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2016
1
Sumrio
AULA CONTEDO
Apresentao e Disposies Gerais do Curso Experimental
Introduo
2
Apresentao e Disposies Gerais do Curso Experimental
APRESENTAO
A disciplina Bioqumica: Estrutura, Propriedades e Funes de Biomolculas composta por
aulas expositivas em sala de aula (3 horas semanais), por aulas prticas nos laboratrios didticos (2 horas
semanais) e atividades de estudo e resoluo de problemas pelos alunos, em casa (6 horas semanais). Este
guia traz ao estudante o contedo das aulas prticas, com introduo, objetivos, procedimentos e normas que
regem a execuo destas atividades.
OBJETIVOS E COMPETNCIAS
Os mdulos prticos desta disciplina tm como objetivo apresentar uma sequncia de experimentos
que permitir ao aluno identificar aspectos estruturais, funcionais e de reatividade da gua, protenas,
acares, lipdeos incluindo surfactantes naturais e sintticos, e enzimas. O aluno dever correlacionar as
estruturas com diferentes propriedades biolgicas e de potencial aplicao em novos materiais e tecnologias.
Dentre essas propriedades citamos: formao de agregados supramoleculares, tais como micelas e
lipossomos, sntese e estabilizao de nanopartculas, participao em reaes de xido-reduo,
propriedades catalticas como enzimas e coenzimas, propriedades de captao de energia luminosa,
propriedades de converso de energia. Dentre as aplicaes em diferentes ramos do conhecimento
destacamos o uso ou participao de biomolculas e seus mimticos em: controle de pH em diferentes meios
incluindo o biolgico, transporte atravs das membranas biolgicas, desenvolvimento e terapia de doenas
degenerativas, nutrio, carreamento de frmacos, produo de polmeros quimio, foto e biodegradveis,
bioclulas a combustvel, clulas solares, processos de remediao de danos ambientais, entre outros.
Espera-se que, aps a realizao das aulas prticas, o aluno seja capaz de compreender os conceitos
fundamentais da Bioqumica, fazendo a conexo entre o macroscpico, acessvel aos nossos sentidos, e os
eventos que ocorrem em escala molecular.
AULAS PRTICAS
Existem normas de segurana para o trabalho em laboratrio que devem ser seguidas e respeitadas.
Um conjunto destas normas ser entregue ao aluno no incio das aulas de laboratrio juntamente com um termo
de compromisso (caso no o tenha recebido em disciplina anterior) no qual o aluno se compromete a ler e seguir
as mesmas. Todos os trabalhos em laboratrio sero realizados por equipes de no mximo 5 alunos. Espera-se
que os resultados obtidos sejam obra de um esforo conjunto e que todos os componentes estejam presentes na
hora marcada para o incio das aulas. Haver uma tolerncia de 10 minutos e aps esse tempo os alunos
retardatrios no podero realizar as atividades do dia. A aula ser encerrada no horrio pr-
3
estabelecido, no havendo prorrogao para os alunos que no tenham concludo os experimentos dentro do
prazo previsto por motivos alheios prtica.
IMPORTANTE: No haver reposio de experimentos no caso de falta, ficando o aluno prejudicado com
o aprendizado daquele contedo.
AVALIAO
Para a avaliao das atividades prticas, ser utilizado o contedo do caderno de laboratrio
elaborado individualmente pelo aluno sobre cada experimento. O aluno dever fazer um pr-relatrio no
caderno anteriormente a aula em questo e utiliz-lo para as anotaes durante a aula, bem como as anotaes
referentes discusso dos resultados obtidos. Esse caderno deve ser apenas manuscrito e no poder conter cpia
xerogrfica do caderno dos colegas ou de qualquer outro material. O aluno no poder participar, em
hiptese alguma, da aula prtica sem o caderno de laboratrio contendo o pr-relatrio. O aprendizado
na disciplina de Bioqumica: estrutura, propriedade e funes de Biomolculas ser avaliado continuamente
ao longo da disciplina pelo acompanhamento direto do docente e tambm ao final por meio de provas
tericas e prticas. O componente da teoria da nota final ter peso 7 e o prtico, peso 3. A prova prtica
envolver a execuo de experimentos no laboratrio e resposta a questes propostas durante a execuo.
Alunos com rendimento igual ou superior a 86% obtero conceito A; com rendimento entre 70 e
85%, conceito B; com rendimento entre 56 e 70%, conceito C; de 50 a 55%, conceito D e rendimento
inferior a 50% com conceito F. O aluno reprovado (conceito F) poder fazer EXAME com o contedo
todo do quadrimestre, cuja nota constituir uma nova mdia aritmtica com a mdia quadrimestral
obtida previamente para chegar em seu conceito final.
1. obrigatrio o uso de avental (jaleco) no laboratrio; o mesmo deve ser comprido, de mangas compridas
e ser usado fechado (com os botes fechados);
2. No ser permitido fazer a aula de laboratrio usando sandlias, bermudas, shorts ou saia;
3. No permitida a execuo da aula de Transformaes Bioqumicas de bon, culos escuros nos olhos ou
na cabea e fones de ouvido;
6. O aluno que faltou em aula prtica ter prejuzo no componente da parte prtica da nota e nos seus
conhecimentos daquele tpico, uma vez que no h possibilidade de reposio da aula;
Modelo de Fluxograma
Experimento 1 Parte 1:
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ORIENTAES PARA O USO DE MICROPIPETAS
A transferncia de volume exato de lquidos fundamental para vasta maioria dos experimentos nas
reas de bioqumica, biologia molecular, qumica, etc. A medio de volume um passo importante em
qualquer laboratrio porque um pequeno erro de pipetagem pode causar um erro significativo no resultado
obtido. Micropipetas so aparelhos designados para a transferncia de pequenos volumes (entre 0,2 a 5000 l)
com mxima preciso. A construo das micropipetas consiste em um corpo anatmico de polipropileno
(autoclavvel) equipado com um boto dispensador e um ejetor de ponteiras no topo, um indicador de volume
na lateral e uma haste para encaixe de ponteiras descartveis na parte inferior. Existem vrios tipos de
micropipetas:
o pipetas monocanal ou multicanal
o pipetas com volume fixo ou com volume varivel
o pipetas com deslocamento de ar ou com deslocamento positivo
Fig. 2. Descrio de uma micropipeta. As micropipetas possuem os componentes indicados na figura pelas
letras de A-V. O boto de ejeo apresenta duas fases de presso cuja ordem ser primeira e segunda na
pipetagem direta e segunda e primeira fase na pipetagem reversa (Veja adiante).
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Funcionamento de micropipetas com deslocamento de ar
Este tipo de pipetas o mais utilizado, por ser muito verstil. O boto dispensador ligado a um
pisto dentro da pipeta. Ao pressionar o boto, o pisto se move deslocando o ar que por sua vez desloca um
lquido para dentro ou para fora da ponteira. A trajetria de boto dispensador tem dois estgios que podem
ser percebidos por diferena da resistncia de molas que retornam o boto dispensador para posio de
repouso aps ele ser liberado. Os dois estgios permitem fazer a pipetagem usando duas tcnicas diferentes:
a pipetagem direta (esgotamento total) ou a pipetagem reversa (esgotamento parcial). A escolha da
tcnica depende das caractersticas do lquido a ser pipetado (viscosidade, volatilidade, hidrofilicidade) e do
processo da pipetagem (pipetagem nica, titulante ou repetida).
A preciso da pipetagem influenciada por vrios fatores:
- encaixe da ponteira na haste: antes de pipetar, a compatibilidade do tipo de ponteira (fabricante) com o
tipo de haste deve ser verificada para evitar passagem de ar no encaixe. A ponteira deve ser encaixada por
movimento circular que assegura boa vedao entre a ponteira e a haste, alm de maior durabilidade pelo
uso correto da haste. Por estas razes, o encaixe da ponteira por batimentos repetidos de haste na ponteira
deve ser evitado.
- ajuste de volume (pipetas com volume varivel): cada indicador de volume tem uma pequena folga.
Assim, para a maior preciso, o volume deve ser ajustado sempre e somente de um lado (de preferncia, no
sentido horrio). Quando o ajuste ultrapassa o volume desejado, recomenda-se voltar <1/3 da rotao e
ajustar o volume de novo. Para ajustar corretamente o volume, deve ser considerado o erro paraltico; o eixo
da viso tem que ser perpendicular escala do indicador do volume.
O volmetro formado por trs dgitos indicadores que so usados para ajustar o volume de lquido a ser
transferido. So lidos desde o alto (dgito mais significativo) at a base (dgito menos significativo). Um
marcador (ponta da seta) usado para ajustar o volume exato ou intermedirio contra a escala dos indicadores da
base. Os dgitos possuem as cores preta ou vermelha para indicar a posio do ponto decimal, de acordo com o
modelo. O volume ajustado girando-se o tambor de ajuste do volume ou o boto da pipeta. O boto
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da pipeta a maneira mais fcil e rpida de acertar o volume, especialmente quando o operador estiver
usando luvas. O tambor de ajuste deve ser utilizado para se alcanar lentamente o volume desejado.
