanto a faixa de mximo tamponamento fica entre 3,7 e
5,7. cido actico e acetato so as formas cido e base conjugada do tampo acetato
cujas propores determinam o pH da soluo tamponada. No caso especfico dessa
aula dever ser preparada a soluo com cido actico glacial (0,2 mol/L) e, durante o
experimento, os alunos iro acrescentar o KOH ou HCl, caracterizando assim o tampo
acetato de potssio. Para preparar essa soluo s usar a frmula da molaridade e usar
o cido actico glacial como tampo. Ex.: Para 30 mL de soluo tampo, utilizar 343,5
L de cido actico e 29,656 mL de gua deionizada. Ficar acetato de potssio quando
os alunos adicionarem o KOH.

A soluo estoque de BSA pode ser preparada sob aquecimento controlado de at 40C
e agitao suave. Deve ser mantida na geladeira at o incio da aula.

Procedimento
(Cada grupo dever fazer os procedimentos dos seis tubos de ensaio)

1) Adicione 11 mL da soluo tampo preparada com cido actico (0,2 M) em um copo de


Becker de 25 mL; mea e anote o valor do pH. _______
2) A essa soluo tampo adicione 2 mL de BSA (270 mg/mL) e agite com um basto de
vidro, suavemente para evitar a formao de espuma; mea e anote o valor do pH. ____
3) Retire 6,0 mL dessa soluo (tampo + BSA) e coloque em um Becker de 10 mL
identificado como com PEG. Mantenha o restante na soluo no Becker de 25 mL,
identifique-o como sem PEG e reserve-o para o item 13 do procedimento;
4) Adicione 2,0 mL de soluo aquosa de PEG (4000, 40%) no Becker de 10 mL identificado
como com PEG onde foi colocado os 6 mL da soluo (tampo + BSA) e agite suavemente;
5) Verifique o valor do pH com o auxlio de um pHmetro e anote o valor encontrado; pH______
6) Retire 2 mL dessa soluo, coloque-a em um novo Becker de 10 mL, identificado como
pH 3 acrescente a esse aproximadamente 5L de soluo de HCl (1M) para ajustar o pH

58
deixando-o em torno de 3. Transfira essa soluo pH 3 para o tubo de ensaio 1. Anote na tabela
1. Lave cuidadosamente esse Becker.
7) Acrescente aproximadamente 220 L de soluo de KOH 1M, gota a gota, soluo
restante do Becker com PEG at que a soluo fique turva (esbranquiada). Verifique o valor
do pH dessa soluo nessa condio, esse deve corresponder ao pI da BSA.
Obs.: O KOH deve ser acrescentado aos poucos soluo de BSA para que no haja o risco da
protena desnaturar.
8) Retire 2,0 mL dessa soluo e guarde-a no tubo de ensaio 2. Anote na tabela 1.
9) Continue ajustando a soluo restante do Becker com PEG at pH neutro (pH=7). Faa
esse procedimento cuidadosamente utilizando pipeta, acrescentando aproximadamente 500
L de soluo de KOH, gota a gota. Mea o valor do pH a cada gota depositada. Quando estiver
prximo de atingir o valor do pH desejado, v adicione alquotas de apenas 5 L de KOH,
sempre conferindo o pH para que no haja o risco do valor ultrapassar o desejado.
10) Retire 2,0 mL dessa soluo e guarde-a no terceiro tubo de ensaio (tubo 3), anotando o
valor do pH na tabela 1;
11) Coloque os trs tubos, na ordem 1, 2, 3, na estante de tubos de ensaio e fotografe. Anote
na tabela 1 as observaes quanto ao aspecto das solues nos devidos pHs;
12) Pese e adicione 0,74 g de KCl em cada tubo de ensaio (1, 2 e 3). Agite vigorosamente as
solues, observe e fotografe. Anote na tabela 1 os aspectos das solues aps a adio de sal.
13) A partir desse tem voc ira utilizar a amostra sem PEG que foi reservada no Becker de
25 mL no tem 3. Retire 2 mL dessa soluo e transfira para o Bquer de 10 mL identificado
com pH 3 limpo e acrescente aproximadamente 5 L de soluo de HCl (1M) para ajustar
o pH deixando-o em torno de 3. Guarde essa soluo de pH 3 em um tubo de ensaio (tubo 4).
Anote na tabela.
14) Acrescente aproximadamente 220 L de soluo de KOH 1M, gota a gota, soluo que
havia ficado no Becker sem PEG at que essa fique turva (esbranquiada). Verifique o valor
do pH dessa soluo nessa condio, esse deve corresponder ao pI da BSA.
Obs.: O KOH deve ser acrescentado aos poucos soluo de BSA para que no haja o risco da
protena desnaturar.
15) Retire 2,0 mL dessa soluo e guarde-a no tubo de ensaio 5. Anote na tabela 1.
16) Continue ajustando a soluo do Becker sem PEG at pH neutro , como no tem 9.
17) Retire 2,0 mL dessa soluo e guarde-a no terceiro tubo de ensaio (tubo 6).
18) Coloque os trs tubos na estante de tubos de ensaio, na ordem 4, 5, 6, e fotografe. Anote
na tabela 1 as observaes em relao turbidez das solues (precipitao da protena) nos
devidos pHs;
59
19) Pese e adicione 0,74 g de KCl em cada tubo de ensaio (4, 5 e 6). Agite vigorosamente as
solues, observe e fotografe. Anote na tabela 1 os aspectos das solues aps a adio de sal.

Tabela 1: reagentes adicionados em cada tubo de ensaio.


Tubo 1 Tubo 2 Tubo 5
pH ____ pH _____ Tubo 3 Tubo 4 pH _____ Tubo 6
pH ___ pH _____ pH ____
(pI) (pI)

BSA + H3CCOOK +PEG 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL - - -

BSA + H3CCOOK - - - 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL

Aparncia da amostra
(turbidez)

KCl 0,74 g 0,74 g 0,74 g 0,74 g 0,74 g 0,74 g

Aparncia da amostra
(turbidez)

Anlise dos dados

Em casa, monte um texto com as fotos inseridas no qual se discute os fenmenos


ocorridos durante as etapas do procedimento. Proponha uma explicao para o sal (KCl) ter
promovido a precipitao da albumina com PEG em pH menor do que o pI. Recomendamos a
leitura do artigo de Ingham, 1978 e a montagem de um resumo sobre os mecanismos propostos
pelo autor para explicar a precipitao da albumina promovida pelo PEG.

60
EXERCCIOS

1) Atribua o nome de cada aminocido (como exemplificado para a L-alanina) comparando as


estruturas qumicas (Figura 1) com as projees moleculares 3D abaixo. Nas estruturas,
considere os tomos de carbono em cinza, oxignio em vermelho, nitrognio em azul, enxofre
em amarelo e hidrognio em branco. No se esquea de considerar as mltiplas ligaes que
esto implcitas nestes modelos (por exemplo, uma nica ligao entre um dos carbonos e um
dos oxignios da L-alanina, significando que h uma dupla ligao pois o oxignio bivalente
veja a posio circulada).

L-alanina

/ 3,9 / 4,3

61
62
63
2) Durante uma aula de bioqumica o professor props aos seus alunos que observassem as
propriedades cido-base da albumina bovina (BSA). Para isso os alunos prepararam trs solues
de BSA (270 mg/mL) em tampo acetato de potssio (0,2 M): uma em pH 3, outra em pH 4,7 e
a terceira em pH 7. Em seguida, os alunos numeraram seis tubos de ensaio como: pH 3; pH 4,7;
pH 7; pH 3 + KCl; pH 4,7 + KCl; pH 7 + KCl e adicionaram 1,5 mL de soluo em cada tubo,
respeitando os pHs descritos nos rtulos (figura 1).

Fig. 1: Solues de albumina (270 mg/mL) em tampo acetado de potssio (2 M), nos pHs
indicados nos tubos de ensaio.

Em seguida os alunos adicionaram 0,5 mL de PEG 4000 (40%) em cada tubo e observaram que
os tubos em pH 4,7 turvaram (figura2).

Fig. 2. Solues de albumina (270 mg/mL) em tampo acetado de potssio (2 M) e 0,5 mL de


PEG 4000 (40%), nos pHs indicados nos tubos de ensaio.

Na sequncia, os alunos adicionaram 7,4 mg de KCl nos tubos indicados com KCl. Esses tubos
foram agitados e verificou-se alteraes nos pHs 3 e 4,7 (figura 3).

Fig. 3. Solues de albumina (270 mg/mL) em tampo acetado de potssio (2 M) e 0,5 mL de


PEG 4000 (40%). Foram adicionados 7,4 mg de KCl nos trs tubos da direita. Os pHs esto
indicados nos tubos de ensaio.

64
Aps esse experimento, pergunta-se:
A-Por que o PEG 4000 (40%) precipitou a BSA em pH 4,7 e no precipitou a albumina nos
demais valores de pH (figura 2)?

B- Por que o KCl solubilizou a BSA em pH 4,7 e precipitou a BSA em pH 3 (figura 3)?

Referncias Bibliogrficas

1. LEHNINGER, A.L; NELSON, D.L; COX, M.M. Princpios de bioqumica. 4 ed. So Paulo: Sarvier,
2006. 1202 p.
2. BERG, M.J.; TYMOCZKO, J.L., STRYER, L. Biochemistry 5th. Edition. W. H. Freeman and
Company. New York, 2002.
3. BETTELHEIM, F.A.; LANDESBERG, J.M. Laboratory Experiments for General, Organic &
Biochemistry, Harcourt College Pub, New York, 2000.
4. VOET, D.; VOET, J.G. Bioqumica, 3 ed., Porto Alegre: Artmed, 2006.
5. INGHAM. K. C. Precipitation of Proteins with Polyethylene Glycol: Characterization of
Albumin. Arch. Biochem. Biophys. 186, 106-113, 1978.

Resultados esperados

65
Experimento 4 - Propriedades de surfactantes e lipdios

Abstract

The aim of this experiment is to introduce the students of the Federal University of ABC
to the procedures related to the characterization of lipids employing soybean as a source of
triacylglycerol, one type of biologic lipids. Furthermore the students will learn the
saponification concept through the alcaline hydrolysis of soybean triacylglycerol and the
physical and chemical properties of the soap obtained will be exploited.

Resumo

O presente experimento visa apresentar aos alunos de Bacharelado em Cincias e


Tecnologia, da Universidade Federal do ABC, caractersticas fsico-qumicas de lipdios. Sero
utilizados o sabo de coco para explorar as caracterstias fsico-qumicas dos surfactantes e
diferentes tipos de gorduras para explorar o efeito do grau de insaturao de seus cidos graxos
constituintes no ponto de fuso das mesmas.

Introduo

Os lipdios so representados por um grupo de biomolculas de baixa massa molecular


que apresentam estruturas qumicas bastante variadas, baixa solubilidade em gua de tal
forma que so extraidos dos tecidos biolgicos com uso de solventes de baixa polaridade tais
como ter e clorofrmio . A diversidade de estruturas apresentadas pelos lipdios faz com que
esses compostos tenham a capacidade de exercer diversas funes biolgicas atuando desde
componentes de membranas celulares, isolantes trmicos, sinalizadores celulares, pigmentos e
reservas de energia (leos e gorduras). Adicionalmente, os prprios lipdios ou seus derivados,
podem tambm exercer funes de vitaminas e hormnios. As principais classes de compostos
pertencentes ao grupo dos lipdios so os triacilgliceris, glicerofosfolipdeos, esfingolipdios,
glicolipdios e esterides (Figura 1).

66
(A)

(B)

Fig. 1. As principais classes de lipdios biolgicos. Em (A) todos os lipdios mostrados


apresentam glicerol ou esfingosina, estrutura central, ligados a cidos graxos. (B) Estrutura de
trs hormnios esterides.

Tipicamente, os lipdios apresentam em suas estruturas longas cadeias carbnicas, como


os cidos graxos e isoprenos, ou mltiplos anis interligados, como no caso dos esterides.
Vrias classes de lipdios apresentam cidos graxos como componentes estruturais. cidos
graxos so cidos monocarboxlicos, molculas anfipticas que apresentam uma regio polar,
representada pelo grupo carboxila (ionizado em pH neutro), e uma regio apolar, representada
por uma cadeia carbnica com comprimento variando entre 4 a 36 tomos de carbono (Figura
2). Estruturalmente, a cadeia carbnica dos cidos graxos caracterizada pela presena de
nmero par de carbonos formando uma estrutura no ramificada que pode ser saturada ou
conter uma, duas ou mais insaturaes.

67
Grupo
carboxila

Insaturao

Cadeia
carbnica

(A) (B)

Fig. 2. Estrutura de cidos graxos. Os cidos graxos so compostos anfipticos formados por
uma longa cadeia carbnica apolar e um grupo carboxila polar. As cadeias carbnicas dos
cidos graxos no possuem ramificaes e podem ser saturadas, como no caso do cido
esterico, (A) ou insaturadas, como no caso do cido oleico (B).

Lipdios como triacilgliceris, fosfolipdios, glicolipdios e esfingolipdios apresentam


cidos graxos esterificados em suas estruturas. Uma das funes mais importantes dos cidos
graxos nas clulas a participao na construo das membranas celulares, finas camadas
lipdicas que circundam todas as clulas e suas organelas internas. As membranas celulares so
compostas em grande parte por fosfolipdios, pequenas molculas constitudas principalmente
por cidos graxos e glicerol. Outra importante funo desempenhada pelos cidos graxos est
associada manuteno de uma reserva energtica celular. De fato, os cidos graxos podem ser
estocados no citoplasma celular na forma de gotculas lipdicas constitudas por molculas de
triacilgliceris. Os triacilgliceris, tambm conhecidos como triglicerdeos, triglicrides ou
gorduras neutras, representam os lipdios mais abundantes na natureza sendo formados pela
esterificao de trs cidos graxos a uma molcula de glicerol. este estabelecimento de ligaes
ster entre os precursores polares dos triacilgliceris (hidroxilas do glicerol e carboxilas dos
cidos graxos) que confere ao composto carter essencialmente apolar, permitindo com que seja
armazenado nas clulas de forma praticamente anidra (Figura 3).

68
Glicerol

Triacilglicerol

Fig. 3. Triacilglicerois so compostos apolares resultantes da formao de ligaes ster entre


as hidroxilas livres de uma molcula de glicerol e os grupos carboxila dos cidos graxos.

As gorduras animais e leos vegetais so misturas de triacilgliceris, que diferem na sua


composio em cidos graxos e, conseqentemente, no seu ponto de fuso. Os triacilgliceris
das gorduras animais so ricos em cidos graxos saturados, o que atribui a esses lipdeos uma
consistncia slida temperatura ambiente. J os triacilgliceris origem vegetal so ricos em
cidos graxos poliinsaturados sendo, portanto, lquidos temperatura ambiente. Os leos
vegetais so utilizados para a fabricao de margarinas atravs de um processo de hidrogenao
que reduz parte de suas duplas ligaes e os torna slidos temperatura ambiente.

cidos graxos saturados Cadeia carbnica no apresentam ligaes duplas entre os


tomos de carbono e, assim, contem o nmero mximo possvel de hidrognios.


cidos graxos insaturados Cadeia carbnica possui uma ou mais ligaes duplas entre
tomos de carbono contendo o nmero mximo possvel de hidrognios.

Os lipdios anfipticos, tais como os cidos graxos, quando so adicionados a um meio


aquoso, tendem a agregar-se, organizando-se espontaneamente em estruturas plurimoleculares.
Essas estruturas permitem maximizar as interaes hidrofbicas entre as cadeias carbnicas,
isolando-as da gua, e deixar os grupos polares em contato com o solvente, com o qual podem
interagir. Tais arranjos moleculares constituem o estado de menor energia livre para esses lipdios
em gua e resultam da presena de duas regies com solubilidades diferentes na mesma molcula.

69
O tipo de estrutura formada determinado pela geometria da molcula do lipdio
anfiptico (Figura 4). Lipdios com uma nica cadeia carbnica, como sabes de detergentes,
devido a forma cnica e afilada de suas molculas, formam, preferencialmente, micelas. Nesta
estrutura esfrica, as cadeias carbnicas organizam-se no interior, isolando-se da gua, e os
grupos polares posicionam-se na superfcie externa, interagindo com o solvente. A formao de
micelas uma etapa importante na digesto dos lipdios da dieta. A maioria dos fosfolipdios e
glicolipdios associam-se em uma camada dupla de molculas, chamada bicamada lipdica. Esta
estrutura permite uma agregao mais estvel das molculas desses lipdios, que tm forma
cilndrica pela presena de duas cadeias apolares.