- a poro imersa no lquido: por causa da compressibilidade do ar, existe uma medida ideal da imerso da
ponta da ponteira que minimiza tais imprecises (Tabela 1).
Tabela 1: Imerso ideal da ponta da ponteira em relao do tipo de ponteira - volume pipetado
Volume (L) Poro imersa (mm)
0,1 - 1 1
1 - 100 2-3
101 - 1000 2-4
> 1001 3-6
- tenso lateral do lquido: os lquidos podem molhar a parede da ponteira, o que pode resultar em perdas de
volume ejetado (parte dele fica nas paredes). A minimizao dessa impreciso consiste em aspirao e
ejeo de lquido sem efetuar a transferncia (no mesmo recipiente). Assim, as paredes j estaro molhadas
a
e o volume da 2 aspirao ser transferido por completo.
- volatilidade do lquido: para diminuir gotejamento do lquido durante a transferncia e quando a natureza
do lquido permite (no corrosivo, no infectante ou no radioativo), o lquido pode ser aspirado/ejetado no
mesmo recipiente vrias vezes at o ar em cima do lquido ser trocado completamente por vapor do lquido.
Cada micropipeta calibrada para o valor indicado (valor terico) corresponder ao valor
efetivamente medido (valor real) na faixa da preciso de micropipeta (erro 2% para pipetas P10, P20,
P100, P200, P1000 e 5% para pipetas P2 e P5000). Porm, com tempo e uso prolongado, os componentes
mecnicos so sujeitos ao desgaste ou disfuno resultante de uso inadequado. Assim, essencial a
verificao da calibrao das micropipetas nas mesmas condies em que so utilizadas no laboratrio. Esta
verificao consiste essencialmente em um conjunto de medies usadas para restabelecer/atualizar a
relao entre o valor indicado e o valor efetivamente medido.
Normalmente, a verificao deve ser realizada nas seguintes situaes:
- aps uma manuteno e/ou troca de peas;
- aps um perodo de uso (~ 1 ano);
- quando a pipeta sofre um dano: queda, contaminao da haste, etc;
- de acordo com orientaes do fabricante;
Empregam-se geralmente trs mtodos de calibrao de pipetas automticas:
1. Mtodo gravimtrico: uma srie de medies do peso de lquido pipetado (considerando a
temperatura, umidade, presso atmosfrica e coeficiente de expanso) posteriormente convertida em
volume. Este mtodo realizado por laboratrios de calibrao especializados.
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2. Mtodo titrimtrico: uma srie de medies de quantidades de NaOH com concentrao conhecida em
volumes pipetados (sem interferncia da temperatura, umidade ou presso atmosfrica). Exige uma
padronizao das solues envolvidas.
3. Mtodo fotomtrico: uma srie de medies fotomtricas de diferentes diluies de um cromforo com
concentrao conhecida. Este mtodo pode ser facilmente implantado no laboratrio.
Para a anlise dos resultados da calibrao, as sries de medies so convertidas para volume (valor
efetivamente medido) e comparados com volumes ajustados no indicador da micropipeta (valores indicados).
Calcula-se uma mdia (para mesmos volumes) ou regresso linear (para volumes diferentes) desvio padro.
a tcnica de pipetagem mais conhecida. Utiliza-se para transferir volumes nicos de lquidos
aquosos ou de lquidos no volteis, no viscosos e no espumantes. O princpio de transferncia de lquido
mostrado na Figura 4.
Fig. 4. Esquema de procedimento usado para a tcnica de pipetagem direta. Linhas pontilhadas representam
o o
as posies de boto de esgotamento: Repouso (linha superior), 1 estgio (linha no meio) e 2 estgio
(linha inferior).
uma tcnica de pipetagem pouco conhecida. Recomenda-se fortemente o uso desta tcnica em casos de
pipetagem de lquidos viscosos, volteis e espumantes. Uso da pipetagem reversa em casos de pipetagem
repetida de um volume do mesmo lquido (por exemplo, em dosagens de protena amostra e curva padro)
pode melhorar a confiabilidade do mtodo at 10 vezes.
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A transferncia de lquidos por esta tcnica resulta em um volume que sobra na ponteira aps da
transferncia que pode ser uma desvantagem no caso de lquidos caros ou de volume limitado. Porm, a
grande vantagem consiste em ejeo de lquido viscoso ou espumante, onde praticamente impossvel
realizar o esgotamento total (da tcnica direta). Caso de lquidos volteis, a transferncia do lquido pode ser
acompanhada por gotejamento do lquido fora da ponteira (vapor do lquido voltil expande o ar dentro da
pipeta). A tcnica da pipetagem reversa garante um volume de reserva na ponteira que permite a
transferncia de volume correto at de lquido bastante voltil.
O princpio de transferncia de lquido mostrado na Figura 5.
Fig. 5. Esquema de procedimento usado por a tcnica de pipetagem reversa. Linhas pontilhadas representam
o o
as posies de boto de esgotamento: Repouso (linha superior), 1 estgio (linha no meio) e 2 estgio
(linha inferior)
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Experimento 1 gua: propriedades fsico-qumicas relacionadas
sua estrutura e polaridade
Abstract
The peculiar structure of water molecule is responsible for the properties of this solvent which are
crucial to the existence of life on earth in terms of modulating the structure and function of biomolecules as
to control the climate. The properties of the water which determine the behavior of biomolecules are also
used for technological applications and for this reason, the study of these properties is relevant to many
areas of knowledge. In this lesson, we will study the formation of aqueous SDS and CTAB micelles, anionic
surfactants and cationic respectively, influenced by the ionic strength of the medium with different
concentrations of NaCl. In sequence, we will see the ability of the micelles have to kidnap the methylene
blue dye and modulate the state of aggregation and optical properties thereof.
Resumo
A estrutura peculiar da molcula de gua responsvel pelas propriedades desse solvente que so cruciais
para a existncia de vida na Terra tanto em termos de modular a estrutura e funo das biomolculas quanto ao
controle do clima do planeta. As propriedades da gua que determinam o comportamento das biomolculas
tambm so utilizadas para aplicaes tecnolgicas e por essa razo, o estudo dessas propriedades relevante
para diversas reas do conhecimento. Nessa aula, estudaremos a formao de micelas aquosas de SDS e CTAB,
surfactantes aninico e catinico, respectivamente, influenciadas pela fora inica do meio com diferentes
concentraes de NaCl. Em sequncia, veremos a capacidade que as micelas possuem de sequestrar o corante
azul de metileno e modular o estado de agregao e as propriedades ticas do mesmo.
Introduo
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no ligantes (par de eltrons no compartilhados) do tomo de oxignio e os outros dois so ocupados pelos
tomos de hidrognio.
Fig. 1. Estrutura molecular da gua inserida em uma estrutura tetradrica e frmula estrutural da gua com o
valor do ngulo entre os hidrognios que se desvia do valor esperado de 109,5 do carbono tetradrico com
3
hibridizao sp .
Os tomos de hidrognio na estrutura da gua formam um ngulo de 104,5 que difere do valor
3
esperado de 109,5 do carbono tetradrico com hibridizao sp . Esse valor de ngulo entre os hidrognios
explicado pela regra de Bent (Bent, 1961) segundo a qual em uma molcula AX2 e AX3, o tomo central
ligado a multiplos grupos hibridizar de modo que orbitais com maior carter s estaro direcionados para
substituintes eletropositivos e orbitais com maior carter p estaro direcionados para os substituintes mais
eletronegativos. Um exemplo bem conhecido o da molcula de gua em comparao com o dimetil ter,
metanol e difluoreto de oxignio.
1
Tabela
111
Dimetil ter
107-109
Metanol
104.5
gua
Difluoreto de 103.8
oxignio
A polaridade da gua a torna um excelente solvente para ons e um indutor da formao de agregados
supramoleculares de molculas surfactantes. Surfactantes com uma cauda apolar, como o SDS (surfactante
aninico, Fig. 4) e o CTAB (surfactante catinico, Fig. 4) quando presentes em gua em concentrao acima
da CMC (concentrao micelar crtica) organizam-se como micelas aquosas (Fig. 5). Quando misturados
com gua e solventes orgnicos em propores de cerca de 1/10 podem formar as chamadas micelas
reversas (Fig. 5).
Surfactantes com duas caudas apolares tais como os fosfolipdios organizam-se em meio aquoso como
bicamadas e formam vesculas uni ou multilamelares. O tipo de estrutura formada determinado pela
geometria da molcula do lipdio anfiptico (Figura 6). Lipdios com uma nica cadeia carbnica, como sabes
de detergentes, devido a forma cnica e afilada de suas molculas, formam, preferencialmente, micelas. Nesta
estrutura esfrica, as cadeias carbnicas organizam-se no interior, isolando-se da gua, e os grupos polares
posicionam-se na superfcie externa, interagindo com o solvente.