As molculas de lipdios alinham-se lado a lado, compondo duas monocamadas e as


cadeias carbnicas das monocamadas agrupam-se frente a frente de modo a criar um domnio
hidrofbico no meio da bicamada; os grupos hidroflicos dispem-se na superfcie das duas faces
da bicamada, interagindo com a gua. Bicamadas lipdicas tendem a se converter em estruturas
fechadas, chamadas lipossomos, que so mais estveis porque no apresentam caudas
hidrofbicas expostas ao solvente, como acontece na periferia das bicamadas planas. Lipossomos
so, portanto, vesculas sintticas esfricas formadas por uma bicamada lipdica contnua, que
delimita uma cavidade interna preenchida por solvente.

Cavidade Aquosa

(A) Micela (B) Bicamada Lipdica (C) Lipossomo

Fig. 4. Estruturas formadas por lipdios anfipticos em meio aquoso. (A) Micelas so formadas
por molculas de lipdios com uma nica cadeia carbnica, cadeias estas que se localizam no
interior dessas estruturas. (B) Bicamada lipdica uma estrutura bidimensional na qual as
cadeias carbnicas formam um domnio central hidrofbico, isolando-se da gua, exceto nas
extremidades da bicamada; a estrutura comumente formada por lipdios anfipticos com duas
cadeias de hidrocarbonetos. (C) Liposssomo uma vescula oca, resultante do fechamento de
uma bicamada lipdica, dotada de uma cavidade central preenchida por solvente.

70
1. Fundamentao Terica

Os lipdios representam um grupo de compostos com estrutura bastante variada. Vrias


classes de lipdios apresentam cidos graxos como componentes estruturais entre eles, os
fosfolipdeos, glicolipdeos e os triacilgliceris. Os lipdios podem ser caracterizados por suas
propriedades fsico-qumicas. Em geral, possuem baixa solubilidade em gua enquanto
apresentam alta solubilidade em solventes orgnicos como clorofrmio, ter, benzeno, mistura
de Folch (clorofrmio:metanol), entre outros.

Os triacilgliceris, que constituem o principal grupo de lipdios, podem ser hidrolisados


liberando cidos graxos e glicerol. Se esta hidrlise feita mediante aquecimento em meio
alcalino (hidrlise alcalina), formam-se sais de cidos graxos (sabes) e o processo chamado
saponificao (Figura 5). Este o princpio da fabricao dos sabes a partir de gordura animal
fervida em presena de NaOH ou KOH.

Triestearina Glicerol Estearato de Sdio

Fig. 5. Hidrlise alcalina de triacilgliceris. Triacilgliceris, mediante aquecimento em presena


de bases fortes, como hidrxido de sdio (NaOH) ou hidrxido de potssio (KOH), sofrem
hidrlise produzindo sais de cidos graxos (sabes). No esquema acima mostrada a hidrlise
do triestearina na presena de NaOH dando origem a glicerol e sal sdico (estereato de sdio).

Como so cidos graxos, os sabes obtidos da hidrlise de gorduras so molculas


anfipticas apresentando em sua estrutura uma longa cadeia carbnica (cauda apolar, lipoflica)
e um grupo carboxilato (cabea polar, hidroflica). Dessa maneira, os sabes, quando em soluo
aquosa, associam-se por interaes hidrofbicas entre as caudas apolares formando um uma
pelcula lipdica na superfcie do liquido ou dando origem a estruturas como as micelas (Figura
6).
71
Pelcula lipdica

Grupo carboxilato
Cadeia carbnica

Micela
Sabo

Fig. 6. Formao de micelas a partir das interaes entre sabes dispersos em soluo aquosa.

Propriedades dos sabes:

Sob condies especficas, os cidos graxos dos sabes podem ser precipitados. A adio
de cidos fracos, como cido actico, leva a formao de cidos graxos insolveis por causa do
baixo grau de dissociao (Figura 7).

OLEATO DE POTSSIO CIDO ACTICO CIDO OLICO ACETATO DE


(precipita) POTSSIO

Fig. 7. Precipitao de cidos graxos devido ao protonamento do grupo carboxilico promovido


pelo cido actico . Em presena de cido actico (cido fraco), cido olico (cido graxo)
precipitado a partir da hidrlise cida do oleato de potssio (sabo).

Os sabes precipitam quando so usados em guas ricas em sais de clcio ou magnsio


(guas duras). Os ons clcio e magnsio da gua reagem com cidos graxos formando sais
insolveis. Os sabes tambm podem precipitar pela adio de excesso de eletrlitos, os quais
reprimem a dissociao dos sabes, fazendo com que as micelas percam a carga e precipitem.

OLEATO DE POTSSIO CLORETO DE OLEATO DE CLCIO CLORETO DE


CLCIO (precipita) POTSSIO

Fig. 8. Reao de precipitao de sabo atravs de salificao. A exposio de sabes, como o


oleato de potssio, ambientes ricos em sais de clcio ou magnsio induz a formao de sabes
insolveis.
72
Os sabes possuem propriedades emulsificantes. Emulso a mistura entre dois lquidos
imiscveis em que um deles (fase dispersa) encontra-se na forma de pequenos glbulos dispersos
em meio ao outro (fase contnua). Minsculas partculas de leo ou solventes orgnicos so
mantidas em suspenso numa soluo aquosa. Porm, quando as duas fases so misturadas ou
agitadas vigorosamente, essas partculas formam uma emulso onde os leos ou os solventes
orgnicos tendem a dispersar-se pela soluo. Com o tempo, as emulses tendem a retornar para
o estado estvel podendo se observar duas ou mais fases distintas (Figura 9A). Os sabes so
agentes emulsificantes, pois quando adicionados s emulses, tendem a torn-las mais estveis e
homogneas (Figura 9B).

(A)

AGITAO TEMPO

MISTURA EMULSO MISTURA

SABO

(B)

AGITAO

MICELA

MISTURA EMULSO

Fig. 9. Propriedade emulsificante dos sabes. Uma mistura de dois lquidos imiscveis pode
formar uma emulso atravs de agitao (fornecimento de energia). Contudo, as emulses so
instveis e tendem a tornar-se misturas com o passar do tempo (A). Os sabes agem como
surfactantes estabilizando a emulso formada atravs da formao de micelas com leos ou
solventes orgnicos. As cadeias hidrocarbnicas no-polares dos sabes dissolvem-se no leo
ou solvente orgnico enquanto os grupos inicos polares na fase aquosa. As gotculas
carregadas negativamente repelem-se mutuamente (B).

Curiosidade: Um subproduto da manufatura de sabes a glicerina (glicerol), da qual se pode


obter a nitroglicerina, um poderoso explosivo. Durante a I e II Guerras Mundiais, as donas de

73
casa guardavam o excesso de leo e gorduras de cozinha e o devolviam para a recuperao da
glicerina.

2. Objetivos da aula

A aula apresenta como objetivos verificar o efeito de pH na formao de agregados


supramoleculares de surfactantes, no caso, sabo de coco fabricado a partir da hidrlise da gordura
de coco (saponificao). Adicionalmente a aula ter por objetivo verificar o efeito do grau de
insaturao dos cidos graxos no ponto de fuso dos mesmos e das gorduras que integram.

OBS: Nessa aula tambm dever ser iniciado o experimento referente a aula de Acares
(Aula 5), o qual encontra-se na Parte III dessa aula.

3. Procedimento experimental (A turma dever ser dividida em 6 grupos)

Parte I

Materiais e vidrarias

Azeite de oliva extra virgem e leo de algodo puro (armazenados em temperatura ambiente)
manteiga, gordura vegetal hidrogenada e banha de porco (armazenados em geladeira)

5 tubos de ensaio por grupo, identificados e contendo individualmente cerca de 1mL ou 1 g


de cada um dos lipdeos listados acima. Os leos sero pipetados pelos alunos e os slidos sero
disponibilizados j fracionados pelos colaboradores da disciplina.

Estante para tubos de ensaio

Banho-maria (bquer de 250 mL na chapa de aquecimento regulada inicialmente para


aproximadamente 40C e se necessrio ajustar para temperatura mais elevada)

Termmetro

1 recipiente com gelo e sal de cozinha, por bancada, contendo um tubo de ensaio com 2 mL
de azeite de oliva extra virgem e um tubo de ensaio com 2 mL de leo de algodo que foram
mantidos no freezer por no mnimo 30 min

74
a) Numa primeira etapa, cada grupo dever pipetar 1 mL de cada leo e colocar em tubos de
ensaio separados. Fotografar lado a lado o tubo de ensaio contendo o leo de algodo e o tubo
de ensaio contendo o azeite de oliva temperatura ambiente.

Em seguida comparar os referidos leos com o seu similar que se encontra no recipiente com
gelo colocado sobre cada bancada. Observar o turvamento das amostras. Fotografar lado a lado
as amostras semelhantes.

b) Numa segunda etapa, cada grupo dever colocar os tubos de ensaio contendo a manteiga, a
gordura vegetal hidrogenada e a banha de porco em banho-maria, partindo de cerca de 30C.
Ligar o aquecimento somente aps colocar os tubos de ensaio. Acompanhar, atravs do
termmetro, a faixa de temperatura de fuso de cada lipdeo e anotar. Fotografar as amostras
aps todas atingirem o ponto de fuso.

Discuta:

1) O que explica a ordem de fuso dos diferentes lipdeos concomitante com o aumento de
temperatura?

2) O que explica a mudana de estado fsico (evidenciada pela turbidez da amostra) para os
dois leos colocados no gelo? Pesquise a composio de cidos graxos desses leos indicando o
ponto de fuso dos principais.

3) O que explica as diferentes coloraes dos lipdeos apresentados?

4) Pesquise e indique de maneira sucinta os processos industriais de gerao de gordura


vegetal hidrogenada.

As tabelas a seguir, baseadas na referncia (6), indicam o total em cidos graxos saturados e
insaturados de 21 leos e gorduras vegetais, avaliados por cromatografia a gs (GC-FID).

75
leo Total cidos leo Total cidos Total cidos ndice
graxos graxos
BOR 12,96 BOR 25,25 61,79 4,77
CAN 6,98 EPR 7,99 83,90 10,34
CRN 13,46 CAN 64,42 28,60 4,10
COR 13,87 CRN 26,11 60,43 4,49
SUN 12,36 COR 24,76 61,37 4,42
SUR 11,92 SUN 15,93 71,71 5,80
COT 25,73 SUR 17,11 70,97 5,95
EPR 8,11 COT 17,49 56,78 2,20
FCO 8,15 FCO 22,04 69,81 6,56
SOY 15,10 SOY 21,73 63,17 4,18
SYB 15,12 SYB 23,92 60,64 4,01
OEV 12,98 OEV 77,44 9,58 0,74
OPR 13,53 OPR 75,37 11,10 0,82
ORF 15,28 ORF 77,00 7,72 0,50
PEA 18,38 PEA 50,33 31,29 1,70
RBO 20,68 RBO 41,41 37,91 1,83
RIO 18,22 RIO 44,51 37,27 2,04
PAL 49,45 PAL 39,66 10,83 0,22
PLK 80,34 PLK 16,90 2,76 0,03
COC 90,69 COC 7,51 1,80 0,02

*BOR = borage; CAN = canola; CRN/COR = corn; SUN/SUR = sunflower; COT =


cottonseed; EPR = evening primrose; FCO = linseed; SOY/SYB = soybean; OEV = extra
virgen olive; POR = olive pomace; ORF = olive; PEA = peanut; RBO/RIO = rice bran; PAL =
palm; PLK = palm kernel; COC = coconut;

Desafio: Considerando que lipossomos de fosfatidilcolina de ovo e de soja so feitos


temperatura ambiente e aps pesquisar sobre a metodologia de preparo de lipossomos (itens 2.1,
2.2 e 2.3) no artigo Interaction of gramicidin with DPPC/DODAB bilayer fragments de Ana
Maria Carmona-Ribeiro, explique porque os lipossomos de DODAB so feitos sob aquecimento.

76
Parte II

Materiais
Reagentes
Soluo de sabo de coco obtida da diluio em gua deionizada aquecida e sob
agitao de sabo de coco puro em barra na proporo de 1:9 (m/v)
Soluo de NaOH (10 M)
Soluo de HCl ( 1 M)
gua deionizada
Materiais e vidrarias
3 tubos de ensaio por grupo
Estante para tubos de ensaio
Pipetador automtico e ponteiras de 1000 e de 100
L Bquer pequeno

1. Identificar os tubos de ensaio: 1, 2 e 3. Em cada um deles colocar 1 mL da soluo de sabo


de coco fornecida e acrescentar 1 mL de gua deionizada.
2. No tubo 2 acrescentar 100 L de HCl, observar e anotar a mudana ocorrida.
3. No tubo 3 acrescentar 100 L de HCl, em seguida 50 L de NaOH e agitar suavemente
misturando a soluo. Observar a mudana ocorrida. Fotografe os 3 tubos juntos.

1
2 3
(controle)

Soluo sabo de coco 1 mL 1 mL 1 mL

gua 1 mL 1 mL 1 mL

Soluo HCl (1 M) - 100 L 100 L

Soluo NaOH - - 50 L

Aspecto da soluo
(turvo,precipitado,lmpido)

77
Discuta:

1) Qual a natureza qumica do detergente do sabo de coco e como ele produzido.


2) Qual a organizao supramolecular que o surfactante do sabo de coco forma em gua.
3) Pesquise quais os outros surfactantes que frequentemente so usados nos produtos de
limpeza comerciais e suas estruturas.

Exercicos:

1) Para a produo de sabo caseiro usa-se uma mistura denominada potassa alcolica (1,75M
KOH, 95% etanol) misturada ao leo desejado (leo de cozinha, por exemplo), seguido de
aquecimento lento. Responda as questes abaixo:
A) Sabendo que a peso molecular do KOH 57, demonstre como preparar 2 litros de potassa
alcolica. B) Se adicionarmos um cido forte em uma soluo de sabo, qual o resultado
observado? Justifique.

4) Com o objetivo de caracterizar cidos graxos, um professor de bioqumica resfriou uma


amostra de azeite de oliva e outra de leo de amendoim a 0 C. Ele observou a
solidificao do leo de amendoim, mas o azeite de oliva permaneceu lquido. Explique
os resultados obtidos com base na estrutura molecular dos cidos graxos e seus
respectivos pontos de solidificao.

Resultado esperado

76
Parte III ( incio do experimento referente a Aula 5)

Materiais e vidrarias (para uma turma dividida em 6 grupos)

8 frascos de vidro com tampa (um por grupo e dois frascos para os controles PLA e
PLA /10% TPS)
Micropipetas de 10 L, 100 L e de 1000 L (um conjunto para cada grupo)

Reagentes

3 placas de PLA (grupos A,B e C uma placa por grupo) mais uma placa controle
3 placas de PLA /10% TPS (grupos D, E e F uma placa por grupo) mais uma placa
controle
Soluo alcolica de Cumeno hidroperxido 300 mM
Soluo aquosa de Cloreto de ferro II (FeCl2) 2 mM

Observaes:
1 - Preparar a soluo estoque de cumeno hidroperxido (300 mM) em etanol P.A.
( 110,8 L de cumeno e 1889,2 L de etanol = volume final de 2 mL)
2 - A soluo de Cumeno hidroperxido deve ser armazenada protegida da luz no freezer.e
descongelada a temperatura ambiente no momento da utilizao.
3 - A soluo de cloreto de ferro II deve ser armazenada protegida da luz a temperatura
ambiente.
4 - Agitar as solues antes da utilizao.
5 - Manipular as solues utilizando luvas.
6- As placas sero fornecidas pelo professor Derval Rosa. Essas devero serr cortadas com
2
tamanho mdio de 0,8 cm (ou adequado para ser colocada nos frascos).

Procedimento:

1) Separar a TURMA em 6 grupos (A, B, C, D, E e F)

2) Cada GRUPO dever seguir o PROTOCOLO proposto PARA A SUA LETRA, conforme
especificado abaixo e na tabela 1. O grupo A e o grupo D devero fazer tambm,
respectivamente, os grupos CONTROLE PLA e CONTROLE PLA/10% TPS. Cada controle
corresponde a respectiva placa mantida individualmente em um frasco com gua durante todo
o experimento.

GRUPO A:

1) Fotografar a placa de PLA antes do incio do experimento. Observar o aspecto da sua


superfcie.

2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (A) e adicionar no interior desse frasco 1990 L
de gua deionizada.

77
3) Adicionar 10 L de FeCl2 (2mM). Agitar a soluo.

4) Adicionar a placa de PLA.

5) Deixar a placa reagindo com a soluo por 7 (sete) dias.

6) Aps o perodo de incubao fotografar a placa de PLA e observar as mudanas ocorridas.

GRUPO B:

1) Fotografar a placa de PLA antes do incio do experimento. Observar o aspecto da sua


superfcie.

2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (B) e adicionar no interior desse frasco 1938 L
de gua deionizada.

3) Adicionar 62 L de cumeno hidroperxido (300 mM). Agitar a soluo.

4) Adicionar a placa de PLA.

5) Deixar a placa reagindo com a soluo por 7 (sete) dias. Obs.: O tcnicos do laboratrio
iro adicionar mais 62 L de cumeno hidroperxido a esse frasco, diariamente, at o dia da
prxima aula (de 4 a 5 adies).

6) Aps o perodo de incubao fotografar a placa de PLA e observar as mudanas ocorridas.

GRUPO C:

1) Fotografar a placa de PLA antes do incio do experimento. Observar o aspecto da sua


superfcie.

2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (C) e adicionar no interior desse frasco 1928 L
de gua deionizada.

3) Adicionar 10 L de FeCl2 (2mM) e 62 L de cumeno hidroperxido (300 mM). Agitar a


soluo. Obs.: O tcnicos do laboratrio iro adicionar mais 62 L de cumeno hidroperxido
a esse frasco, diariamente, at o dia da prxima aula (de 4 a 5 adies).

4) Adicionar a placa de PLA.

5) Deixar a placa reagindo com a soluo por 7 (sete) dias.

6) Aps o perodo de incubao fotografar a placa de PLA e observar as mudanas ocorridas.

78
GRUPO D:

1) Fotografar a placa de PLA /10% TPS antes do incio do experimento. Observar o aspecto
da sua superfcie.

2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (D) e adicionar no interior desse frasco 1990 L
de gua deionizada.

3) Adicionar 10 L de FeCl2 (2mM). Agitar a soluo.

4) Adicionar a placa de PLA /10% TPS.

5) Deixar a placa reagindo com a soluo por 7 (sete) dias.

6) Aps o perodo de incubao fotografar a placa de PLA /10% TPS e observar as mudanas
ocorridas.

GRUPO E:

1) Fotografar a placa de PLA /10% TPS antes do incio do experimento. Observar o aspecto
da sua superfcie.

2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (E) e adicionar no interior desse frasco 1938 L
de gua deionizada.

3) Adicionar 62 L de cumeno hidroperxido (300 mM). Agitar a soluo.

4) Adicionar a placa de PLA /10% TPS.

5) Deixar a placa reagindo com a soluo por 7 (sete) dias. Obs.: O tcnicos do laboratrio
iro adicionar mais 62 L de cumeno hidroperxido a esse frasco, diariamente, at o dia da
prxima aula (de 4 a 5 adies).

6) Aps o perodo de incubao fotografar a placa de PLA /10% TPS e observar as mudanas
ocorridas.

GRUPO F:

1) Fotografar a placa de PLA /10% TPS antes do incio do experimento. Observar o aspecto
da sua superfcie.

2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (F) e adicionar no interior desse frasco 1928 L
de gua deionizada.

3) Adicionar 10 L de FeCl2 (2mM) e 62 L de cumeno hidroperxido (300 mM). Agitar a


soluo. Obs.: O tcnicos do laboratrio iro adicionar mais 62 L de cumeno hidroperxido
a esse frasco, diariamente, at o dia da prxima aula (de 4 a 5 adies).

79
4) Adicionar a placa de PLA /10% TPS.

5) Deixar a placa reagindo com a soluo por 7 (sete) dias.

6) Aps o perodo de incubao fotografar a placa de PLA /10% TPS e observar as mudanas
ocorridas.

GRUPO CONTROLE PLA e GRUPO CONTROLE PLA /10% TPS

1) Identificar nos frascos o nome do grupo (em um controle PLA e no outro controle PLA
/10% TPS e adicionar no interior de cada frasco 2000 L de gua deionizada.

2) Adicionar a respectiva placa.

3) Deixar em incubao por tempo semelhante aos demais grupos.

OBSERVAO PARA OS COLABORADORES DA DISCIPLINA:

As placas devero permanecer reagindo com a soluo em mdia por 7 dias, sendo que
a adio de reagente quando indicado dever ser feita por 4 ou 5 dias, de acordo com o
permitido pelo calendrio do quadrimestre.

Antes da aula, descartar a soluo de todos os frascos, mantendo a placa no respectivo


recipiente destampado, para que essa esteja seca no momento da observao ao
microscpio ptico. Disponibilizar as placas no frasco para os alunos.

Tabela 1 - Resumo do procedimento experimental sobre o uso do amido termoplstico como


aditivo ao policido lctico para produo de material compsito de mais fcil degradao
no meio ambiente por mecanismos oxidativos.
Grupo CONTROLE
CONTROLE
A B C D E F PLA /10%
PLA (grupo A)
TPS (grupo D)
PLA PLA PLA
PLA /10%
Placa PLA PLA PLA /10% /10% /10% PLA
TPS
TPS TPS TPS
gua deionizada
1990 1938 1928 1990 1938 1928 2000 2000
(microlitros=L)
Cloreto de Fe II
(2mM) 10 -- 10 10 -- 10 -- --
(microlitros=L)
Cumeno
hidroperxido
-- 62 62 -- 62 62 -- --
(300mM)
(microlitros=L)
Adio diria de
cumeno
-- 62* 62* -- 62* 62* -- --
Hidroperxido
(microlitros=L)
*Feito pelos tcnicos de laboratrio

80
Referncias Bibliogrficas
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4 ed., So Paulo: Sarvier, 2006.
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Bioqumicas Qualitativas e Quantitativas, 1 ed., Ribeiro Preto: Tecmedd, 2004.
5. PETKOWICZ, I.; DE OLIVEIRA, C. L. Bioqumica: Aulas Prticas, 7 Ed., Editora UFPR, Paran,
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composition of vegetable oils and fats. B.CEPPA, Curitiba, v. 25, n. 1, p. 111-120, jan./jun. 2007.
7.CARVALHO, C.A.; OLIVARES-ORTEGA, C.; SOTO-ARRIAZA, M.A.; CARMONA-RIBEIRO
A. M. Interaction of gramicidin with DPPC/DODAB bilayer fragments. Biochimica et
Biophysica Acta 1818, 30643071, 2012.

81
Experimento 5 Acares para biologia e
materiais avanados.

Resumo

O objetivo da aula estudar o poder redutor dos acares no hidrolisveis e


hidrolisveis com uso de mtodo colorimtrico qualitativo. Para tanto sero usados a glicose,
o amido e a sacarose. Os resultados obtidos sero discutidos em funo da estrutura qumica
espacial adquirida em meio aquoso por este polissacardeo. O poder redutor dos acares
possui aplicaes como por exemplo para fins de diagnstico em exames laboratoriais. Ser
tambm estudada a aplicao dos acares, no caso o amido, na produo de materiais que
tenham propriedades de resistncia associada com maior rapidez e intensidade de degradao
ambiental. Para tanto, vamos comparar a degradao do policido lctico (do Ingls, PLA)
com o material compsito contendo 10% de amido termoplstico (do Ingls, TPS). Placas dos
dois materiais sero expostas degradao oxidativa promovida por ferro, cumeno-
hidroperxido e a combinao dos dois agentes. Os materiais sero analisados a olho nu e ao
microscpio tico. Essas observaes sero complementadas por medidas previamente feitas
de micro-FTIR e microscopia eletrnica de varredura.

Estes experimentos permitem a aplicao dos conceitos tericos adquiridos durante as


aulas sobre a conformao espacial do amido e o estudo dos mecanismos oxidativos para a
degradao de PLA associados com o efeito da mistura com TPS. Assim, h a juno da
cincia fundamental com o interesse prtico no desenvolvimento de novos materiais para
garantir a sustentabilidade, o que justifica a incluso desses tpicos na disciplina de
Bioqumica: Estrutura, Propriedades e Funes de Biomolculas para o BCT da UFABC.

Introduo

Os accares so os componentes essenciais de todos os organismos vivos e


representam a classe mais abundante de biomolculas. A unidade bsica dos acares so os
chamados monossacardeos ou acares simples (glicose, frutose, manose, ribose, etc...). Os
polissacardeos so constitudos de um grande nmero de unidades monossacardeas ligadas
covalentemente, sendo dessa classe o amido, o glicognio, a celulose, dentre outros.
82
O amido constitui uma das mais abundantes fontes de acar. O amido um
polissacardeo que tem como funo reserva energtica na forma de acares em plantas, que so
consumidas por organismos heterotrficos como principal fonte de glicose para gerao de ATP
1
por meio de reaes catablicas oxidativas .Embora a distribuio do amido seja ampla no reino
vegetal, poucas plantas o produzem em grandes quantidades. O amido constitui de 50% a 65% do
peso das sementes de cereais secos, e at 80% da substncia seca dos tubrculos. Milho e outros
cereais, como o arroz, o sorgo e o trigo, contribuem significativamente para o suprimento mundial
de amido. Nos Estados Unidos mais de 95% do amido comercializado proveniente do milho. Em
muitos pases, como por exemplo, no Brasil, o amido tambm extrado da batata, dos rizomas da
2
araruta e das razes da mandioca . O amido ocorre em grnulos (ou gros) que tm estrias tpicas.
Estas, aliadas ao tamanho e forma dos grnulos, so especficas de cada espcie de planta e esta
caracterstica morfolgica pode servir de meio de identificao microscpica da origem botnica
3
do amido (Fig. 1).

Fig. 1 . Microscopia eletrnica de varredura (MEV) esquerda e microscopia ptica


direita de um grnulo de amido.
(fonte: http://www.cheng.cam.ac.uk/research/groups/polymer/RMP/nitin/Granule.jpg).

O amido tem estrutura qumica muito parecida com o glicognio, porm possui menos
ramificaes. Tem funo nos vegetais semelhante do glicognio nas clulas animais, ou
seja, de reserva energtica. Sua sntese em plantas tambm bastante semelhante sntese do
glicognio em animais, com a substituio da forma ativada da glicose de UDP-glicose por
ADP-glicose, com catlise pela enzima amido sintase. No processo de digesto, a hidrlise do
amido catalisada enzimaticamente pelas -amilases salivar e pancretica, que clivam as
ligaes glicosdicas 14 da amilose originando uma mistura de maltose, amilopectina e
glicose, e tambm as ligaes 14 da amilopectina, originando uma mistura de
1
polissacardeos denominados dextrinas .

Estruturalmente, o amido classificado como um homopolissacardeo e a hidrlise de


1
suas ligaes glicosdicas fornece unidades de glicose livres . Tal hidrlise pode ser qumica
ou enzimtica e a glicose formada pode ter diversos destinos, desde aplicaes biolgicas, at

83
aplicaes biotecnolgicas, servindo como fonte de acares para reaes fermentativas para
produo de etanol em indstrias qumicas, na industira de alimentos, de bebidas ou de
combustveis. Nos pases europeus e nos Estados Unidos, mais de 50% da produo de amido
destinada produo de hidrolisados, tais como glicose, maltose, dextrinas e maltodextrinas.
Esses hidrolisados, por suas propriedades especficas e seus diferentes usos no setor
alimentcio, constituem uma excelente valorizao da fcula, sendo usado na fabricao de
2
xaropes, preparo de colas e gomas, como excipiente farmacutico, etc .

No entanto, as aplicaes comerciais do amido esto sendo ampliadas. Atualmente os


cientistas esto sendo desafiados a pesquisas focadas no desenvolvimento e avaliao de
polmeros e compsitos de fontes renovveis para a substituio de polmeros base de
petrleo. O amido considerado promissor, pois pode ser usado como matria prima para a
produo de polmeros sintticos ou diretamente como polmero termoplstico, possui baixo
custo e derivado de fonte abundante. O amido, em especial o amido termoplstico (TPS, do
ingls Thermoplastic Starch), tem sido pesquisado para aplicaes sob a forma de filmes e em
produtos da rea biomdica, devido sua biocompatibilidade e biodegradabilidade nos sistemas
8
biolgicos . O TPS tem sido usado como um bom substituto para os plsticos baseados em
petrleo em muitas aplicaes, com grande potencial para novas aplicaes e conseqentes
impactos positivos, econmicos e ambientais. Essa uma questo de grande relevncia, pois
atualmente os polmeros sintticos se tornaram indispensveis devido sua aplicao em
diversas reas, tais como embalagens, alimentos, agricultura, construo civil, materiais
espaciais, etc. No entanto, quando aplicados em produtos plsticos de curto tempo de vida
tem-se observado a eliminao de milhes de toneladas, muitas vezes, de forma inadequada.
Esse fato tem causado srios impactos ambientais devido os polmeros sintticos serem
4
resistentes degradao abitica e bitica .

Os monossacardeos so definidos como poli-hidroxialdedos ou poli-hidroxicetonas


ou compostos que os liberem por hidrlise. Apresentam a frmula geral [C(H2O)]n e
apresentam uma propriedade qumica muito importante em meio aquoso devido reatividade
da carbonila: ciclizao em meio aquoso. Este processo de ciclizao leva a formao de um
carbono anomrico, sendo que a hidroxila formada ligada a esse carbono apresenta
1,5,6,
propriedades redutoras .

Diversos reagentes so utilizados para a anlise de poder redutor em acares. Alguns


3+ 2+
desses mtodos utilizam agentes oxidantes suaves, tais como ons frrico (Fe ) e cprico (Cu )
1,6
em meio alcalino, fazendo deteco qualitativa . Mtodos quantitativos utilizam tcnicas

84
5
espectrofotomtricas, titulomtricas ou gravimtricas . Dissacardeos ligados pelas suas
hidroxilas redutoras como o caso da sacarose no apresentam poder redutor, porm quando
hidrolisados passam a exibir esta caracterstica. Tais propriedades so muito importantes e,
por muitas vezes, utilizadas para identificao de acares, verificao de adulterao e
5
falsificao de alimentos, entre outros .

1.Fundamentao Terica

Estruturalmente, o amido formado pela mistura de dois polmeros, a amilose e a


amilopectina, que so homopolissacardeos constitudos por resduos de -D-glicopiranose ligados
entre si por ligaes glicosdicas mas que apresentam diferentes estruturas e propriedades. A
amilopectina constitui aproximadamente 80% do peso seco dos polissacardeos existentes no gro
de amido e menos hidrossolvel que a amilose. formada por resduos de
-D-glicose unidos entre si por ligaes glicosdicas (14) com ramificaes (16),
enquanto que a amilose no possui tais ramificaes, formando um polmero linear (Fig. 2). A
cristalinidade do grnulo de amido se deve basicamente molcula de amilopectina. A
amilose, embora linear, no responsvel pela cristalinidade do amido, provavelmente devido
1
ao fato de se conformar como hlice (Fig. 3) o que dificulta sua associao regular com
outras cadeias. A organizao da amilopectina em domnios amorfos (pontos de ramificao)
3
e cristalinos gera a estrutura em camadas e radialmente orientada (Fig. 4 ) dos grnulos
densos de estocagem do amido, j mostrados na Fig. 1

CH2OH
O
H H AMILOPECTINA
H

OH H

AMILOSE ligao
O
H OH 16
CH2OH CH2OH
CH2 CH2OH
O O
H H H H O O
H H H H H H
H H
OH H OH H
O O OH H OH H
O O

H OH H OH n H OH H OH n
ligao ligao
14 14

1
Fig. 2 . Estruturas qumicas da amilose e amilopectina, evidenciando as ligaes glicosdicas .

85
Fig. 3. Representao da estrutura helicoidal de uma cadeia de amilose, polmero que compe a
A 1
estrutura do amido .
B

Fig. 4. A) Classificao das cadeias da amilopectina em tipo A, B e C. B) Estrutura da amilopectina


formando as regies amorfas e cristalinas no grnulo de amido. C) Modelo da estrutura interna do
3
grnulo de amido com a visualizao dos anis de crescimento e centro ou hilum .

Conforme pode ser verificado na Fig. 2, h a presena de vrios grupos hidroxila na


estrutura do amido, o que acarreta uma natureza altamente hidroflica a esse. A insolubilidade
do grnulo em gua fria devida s fortes ligaes de hidrognio que mantm as cadeias de
amido unidas. No entanto, na presena de gua e aquecimento, a gua incorporada na
estrutura do grnulo fazendo com que componentes mais solveis, como a amilose, se
dissociem e difundam-se para fora do grnulo. Este processo conhecido como gelatinizao.
Com a gelatinizao, ocorre um aumento da viscosidade do meio, os grnulos so totalmente
7
quebrados e as regies cristalinas desaparecem .