Fig. 6. Diferentes agregados supramoleculares formados por molculas anfiflicas em meio aquoso e que so
termodinamicamente favorveis. A parte hidrofbica dos anfiflicos em meio aquoso organiza a gua ao seu
redor em uma estrutura semelhante ao clatrato, o que diminui a entropia da gua. A agregao das molculas
anfiflicas pelas pores hidrofbicas exclui essas partes do contato com a gua de tal forma que aumenta a
entropia da gua, sendo portanto, um processo com valor negativo de variao de energia livre de Gibbs. O
valor negativo da energia livre de Gibbs vem do ganho de entropia da gua, pois o processo endotrmico (
G = H T S). Maiores detalhes, veja nos livros textos da bibliografia indicada. Figura inspirada em Jan
Koolman, Klaus-Heinrich Roehm. Color Atlas of Biochemistry; Thieme, 2004, pag.29.
14
As micelas e os lipossomos possuem a capacidade de sequestrar molculas hidrofbicas como o corante
+
azul de metileno (MB do ingls, methylene blue) e modular o estado de agregao e as propriedades ticas do
3
mesmo . O corante possui uma estrutura molecular de baixa polaridade e se associa a micelas e no ao
+
monmero de um detergente, ou seja, micelas formadas pelos surfactantes aprisionam molculas de MB .
As micelas de SDS, um detergente aninico, formam uma interface carregada negativamente e tem maior
afinidade pelo MB (catinico) que o CTAB (catinico). Assim, para modular esse processo necessrio
considerar a razo micela/corante.
Fig. 7. Estrutura de surfactantes, do azul de metileno, de micelas e da associao do corante com as micelas
na forma de monmero e dmero. a- modelo de preenchimento das estruturas de lauril sulfato (esquerda) e
CTAB (direita), b estrutura do azul de metileno, c micela aquosa, d micela aquosa com monmero de
azul de metileno, e- micela aquosa com dmero de azul de metileno.
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Um surfactante tpico possui estrutura R-X , onde R uma cadeia carbnica variando de 8 a 18
tomos (normalmente linear) e X o grupo hidroflico. Dependendo da caracterstica do grupo X, os
tensoativos podem ser classificados como no-inicos (neutros) e inicos. Os surfactantes inicos contm
uma cabea hidroflica com carga lquida postiva (catinicos), negativa (aninicos) ou zero (zwitterinicos).
Os exemplos mais clssicos so o SDS (dodecil sulfato de sdio) que apresenta carga negativa no seu grupo
sulfato e o CTAB (brometo de cetil trimetil amnio) que possui carga positiva no seu grupo trimetilamnio.
Os surfactantes aninicos contm geralmente um dos quatro grupos hidroflicos solveis (carboxilato,
sulfonato, sulfato ou fosfato). Os surfactantes no-inicos no contm carga, mas apresentam grupos
altamente hidroflicos na parte polar. Em geral, a poro polar da molcula formada por polioxido-etilenos
ou grupos glicosdeos (Ex.: Brij, Triton X-100, Tween CxEy, dodecyl-SDS- D-maltosdeo, digitonina) e esse
tipo de surfactante no se dissocia em ons hidratados em meio aquoso. As propriedades hidroflicas so
observadas pela hidratao dos grupos amida, amina, steres e hidroxilas. Os surfactantes anfteros
(zwiterinicos) so os nicos que apresentam propriedades combinadas de surfactantes inicos e no-
inicos, de acordo com o pH do meio. Como os no-inicos, no apresentam uma carga lquida; tm baixa
condutividade e mobilidade eletrofortica; e no se ligam em resinas de troca-inica (Ex.: CHAPS, SB 3-10,
5
ASB) .
aplicao no combate ao mosquito Aedes aegypti. Pesquisas tem demonstrado que o biosurfactante causa a morte
de larvas do mosquito Aedes aegypti porque o composto interage com o sifo respiratrio das larvas, deixando a
regio formada por molculas apolares, com umidade controlada e protegida pelo exosqueleto suscetvel
interao com a gua. Com isso, as larvas do mosquito sofrem asfixia. Alm disso, a presena do biossurfactante
na gua onde o mosquito depositou seus ovos altera e dificulta o equilbrio hidrosttico das larvas, o que as leva a
ter um gasto energtico exacerbado e morte por afogamento. Nessa mesma linha existe a perspectiva de utilizar
biossurfactantes para o combate de outras doenas tropicais negligenciadas, como a leishmaniose e a
esquistossomose.
O SDS (dodecil sulfato de sdio ou lauril sulfato de sdio), utilizado nos experimentos dessa aula, um
detergente aninico e agente umectante efetivo tanto em solues alcalinas quanto cidas. Na rea biolgica
possui uma variedade de aplicaes, sendo a mais comum o seu uso para solubilizao de protenas e lipdios.
Para solubilizao de protenas, o SDS deve ser usado em sua concentrao micelar crtica (CMC), sendo
tambm um poderoso desnaturante de protenas. H estudos comparando o SDS com outros detergentes com
relao solubilizao de lipdios e protenas e seus efeitos sobre a atividade enzimtica. Como muitos
protocolos exigem a remoo do SDS de amostras proticas, vrios mtodos de remoo do SDS por
+
cromatografia por troca inica tm sido descritos. Em alguns, o corante azul de metileno (MB ) pode ser usado
para determinar a quantidade remanescente de SDS aps remoo por cromatografia por troca inica. Alm dessa
+
aplicao, o MB utilizado como bactericida e fungicida; colorao temporria para examinar RNA ou DNA
sob o microscpio; agente fotossensibilizador para a terapia fotodinmica (TFD) de tumores, infeces e
parasitoses; indicador redox em qumica analtica e na indstria txtil. Devido ao seu uso na indstria textil o
+
MB , assim como outros corantes, um problema ambiental na gua de efluentes. Solues de diferentes
+
concentraes de MB , associado ou no a surfactantes, apresentam diferentes tonalidade de azul, relacionada a
predominncia de dmero ou monmero. A tonalidade royal indica predominncia de dmeros do corante e a
tonalidade cyan indica predominncia de monmero do corante. A mudana de cor conforme o estado de
agregao decorre do fato de que a agregao afeta a estrutura molecular, que por sua vez, afeta os nveis de
energia dos orbitais moleculares e assim, os comprimentos de onda de luz que so
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absorvidos e transmitidos. A ampla utilizao justifica o uso de SDS e do azul de metileno nos experimentos
didticos 1 e 2.
Objetivo Geral
Este experimento didtico tem como proposta fazer com que os estudantes entendam as propriedades fsico-
qumicas da gua relacionadas sua estrutura e polaridade e sua influncia na formao de agregados
supramoleculares de surfactantes que so capazes de sequestrar molculas hidrofbicas e interferir no estado
de agregao e propriedades das mesmas. Ao manipular as solues e fazer transferncias de volumes
devem adquirir conhecimento e desenvolver a habilidade no uso correto de micropipetas e modos de
pipetagem dos lquidos.
Objetivos Especficos
Mais especificamente abordaremos o efeito dos estados de agregao nas propriedades ticas de um corante,
o azul de metileno (Fig. 7), promovidas por altas concentraes do mesmo e associao a micelas.
Adicionalmente veremos que a carga do surfactante pode influir na afinidade por determinadas molculas.
Materiais
10 tubos de ensaio, por grupo, para Parte 1 (identificar como 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 1B, 2B,3B, 4B e 5B ,
conforme a Tabela 1)
6 microtubos Eppendorfs de 2 mL por grupo (Parte 2)
Suporte para tubos e para microtubos
1 unidade de micropipeta automtica de volume varivel por grupo ( P10, P20, P100, P200, P1000)
Ponteiras
1 bquer de 50 mL
Papel absorvente
Fita crepe para identificao dos tubos e Eppendorfs ( a equipe tcnica pode fazer a
identificao prvia)
Soluo de NaCl (Cloreto de sdio M.M. 58,5 g/mol) a 1,14 mol/L. Para 10 mL de soluo estoque
utilizar uma massa de 0,6669 g.
Soluo de SDS ( Sodium dodecyl sulfate / C12H25NaO4S , M.M. 288 g/mol ) a 40 mmol/L. Para 10 mL
de soluo estoque utilizar uma massa de 0,1152 g
Soluo de CTAB (N-Cetyl-N,N,N-trimethyl-ammioniumbromid / C19H42BrN ,M.M. 364,46 g/mol) a
40 mmol/L. Para 10 mL de soluo estoque utilizar uma massa de 0,1458 g
Soluo de Azul de Metileno (Methylene Blue / CHClNS, M.M. 319,85 g/mol ) a 500 mol/L.
gua deionizada
Agitador Vrtex
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Papel de alumnio
Procedimento
Para as pipetagens utilize a micropipeta de volume varivel disponvel para o seu grupo ( P10, P20, P100,
P200, P1000) que seja adequada para a transferncia de volume exato do lquido.
Parte 1
A turma dever ser dividida em grupos e cada grupo dever preparar as amostras A (sem sal) e B (com sal).