Devido as caractersticas do amido nativo, materiais polimricos com grandes


concentraes de amido, ou com base exclusivamente desse, apresentam muitas deficincias,
tais como elevada hidrofilicidade, pouca resistncia mecnica, sensibilidade trmica, ausncia
de plasticidade e baixa miscibilidade com outros polmeros. Alm disso, como a temperatura
de fuso cristalina do amido superior sua temperatura de degradao trmica, seu
4
processamento s possvel com a plastificao do material .

O TPS, tambm denominado amido plastificado ou amido desestruturado, formado


o
com o processamento do amido a cerca de 130 C e posterior resfriamento, aps o qual
apresenta-se como um material amorfo ou semicristalino, no qual as cadeias de amilose e
86
amilopectina esto intercaladas. produzido pelo aquecimento do amido na presena de
plastificantes (molculas pequenas que interagem com cadeias polimricas como um solvente,
formando uma soluo slida), sendo o glicerol o mais empregado por possuir estrutura
molecular pequena, polar e com elevado ponto de ebulio. Durante o processamento, os
grnulos de amido absorvem o plastificante; e posteriormente, ao absorver energia tm seu
grau de cristalinidade significantemente reduzido, o que favorece a formao de novas
4
ligaes (ou interaes) entre o amido e o plastificante .

A B
Processamento

Fig. 5 - Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrnica de varredura (MEV) da superfcie do


7
amido granular (A) e do Amido TPS com gros desestruturados (B) .

Considerando que h limitantes tecnolgicas para o uso em processos industriais,


alguns mtodos so empregados para melhorar as propriedades de materiais a base de amido:
preparao de misturas com outros polmeros naturais (blenda polimrica), compsitos,
4
nanocompsitos e modificao qumica . O estudo de blendas de amido com outros materiais
biodegradveis, oriundos de fontes renovveis, tem sido foco de vrios pesquisadores nos
8,9
ltimos anos . Vrios polisteres biodegradveis sintticos ou obtidos por processos
biolgicos (Fig. 6) tem sido usados em blendas com o amido termoplstico: o poli(cido-
ltico) (PLA), policaprolactona (PLC), poli(succcinato-co-adipato de butileno (PBSA),etc.
Destes, o PLA tem sido largamente estudado devido suas caractersticas fsico-qumicas que
8
so apropriados para a maioria dos usos comuns destes materiais .

O poli(cido-ltico) um termoplstico da famlia dos polisteres alifticos com


caractersticas hidrofbicas, obtido a partir da policondensao do D- ou L-cido ltico, um
cido orgnico encontrado em muitos produtos naturais, produzido por sntese qumica ou
fermentao microbiana. O PLA ser encontrado em duas formas: (i) materiais enantiomricos
feito a partir de cido D- e L-lctico (PLLA e PDLA), esses so polmeros semicristalinos
quando enantiomericamente puro; e (ii) materiais amorfos que contm ambas as formas D e L
de cido lctico (PLLA). Suas principais desvantagens so sua fragilidade e baixa estabilidade

87
trmica. Estudos com blendas polimricas de TPS com PLA tem mostrado que as
propriedades do PLA podem ser moduladas pela variao da proporo dos enantimeros na
7,8,9
composio do material e pelo uso de aditivos .

Fig. 5. Polmeros bioplsticos e seus monmeros relacionados com o processo de origem e


8
molculas precusoras .

Apesar dos avanos recentes no desenvolvimento de composies de TPS, sua


aplicao ainda muito limitada em funo de algumas deficincias: baixa resistncia
mecnica, elevada sensibilidade gua, alterao de suas propriedades devido a cristalizao
durante o armazenamento e elevada viscosidade do material fundido, alm da baixa
4
compatibilidade do amido com os polmeros atuais, o que pode dificultar seu processamento .
Assim, novas abordagens de produo so necessrias para uma maior utilizao do amido
como material plstico, j que blendas de PLA com TPS resultam em materiais que tm sua
degradao favorecida pois alguns microrganismos podem utilizar o amido como fonte de
9
nutrientes e secretar enzimas que consomem o polmero .
Polmeros biodegradveis so decompostos em fragmentos de menor massa molar pela
ao de microrganismos, ou seja, fungos, bactrias que podem excretar enzimas que podem
promover a degradao destes materiais em um perodo de tempo (principalmente quando se
compara com relativamente curto quando com os polmeros convencionais). O processo
irreversvel da biodegradao ocorre em certas condies de umidade, luz, calor e nutrientes
88
orgnicos e gera CO2, CH4, H2O, entre outros. claro que esses compostos so diferentes
quando os processos so aerbio (com a presena de oxignio) ou anaerbio (sem a presena
de oxignio). H muitas enzimas no solo as quais podem ser ativas tanto em ambientes
biticos quanto abiticos. Estas enzimas so produzidas por microrganismos nativos do solo,
bem como por razes das plantas. Os fungos so importantes produtores de enzimas
oxidativas, tais como Mn-peroxidase e peroxidase de lignina que podem contribuir para a
degradao de biopolmeros e polmeros sintticos. Enzimas do solo so encontradas em
clulas proliferativas ou latentes, detritos celulares, argilas, hmus em coloides ou em fase
aquosa. A contribuio de protenas heme e perxidos para a degradao do PLA modulada
9
pela presena da TPS foi o foco de um estudo realizado na UFABC o qual inspirou essa aula.
O estudo dos mecanismos oxidativos para a degradao de PLA associados com o
efeito da mistura com TPS combina a cincia fundamental com o interesse prtico no
desenvolvimento de novos materiais para garantir a sustentabilidade, o que justifica a incluso
desse tpico na disciplina de Bioqumica: Estrutura, Propriedades e Funes de Biomolculas.

Fig. 6. Estrutura de (a) Poli(cido ltico) e amido: (b) amilopectina e (c) amilose.

2.Caracterizao do PLA e PLA/TPS por micro-ATR-FTIR

Tcnicas espectroscpicas

A espectroscopia estuda a interao da radiao eletromagntica com a matria, sendo


um dos seus principais objetivos o estudo dos nveis de energia de tomos ou molculas, obtendo
informaes fsicas e qumicas sobre o material analisado. H dois tipos de tcnica
espectroscpica: espectroscopia de emisso e espectroscopia de absoro. Na espectroscopia de
emisso, ocorre a excitao dos tomos do material estudado por meios trmicos e

89
eletrnicos. Quando os tomos decaem de volta ao estado fundamental estvel, a energia
absorvida pode ser parcialmente emitida em forma de ondas eletromagnticas, sendo essa
energia detectada e utilizada para a anlise do material. Na espectroscopia de absoro, a
substncia a ser analisada posicionada entre o detector e uma fonte de energia que emite a
radiao eletromagntica com o comprimento de onda desejado, sendo a anlise feita
comparando-se a radiao transmitida ou refletida pela amostra, com a radiao da fonte. A
escolha da tcnica depende do material ou substncia a ser analisado, da informao desejada
10,11
e da radiao eletromagntica utilizada .

Espectroscopia de absoro

O processo de absoro ocorre quando a frequncia da radiao incidente a mesma


que a frequncia de vibrao molecular. Sabe-se que as molculas e tomos de um material no
so estticos; eles possuem uma frequncia natural de vibrao. Assim, quando a vibrao
molecular ou rotacional origina um momento dipolo da molcula, surge um campo eltrico. Se a
radiao eletromagntica tiver a mesma frequncia da vibrao molecular, o campo eltrico
alternante da radiao incidente interage com o campo eltrico originado pela mudana de
momento dipolo, e ocorre uma transferncia de energia da radiao para a molcula (absoro),
originando um espectro. Essa frequncia pode ser calculada atravs de uma expresso que
relaciona a frequncia vibracional com a constante de ligao qumica (uma medida de rigidez) e
10,11
a massa reduzida em relao s massas dos tomos que formam a molcula .

A vibrao dos tomos no interior de uma molcula apresenta energia


correspondente a regio do espectro eletromagntico do infravermelho (IR). Alm disso, a
radiao infravermelha no possui energia suficiente para que sua absoro possa alterar o
nvel energtico orbital da molcula, sendo assim, seu uso envolve a espectroscopia de
absoro e o sinal analisado ser o transmitido ou o refletido, dependendo do equipamento
utilizado e do material analisado. Em relao a anlise quantitativa e qualitativa de compostos
orgnicos, a espectroscopia de absoro de grande utilidade e a mais indicada, pois existe
uma diversidade de compostos que apresentam bandas de absoro na regio espectral entre
-1
4000 a 670 cm que o segmento, dentre as regies espectrais do infravermelho mostradas
10,11
na Tabela 1, mais frequentemente usado nos equipamentos disponveis .

90
10
Tabela 1 - Subdivises da regio espectral do infravermelho .

-1
Nmero de onda (cm ) Frequncia (Hz) Comprimento de onda (m)
14 14
Infravermelho prximo 12800 - 4000 3,8x10 - 1,2x10 0,78 2,5
14 12
Infravermelho mdio 4000 200 1,2x10 6,0x10 2,5 50
12 11
Infravermelho distante 200 - 100 6,0x10 3,0x10 50 - 1000

Como a energia fornecida pela radiao no IR tende a afetar os nveis vibracionais de


uma ligao qumica, classifica-se as vibraes moleculares em dois tipos: deformaes axiais e
deformaes angulares, simtricas ou assimtricas. Quando a deformao ocorre na direo do
eixo da molcula, a distncia interatmica aumenta e diminui alternadamente, o modo de vibrao
denominado estiramento ou deformao axial. As vibraes de deformao angular
correspondem ao movimento de um grupo de tomos em relao ao resto da molcula, sem que as
posies relativas dos tomos do grupo se alterem, entretanto, ocorre a variao do ngulo entre
10,11
duas ligaes e podem ser de quatro tipos: tesoura, balano, sacudida e toro .

Conforme esquematizado na Fig. 7, o espectro de absoro no infravermelho tem


origem quando a radiao eletromagntica incidente tem uma componente com frequncia
correspondente a uma transio entre dois nveis vibracionais, refletindo esse movimento
vibracional, o que aparece em forma de bandas. Embora o espectro no IR seja caracterstico
da molcula como um todo, certos grupos de tomos do origem a bandas que ocorrem
prximas a uma mesma frequncia, independentemente da estrutura da molcula.
justamente a presena destas bandas caractersticas de grupos que permite a obteno de
informaes estruturais teis. A frequncia ou o comprimento de onda de uma banda de
absoro depende das massas relativas dos tomos, das constantes de foras das ligaes e da
geometria dos tomos. tomos leves vibram a frequncias mais altas do que os tomos mais
pesados. As ligaes triplas so mais rgidas do que as duplas, que so mais rgidas que as
ligaes simples, logo as ligaes triplas vibram a frequncias mais altas. A intensidade de
uma banda de absoro proporcional concentrao do componente que causou essa banda.
Essa intensidade pode ser expressa como transmitncia ou absorbncia. A transmitncia a
razo entre a energia radiante transmitida por uma amostra e a energia radiante que nela
10
incide. A absorbncia o logaritmo decimal do inverso da transmitncia .

91
Espectro

Amostra
Infravermelho

-
cm

Caracterstica de cada molcula


Obteno de informaes
estruturais da molcula

Fig. 7 - Esquema do processo de identificao de estruturas moleculares por espectroscopia


de absoro no infravermelho.

Na espectroscopia de absoro no infravermelho a radiao proveniente de uma luz


-1
contnua (usualmente na regio espectral de 2.5 a 25 m ou 4000 a 400 cm ) atravessa a
amostra a ser analisa, a radiao transmitida comparada com aquela transmitida na ausncia
de amostra e o espectrmetro registra o resultado na forma de uma banda de absoro. A
tcnica de medio mais sofisticada atualmente envolve o uso de um interfermetro de
Michelson e a posterior transformada de Fourier do interferograma, a chamada Absoro no
Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR). H vrias tcnicas de FTIR que devem
ser escolhidas de acordo com o tipo de amostra e as informaes que se deseja obter. Assim,
h disponveis as seguintes tcnicas: de Transmisso, de Absoro, Reflexo Total Atenuada
(ATR), Refletncia Especular e Refletncia Difusa. Alm dessas, com o acoplamento do
microscpio ao equipamento possvel realizar a microespectroscopia pelas tcnicas de
11
Transmisso, Absoro, ATR, e Refletncia Especular .
A tcnica de reflexo total atenuada (ATR) (Figura 8A) possibilita a obteno de espectros
qualitativos e quantitativos de amostras slidas independente de sua espessura. Essa tcnica
consiste na reflexo de um feixe que passa de um meio menos denso (cristal) para um meio mais
denso (amostra). No entanto, uma pequena parcela da radiao incidente penetra poucos
2
micrometros na amostra, podendo ser absorvida. Essa radiao que penetra no material
chamada de onda evanescente. O cristal, um material de alto ndice de refrao, pode ser de

2A profundidade de penetrao depende do comprimento de onda do feixe ,do ngulo de incidncia deste com a amostra, do
ndice de refrao do cristal do equipamento e do material analisado
92
diamante, ZnSe (Seleneto de Zinco) ou Ge (Germnio) o qual deve ser escolhido de acordo
com o material a ser analisado. A proporo de feixe refletido varia com o ngulo de
incidncia, havendo um ngulo crtico onde a reflexo total, que depende do tipo de cristal.
Com a absoro da radiao que penetrou na amostra, o feixe refletido tem sua intensidade
atenuada, e assim se consegue identificar as bandas de absoro. A utilizao do microscpio
como acessrio do equipamento caracteriza a tcnica de -ATR (Figuras 8B e 9), que
proporciona uma profundidade de penetrao da radiao da ordem de 0.66 m com o uso do
cristal de Ge e de 2 m de profundidade de penetao obtida com o cristal de Seleneto de
Zinco, ou com o de diamante, disponvel no modo ATR. Isso permite que o sinal analisado
fique restrito superfcie da amostra. No modo microscpio possvel realizar a anlise numa
11
rea de interesse previamente visualizadas .

Amostra A B
FONTE
Cristal de DETECTOR
AMOSTRA Ge
AMOSTRA

FONTE Placa de apoio


CRISTAL DETECTOR

11
Fig. 8 - Esquema de funcionamento. A - FTIR com acessrio ATR; B - -ATR .

MICROESPECTRMETRO

FTIR

Cristal

Amostra
posicionada Placa de apoio

Fig. 9 - Microespectrmetro Varian 610 da CEM-UFABC, onde foram tomados os dados para
anlise composicional das placas de PLA e PLA/10%TPS.

93
2. Objetivos da aula

Permitir a compreenso da aplicao dos conceitos tericos adquiridos durante as


aulas sobre a conformao espacial do amido. Para isso, so propostos os seguintes objetivos
especficos:

- fazer a reao qualitativa de identificao de acares redutores no amido utilizando o


reagente de Benedict, em comparao com solues de glicose e sacarose.

- estudar a aplicao dos acares, no caso o amido, na produo de materiais que tenham
propriedades de resistncia associada com maior rapidez e intensidade de degradao
ambiental.

- familiarizao dos discentes com a tcnica espectroscpica FTIR, com imagens de


microscopia eletrnica de varredura e de microscopia ptica para caracterizao de materiais.

3. Procedimento Experimental
Reagentes

- reagente de Benedict;
- soluo de glicose 1,0 % (m/v);
- soluo de sacarose 1,0 % (m/v);
- suspenso de amido 1,0 % (m/v);
Materiais e Vidrarias

- estante para tubos de ensaio;


- 4 tubos de ensaio
- banho de aquecimento fervente (~ 100C);
- pipetador automtico e ponteiras de 500 e 1000 L;
- pina de madeira
- microscpio ptico com lminas
- amostras de PLA e PLA-TPS preparadas na aula anterior

3.1. Pesquisa de poder redutor. Tomar 4 tubos de ensaio e seguir o procedimento abaixo:

Tubos Amostras (mL) H2O (mL) Benedict (mL)

B - 1,5 1,0

1* 1,0 0,5 1,0

2* 1,0 0,5 1,0

3* 1,0 0,5 1,0


*onde, 1, 2 e 3 so as amostras numeradas fornecidas para o experimento.

94
Em seguida, ferver os tubos em banho-maria por 5 minutos e observar as possveis
alteraes. Sabendo que entre as amostras 1, 2 e 3 tratam-se de glicose, amido e sacarose,
identifique as amostras em funo da colorao observada e discuta os resultados.