1) Posicione os tubos no suporte e numere-os na seguinte ordem: 1A, 2A, 3A, 4A e 5A e outra fileira 1B,
2B, 3B, 4B e 5B.
2) Nos tubos de 1A a 5A e de 1B a 5B, coloque os respectivos volumes de gua deionizada recomendados
para cada tubo, conforme Tabela 1.
3) Em seguida adicione os volumes de soluo estoque de NaCl, 0, 35, 175 e 350 L respectivamente nos
tubos 2B a 5B.
4) Por fim adicione os respectivos volumes indicados da soluo estoque de SDS nos tubos 2A a 5A e 2B a
5B para as concentraes finais de 16, 8, 4 e 1.5 mmol/L.
5) Aps a adio do detergente em todos os tubos, agitar individualmente, manualmente e depois no agitador
Vrtex, e observar a formao de espuma (vide Fig. 8). Anotar (Tabela 1) e fotografar por grupo (A e B).
1A 1B
2A 3A 4A 5A 2B 3B 4B 5B
(controle) (controle)
Reagente
(concentrao) (0) (16 mM) (8 mM) (4 mM) (1,5 mM) (0) (16 mM) (8 mM) (4 mM) (1,5 mM)
Formao de espuma
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SDS 8 mM SDS 8 mM
NaCl zero NaCl 200mM
(2mL) (2mL)
Fig. 8. Exemplo de resultado esperado. Efeito da fora inica sobre a CMC de um detergente. O tubo da esquerda
contm 8 mmol/L de SDS em gua deionizada o que equivale ao valor da CMC do detergente e o tubo da direita
possui a mesma concentrao de SDS em soluo de NaCl 200 mmol/L. Nessa concentrao a CMC do
detergente cai para 1 mmol/L. Quando um detergente atinge a CMC, observa-se brusca queda na tenso
superficial da gua. Importante notar que concentraes acima da CMC favorecem a formao de espuma, mas
esse mtodo de avaliao da CMC no tem preciso. Para determinar valores precisos de CMC deve-se recorrer a
medidas de variao da tenso superficial da gua. Exemplos de determinao de CMC podem ser encontrados
em vrios trabalhos como a referncia a seguir: Braz. arch. biol. technol. vol.57 no.2
Curitiba Mar./Apr. 2014.
Parte 2 .
A turma dever ser dividida em 6 grupos e cada grupo dever preparar somente as solues relacionadas a
+
uma determinada concentrao de azul de metileno (MB , do ingls, methylene blue) conforme Tabela 2, ou
seja, Grupo A (Aa e Ab) ou Grupo B (Ba e Bb) ou Grupo C (Ca e Cb).
1) Nos microtubos Eppendorf, prepare solues com concentraes finais de SDS de 0, 1.5 e 16 mmol/L e
de CTAB com 0, 0.75 e 8 mM, nos volumes indicados na Tabela 2 referente ao seu grupo (A, B ou C),
identificando-os respectivamente como 1a, 2a e 3a, e 1b, 2b e 3b e o nome do grupo (Exemplo: B1a).
2) Em seguida, adicione a soluo de azul de metileno (MB) nos Eppendorfs, de acordo com o indicado para
seu grupo: Aa e Ab q.s.p. 5 M; Ba e Bb q.s.p. 50 M ; Ca e Cb q.s.p. 150 M.
(Ateno para os volumes indicados para o seu grupo!)
3) Observe a colorao das solues e fotografe na ordem 1, 2 e 3.
Todas as amostras da Parte II desse experimento devem ser guardadas, no laboratrio, para
utilizao no Experimento 2.
20
Tabela 2 Volumes de adio referentes Parte II do experimento 1 gua.
Grupo A q.s.p. 5 M de MB
2a 3a 2b 3b
1a 1b
(1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente
Azul de Meliteno 20 L 20 L 20 L 20 L 20 L 20 L
Grupo B q.s.p. 50 M de MB
2a 3a 2b 3b
1a 1b
(1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente
2a 3a 2b 3b
1a 1b
(1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente
21
Fig. 9. Exemplo de resultado a ser obtido. Em cada foto, os tubos Eppendorfs da esquerda contm 0, 1,5 e
16 mM de SDS e os da direita contm 0, 0,75 e 8 mmol/L de CTAB. Nas foto da esquerda, centro e direita,
as concentraes de azul de metileno so respectivamente, 5, 50 e 150 mmol/L. Observar as diferenas de
tonalidade de azul. A tonalidade royal indica predominncia de dmeros do corante e a tonalidade cyan
indica predominncia de monmero do corante.
3- Aps analisar a estrutura do MB, as fotos e as observaes dos grupos A, B e C, indique e explique qual
(quais) ficaram com a colorao cyan ou royal em todas as condies (presena ou no de surfactante e tipo
de surfactante). Fundamente sua discusso com base na hidrofobicidade.
Referncias Bibliogrficas
4. MANIASSO, N. Ambientes micelares em qumica analtica. Quim. Nova, Vol. 24, No. 1, 87-93, 2001.
5. NITSCHKE, M.; PASTORE, G.M. Biossurfactantes: propriedades e aplicaes. Quim. Nova, Vol. 25, No. 5, 772-
776, 2002.
6. SILVA, S. S. Biossurfactantes como molculas versteis: um novo conceito de produtos para biorrefinarias e
combate s doenas tropicais negligenciadas fase 1: seleo de leveduras, produo fermentativa e caracterizao
fsico-qumica. Disponvel em: http://www.bv.fapesp.br/pt/auxilios/90924/biossurfactantes-como-moleculas-versateis-
um-novo-conceito-de-produtos-para-biorrefinarias-e-combat/. Acesso em 26 de ago. 2016.
7. M. Li et al. Accelerated methylene blue (MB) degradation by Fenton reagente exposed to UV or VUV/UV light in
an innovative micro photo-reactor. Applied Catalysis B: Environmental 187, 8389, 2016.
22
Experimento 2 Espectrofotometria: Conceitos e Aplicao
Abstract
Resumo
O fenmeno de absoro de luz diretamente por macromolculas ou cromforos formados por reaes
secundrias usado para a caracterizao espectral e/ou quantificao dessas substncias por espectrofotometria.
Este experimento didtico tem como proposta apresentar a tcnica de espectrometria de absoro eletrnica na
faixa de espectro eletromagntico UV-vis aplicada Bioqumica para realizar medidas quantitativas de acordo
com a Lei de Lambert-Beer e medidas qualitativas por meio da observao da relao monmero/dmero em
agregados supramoleculares de um corante. Para esta aula, sero obtidos espectros de absoro de uma soluo
de concentrao desconhecida da protena albumina para dosagem dessa diretamente a 280 nm e pelo mtodo do
Biureto. O coeficiente de extino () da albumina a 280 nm e o do cromforo do
Biureto sero calculados por meio do ajuste de uma curva padro de intensidade de absorbncia em funo
da concentrao do cromforo. Tambm sero obtidos espectros de absoro de solues de trs diferentes
concentraes do corante azul de metileno combinadas com trs diferentes concentraes dos surfactantes
SDS e CTAB. A diferena na absoro entre monmeros e dmeros facilita o clculo da concentrao de
cada espcie presente em soluo e permite uma estimativa qualitativa da concentrao relativa de dmeros e
monmeros na soluo, o que ser observado pelos estudantes em diferentes condies experimentais.
23
Introduo
O termo medida fotomtrica foi definido originalmente como o ato de medir a intensidade da luz,
independente do comprimento de onda (energia). A maioria dos instrumentos tem, contudo, mecanismos
para isolar uma faixa estreita de comprimentos de onda do espectro. Os instrumentos que usam filtros para
esse propsito so referidos como fotmetros de filtro ou colormetros e os que utilizam prismas ou grades
de difrao so chamados de espectrofotmetros.
Comprimento de onda refere-se distncia entre dois picos da propagao da luz que ocorre na
forma de onda, e essa distncia normente dada em nanmetros (nm). A radiao eletromagntica inclui
desde a energia radiante dos comprimentos de onda curtos dos raios aos comprimentos de onda longos das
ondas de rdio. O termo luz usado para descrever a energia dos comprimentos de onda visveis ao olho
humano e queles limtrofes. O olho humano capaz de detectar comprimentos de onda entre 380 e 750 nm,
entretanto espectrofotmetros so capazes de medir tambm comprimentos de onda mais curtos (ultra-
violeta, UV) ou mais longos (infra-vermelho, IV) (Fig. 1).
A espectrofotometria um dos mtodos pticos de anlises mais usados nas investigaes bioqumicas
(Fig. 2). O espectrofotmetro um instrumento que permite comparar a intensidade de luz absorvida ou
transmitida por uma soluo que contm uma quantidade desconhecida de soluto, em relao a quantidade
conhecida da mesma substncia. Todas as substncias podem absorver energia radiante, como por exemplo, a
gua que absorve fortemente na regio do IV. A absoro das radiaes ultravioletas, visveis e infravermelhas
dependem da estrutura molecular e caracterstica para cada substncia qumica. Quando a luz atravessa uma
soluo de determinada substncia, parte da energia absorvida (absorbncia). A cor das substncias se deve a
no absoro (transmitncia) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando
24
transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas no absorvidos. Esse fenmeno pode ser
usado para quantificao de substncias por meio da intensidade de absorbncia em um comprimento de
1
onda especfico, com base em uma curva-padro, utilizando-se da Lei de Lambert-Beer .
Fundamentao Terica
Considere um feixe de luz incidente com intensidade Io passando por uma cubeta contendo uma soluo
de uma determinada substncia que absorve luz de certo comprimento de onda (Fig. 3). A intensidade do feixe de
luz transmitido (I) ser sempre menor que Io, sendo que a transmitncia (T) definida como uma relao entre a
intensidade da luz transmitida e a intensidade da luz incidente (Lei de Beer).
T = I/Io
25
Dessa forma, a absorbncia direta e linearmente proporcional concentrao. Esta varia tambm de
forma direta com o caminho ptico (dimetro interno) da cubeta, ou seja, se dobrarmos o caminho ptico
mantendo a concentrao constante, teremos um valor de absorbncia duas vezes maior. Essa relao
frequentemente referida como Lei de Lambert-Beer:
A = a.b.c
Assim, a proporcionalidade direta entre absorbncia e concentrao pode ser usada para a
determinao da absortividade de uma dada substncia em determinada condio experimental por meio de
realizao de uma curva-padro. Para a construo dessa curva, solues de concentraes conhecidas da
substncia devem ser preparadas e as absorbncias determinadas no comprimento de onda adequado.
Posteriormente, essa absortividade pode ser utilizada para quantificao dessa substncia em uma soluo,
2
cuja concentrao desconhecida . Esse o princpio utilizado para medidas quantitativas obtidas pela
Espectroscopia UV-visvel.
A Espectroscopia UV-visivel tambm pode ser usada para anlise qualitativa de substncias, como ser
+ +
feita nessa aula com o azul de metileno (MB , do ingls, methylene blue). O MB um corante tiaznico com
aplicaes variadas. Foi sintetizado pela primeira vez para ser usado como corante de tecidos durante o perodo
de grande expanso da indstria txtil europeia sendo que, atualmente, a gua residual do processo de tingimento
de tecidos representa um problema ambiental mundial. largamente utilizado como um indicador redox em
qumica analtica: solues desta substncia so azuis quando em um ambiente oxidante, mas tornam-se incolores
+
quando expostas a um agente redutor. O MB tambm desempenha papis importantes na microbiologia e
farmacologia h tempos, sendo muito utilizado para corar os organismos vivos; como colorao temporria para
examinar RNA ou DNA sob o microscpio; para o tratamento metemoglobinizante, isto , converte
3+ 2+
metemoglobina (Fe ) a hemoglobina (Fe ); como bactericida e fungicida. Ultimamente uma inovao de uso
+
teraputico tem tido sucesso na medicina e na veterinria: o MB tem sido utilizado como agente
fotossensibilizador para a terapia fotodinmica (TFD) de tumores, infeces e parasitoses. Essa terapia utiliza a
aplicao de um corante na rea a ser tratada, seguida de irradiao com luz de comprimento de onda longo que
penetra melhor nos tecidos. A luz promove excitao eletrnica do corante que transfere sua energia ao oxignio
molecular do meio e o converte em uma espcie altamente oxidante, o oxignio singlete, que leva morte do
4
tecido tumoral ou do agente infeccioso .
26
+
A cor caracterstica do MB causada pela forte banda de absoro na regio espectral de 550-700 nm,
sendo seu espectro de absoro dependente da concentrao. Em soluo aquosa o corante azul de metiletno
encontra-se em equilbrio entre as formas monmero e dmero. O equilbrio encontra-se deslocado para a forma
monomrica e dimrica, respectivamente em baixas e altas concentraes do corante. Monmeros e dmeros tem
espectros de absorbncia distintos: monmeros tem intensidade mxima em 664 nm (
-1 -1
=85,000M cm ) e dmeros em 590 nm (Fig. 4). A diferena na absoro entre monmeros e dmeros
facilita o clculo da concentrao de cada espcie presente em soluo. A intensidade relativa dos picos
indica em qual direo o equilbrio esta deslocado. A razo entre a absorbncia a 580 e 665 nm (A580/A665) d
uma estimativa qualitativa da concentrao relativa de dmeros para monmeros, assim d uma estimativa de
+
qual forma do corante prevalece no meio. Em soluo, o estado fundamental do MB forma dmeros com
-3 -1
uma constante de associao de 4 1 x 10 M e que podem ser favorecidos pelo aumento da fora inica
e presena de micelas em determinadas razes de corante/surfactante. A interao corante-surfactante tem
sido estudada devido a sua grande relevncia para a indstria de tingimento e fotografia.
3,4
A forma agregada de azul de metileno possui peculiares propriedades fotoqumicas . Quando os
dmeros so expostos luz branca ou vermelha observa-se a separao de carga dos pares, pois o triplete
oxidante e oxida seu par com formao do par radicalar formado pelo corante reduzido com um eltron (MB ) e
2+
o corante oxidado com menos um eltron (MB ). Dessa forma, o rendimento quntico de produo de oxignio
singlete cai bastante para as formas agregadas. A forma reduzida com um eltron absorve luz em 420 nm e
possui pKa = 9,0. Essa espcie pode transferir o eltron ao oxignio do meio e gerar on superxido ou
prontamente dismutar para a forma reduzida com dois eltrons, ou seja, a forma leuco (MBH) e o estado
+ 2+
fundamental MB . O ction radical do azul de metileno (MB ) absorve em 520 nm.
O princpio que faz a fotoqumica interessante o uso da luz como uma fonte de energia para promover
reaes qumicas. Em comprimentos de onda de luz () especficos, a energia pode ser absorvida por
determinadas molculas, levando-as a um estado molecular excitado no qual, devido conformao menos
estvel ficam propensas a reagirem com outras molculas. A maior parte das reaes qumica realizadas em
laboratrio utiliza a faixa espectral visvel ao olho humano (vis), ultravioleta (UV) e infravermelho (IR) prximo.
Molculas excitadas podem perder sua energia atravs das propriedades fsicas ou por participar de reaes
qumicas. Para quantificar cada um destes processos, utilizam-se as medidas dos rendimentos qunticos (). O
a razo entre o nmero de ftons incidentes em uma amostra para um especfico processo pelo nmero de ftons
absorvidos ou nmero de molculas do produto formado por unidade de tempo pelo nmero de ftons absorvidos
por unidade de tempo. A fim de compreender o comportamento fotoqumico quando interage com biomolculas,
+
em particular com membranas, as propriedades do MB foram estudados em solues de SDS e CTAB em
vrios trabalhos como a referncia a seguir: Helena C. Junqueira et al. Modulation of methylene blue
photochemical properties based on adsorption at aqueous micelle interfaces.
Phys. Chem. Chem. Phys.(4) 23202328, 2002.
27
1.0
Absorbance Normalized
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
+
Fig. 4. Espectro UV-visivel de MB em gua obtido com 25 (azul claro) e 250 (azul escuro) M do corante.
O inserto mostra a colorao diferenciada das solues com elevada porcentagem de dmero (azul royal) e
de monmero (azul turqueza).
O processo fotoqumico se inicia com a absoro de um fton por uma molcula com a qual encontra
condio de ressonncia. A energia do fton absorvida pela molcula no estado fundamental (S0) leva ao
deslocamento de um eltron de seu orbital ligante para um orbital anti-ligante desocupado de mais alta
energia, o que leva a molcula ao estado eletronicamente excitado singlete S1 ou Sn, dependendo da energia
de excitao ou do solvente. Deve ser ressaltado que uma molcula pode atingir o estado eletronicamente
5,6,7
excitado, na ausncia de luz, um processo conhecido como Fotoqumica no Escuro . Nesse caso, o estado
8
eletronicamente excitado resulta de uma reao qumica (clivagem trmica de um dioxetano , por exemplo)
10
ou bioqumica (reao da luciferina catalisada pela enzima luciferase dos vagalumes , por exemplo). A
molcula no estado eletronicamente excitado pode ter diferentes rotas de decaimento para o estado
fundamental (processos fotofsicos). Os processos fotofsicos possveis so: converso interna (SnS1 +
calor) quando a molcula encontra-se em estado excitado Sn acima de S1, fluorescncia (S1S0, sendo que
S1 pode ter sido atingido por excitao a partir de S0 ou por converso interna), cruzamento intersistemas
(S1T1 ou S2T2 e T2T1, via converso interna), como esquematizado na figura 5. Outra possibilidade,
vlida especialmente para o estado eletronicamente excitado triplete que possui tempo de vida relativamente
longo, o suficiente para colidir com outras molculas ainda no estado excitado, a reao fotoqumica. Portanto,
h transies que resultam em emisso de ftons (fluorescncia, F ou Fluo e fosforescncia, P ou Phos); as
transies sem a emisso de ftons, isto , aquelas em que a desativao se d atravs de processos de liberao
de calor para o ambiente; processos de absoro de radiao eletromagntica produzindo estados eletrnicos e
vibracionais excitados (S2 ou Sn); processos de desativao molecular de estados eletrnicos e vibracionais
excitados atravs de processos radiativos ou no radiativos (S1 e T2).