Uso do amido termoplstico como aditivo ao policido lctico para produo de material
compsito de mais fcil degradao no meio ambiente por mecanismos oxidativos.

3.2. Exame a olho nu e ao microscpico ptico das placas de PLA e PLA/10% TPS submetidas
degradao desde a aula anterior, conforme procedimento resumido na Tabela 2.

1) Observe e fotografe as mudanas perceptveis a olho nu na placa do seu grupo. As fotos


devero ser compartilhadas com os outros grupos.
2) Coloque as placas de mesmo tipo (por exemplo as 4 de PLA) sobre uma lmina e observe
em microscpio ptico as diferentes alteraes ocorridas na superfcie dessas, promovidas
pelos diferentes reagentes. Faa uma descrio das alteraes observadas nas placas
degradadas em relao placa controle.
Tabela 2 - Resumo do procedimento experimental sobre o uso do amido termoplstico como
aditivo ao policido lctico para produo de material compsito de mais fcil degradao
no meio ambiente por mecanismos oxidativos

Grupo CONTROLE
CONTROLE
A B C D E F PLA
PLA /10%
TPS
PLA PLA PLA
PLA /10%
Placa PLA PLA PLA /10% /10% /10% PLA
TPS
TPS TPS TPS
gua
deionizada
1990 1938 1928 1990 1938 1928 2000 2000
(microlitros=
L)
Cloreto de Fe
II (2mM)
10 -- 10 10 -- 10 -- --
(microlitros=
L)
Cumeno
hidroperxido
(300mM) -- 62 62 -- 62 62 -- --
(microlitros=
L)
Adio diria
de cumeno
Hidroperxido -- 62* 62* -- 62* 62* -- --
(microlitros=
L)
*Feito pelos tcnicos de laboratrio
95
2) Analisar as imagens da Tabela 3 que mostram a superfcie das diversas placas a olho nu e por
meio de microscopia eletrnica de varredura. Faa uma descrio das alteraes observadas nas
placas degradadas em relao placa controle e entre as placas com e sem TPS.

Tabela 3 - Resumo dos resultados esperados

Soluo
para
degradao
Cloreto de Fe II
Cumeno
Cloreto de Fe II + Cumeno Controle
Imagens hidroperxido
da hidroperxido
superfcie
das placas

Imagens
a olho nu
(PLA)

Imagens
de MEV
(PLA)

Imagens
a olho
nu (PLA
/10%
TPS)

Imagens
de MEV
(PLA
/10%
TPS)

96
3.3. Discusso das anlises feitas previamente por -ATR-FTIR:

Nas figuras a seguir so apresentados os espectros de FTIR de placas de PLA e de


placas de blendas de PLA com 10% de TPS (PLA_TPS) nas diversas condies experimentais
trabalhadas em aula. Em cada condio observe as mudanas qumicas decorrentes dos
mecanismos oxidativos por meio da identificao do aparecimento ou desaparecimento de
diferentes bandas de absoro.

Obs: Em cada painel, o eixo Y esquerda indica a intensidade de absoro correspondente


regio espectral plotada no tero esquerdo de cada grfico (A); o eixo Y direita indica a
intensidade correspondente regio espectral plotada nos teros central e direito.

0,30 0,6
PLA hidratado A 1088

0,25 PLA + cumeno 1752 1187 0,5


Gota Cumeno sobre PLA
Intensidade

0,20 0,4

2356
0,15 0,3

2152 1953 922


0,10 866 0,2
1450 1370
3530 2927 1698 1526 1263
0,05 1644 0,1

0,00 0,0

0,30 0,5
PLA -TPS hidratado
PLA_TPS + cumeno
0,25
Gota Cumeno sobre PLA-TPS 0,4
Intensidade

0,20
0,3
0,15

3315
0,2
0,10

0,05 0,1

0,00
0,0

3600 3300 3000 2700 2400 2100 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800
-1
Nmero de onda (cm )

Fig. 10 - Espectros ATR/FTIR de PLA (painel superior) e de PLA_ 10%TPS (painel


inferior); Amostra controle (linha azul), regio da amostra tratada com Cumeno hidroperxido
- CumOOH (linha vermelha) e espectro de uma gota de CumOOH imediatamente aps ser
colocado sobre a amostra (linha preta).

97
0,10 0,5
PLA hidratado
PLA + Fe II (liso)
PLA + Fe II (mancha escura) 0,4
Intensidade

0,3

0,05
0,2

0,1

0,00 0,0

0,10 0,5
PLA_TPS hidratado
PLA_TPS+Fe II (liso)
PLA_TPS+Fe II (rugoso) 0,4

0,3
Intensidade

0,05

0,2

0,1

0,00

0,0

3600 3300 3000 2700 2400 2100 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800
-1
Nmero de onda (cm )

Fig. 11 Espectros ATR/FTIR de PLA (painel superior) e de PLA_10% TPS (painel inferior).
Amostra controle (linha azul), regio lisa da amostra tratada com Cloreto de Ferro II
tetrahidratado Fe II (linha alaranjada) e regio de mancha escura ou rugosa da amostra tratada
com Fe II (linha vermelha). As regies lisas, de mancha escura ou rugosa foram identificadas por
meio de microscpio tico acoplado ao equipamento de FTIR (imagens no mostradas).

98
0,10 0,5

PLA hidratado
PLA+Fe+cumeno (sup-riscos)
0,4
Intensidad

0,3
e

0,05

0,2

0,1

0,0
0,00

0,10 0,5

PLA_TPS hidratado
PLA_TPS+Fe+Cumeno(sup-riscos)
0,4

0,3
Intensidade

0,05

0,2

0,1

0,00

0,0

3600 3300 3000 2700 2400 2100 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800
-1
Nmero de onda (cm )

Fig. 12 Espectros ATR/FTIR de PLA (painel superior) e de PLA_10% TPS (painel


inferior); Amostra controle (linha azul), regio de riscos da amostra tratada com Cloreto de
Ferro II tetrahidratado Fe II e Cumeno hidroperxido - CumOOH (linha vermelha) As
regies de riscos foram identificadas por meio de microscpio tico acoplado ao equipamento
de FTIR (imagens no mostradas).

99
Stretching C-O-C
C=O ( (1,4) e glicopiranose)
-1
(1759 cm )

C-OH
)
C-CH3
-OH
Intensidade

(Stretching )
(anel da glicose)
-1 -OH hidratado
3315 cm
amido -OH
do
O -CH (H 0 do
-OH (H 2 2
(TPS) amido)
-1
3400 cm

C-O
Deformao
PLA-hidratado (ster)

PLA_TPS_hidratado C-H de CH2


3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800
-1
cm

Fig. 13 - Espectros FTIR de PLA (linha preta) e PLA_10 %TPS (linha vermelha), com
indicao de modos de vibraes (estiramento), grupos funcionais (OH) ou ligaes qumicas
(C=O) correspondentes a alguns picos ou banda de absoro consideradas para o presente
estudo.

-1
A regio espectral de 2998-2985 cm corresponde vibrao de estiramento (stretching)
do grupo CH das cadeias alquila. Essa regio geralmente no fornece informao importante
porque quase todos compostos orgnicos possuem esse grupo. Entretanto, informaes
significativas sobre o tamanho da cadeia alquila podem ser obtidas pela comparao da
intensidade desses picos em relao a outros. Assim, os picos de baixa intensidade nessa regio
para o PLA e PLA/TPS so consistentes com a ausncia de longas cadeias alquila na estrutura do
PLA e do TPS. Para o compsito de PLA com 10 % de TPS, aparece um pico de absoro forte e
-1
largo prximo a 3380 cm , o qual geralmente atribudo ao lcool OH de resduos de glicose.
Nessa regio, h tambm a sobreposio da contribuio da vibrao OH da gua da camada de
-1 -1
hidratao do amido (3230 e 3114 cm ) . A regio de 1800 a 1700 cm contm uma banda com
-1
pico em 1752 cm atribuda a forte estiramento C=O tpico de PLA. Para PLA
100
-1 -1
amorfo, o pico dessa banda 1759 cm e esse sofre um desvio de 10 cm (blue-shifted) depois
-1
da cristalizao trmica. O pico em 1752 cm encontrado para essas amostras sugerem a presena
de material polimrfico. Essa banda est ligeiramente menos intensa e desviada (red-shifted) na
presena de TPS, mas sem perda das bandas adicionais. Esse resultado consistente com uma
-1
modificao no-covalente da PLA no compsito. Na regio de 1500 a 1300 cm , o espectro de
FTIR apresenta outras bandas tpicas de PLA, nomeadas estiramento assimtrico
1
as(CH3) e estiramento simtrico (CH3) na regio espectral de 1453 e 1359 cm ,
respectivamente. Essas bandas diminuram de intensidade na presena de 10% de TPS. Um
-1
efeito similar foi observado para as(COC) e s(COC) em 1182 e 1037 cm , r(CCH3) em
1 -1
1017 cm1 e (OCC) em 870 cm . O alargamento da banda na regio de 960 cm pode ser
atribudo a sobreposio da contribuio de unidades de glicopiranose na conformao de
9,12
cadeira .

Tabela 4- Resumo da caracterizao espectral por FTIR de PLA e PLA/TPS

Regio espectral
da banda ou
Grupo caracterstico Atribuio Peculiaridade
pico de
absoro

tamanho cadeia alquila baixa


-1 estiramento do grupo quando comparada com intensidade=
2998-2985 cm CH intensidade de outros ausncia
picos cadeias longas

pico de
-1
3380 cm lcool OH de resduos de glicose absoro forte e
largo

3230 e 3114 gua da camada de sobreposio na


-1 vibrao OH
cm hidratao do amido contribuio
1800 a 1700 forte
-1 estiramento C=O tpico de PLA
cm intensidade
diminuram de
Estiramento
1500 a 1300 intensidade na
-1 assimtrico e tpico de PLA
cm presena de
simtrico
10% de TPS

conformao de sobreposio da
-1 alargamento da
960 cm cadeira da contribuio de banda
glicopiranose glicoranonose.
101
4. Discusso:

A reao de ferro e perxidos (Reao de Fenton) gera radicais livres. Pesquise esses
mecanismos de reao. Como voc explicaria que cada um dos componentes isolados tambm
foi capaz de causar danos? Veja a referncia 8.

5. Exerccios

1-Desenhe com uso de um programa como o ChemSketch (verso gratuita para uso
educacional), ou pegue imagens pela internet da estrutura do PLA e do amido. Identifique
nessas estruturas os grupos funcionais que aparecem na tabela 4 e Fig. 13.

2- Com base na identificao dos grupos funcionais presentes nas estruturas do PLA e do
amido termoplstico, faa uma anlise de cada grfico de FTIR que foi apresentado. Exemplo
para orientar as respostas: no espectro ... observa-se que a degradao do material contendo
10% de amido resultou em aumento do sinal vindo da contribuio da glicopiranose o que
consistente com a hidrlise do amido (...).

3-Um pesquisador precisava identificar qual era o tipo de acar dominante em um extrato
3
vegetal. Decidiu aplicar a reao de Benedict . Para isso preparou dois tubos de ensaio. O
primeiro, com 1,5 mL de H2O destilada. O segundo, com 1, 5 mL de extrato aquoso da planta.
Ento adicionou 1 mL do reagente de Benedict e incubou os tubos em H2O fervente por 5
minutos. Ele obteve os seguintes resultados:

Responda: A) Qual a funo do tubo 1 no experimento? B) Qual tipo de acar prevalente


neste tecido vegetal? Justifique.

102
Referncias Bibliogrficas

1.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princpios de Bioqumica, 4. ed. New
York: Worth Publishers, 2006, p.685-686.

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. SUMERLY, R.; ALVAREZ, H.; CEREDA, M.P.; VILPOUX, O.F. Tecnologia, usos e
potencialidades de tuberosas amilceas latino-americanas. Em: Culturas de tuberosas
amilceas latino-americanas. v. 3, p. 377-448, 2002.

3
. DENARDINI, C.C.; SILVA, L.P. Estrutura dos grnulos de amido e sua relao com
propriedades fsico-qumicas. Cincia Rural, v.39, n.3, mai-jun, 2009.

4
.NOSSA, T.S. Novas composies polimricas obtidas a partir da modificao do amido via
extruso reativa.2014. Tese (Doutorado em Cincias e Engenharia de Materiais) Escola de
Engenharia de So Carlos, USP, So Carlos-SP.

5
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6
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e deteco de acares em amostras biolgicas)

7
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Termoplstico; Documentos 30, 27 p. Embrapa Instrumentao Agropecuria, So Carlos;
2007.

8
.CHEN, G-Q; PATEL, M.K. Plastics Derived from Biological Sources: Present and Future:
A Technical and Environmental Review. Chem. Rev., 2012, 112 (4), pp 20822099.

9
. RODRIGUES, C.A.; TOFANELLO, A.; NANTES, I.L.; ROSA, D.S. Biological Oxidative
Mechanisms for Degradation of Poly(lactic acid)Blended with Thermoplastic Starch; ACS
Sustainable Chem. Eng. 2015, 3, 27562766; DOI: 10.1021/acssuschemeng.5b00639.

10
.SKOOG, D.A.; CROUCH, S.R.; HOLLER, F.J. Principles of instrumental analysis. 6th.
Cengage Learning, 2006.

11
. BRITO, A. M.M. Efeitos qumico-estruturais promovidos pelo laser de Nd:YAG,
associado ou no ao fluoreto, quando empregado para preveno da progresso de leses de
crie radicular.2014. Dissertao (Mestrado em Biotecnocincia) UFABC, Santo Andr.

12
. LOPES, W.A.; FASCIO, M.; Esquema para interpretao de espectros de substncias
orgnicas na regio do infravermelho. Quim. Nova. Vol. 27, No. 4, 670-673, 2004.

103
Experimento 6 Catlise enzimtica modulada
por nanopartculas metlicas

Resumo

Por meio de experimentos simples, nessa aula pretende-se estudar a correlao entre
estrutura proteica e atividade enzimtica, resgatar, ampliar e aplicar conceitos bsicos, como
teorias de ligao metlica, estrutura atmica, reaes de oxidao-reduo e espectroscopia
UV-Vis, ao mesmo tempo em que so introduzidos conceitos de nanocincia, como o efeito
de confinamento quntico e a ressonncia de plasmons de superfcie, conceitos de interesse
tecnolgico.
Para esse estudo ser analisada a atividade enzimtica de gelatinase (a gelatina contm
colgeno desnaturado) presente no extrato da polpa do abacaxi que possui um conjunto de
enzimas diversas conhecido como bromelana. A modulao da estrutura/atividade ser feita por
meio de aquecimento das amostras em duas temperaturas para promover desnaturao parcial e
total das enzimas e pela associao das enzimas com nanopartculas de ouro. Tambm ser
estudada a precipitao protica pela adio de lcool (coagulao) ou sulfato de amnio (salting
out) na soluo de colgeno, mostrando a alterao da solubilidade protica.
Nanopartculas de ouro sero produzidas em aula por meio de dois protocolos: a) uso
simultneo do HEPES e dos prprios componentes do suco de abacaxi como agentes
3+ 0
redutores do on ouro (Au ) sua forma atmica (Au ); b) uso do HEPES como nico
agente redutor, seguido pela adio do suco de abacaxi aps a formao das nanopartculas.
Os dois protocolos produziro nanopartculas de ouro que estaro recobertas por HEPES e
pelas biomolculas do suco de abacaxi, inclusive a bromelana.

1.Fundamentao Terica

Enzimas

1
Enzimas proteolticas ou proteases catalisam o rompimento das ligaes peptdicas em
protenas. So enzimas da classe 3, as hidrolases, e subclasse 3.4, as peptdeo-hidrolases ou
peptidases. Estas enzimas constituem uma grande famlia (EC 3.4), dividida em endopeptidases
ou proteinases (EC 3.4. 21-99) e exopetidases (EC 3.4.11-19), de acordo com a posio da

104
ligao peptdica a ser clivada na cadeia peptdica. Estas endopeptidases podem ser ainda
subdivididas de acordo com o grupo reativo no stio ativo envolvido com a catlise em serina-
2 3 4
(EC 3.4.21) , cistena- (EC 3.4.22) , asprtico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e
5
metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC 3.4.24). As enzimas cujo mecanismo de
ao no est completamente elucidado so classificadas no subgrupo EC. 3.4.99.

Exopeptidases

As exopeptidases atuam somente nos finais das cadeias polipeptdicas na regio N ou


C terminal. Aquelas que atuam na regio amino terminal livre liberam um nico resduo de
aminocido (aminopeptidases), um dipeptdeo (dipeptidil-peptidases) ou um tripeptdeo
(tripeptidil-peptidases). As exopeptidases que atuam na regio carboxi terminal livre liberam
um nico aminocido (carboxipeptidases) ou um dipeptdeo (peptidil-dipeptidases).