28
Fig. 5. Diagrama de Jablonski: esquerda, para uma molcula genrica aps interagir com um fton em
condies de ressonncia; direita, especificamente para as formas monomrica e dimrica do azul de
11
metileno .
A Terapia Fotodinmica, tambm conhecida como PDT (da sigla em ingls, Photodynamic Therapy),
fotorradiao, fototerapia ou terapia fotoqumica, uma modalidade de tratamento mdico que vem apresentando
timos resultados para o tratamento de cncer, infeces, parasitoes e queimaduras e vem se destacando em
relao s terapias tradicionais (cirurgia, quimioterapia e radioterapia), pois diferentemente dessas terapias no
apresenta os graves efeitos colaterais j que o efeito localizado e seletivo. A PDT visa a destruio localizada
do tecido vivo tumoral, do agente infeccioso ou do tecido danificado por queimaduras, por meio do disparo de
mecanismos de morte celular. No caso de infeces bacterianas, fngicas e virais o tratamento fotodinmico em
geral promove a inativao fotodinmica de micro-organismos (PDI). Assim, tem sido objeto de investigao
para desinfeco de sangue, guas ou superfcies. Alm disso, fotoinativao microbiana tem sido indicada como
alternativa para reduzir o uso abusivo de antimicrobianos e, como consequncia, diminuiria o desenvolvimento
da resistncia microbiana, principalmente nas reas de dermatologia, otorrinolaringologia, oftalmologia,
neurologia, gastroenterologia, urologia e odontologia. Essa terapia se baseia no emprego de um corante fotoativo,
o fotossensibilizador (substncia no txica) que combinado com irradiao em baixas doses de luz visvel de
comprimento de onda adequado, ativado ao estado eletronicamente excitado e portanto, com potencial pro-
oxidante. Quando no estado excitado triplete, e na presena de oxignio, pode reagir com molculas vizinhas por
transferncia de eltrons ou hidrognio, levando produo de espcies reativas de oxignio: superxido,
perxido de hidrognio e radical hidroxila (reao do tipo I) ou por transferncia de energia ao oxignio (reao
1
do tipo II), induzindo a produo do oxignio singlete ( O2) (Fig.6). Todas essas so espcies altamente reativas,
capazes de danificar lipdeos, cidos nucleicos e outros componentes celulares, tendo como consequncia a morte
celular. O oxignio singlete, capaz de reagir com proteinas da membrana celular de micro-organismos, enzimas
do citoplasma e destruir material gentico. A principal vantagem dessa terapia quando aplicada s bactrias que
devido
29
existncia de mltiplas mecanismos improvvel o desenvolvimento de resistncia bacteriana ao tratamento. O
dano causado depender da quantidade de oxignio singlete produzido e da concentrao do PS.
J foi observado que as interfaces de micelas carregadas negativamente induzem a formao de dmero
de sensibilizadores de carga positiva e so capazes de deslocar um mecanismo de sensibilizao tipo II para um
1
tipo I, praticamente abolindo a gerao de O2. Estes achados so relevantes para PDT, em que o sensibilizador
reage em contato direto com membranas, que podem variar desde membranas ligeiramente negativas, como a
citoplasmtica, a altamente negativa, como a membrana mitocondrial interna. Alm disso, os corantes catinicos
tambm interagem com o DNA que possui carga negativa. As interfaces carregadas negativamente podem alterar
o mecanismo e eficincia de sensibilizao de fotosensibilizadores de carga positiva. Portanto, mudando a via
fotoqumica tambm desloca o mecanismo e a eficincia de danos celulares.
5
Outro aspecto da fotoqumica que aparece nos sistemas biolgicos a Fotoqumica no Escuro que
tem sido aplicada em kits para dosagem de ATP com diferentes finalidades. Nesse caso, utiliza-se a reao
enzimtica dos organismos bioluminescentes, sendo o vagalume, o mais conhecido. O mecanismo geral
apresentado abaixo.
30
Observem que o mecanismo envolve etapas intermedirias de ligao com AMP (um nucleotideo)
formao de dioxetano (etapa d) que sofre clivagem espontnea e gera oxiluciferina no estado
eletronicamente excitado singlete que decai, nesse caso, exclusivamente de forma radiativa. A cor da luz
emitida depende da forma isomrica que decai ser o ismero ceto ou enol (etapa f).
Em relao fotoqumica, vale ressaltar que o Prmio Nobel de Qumica de 2008 esteve
relacionado a descoberta da Protena Verde Fluorescente (GFP) uma protena brilhante de guas-vivas,
um dos organismos mais interessantes da bioqumica atual. Esses estudos permitiram que pesquisadores
iluminassem tumores cancergenos em crescimento, mostrassem o desenvolvimento do mal de Alzheimer no
11
crebro ou o crescimento de bactrias nocivas, entre outras aplicaes .
5,12
A fotoqumica apresenta inmeras aplicaes biolgicas e tecnolgicas tais como sntese
14
qumica, produo de biocombustveis (envolve a fotossntese ), converso de energia (clulas solares),
fotografia, sinalizao de estradas com tintas fosforescentes, iluminao de ambientes, telas de televisores e
14
computadores (OLEDs), entre outras . Esses aspectos justificam a incluso do presente tpico no BC&T da
UFABC.
Objetivo Geral
Objetivos especficos
31
4. Observar o espectro de absoro de solues do corante azul de metileno (MB) em trs diferentes
concentraes que interferem com seu estado de agregao e em trs concentraes dos surfactantes SDS e
CTAB relacionadas com a CMC dos detergentes. O uso de surfactantes catinicos e aninicos tambm
fornecer informaes sobre a influncia da carga da interface das micelas na associao com outras
molculas.
Materiais
Observao: o reagente de Biureto composto por CuSO4 0,15 % (m/v), tartarato de sdio e potssio
0,6 % (m/v) e NaOH 0,75 mol/L. Este reagente no deve ser guardado por mais de 30 dias, devido a
possibilidade de precipitao do cobre na forma de xidos ou sais insolveis. Porcentagem m/v refere-se
massa do soluto, em grama, usada para preparar 100 mL de soluo, isto , 0,15 g de CuSO4 para 100 mL de
soluo.
15
Nesses experimentos determinaremos a concentrao de uma soluo de albumina por dois mtodos de
forma comparativa: diretamente pela absorbncia de seus aminocidos aromticos e cistinas a 280 nm (mtodo
32
2+
direto) e pela formao de complexos com Cu presentes no reagente de biureto e que absorvem luz com
mximo em 550 nm (mtodo do Biureto).
1. Mtodo direto. Nesse mtodo, a quantificao da concentrao de albumina feita pela contribuio de
absorbncia dos seus resduos de aminocidos aromticos (tirosina, fenilalanina e triptofano) e tambm dos
resduos de cistina.
Procedimento
A turma dever ser dividida em dois ou trs grupos dependendo do nmero de alunos presentes. Dever ser
utilizado um espectrofotmetro de varredura. A aquisio dos espectros e a manipulao da cubeta devero
ser feitas por um tcnico de laboratrio ou pelo professor. Os alunos devero acompanhar o procedimento.
1) Cada grupo dever diluir, em um tubo de ensaio, 200 L da soluo-problema de BSA em 1800 L de
gua deionizada. Reservar essa soluo diluda.
2) Utilizando um espectrofotmetro de varredura, operado pelo tcnico de laboratrio, dever ser feito o
branco em uma cubeta de quartzo de caminho ptico 1 cm, utilizando 2 mL de gua deionizada e lendo na
regio espectral de 240 a 320 nm, com 1 nm de intervalo de . Discutir a funo da leitura do branco.
Aps a leitura, a gua dever ser descartada.
3) Adquirir o espectro da soluo-problema de BSA concentrada.
Analisar o espectro obtido, verificando se a intensidade de absorbncia no ultrapassa o valor de 1 e se
apresenta uma banda bem definida com pico em 280 nm (verificar se no estourou o espectro).
Obs: Aps a aquisio retire a soluo contida na cubeta e guarde-a em um tubo de ensaio, pois essa soluo
ser reutilizada no Mtodo do Biureto.) Lave muito bem a cubeta utilizada com soluo de detergente e
posteriormente gua em abundncia, para que no fique contaminada.
4) Utilizando a amostra previamente diluda 10 vezes (tem 1 desse procedimento) fazer uma nova leitura.
Comparar o espectro obtido nesse item com o obtido no item 3(soluo concentrada) e discutir qual deles
confivel.
Obs.: salve ambos os espectros (BSA e BSA diluda), pois esses dados devero ser plotados e
compartilhados com os demais grupos.
33
Beer para a quantificao da substncia de interesse. Assim, voc dever construir uma curva padro da
albumina utilizando os dados da tabela a seguir (obtidos previamente por colaboradores da disciplina em
cubeta de caminho ptico de 0,1 cm) para plotar um grfico de absorbncia em 280 nm (eixo y) em funo
da concentrao de albumina em M (eixo x). A partir desse grfico determine o valor de em 280 nm
(contribuio conjunta dos aminocidos aromticos).
Usando o valor de em 280 nm obtido (coeficiente angular), calcule a concentrao de albumina nessa
soluo problema, aplicando a equao de Lambert-Beer = . . . Lembre-se que a concentrao encontrada na
leitura feita em aula foi da AMOSTRA DILUIDA e que preciso calcular a concentrao da AMOSTRA
CONCENTRADA.
Dicas: Cdil = A / ( x l)
Conforme pode ser verificado, de acordo com a equao de Lambert-Beer (equao de reta), a
intensidade de absorbncia em 280 nm deve aumentar linearmente com a concentrao de albumina. O ajuste
linear do grfico de intensidade de absorbncia (A), em 280 nm, versus concentraes conhecidas de albumina,
em concentrao molar (C), X caminho tico de leitura (l), em cm, fornece o valor da constante de absortividade
molar () do cromforo, no caso, a contribuio simultnea dos resduos aromticos e de cistina.
Deve-se ressaltar que o aumento linear da absorbncia da albumina em funo da concentrao se restringe
a condies de concentraes relativamente baixas nas quais no h agregao significativa das molculas
de protenas. A formao de agregados a partir de determinadas concentraes leva a perda da linearidade
do grfico a partir de dada concentrao, visto que o agregado se comporta como outro cromforo, com
propriedades distintas do monmero.
2) Compare os espectros da amostra concentrada e diluda e discuta qual deles mais confivel. Qual seria a
outra alternativa para no saturar a fotomultiplicadora caso no fosse possvel diluir a amostra?
34
3) Plote os resultados das amostras diludas de seu grupo e dos demais grupos do laboratrio e discuta
possveis discrepncias de dados. (Houve amostras diludas de forma inadequada? Seu grupo chegou
prximo ao valor correto da concentrao de BSA do estoque?)
2. Mtodo do Biureto. Esse mtodo utilizar igualmente a lei de Lambert-Beer. A nica diferena que nesse
mtodo, cria-se um novo cromforo na molcula de albumina capaz de absorver na regio visvel do espectro
eletromagntico, no caso com pico mximo de absoro em 550 nm. Esse cromforo resulta da complexao do
cobre presente no reagente com as ligaes peptdicas e assim, independe do tipo de protena.
Procedimento.
Observao: A aquisio dos espectros da soluo BSA+biureto dever ser realizada pelos prprios alunos
em ESPECTROFOTMETRO DE BANCADA, no de 550 nm, utilizando cubeta de plstico de caminho
ptico de 10 mm (1 cm). Desse modo, a turma dever ser dividida em grupos, estando a quantidade desses
na dependncia do nmero de equipamentos disponvel.
1)Em um tubo de ensaio identificado prepare o branco com uma soluo de gua+biureto (1,5 mL de gua
destilada + 1,5 mL de Biureto ).
2) Em outro tubo de ensaio prepare a soluo BSA + biureto, colocando 0,5 mL de soluo de albumina
(utilize o BSA estoque que seu grupo guardou do mtodo direto) no tubo e acrescente 1 mL de gua
destilada. Aps agitao manual delicada, adicionar 1,5 mL do reagente de Biureto e tornar a agitar.
3) Aps 5 minutos, fazer a aquisio do espectro de absoro no visvel dessa soluo, de forma pontual em
550 nm. Anote o valor de absorbncia encontrado.
ATENO, fazer a leitura da absorbncia do branco antes da leitura da amostra BSA + biureto.
Para dosar albumina pelo mtodo do biureto voc utilizar a constante de absortividade molar de 15.100
-1 -1
M cm obtida a partir de uma curva padro de albumina que reagiu com o biureto (Figura 7).
35
1.0
0.9 Concentraoes
Albumina-Biureto
(cubeta 1cm)
20M
0.8 0.5
40M
60M
80M
100M
0.7 120M
140M
160M
180M
0.6
or
ci
A
200M
b
n
a
s
0.5
A550
0.0
0.3
0.2
0.1 Albumina_Biureto (cubeta 1cm)
-1 -1
= 15.100 M .cm
0.0 550nm
0 1 2 3
6 -1 -1
C .l . 10 M cm
Fig. 7. Curva padro de albumina determinada pelo mtodo do biureto. O inserto mostra os espectros do
nci
Ab
60 M
b
0.5
a
80 M
200 M
A
b
b
n
a
s
c
r
80 M 100 M
120 M
0.4 100 M 140 M
120 M 160 M
180 M
140 M
160 M
0.2 180 M
200 M
0.0
300 400 500 600 0.0
400 450 500 550 600 650 700
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
3) Relacione as vantagens e desvantagens do mtodo do biureto em relao a outros mtodos para dosagem
de protenas. Utilize o artigo Determinao de protenas totais via espectrofotometria: vantagens e
15
desvantagens dos mtodos existentes .
36
Parte 2 : Medidas qualitativas obtidas pela espectroscopia UV-Vis
Solues de Azul de Metileno com surfactante
Nessa parte da aula sero usadas as amostras preparadas no Experimento 1. Somente as amostras
com ndice B (maisculo) devem ser lidas no espectrofotmetro de varredura em cubeta de caminho ptico
de 1 mm (0,1 cm). Entretanto todas as amostras devero ser analisadas visualmente em relao s diferenas
de tonalidade de azul, relacionando-as a predominncia de dmero e monmero. A tonalidade royal indica
predominncia de dmeros do corante e a tonalidade cyan indica predominncia de monmero do corante. A
mudana de cor conforme o estado de agregao decorre do fato de que a agregao afeta a estrutura
molecular, que por sua vez, afeta os nveis de energia dos orbitais moleculares e assim, os comprimentos de
onda de luz que so absorvidos e transmitidos. Monmeros e dmeros tem espectros de absorbncia
-1 -1
distintos: monmeros tem intensidade mxima em aproximadamente 664 nm ( =85,000M cm ) e dmeros
em 590 nm. A razo entre a absorbncia a 580 e 665 nm (A580/A665) d uma estimativa qualitativa da
concentrao relativa de dmeros para monmeros. Observe a colorao das solues referentes ao seu
grupo e compare com os grupos cuja concentrao de MB diferente, relacionando cor da soluo, estado
de agregao e aspecto do espectro apresentado. Espectros de absorbncia obtidos de todas as condies
preparadas no Experimento 1 esto disponibilizados no apndice a seguir.
Procedimento para obteno dos espectros de varredura. Essa parte do experimento ser executada por um
colaborador da disciplina e acompanhada pelos alunos. As solues devem ser lidas na sequncia especificada na
Tabela 2, em cubeta de vidro ou quartzo com caminho ptico 0.1 cm, aps realizar o branco.
Aps a leitura, voltar com a soluo para o respectivo Eppendorf.
Importante: fazer a IDENTIFICAO DE CADA AMOSTRA, atente para o nome marcado em cada
Eppendorf e na Tabela 2, que devem ser o mesmo.
Configurao do equipamento:
Regio espectral de 350 a 750 nm, Escala e unidades : auto
de leitura de 1 em 1 nm
Observao: Combinar com o professor responsvel pela turma como os dados obtidos nessa aula sero
disponibilizados aos alunos (espectro de BSA de concentrao desconhecida e das solues de azul de
metileno com surfactante.
37
Tabela 2 - Dados para orientao da identificao e ordem de leitura dos espectros de varredura das
amostras da parte 2 do Experimento 2 .
Cubeta Identificao da amostra Nmero do arquivo Check list
Branco : gua destilada
0,1 cm
B1a
(vidro ou
B2a
quartzo)
B3a
ATENO: para auxiliar no estudo das aulas 1 e 2, na anlise dos dados e resoluo dos exerccios,
interaja com o objeto de aprendizagem espectroscopia uv-vis medidas qualitativas, desenvolvido
especificamente para essas aulas, por Adrianne M. M. Brito e pelo NTE-UFABC e disponibilizado no
site da biblioteca da UFABC.
1 . Plotar os grficos absorbncia X comprimento de onda e analisar a razo entre os picos de absoro das
formas monmero e dmero em cada condio, conforme modelos no apndice
APNDICE
Em soluo aquosa o corante azul de metiletno encontra-se em equilbrio entre as formas monmero e
dmero. O equilbrio encontra-se deslocado para a forma monomrica e dimrica, respectivamente em baixas e
altas concentraes do corante. Mesmo em condies onde predomina a forma monomrica, pode-se deslocar o
equilbrio para a forma dimrica com o uso de detergentes como o SDS. Conforme mostrado na figura 1,
+
monmeros e dmeros de MB tm espectros de absoro distintos: monmeros tem intensidade mxima em,
aproximadamente, 664 nm e dmeros em 590 nm. A intensidade relativa dos picos indica em qual direo o
equilbrio esta deslocado. Na presena do detergente SDS a razo entre a concentrao de micelas e
concentrao do corante ir determinar se as molculas do corante permanecero distribudas isoladamente ou
em pares no interior das micelas e isso pode ser monitorado por espectroscopia UV-visvel. Portanto, em
+
presena de SDS, a predominncia de dmero ser dependente da concentrao relativa de MB e SDS.