Endopeptidases

Endopeptidases atuam preferencialmente nas regies internas da cadeia polipeptdica,


entre as regies N e C terminal.

Tipos catalticos

Segundo Barret, 1994 as proteases so classificadas em carboxipeptidases e as


endopeptidases e so divididas em subclasses, tendo como base o seu mecanismo cataltico.
As carboxipeptidases foram subdivididas em serino-, metalo- e cisteno- carboxipeptidases e
as endopeptidases em serino-, cisteino-, asprtico- e metaloendopeptidases. Serino peptidases
possuem um resduo de serina em seu centro ativo, enquanto as asprtico-peptidases tm duas
unidades de cido asprtico no seu centro cataltico. Cisteno-proteases apresentam um
aminocido cistena e as metalo-proteases usam um on metal no seu mecanismo cataltico.

Proteases: funo e aplicao

Proteases representam uma classe de enzimas com importantes papis em processos


fisiolgicos. Alm disto, elas possuem aplicao comercial, estando entre os trs maiores grupos
de enzimas industriais, sendo responsveis por 60% da venda internacional de enzimas. Estas
enzimas esto envolvidas em processos biolgicos essenciais, como a coagulao sangunea,
morte celular e diferenciao de tecidos. Vrias etapas proteolticas importantes ocorrem no
mecanismo invasivo de tumores, assim como no ciclo de infeco de um grande nmero de vrus
e microrganismos patognicos. Estes fatos tornam as proteases um alvo quimioterpico valioso
para o desenvolvimento de novos compostos farmacuticos. As enzimas
105
proteolticas tambm participam no catabolismo de protenas, tanto nas vias degradativas
como nas biossintticas, e na liberao de hormnios peptdeos farmaceuticamente ativos a
partir de protenas precursoras. Certas modificaes especficas e seletivas de protenas
durante a ativao de enzimas ocorrem via protelise, que tambm colabora no transporte de
protenas secretrias na membrana. As proteases tm tambm uma variedade de aplicaes
principalmente na indstria de detergentes e de alimentos. Tendo em vista os recentes acordos
mundiais para uso de tecnologias no poluentes, as proteases comearam a ser usadas em
larga escala no tratamento do couro, em substituio aos compostos txicos e poluentes at
ento usados. Na indstria farmacutica, as proteases so usadas em pomadas cicatrizantes e
tm um uso potencial para outros medicamentos. Proteases hidrolisam as protenas em
peptdeos e aminocidos, facilitando a sua absoro pelas clulas; devido a seu papel
6
despolimerizante, as enzimas extracelulares tm um papel importante na nutrio .

Gelatina

Gelatina uma mistura heterognea de protenas desnaturadas solveis em gua,


derivada da hidrlise parcial do colgeno tipo I nativo e que possuem alta mdia de massa
molecular. Tradicionalmente so usadas na indstria alimentar e de cosmticos. Entretanto,
recentemente vem sendo muito usada em pesquisas na rea biomdica (devido sua alta
biocompatibilidade, biodegradabilidade e baixa imunogenicidade, alm de baixo custo) como
estrutura para adeso celular, biomaterial para engenharia de tecidos e sistema de entrega de
7
frmacos diferente das cpsulas tradicionais .
Na converso do colgeno gelatina, que ocorre acima da temperatura de
desnaturao do colgeno, tropocolgenos perdem a estrutura de hlice tripla caracterstica, h
quebras de ligaes intermoleculares e de ligaes peptdicas resultando em cadeias
polipeptdicas que pela anlise SDS-PAGE apresentam peso molecular de menos de 300 kDa
com distribuio muito ampla. Assim, os constituintes moleculares da gelatina so
heterogneos em relao ao colgeno, apresentam cadeias com menor peso molecular relativo
e variada distribuio de estrutura primria. Como alguns dos aminocidos na estrutura
peptdica do colgeno contm grupos funcionais que so hidrolisados sob condies cidas ou
bsicas, h dois tipos de gelatina, dependentes do processo de extrao: tipo A e tipo B,
7
obtidas de pr-tratamento cido e bsico respectivamente .

106
Considerando-se a forma e tamanho da molcula de gelatina, observa-se que essa tem
baixo ponto isoeltrico (pI), a conformao de suas molculas predominantemente de
random coil com perda da habilidade de formar fibrilas e facilmente atacada por proteinase.
A gelatina possui uma grande habilidade de ligao com a gua (5 a 10 vezes seu peso) e suas
cadeias peptdicas de configurao helicoidal so importantes para a formao do gel. Por ser
um hidrocolide de origem proteica possui carter anftero, associado presena de grupos
amina e carboxlicos nos aminocidos. A viscosidade em soluo afetada pela concentrao
7
e pela temperatura .

Nanopartculas e Nanoestruturas Metlicas

Avanos tecnolgicos esto relacionados com a descoberta ou desenvolvimento de


produtos com caractersticas inovadoras. Nas duas ltimas dcadas, tem sido crescente o interesse
da comunidade cientfica na Nanocincia e Nanotecnologia (NN), o que tem resultado no
desenvolvimento de novos campos cientficos tais como a nanotecnologia molecular e o
desenvolvimento de nanossistemas, nanomateriais, nanodispositivos e nanomquinas. Duas so as
estratgias para o desenvolvimento da nanotecnologia: a top-down e a bottom-up (Fig. 1A). A
primeira est relacionada com o grande desenvolvimento da indstria eletroeletrnica e a segunda
abrange a engenharia dos materiais em nvel supramolecular e hierrquico, utilizando molculas,
biomolculas, polmeros, semicondutores e dieltricos, metais, xidos metlicos, entre outros,
associados a mtodos de modificao/funcionalizao de superfcie. Entre os processos
envolvidos na estratgia bottom-up observa-se a automontagem, montagem coordenativa,
8
montagem eletrosttica, adsoro e outros .

Por definio, nanoestruturas devem possuir pelo menos uma dimenso na escala
nanomtrica (1 a 100 nm) (Fig.1B), ter uma alta razo superfcie/volume e suas propriedades
9
devem mudar em relao ao material na escala macroscpica (material bulk) . Assim, a
nanocincia e a nanotecnologia apresentam a possibilidade e o desafio de controle sobre os
componentes estruturais do nanosistema em escalas de tomos ou molculas individuais de
dimenses submicromtricas, bem como a integrao de nanoestruturas resultantes em sistemas
maiores, buscando a miniaturizao de dispositivos e a montagem de estruturas organizadas e
funcionais para gerar produtos inovadores (Fig. 1B- Things Manmade). Dentre esses produtos,
encontra-se dispositivos de converso e armazenamento de energia, estruturas para uso em
eletrnica e fotnica, melhores catalisadores de reaes qumicas e sensores para uso em reas
8,
estratgicas como as de energia, medicina, informao, segurana, ambiente e indstria .

107
B
A

10
Fig. 1: A- A escala das coisas ; B- esquema dos mtodos top down e bottom up de sntese
de nanopartculas, os quais so tambm aplicveis para outros nanomateriais e para a
nanotecnologia.

Para superar os desafios, so utilizadas estratgias baseadas nas propriedades


moleculares, tais como, absoro, reflexo e emisso de luz, transferncia e transporte de
eltrons, reaes trmicas, magnetizao, sinalizao qumica, reconhecimento molecular e
qumica de coordenao (interaes metal-ligante). Como essas propriedades so utilizadas na
superfcie das nanoestruturas e, nessa escala, as interaes podem ser potencializadas em
vrias ordens de grandeza devido aos efeitos de tamanho e de superfcie, as nanoestruturas
apresentam propriedades distintas das propriedades das molculas, dos slidos cristalinos
8,9
tpicos e de dispositivos convencionais .

Os sistemas biolgicos apresentam a mais eficiente organizao sistemtica de


estruturas e processos na escala nanomtrica, tais como as enzimas e outros tipos de protena.
Por exemplo, a miosina, responsvel pela contrao e extenso muscular, pode ser
classificada como motores moleculares proteicos que convertem energia qumica em trabalho,
com base nos movimentos coletivos de seus componentes moleculares. O desenvolvimento de
tecnologias que possibilitam a monitorizao da interao de nanomateriais com estruturas
biolgicas tem impulsionado a criao de novas tcnicas e dispositivos de diagnstico e
8
teraputica, como por exemplo, nanosensores de biomolculas . Assim tambm, as
propriedades fsico-qumicas de nanopartculas e diversificadas molculas ou biomolculas
108
podem ser combinadas, visando o desenvolvimento de novos nanomaterias funcionais e
8,9,11
nanoaditivos . Neste sentido, torna-se cada vez mais importante e fundamental a
abordagem da nanocincia no BC&T da UFABC, e especificamente, nas aulas prticas de
Bioqumica: estrutura, propriedades e funes de Biomolculas.

Nanopartculas (NPs) e outras nanoestruturas metlicas envolvem, pelo menos em uma


dimenso, de dezenas a centenas de dezenas de tomos de metais os quais, nesse arranjo, possuem
caractersticas bem diferenciadas dos seus tomos individuais ou materiais massivos (bulk), tais
como grandes energias de superfcie, estrutura eletrnica especfica (densidade local de estados),
excitao de plasmons de superfcie, confinamento quntico, ordenao de curto alcance, entre
outras. As propriedades nicas dessas nanoestruturas so observadas em nvel eletrnico, ptico,
11,12
cataltico e magntico . As propriedades eletrnicas notveis tm despertado o interesse dos

fsicos; as relacionadas as monocamadas orgnicas da superfcie, dos qumicos. Suas aplicaes


vm sendo ampliadas medida que ocorre uma maior compreenso do efeito da ressonncia de
plasmon de superfcie localizado (LSPR), o qual explica o comportamento ptico destes materiais
e um dos tpicos de estudo da plasmnica. Plasmnica uma nova cincia, um termo hbrido
entre oscilao de plasma (plasmon) e eletrnica, que indica o acoplamento de ftons na
determinao da oscilao da densidade de carga nos eltrons de conduo em metais, seguindo o
modelo de oscilador harmnico da mecnica clssica (ressonncia). Um de seus focos o estudo
das propriedades pticas singulares de NPs metlicas que permitem a manipulao ativa da luz na
13
escala nanomtrica .

As nanopartculas de ouro (GNPs, do Ingls gold nanoparticles) tm sido utilizadas


nas mais diferentes reas da pesquisa cientfica fundamental bem como aplicada no setor
produtivo. Essa diversidade de reas de aplicao ocorre porque mudanas de propriedades
das GNPs so observadas em funo da morfologia, tamanho e grau de agregao. Ainda,
nanoestruturas podem criar microambientes capazes de modular propriedades estruturais e
catalticas de outras molculas, bem como servir como sistemas de entrega de diferentes
compostos para clulas e tecidos. GNPs exibem excelente compatibilidade com biomolculas
e associadas a essas tambm possuem a capacidade de reconhecer, de maneira muito
especfica, o seu alvo correspondente, tal como ocorre com as cadeias de DNA, que
reconhecem suas cadeias complementares, e com os anticorpos, que reconhecem seus
antgenos. Assim, as duas caractersticas mais populares das GNPs - a mudana de cor aps a
agregao e a ressonncia de plasmons de superfcie localizada - tm sido exploradas em
13
imunoensaios e qumica analtica .

109
O comportamento ptico das nanopartculas metlicas (NPs-M) tem fascinado a
humanidade desde a antiguidade. Na figura 2A, visualiza-se a Taa de Lycurgus (sculo 4 a.
C) talvez o exemplo mais antigo conhecido de utilizao de nanomaterial. A anlise deste
vidro revelou que ele contm uma pequena quantidade de nanocristais metlicos (~ 70 nm)
contendo Ag e Au. Ainda em 1857, Faraday estudando a interao da luz em solues
coloidais de ouro percebeu que a cor vermelha era atribuda ao ouro nessa forma. conhecido
que o ouro, na forma macroscpica, um slido dourado dctil e com brilho metlico, que
pode ser dissolvido em gua-rgia, gerando uma soluo de cido tetraclorourico (H[AuCl4])
(figura 2B). O cido tetraclorourico ao ser reduzido em soluo, pode gerar nanopartculas
de ouro com a colorao da suspenso de nanopartculas variando do vermelho ao roxo
11,12
azulado dependendo do tamanho da nanopartcula e do estado de agregao (figura 2C) .

A B C

Fig.2: Propriedades de nanopartculas de ouro. Em A, imagem da Taa de Lycurgus: esquerda


visualiza-se em luz refletida e a direita em luz transmitida; em B, soluo de cido tetraclorourico;
em C, suspenso de nanopartculas de ouro semelhante as que sero sintetizadas nessa aula.

Quanto ao formato, GNPs podem ser isotrpicas (ex. esfricas) ou anisotrpicas


(figura 3). No caso das esfricas, as suas propriedades independem da direo em que so
consideradas, no entanto dependem do tamanho da NP. Diferentes tipos de nanopartculas
anisotrpicas de ouro tm sido produzidas, tais como os nanobastes, nanoprismas,
nanocubos, nanoconchas e as NPs multi ramificadas (NPMR) com caractersticas de
14
nanoestrelas, nanoflores, e a forma de ourio do mar . Nanopartculas de ouro anisotrpicas
so interessantes porque possuem propriedades e aplicaes especficas dependentes da sua
forma e do seu tamanho e, dentre essas, destacamos os eletrnicos em nanoescalas, energia
15,16
fotovoltaica (figura 4A), marcadores biolgicos (figura 4B), sensores qumicos e outros .

110
16
Fig. 3: Imagens de microscopia de nanopartculas de ouro (TEM e SEM) .

17 18
Fig. 4: Energia fotovoltaica . Marcador biolgico .

Nanopartculas metlicas (ouro e prata) e semicondutoras exibem propriedades pticas


peculiares que so resultado direto da interao da radiao eletromagntica (ultravioleta ao
infravermelho) com suas propriedades eletrnicas. A diversidade de cores das solues de
nanopartculas metlicas em funo do tamanho, explicada pelo efeito de confinamento
quntico e a prpria origem fsica dessas cores, ressonncia de plasmons de superfcie
11,12.
localizado (LSPR). A interao da luz visvel com NPs-M dispersas no solvente (Fig. 5)
est na origem das interessantes cores observadas, sendo que base terica desses estudos tem
sido a Teoria de Mie (absoro e espalhamento da radiao eletromagntica por esferas de
pequenas dimenses) associada com o modelo de eltrons livres de conduo, considerando o
volume da partcula e as funes dieltricas do meio e do material. Para entender a colorao
de solues de NPs-M importante lembrar que os materiais transparentes apresentam uma
aparncia colorida como consequncia da absoro seletiva de faixas especficas de
comprimento de onda () da luz. Geralmente a frao da luz absorvida pelo objeto est
relacionada excitao dos eltrons entre nveis de energia eletrnicos dos compostos que
constituem o objeto em questo. A cor observada resultado da combinao dos
comprimentos de onda que chegam aos olhos humanos e so decodificados pelo crebro. Na
12
nanoescala, as cores so explicadas por uma teoria que considera o fenmeno de plsmons .

111
Figura 5: Propriedades pticas de nanopartculas de ouro: uma soluo avermelhada de nanopartculas de
ouro de 20 nm ( direita) no detalhe, imagem das partculas por microscopia eletrnica pode ter sua
agregao induzida por agentes qumicos, o que muda a colorao da soluo para azul. A agregao
tambm altera a intensidade do fenmeno de espalhamento de luz, o que interfere na visibilidade de um
8
feixe de luz laser que incide na soluo. Essas propriedades abrem amplas possibilidades de aplicao .

A palavra plasmon veio da lngua inglesa como representao da quantidade da


oscilao do plasma (quantun of plasma oscillation). O plasmon de superfcie (SP, do ingls
surface plasmons) uma oscilao dos eltrons livres da banda de conduo de um metal
quando estes so submetidos a uma onda eletromagntica, podendo ocorrer em filmes
metlicos e nanopartculas metlicas. Nanopartculas de metal nobre possuem um plasmon
caracterstico associado com cada tipo de material e quando essas estruturas tm de 10 a 100
nm, o caminho livre mdio dos eltrons excede o tamanho da NP e a oscilao coletiva de
eltrons concentra-se na superfcie. Quando uma luz com frequncia apropriada incide nessas
NPs, excita o plasmon de superfcie da nanoestrutura (essa frequncia ressonante depende,
dentre outros parmetros, da funo dieltrica do metal e do meio circundante) e nessa
condio, o campo eltrico oscilante da irradiao direciona a oscilao dos eltrons de
conduo da NP no sentido contrrio ao campo eltrico da onda incidente, levando a
separao das cargas (fig. 6A). Este deslocamento das cargas promove a induo de um
dipolo eltrico na partcula. O dipolo induzido promove o aparecimento de um campo eltrico
restaurador na partcula, o qual tem a funo de restaurar o equilbrio dado pela distoro das
cargas. Esta fora restauradora e a induo do dipolo, quando acopladas, geram uma srie de
oscilaes coerentes de densidade de carga e campo eltrico denominadas ressonncia
plasmnica, a qual quando observada em nanopartculas metlicas, denominada
13,19
ressonncia plasmnica de superfcie localizada (fig. 6C e D) .

112
A C

B D

Fig. 6. Representaao esquemtica da origem de um dipolo eltrico induzido e efeito da fora restauradora
devido separao de cargas nas nanopartculas metlicas. A LSPR ocorre quando a oscilao coletiva dos
eltrons de valncia na nanopartcula metlica est em ressonncia com a frequncia da luz incidente. Em
A, excitao de plasmon de superficie em nanopartcula esfrica. Em B, a nanoparticula de ouro (Au) age
como uma nanoanena pela excitao de uma ressonancia de plasmon

de s uperficie localizada dipolar, e es s a nanoantena pode emitir radiao na mes ma frequncia (

Em C, induo de plasmons para formao de bandas de LSPR em nanopartculas de ouro esfricas


11
(AuNP) e em D, em nanobastes de ouro (AuNR) .

A magnitude do dipolo induzido determinada pela polarizabibidade da esfera de


metal e a fora do campo eltrico incidente. O sinal do dipolo induzido localizado muda
periodicamente com a frequncia angular da onda eletromagntica (figuras 6C). Assim, uma
nanoantena gerada, a qual pode emitir radiao na mesma frequncia (fig. 6B). Desse modo,
uma simples NP metlica esfrica capaz de capturar e concentrar ondas de luz em volumes
nanomtricos e, por conseguinte, permite o estudo fundamental das interaes luz-matria
nessa escala. Outra propriedade interessante associada aos plasmons de superfcie sua
capacidade de aumentar o campo eltrico local, principalmente na regio entre NPs prximas,
levando a intensificao do espalhamento Raman das molculas que se encontram nesse hot-
spot. Esse fenmeno est relacionado ao espalhamento Raman intensificado por superfcie
(SERS, na sigla em ingls). Assim, diversas aplicaes tm emergido nos ltimos anos
decorrente da LSPR, tais como microscopia eletrnica de transmisso, tcnicas
espectroscpicas, sensores biolgicos, nano-aquecedores, clulas solares, gravao magntica
assistida termicamente, crescimento de nanoestruturas, manufatura de circuito para
12,13
computadores, gerao de imagens e terapia fototrmica contra o cncer.
113
A LSPR uma propriedade eletrnica de NPs-M, que para os metais nobres ouro e prata
se manifesta na regio espectral do visvel, sendo assim tambm pode ser considerada uma
propriedade ptica. A LSPR, em coloides de ouro e prata, induz uma forte absoro (ou extino)
da luz e os comprimentos de onda no absorvidos so os responsveis pela colorao da
suspenso de NPs que os olhos humanos percebem. Essa propriedade muito sensvel ao formato
da partcula e a agregao dessas, gerando mudanas de colorao da soluo bastante intensas. A
LSPR pode ser medida usando um espectrmetro de absoro UV-Vis e gera uma banda de
absoro no espectro visvel denominada banda de ressonncia plasmmica de superfcie
20
localizada, ou simplesmente banda plasmnica (BP) . A localizao espectral, a intensidade e

a largura da banda plasmnica dependem de fatores que afetam a densidade de carga de eltrons
sobre a superfcie da partcula tais como o tipo de metal, tamanho, forma e estrutura da partcula,
agregao, a constante dieltrica do meio circundante e temperatura. No h BP para GNPs com
dimetro inferior a 2 nm nem para ouro macio (bulk).

A cor de coloides de GNPs de forma aproximadamente esfrica pode ir desde o azul


at o laranja (quando o tamanho da NP reduzido at cerca de 3 nm), passando por diversos
tons de vermelho. A figura 7A ilustra os espectros de absoro de bandas plasmnicas de
partculas isotrpicas de ouro de diferentes dimetros. Na figura 7B observa-se as mudanas
na colorao da suspenso em funo do dimetro das GNPs conforme mostrado por imagens
de microscopia eletrnica de transmisso (TEM). Para GNPs esfricas, existe apenas uma
frequncia SPR, na regio espectral de 520 nm , a qual responsvel pela cor vermelha
intensa dessas NPs . No entanto, para nanopartculas maiores, ocorre um desvio da
aproximao de Mie, uma vez que o campo eltrico da onda incidente gera indues
eletromagnticas no uniformes sobre a partcula, as quais ocasionam modos de excitao e
relaxao diferentes para os eltrons. Assim, o aumento da dimenso gera deslocamentos da
frequncia de excitao plasmnica para energias menores (redshifts). Ocorre tambm o
alargamento da banda plasmnica pois devido a densidade eletrnica no oscilar em fase
(homogeneamente), diferentes densidades eletrnicas so excitadas em diferentes frequncias.

114
A

Figura 7. A. Banda de ressonncia plasmnica localizada das nanopartculas isotrpicas. B.


Diferentes cores das suspenses de nanopartculas de ouro em funo do tamanho e
15
microscopia eletrnica de transmisso (todas as escalas correspondem a 100 nm) .
As figuras 8A e 8B ilustram, respectivamente, os espectros de absoro das bandas
plasmnicas de GNPs anisotrpicas e as coloraes das solues. Essas diferentes formas
possuem diferentes espectros de absoro ou colorao e isto se deve a mltiplas ressonncias
na complexa estrutura. Por exemplo, em partculas alongadas (elipsoides e bastonetes) so
observadas duas bandas plasmnicas que esto relacionadas com os modos de oscilao
21
transversal e longitudinal (fig. 6D) e correspondem a sobreposio de todas as contribuies
de oscilaes de diferentes energias decorrentes da distribuio da nuvem eletrnica induzida
na NP relacionada com o tamanho e forma dessa. A banda transversal est relacionada s
oscilaes de eltrons que ocorrem ao longo da direo transversal, uma banda de absoro
localizada na regio espectral do visvel e semelhante das GNPs esfricas. A banda
longitudinal refere-se as oscilaes de eltrons ao longo do eixo longitudinal e uma banda
de absoro na regio Vis- NIR.

A distncia entre NPs vizinhas determina o acoplamento plasmnico entre partculas,


de modo que quando GNPs se aproximam, para distncias comparveis com o seu dimetro
(agregao), a banda LSPR caracterstica da NP isolada comea a desviar-se para regies de

115
menor energia (regio espectral do vermelho e infravermelho prximo) e apresenta-se alargada.
21
Estruturas complexas como NP agregadas apresentam um amplo espectro de absoro .

Fig. 8. A. Bandas de ressonncia plasmnica de nanopartculas anisotrpicas. B. Banda de


ressonncia plasmnica de um nanobasto e uma nanopartcula multiramificadas. C.
Diferentes cores das suspenses de GNP em funo do tamanho e microscopia eletrnica de
21
transmisso (todas as escalas correspondem a 100 nm) .

O efeito de confinamento quntico est relacionado com o a restrio espacial, nas trs
dimenses geomtricas, dos portadores de carga (eltrons e lacunas), fazendo com que as
propriedades eletrnicas e fsico-qumicas sejam fortemente dependentes da relao
superfcie/volume da nanoestrutura. Para o entendimento desse efeito nas NPs, necessrio
considerar alguns conceitos relacionados s propriedades eletrnicas de materiais condutores,
semicondutores e isolantes no estado slido. Pela mecnica quntica, conhecido que as rbitas
eletrnicas esto a distncias bem definidas em relao ao ncleo do tomo e esse fato faz com
que entre uma rbita e outra exista uma regio onde no possvel existir eltrons, denominada
banda proibida de energia (gap de energia), pois no h nveis eletrnicos que os comportaria.
116
O tamanho dessa banda proibida relativo ao ltimo orbital ocupado e o primeiro vazio define
o comportamento eltrico do material conforme pode ser observado na figura 9. Isolantes
apresentam uma grande banda proibida. Apenas quando a excitao feita com uma energia
superior em vrios eV da banda proibida (bandgap) a conduo possvel. Semicondutores
tm um bandgap mais estreito e mesmo temperatura ambiente poucos eltrons podem ser
conduzidos para a banda de conduo. Semicondutores dopados tm maior condutncia
eltrica, porque dopantes adicionais fornecem eltrons de conduo, pois estes se encontraro
em nveis de energia inseridos no gap do material. Condutores no apresentam gap. Os metais
em escala macroscpica (bulk) apresentam um arranjo peridico de uma enorme quantidade
de tomos em uma rede cristalina e muitos eltrons livres, alta condutividade e alta refletividade
da luz (desde que a frequncia no seja muito alta) e no possuem uma banda proibida de energia.
Porm ocorre a mudana dessa estrutura de energia quando as partculas metlicas se tornam
pequenas o suficiente para que efeitos de quantizao ocorram, ou seja, ao se considerar as
nanopartculas metlicas como aglomerado nanomtrico de poucas dezenas ou at de milhares
de tomos.

Banda de
Primeira Conduo Eltrons Banda de
banda de (BC) livres conduo
energia Metal na escala
vazia Banda macroscpica (bulk)
proibida
(gap)
ltima
banda de Lacunas Banda de
energia Banda de valncia
ocupada Valncia
(BV)
Isolante Semicondutor Condutor

Fig. 9. Esquema da estrutura de bandas de energia de materiais no estado slido. O tamanho da


banda proibida [diferena entre a ltima banda de energia ocupada na banda de valncia e o
primeira vazia na banda de conduo] define o comportamento eltrico do material. Isolantes
apresentam uma grande banda proibida. Condutores no apresentam um gap de energia. Os
metais na escala macroscpica apresentam alta condutividade.

Na figura 10A e 10B observa-se, respectivamente, uma representao esquemtica dos


nveis de energia eletrnica em espcies semicondutoras e em espcies metlicas. sabido que
tomos isolados possuem nveis de energia eletrnica discretos (quantizados). No entanto,
transies eletrnicas, podem ocorrer, por exemplo, devido a excitao ptica e pode mudar o
estado do tomo. As molculas tambm podem ter nveis de energia discretos, mas como possuem
uma estrutura mais complexa apresentam um diagrama dos estados eletrnicos muito mais
complexo. Alm disso, vibraes e rotaes modulam os nveis de energia observados.

117
Ao aglomerarem-se para formao de clusters, ou nanopartculas com algumas dezenas ou
mais de nanmetros, os orbitais eletrnicos dos tomos formadores das estruturas sobrepem-
se interagindo entre si, o que resulta na formao de orbitais moleculares. Com o aumento
progressivo da quantidade de tomos e, portanto, do tamanho da NP, os nveis centrais da
banda de energia se aproximam, tornando-se quase contnuos, enquanto as regies da base e
topo da banda ainda se mostram discretizadas (Fig. 10B nanopartcula). Com o aumento do
nmero de tomos a partir de determinados valores, as bandas de energia adquirem o carter
contnuo de volume metlico (bulk).

A B

BC

tomo BV
isolado
BV
Aglomerado de Nanopartcula Volume
tomo Molcula Quantun Semicondutor bulk poucos tomos metlica (bulk)
dot

Fig. 10. Representao esquemtica da estrutura de energia eletrnica em relao ao nmero de tomos e
densidade de estados. O diagrama de nveis de energia em um slido cristalino depende do nmero de
tomos combinados quimicamente. O aumento da quantidade de tomos (e da densidade de estados)
provoca a transio do discreto para o contnuo. Em A, representao comparativa para uma nanoparticula
de semicondutor (quantum dot): os nveis de energia discretos das orbitais atmicos tendem para bandas de
energia com o aumento do nmero de tomos. Em B, representao comparativa para NP metlica: com o
aumento progressivo da quantidade de tomos e, consequentemente, com o aumento do tamanho da NP, os
nveis centrais da banda de energia se aproximam, tornando-se quase contnuos, enquanto as regies da
base e topo da banda ainda se mostram com valores discretos. Assim, dependendo das dimenses da NP, h
a variao do gap entre o ltimo nvel de valncia e o primeiro de conduo, diferente do metal em escala
macroscpica. No limite em que o nmero de tomos apresenta-se suficientemente grande, consistindo em
um volume metlico, as bandas de energia adquirem o carter contnuo. Em cinza, estados eletrnicos
desocupados. (Adaptado das referncias 13 e 20)

Conforme mostrado na fig. 7, o aumento da dimenso da NP gera deslocamento da


frequncia de excitao plasmnica para energias menores (ou maior ou frequncia menor ou
redshift). A figura 11A tem o objetivo de explicar esse comportamento de uma maneira
simplificada e didtica. Assim, pode ser observado que com o aumento de tamanho das
nanopartculas metlicas o gap passa a apresentar-se menor (devido ao efeito de confinamento
quntico), a energia necessria para promover eltrons da ltima banda de energia ocupada na banda
de valncia para a primeira vazia na banda de conduo menor e, portanto, est relacionada com
ftons com valores maiores de comprimento de onda. Essa caracterstica se mantem at

118
que o dimetro da NP seja tal que os efeitos de confinamento quntico no mais estejam
presentes e sua estrutura de banda de energia aproxima-se do comportamento do material bulk
metlico (sem gap). De modo anlogo, com a diminuio do tamanho da nanopartcula a
quantidade de energia necessria para promover eltrons da ltima banda de energia ocupada na
banda de valncia para a primeira vazia na banda de conduo torna-se maior, estando ento
relacionada com ftons com valores menores de comprimento de onda (maior energia). As
diferentes energias de excitao esto relacionadas com os diferentes tamanhos de gap e esses
por sua vez esto relacionados aos diferentes dimetros das NPs metlicas. Assim, com o
aumento do tamanho de GNPs esfricas, a soluo coloidal passa dos tons de vermelho para a
14
cor azulada . importante lembrar que a cor observada na soluo coloidal resultado da
combinao dos comprimentos de onda que interagiram com a matria e chegaram aos olhos
humanos sendo ento decodificados pelo crebro.

A BULK
Energia

gap

Aumento do tamanho das nanopartculas metlicas


Aumento da energia associada ao fton

Fig. 11. Em A, representao esquemtica da relao entre dimetro de nanopartcula de ouro


esfrica e quantidade de energia da radiao eletromagntica necessria para promover eltrons da
banda de valncia para a banda de conduo. Com o aumento de tamanho dessas nanopartculas, o gap
menor, a radiao eletromagntica absorvida apresenta um valor de energia menor e, portanto,
relacionada com comprimento de onda maiores. Em B, espectro eletromagntico e no destaque a
regio espectral do visvel com os comprimentos de onda, frequncia e cores relacionadas.
119
Mtodos fsicos, qumicos e eletroqumicos tm sido desenvolvidos e aprimorados
para o preparo de GNPs. Atualmente, as abordagens mais comuns para a sntese por mtodos
qumicos de GNPs envolvem a reduo do cloreto de ouro (HAuCl4) em soluo aquosa. Os
3+
ons Au so introduzidos ao meio reacional a partir do cido tetraclorourico, que a forma
cida do cloreto de ouro (III). A reduo de HAuCl4 com reagentes redutores comuns, tais
como boro-hidreto de sdio (NaBH4) ou citrato de sdio, permite a produo de
3+ 0
nanopartculas esfricas. Utilizando o citrato de sdio, ocorre a reduo de Au para Au ,
resultando na formao de nanopartculas que possuem rede cbica de face centrada, com
12
tamanho de partculas definido pela concentrao de citrato de sdio presente no meio .

Uma das principais dificuldades na realizao do experimento de sntese de


nanopartculas metlicas a obteno de suspenses coloidais estveis, j que nanopartculas
metlicas possuem uma alta energia superficial, favorecendo termodinamicamente a imediata
agregao destas para a formao de ligaes metal-metal. Para evitar a agregao das NPs, a
preparao de sistemas coloidais geralmente efetuada em presena de espcies denominadas
estabilizadores, que se adsorvem sobre as superfcies das NPs, formando uma camada auto-
organizada que impede a coalescncia. Assim, tm sido usados agentes que introduzem cargas
eltricas em sua superfcie aumentando a repulso, ou essas tm sido recobertas com
molculas de surfactantes e polmeros, impedindo a atrao. Alguns dos estabilizadores mais
eficazes so os polimricos, como, por exemplo, poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(lcool
vinlico) (PVA) e cido poliacrlico (PAA), que possuem, em suas estruturas, stios bsicos de
Lewis com alta afinidade pelas nanopartculas, e cadeias orgnicas suficientemente compridas
que criam um impedimento estrico, evitando interaes entre as mesmas. Entretanto, a
agregao de NPs pode ser til para certas aplicaes, como por exemplo, para detectar o
reconhecimento molecular de antgenos e anticorpos tratados com GNPs. Nesse caso, a
agregao leva a uma interao que d origem a uma colorao violeta-azulada
9
caracterstica . Tambm as molculas do solvente e de outras espcies coordenantes presentes
em soluo podem se ligar superfcie da partcula, o que somado a fora de ligao e a
densidade dos tomos (que dependem da face cristalina exposta) tornam desigual a velocidade
de crescimento em certas direes e geram nanoestruturas de maior dimenso e com
diferentes formas. As propriedades da camada de recobrimento da NP definem sua
dispersibilidade, compatibilidade e interaes entre si e com outros materiais e molculas.

120
Figura 12. Esquema das etapas ocorridas no processo da sntese qumica para obteno de
nanopartculas de ouro.

Figura13 : Grfico da concentrao atmica versus time, ilustrando a gerao de tomos,


22
nucleao e consequente crescimento das nanopartculas .

O tampo HEPES tem sido usado na sntese verde de NPMRs. Dependendo da


concentrao do tampo HEPES e das molculas presentes no meio, as nanopartculas
possuem diferentes coloraes (figura 15 C e D). Na sntese das NPMR de ouro, o HEPES
atua como agente redutor e agente de crescimento e direcionamento, porque sua piperazina
capaz de gerar radicais livres no nitrognio central e isso reduz o on ouro.

121
Figura 14: Tampo HEPES (esquerda) e cido tetraclorurico (direita).

Figura 15: Espectros eletrnicos de solues coloidais de nanoparticulas de ouro sintetizadas


com diferentes concentraes de HEPES evidenciando as bandas de ressonncia plasmnica e
15
as diferentes cores das solues .

A diversidade de usos das GNPs requer nanopartculas com propriedades especficas e


como essas propriedades so determinadas por forma, tamanho, estado de agregao e agentes
de recobrimento (estabilizantes), existe um grande interesse cientfico por novos mtodos de
sntese. Essa busca visa tambm o baixo custo (os produtos comerciais so caros e pouco
diversificados), condies amigveis ao meio ambiente e biocompatibilidade para a indstria
farmacutica e outras aplicaes biomdicas. Assim, novos processos de sntese mais simples
so desejveis e utilizao de macromolculas biolgicas, tais como as proteinas, so de
grande interesse para desenvolvimento de metdos verdes para a sntese de NPs metlicas.
Esse interesse decorre da presena de grupos qumicos redutores, de oferecerem a vantagem
de agir como biotemplates para dirigir o crescimento e a geometria de NPs alm do processo
de sntese ser modulado por fatores como temperatura, pH do meio, a concentrao e
proporo dos reagentes, o molde fornecido pela estrutura molecular e a solvatao.

O mtodo de sntese proposto nessa aula permite a sntese de GNPs em condies de


bancada temperatura ambiente, com poucos reagentes e extrato de frutas. Essas caractersticas

122
potencialmente ampliam o uso de GNPs como uma ferramenta para pesquisadores com pouca
ou nenhuma experincia em sntese qumica, alm do uso didtico. A sntese e caracterizao
dessas NPs tm sido estudadas no Laboratrio de Nanoestruturas para Biologia e Biomateriais
Avanados da UFABC.

4 1,0
NP-HEPES
1 2 3 4 NP (HEPES+ abacaxi)
0,8
NP-HEPES add abacaxi
suco abacaxi
Tampao HEPES 30mM-pH10
Soluo agua+ouro_200uM
0,6
3
3
0,4 1
Intensidade

2
0,2
2 4
0,0
440 480 520 560 600 640 680 720 760 800

4
1

2 1
0 240 280 320 360 400 440 480 520 560 600 640 680 720 760 800

Comprimento de onda (nm)

Figura 16: Espectros de absorbncia das solues coloidais de nanoparticulas de ouro sinteti-zadas
nessa aula, evidenciando as bandas de ressonncia plasmnica e a colorao das solues.

A fig. 16 mostra o espectro de absorbncia de GNPs sintetizadas com uso de diferentes


substncias como agentes redutores e estabilizantes. A linha azul (1) mostra o espectro de GNPs
3 0
sintetizadas com uso de HEPES como agente redutor do on Au + a Au (primeira etapa de
sntese da GNP) e estabilizante da GNP formada. O espectro mostra bandas de absoro em duas
regies: a regio visvel onde se observa uma banda larga com pico em 640 nm que consistente
23
com GNPs multi ramificadas, anisotrpicas com dimenses acima de 50 nm e a regio UV onde
aparece uma banda em 340 nm que consistente com a presena de HEPES e seus produtos de
oxidao, coordenados na superfcie da GNP. A linha vermelha mostra um espectro de GNPs
sintetizadas com uso de HEPES e uma soluo de suco de abacaxi. Nessa condio as GNPs
formadas apresentam banda plasmnica em 520 nm, consistente com a formao de GNPs
esfricas e de menor dimenso do que as formadas somente com HEPES. O tamanho das GNPs
formadas controlado por fatores termodinmicos e cinticos. Observa-se que as GNPs formadas
em presena de suco de abacaxi com HEPES no apresentam a banda sugestiva da coordenao
desse composto ou seus produtos de oxidao com a superfcie das

123
GNPs, mas, ao contrrio, apresenta uma banda em 280 nm tpica dos aminocidos aromticos
e pontes dissulfeto das protenas. Portanto, nessa condio, provavelmente, as protenas do
suco de abacaxi foram mais competitivas do que o HEPES e seus produtos para coordenao
com a superfcie das GNPs. Porm, no tempo observado nesse experimento, as protenas do
suco de abacaxi, quando esse foi adicionado nas GNP previamente sintetizadas com uso de
HEPES (linha verde), no conseguiram deslocar o HEPES e seus produtos da coordenao
com ouro e o espectro registrado apresenta a banda do suco de abacaxi sobreposta ao espectro
do HEPES e seus produtos coordenado com as GNPs.

Fig. 17. Representao esquemtica das propriedades eletrnicas e pticas na nanoescala


relacionadas com a diversidade de cores apresentadas pelas suspenses de nanopartculas
metlicas em funo do tamanho, morfologia e estado de agregao.

2. Objetivos da aula

Estudar a correlao entre estrutura proteica e atividade enzimtica.


Aprendizagem de um mtodo verde, de uma etapa, de sntese de nanopartculas de ouro
biocompatveis com capacidade de modular a atividade biolgica de protenas. Esse
estudo resgata e coloca em prtica conceitos bsicos de Qumica, como teorias de ligao
metlica, estrutura atmica, reaes de oxidao-reduo e espectroscopia, ao mesmo
tempo em que introduz novos conceitos, como o efeito de confinamento quntico e a
ressonncia de plasmons de superfcie.

124
3. Procedimento Experimental

Materiais

8 tubos de ensaio de 20 mL
1 tubo de ensaio de 30 mL
8 flaconetes de vidro com tampa (5 mL) por
turma 5 eppendorfs de 2mL
Estante para tubos de ensaio
Estante para Eppendorfs
Bquer de vidro de 100 mL (para aquecer gua)
Bquer de 25 ou 50 mL (para gua destilada)
Funil de vidro pequeno e papel de filtro, tesoura para cortar o papel de
filtro Recipiente com gelo
Almofariz e pistilo
Luvas de ltex
Basto de vidro (para dissolver a gelatina)
Placa aquecida ou banho-maria 100C
Banho-maria 60C
Banho-maria 30C
Balana
Micropipetas de 10 L, 100 L e de 1000 L (um conjunto para cada grupo)

Reagentes

Abacaxi maduro (1 fatia mdia de polpa de abacaxi picado por grupo)


Gelatina incolor e sem
sabor gua destilada
Tampo com HEPES e Fosfato de Sdio (30 mM) pH 10
Soluo de sal de ouro (30 mM)
Soluo de sulfato de amnio 3 mol/L
Etanol absoluto ou comercial 99,3 INPM

Planejamento: Turma dividida em 6 grupos, sendo 3 grupos por bancada.

1 etapa : Extrao do suco de abacaxi ( por grupo)

A extrao do suco ser feita macerando-se os pedaos de abacaxi utilizando almofariz


e pistilo. O suco deve em seguida ser filtrado utilizando funil de vidro e papel de filtro em um
tubo de ensaio de 20 mL. O tubo dever ser armazenado no gelo.

125
2 etapa : Sntese de nanopartculas de fruta com sal de ouro (GNP) - por bancada

Essa etapa dever ser feita com a TURMA separada em 2 grupos, ou seja, cada bancada
constitui um grupo.

Cada GRUPO (bancada) dever seguir o PROTOCOLO indicado na tabela 1 e preparar em


frascos de vidro com tampa identificados, 1500 L de cada um dos 4 tipos de soluo,
fazendo a adio na ordem em que aparecem os reagentes. Realizar a sntese em temperatura
ambiente (~ 25C).

Aps a sntese, reservar os frascos tampados para serem usados na 6 etapa dessa aula.

Observar a mudana de colorao das solues. Fotografar os frascos imediatamente aps a


sntese e aps 30 minutos quando da adio do extrato de abacaxi soluo de GNP-HEPES
adicionado abacaxi.

Tabela 1. Resumo do procedimento experimental de sntese de nanopartculas

Soluo
GNP-HEPES GNP-HEPES
Extrato de
adicionado
GNP- HEPES + abacaxi abacaxi
Reagente abacaxi

Tampo
HEPES+Fosfato de
1390 L 1390 L 1390 L 1400 L
sdio (30 mM)
pH 10
L (microlitros)
gua destilada 100 L -- -- --

Extrato de abacaxi -- 100 L -- 100 L

Soluo de sal de
ouro 10 L 10 L 10 L --
(30 mM)

Cor da soluo

Depois de 30
minutos
-- -- -- acrescentar --
100 L extrato
de abacaxi

Cor da soluo

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3 etapa : Preparo da gelatina (por grupo)

Pesar 2 g de gelatina incolor e sem sabor de qualquer marca comercialmente disponvel e


dissolver em 20 mL de gua destilada, em tudo de ensaio de 30 mL, aps solubilizao a soluo
de gelatina deve ser aquecida a 60C e mantida nessa temperatura at o uso.

4 etapa : Atividade enzimtica do suco de abacaxi e desnaturao protica por


aquecimento (por grupo).

1) Primeiramente, deve-se preparar as amostras de abacaxi. Para isso, utilizando tubos de


ensaio de 20 mL, deve-se pipetar 2,0 mL de gua no tubo 1 (controle) e 2,0 mL do extrato de
abacaxi nos tubos 2, 3 e 4, conforme indicado na tabela 2.

2) Tratamento das amostras durante 5 minutos:


O tubo 2 deve ser mantido temperatura ambiente.
O tubo 3 deve ser aquecido 60C .
O tubo 4 deve ser fervido .
3) Aps este tempo de tratamento de cada uma das amostras, imediatamente resfriar no gelo
por 1 minuto.
4) Aps o resfriamento da amostra fervida adicionar em todos os tubos a soluo de gelatina.
Homogeneizar.
o
5) Incubar todas as amostras por 10 minutos a 37 C .
6) Em seguida resfriar todas as amostras no gelo por 7 minutos, observar e anotar o resultado.
Tabela 2. Resumo do procedimento experimental.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4


gua 2,0 mL - - -
Amostra Abacaxi - 2,0 mL - -
Amostra Abacaxi 60C - - 2,0 mL -
Amostra Abacaxi Fervida - - - 2,0 mL
Gelatina 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL
Resultado (geleificao ?)

127
5 etapa : Precipitao de protenas (por grupo).

Pipetar nos tubos de ensaio de 20 mL os reagentes conforme a tabela 3, realizar o


experimento em temperatura ambiente (~ 25C). Observar e anotar o resultado para posterior
discusso.

Tabela 3. Resumo do procedimento experimental de precipitao de protenas.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

gua 2,0 mL - -

Sulfato de amnio - 2,0 mL -

Etanol Absoluto - - 2,0 mL

Gelatina 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL

Precipitao?
Caractersticas do
precipitado

6 etapa : Modulao da estrutura/atividade das enzimas pela associao com


nanopartculas de ouro (por grupo).

1) Identifique os Eppendorfs como: A,B,C,D e E.


2) Adicione a cada um os reagentes conforme tabela 4, colocando inicialmente a soluo de
gelatina mantida a 60C e logo depois a respectiva soluo. Homogeneizar.

128
Tabela 4. Resumo do procedimento experimental da 6 etapa

Grupo

A B C D E

Reagentes

Gelatina 250 L 250 L 250 L 250 L 250 L

gua
250 L -- -- -- --
deionizada

Soluo de
-- 250 L -- -- --
NP- HEPES

Soluo de
-- -- 250 L -- --
NP- HEPES +
abacaxi

NP-HEPES
adicionado -- -- -- 250 L --
abacaxi

Soluo de
extrato de -- -- -- -- 250 L
abacaxi

Digesto da
gelatina ?

(n de dias aps
sntese)

3) Feche bem os Eppendorfs. Esses devero ser mantidos a temperatura ambiente por 10
minutos e logo aps incubados no gelo por 7 minutos.

4) Aps o perodo de incubao, observe as caractersticas da gelatina em relao a


geleificao e viscosidade e anote os resultados. Fotografe.

5) Na prxima aula (aula de discusso) cada grupo dever observar seus Eppendorfs em relao
digesto da gelatina (perda da consistncia de gel), anotando e fotografando os resultados.

129
ATENO : NO ABRIR OS EPPENDORFS EM NENHUM MOMENTO DO PERODO
DE OBSERVAO PARA QUE NO OCORRA CONTAMINAO DAS AMOSTRAS.
O descarte dos Eppendorfs dever ser feito no laboratrio em local adequado.

4. Anlise dos dados:

1. Preencha as tabelas indicando os resultados observados de cada experimento.


2. Utilize as fotografias dos resultados para fazer suas anlises.
3. Discutir o efeito do suco de abacaxi sobre o colgeno (gelatina).
4. Discutir o efeito da temperatura sobre as enzimas (proteases) presentes no suco do abacaxi.
5. Discutir o efeito do etanol e do sulfato de amnio sobre as protenas em soluo. Qual o
princpio de cada efeito.
6. Quais as etapas de sntese de nanopartculas metlicas? Baixe o seguinte artigo como
material de estudo : http://dx.doi.org/10.3389/fchem.2016.00013 Analise a figura 7 desse
artigo e o texto correspondente e faa um resumo para responder a pergunta.
7. Pesquise em artigos cientficos publicados em revistas indexadas os efeitos que a interao
com nanopartculas metlicas provoca na estrutura das protenas globulares.

5. Para discusso:

1. Pesquisar: qual(is) protease(s) est(o) presente(s) no suco de abacaxi.


2. Como poderia ser realizada a purificao dessa(s) protena(s)?
3. A atividade das proteases pode ser otimizada? Como?
4. Discuta o efeito da temperatura sobre a desnaturao de protenas no processo de
cozimento dos alimentos, qual a importncia disso?
5. Por que se pode utilizar abacaxi para amaciar carnes? Qual a relao entre o suco do
abacaxi e os amaciantes de carnes comerciais?
6. Pesquise o que efeito SERS (do Ingls, Surface Enhanced Raman Spectroscopy) quanto a
sua origem e utilidade para tcnicas de espectroscopia.
(Sugesto de artigo: http://www.mdpi.com/1996-1944/8/6/3024)

130
6. Exerccio
Ana, uma dona de casa, resolveu fazer uma sobremesa a base de gelatina e abacaxi para os
amigos que viriam visit-la, procurou na internet uma receita bem simples e que parecia ser
muito boa.

Como Ana estava com pressa deixou o abacaxi pouco tempo no fogo (cerca de 2 minutos) e j
adicionou a gelatina. Aps deixar a sobremesa esfriar, observou que a gelatina no havia
endurecido. Explique por que nessa situao a gelatina no endureceu depois de resfriada. Por
que a sobremesa postada na internet tinha a gelatina com pedaos de abacaxi slida?

Referncias Bibliogrficas
1.URL: http://www.protease.ufrj.br/ProteaseApres.htm

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