Conforme mostrado na fig. 1, mantendo fixa a concentrao do corante, em concentrao de SDS relativamente
baixa o espectro observado com pico em 580 nm, referente a forma dimrica. Por outro lado,
38
em concentrae relativamente altas de detergente o espectro observado com pico em 665 nm referente a
forma monomrica do corante.
Para analisar esses espectros e os espectros obtidos nessa aula, importante entender algumas
3
consideraes . Micelas aquosas so entidades dinmicas e a estrutura micelar est em equilbrio com os
monmeros da soluo e com a monocamada de surfactante na interface ar/gua. A presena de um sal na
soluo diminui a repulso eletrosttica entre os monmeros na interface e consequentemente diminui a
CMC (efeito da fora inica sobre a CMC de um detergente, visto no Experimento 1- parte 1). Esse efeito
+
observado apenas com altas concentraes do soluto (mM). Em uma soluo de surfactante e corante MB ,
dependendo da carga do surfactante, e consequentemente das interaes eletrostticas, bem como da razo
molar entre esses, pode ocorrer ou no formao de complexos que mudam as propriedades de ambos e o
+
equilbrio da soluo. O MB , sendo positivamente carregado tem uma forte atrao pelo SDS e tem sido
sugerido que essa interao muda o equilbrio da soluo de SDS e os complexos formados tm uma
grande tendncia a ficar na interface (menor repulso entre monmeros e menor solubilidade em gua). Em
+
soluo de SDS e MB , a CMC alcanada com menores concentraes de SDS, em relao ao surfactante
3 +
puro. J foi observado que quando a concentrao do MB aumentada de 0 para 45 M, a CMC de SDS
diminui de 7 mM para 70 M conforme pode ser observado na figura 2A. Assim, concentraes em
+
micromolar de MB so suficientes para mudar a CMC em duas ordens de magnitude, o que indica que o
+
MB facilita a formao das micelas.
A diferena na absoro de monmeros e dmeros facilita o clculo da concentrao de cada espcie
na soluo. A razo entre a absorbncia a 580 e 665 nm (A580/A665) d uma estimativa qualitativa da
concentrao relativa de dmeros em relao a monmeros. A fig. 2B extrada da referencia 3, mostra como
varia a razo monmero/dmero de uma soluo de azul de metileno titulada com concentraes crescentes
de SDS. Nesse trabalho a razo monmero/dmero foi medida por espectroscopia de absorbncia e
39
fluorescncia. O monitoramento da formao de dmeros por fluorescncia se baseia no fato de que o
monmero fluoresce e o dmero, no. Portanto quanto mais agregado houver no meio menor a razo
fluorescncia observada com uma dada concentrao de detergente / fluorescncia inicial sem detergente
(IF/f580). Na figura 2B, a curva com smbolos quadrados mostra a razo da absorbncia 580nm/665nm em
funo da concentrao de SDS. O aumento da concentrao de SDS, abaixo da CMC forma agregados pr-
micelares que aprisionam molculas de corante aos pares e isso leva ao aumento progressivo da razo
580nm/665nm concomitantemente com a diminuio progressiva da IF/f580 (inserto da fig. 2B). A partir de
determinada concentrao de SDS acima da CMC, o aumento do nmero de micelas no sistema leva ao
progressivo aumento da ocupao das micelas por monmeros do corante o que faz cair progressivamente a
razo 580nm/665nm e subir a razo IF/f580. Como o corante no tem afinidade por CTAB que positivamente
carregado, a razo 580nm/665nm no muda em funo da concentrao desse detergente (smbolos redondos
3
na Fig. 2B) .
B
A
+
Fig. 2 . A- concentrao micelar crtica do SDS em funo da concentrao de MB . Com o aumento da
+
concentrao do MB de 0 para 45 M, ocorre a diminuio da CMC de SDS de 7 mM para 70 M. B-
+
razo dos valores de absorbncia de MB (8 M) em 580 e 665 nm em funo da concentrao de SDS () e
3. +
CTAB () Para solues de SDS e MB , a A580/A665 aumenta em funo do aumento da concentrao de
SDS at aproximadamente 3 mM e ento comea a diminuir, indicando aumento da concentrao de dmeros
em relao a monmeros, o que confirmado pela medida de intensidade de fluorescncia (IF/f580) mostrada
no inserto. A linha pontilhada na vertical representa a CMC do SDS (0,96 mM). Para soluo de CTAB e
+
MB no h alterao na A580/A665. A CMC foi determinada por medida de tenso superficial do sistema.
+
Para explicar os espectros das solues de SDS com MB foi utilizada medidas de tenso superficial e
a teoria termodinmica de formao micelar (modelo de pseudo-fase) associadas a uma modelagem
matemtica que descreve a ligao e dimerizao de molculas de corantes em solues micelares. Esse
modelo emprega as equaes de balano das massas, da relao entre a concentrao micelar local e a
concentrao analtica de cada espcie envolvida, bem como da constante de dimerizao na fase micelar.
40
Representao grfica do Experimento 2 Parte 2: Medidas qualitativas obtidas
pela Espectroscopia UV-Vis para a soluo de Azul de Metileno com surfactante.
Observao : ao analisar os espectros atente para o fato de que cada espectro sobreposto ao outro foi
plotado em uma escala diferente na ordenada (y), portanto as intensidades no so comparativas. O eixo y
correspondente a cada grfico est na mesma cor da linha do grfico. Na legenda est indicado a concentrao
do surfactante (SDS ou CTAB) e do corante (MB), o nome da amostra preparada em aula (por exemplo,
A1a) e o caminho ptico da cubeta na qual foi realizada a medida (caso no tenha indicao, o caminho
ptico 1 cm).
Os espectros a seguir correspondem aos dados otidos de todas as solues manipuladas na parte II do
Experimento 1. Observem a forma e localizao dos picos das bandas de absoro de acordo com a
+ +
concentrao de MB , na ausncia de surfactante (isto , soluo de MB somente), conforme mostrado na
Figura 4 e na Figura 10 e a seguir relacione-os a presena de MB na forma de monmero ou de dmero (Figura
3). Em seguida observem a forma e localizao dos picos das bandas de absoro de acordo com a concentrao
de MB, na presena das diferentes concentraes de surfactante SDS ou CTAB. Lembrem-se que monmeros e
dmeros tem espectros de absorbncia distintos e a razo entre a absorbncia a 580 e 665 nm (A 580/A665) d uma
estimativa de qual forma do corante prevalece no meio. Atentem para o fato de que o corante se associa a
micelas e no ao monmero do detergente, ou seja, micelas formadas pelos surfactantes
+
aprisionam molculas de MB . As micelas de SDS, um detergente aninico, formam uma interface
carregada negativamente e tem maior afinidade pelo MB (catinico) que o CTAB (catinico). Assim, na
moduo desse processo necessrio considerar a razo micela/corante conforme representado na Fig. 3 e
para uma estimativa qualitativa de qual forma do corante prevalece no meio necessrio a observao do
espectro de absoro no qual deve-se considerar a razo A580/A665 .
+
Fig. 3. Representao MB em micela de SDS na razo 1:1 (forma monomrica do corante) e 2:1
(forma dimrica do corante).
41
0,30
0_SDS_5uM_MB_A1a 0,7
0,20 0_SDS_50uM_MB_B1a (cubeta 0.1)
Monmero
0,25 0_SDS_150uM_MB_C1a (cubeta 0.1) 0,6
Dmero
Absorbncia 0,15 0,20 0,5
0,4
0,15
0,10
0,3
0,10
0,2
0,05
0,05
0,1
Fig. 4 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5uM ,
50uM e 150uM, sem surfactante (0_SDS).
0,35
0,2
0,10 Monmero
0,30
Dmero
0,08 0,25
Absorbncia
0,20
0,06
0,1
0,15
0,04
0,10
0,02 1.5_SDS_5uM_MB_A2a
1.5_SDS_50uM_MB_B2a (cubeta 0.1) 0,05
1.5_SDS_150uM_MB_C2a (cubeta 0.1)
0,0 0,00 0,00
450 500 550 600 650 700 750
Comprimento de onda (nm)
Fig. 5 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50
M e 150 M e concentrao de 1,5 mM do surfactante SDS.
42
16_SDS_5uM_MB_A3a
16_SDS_50uM_MB_B3a (cubeta 0.1)
1,2
0,4 16_SDS_150uM_MB_C3a (cubeta 0.1)
0,3
1,0
0,3
0,8
Absorbncia
0,2
0,6
0,2
0,4
0,1
0,1
0,2
Fig. 6. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50
M e 150 M e concentrao de 16 mM do surfactante SDS.
5uM_MB_0 SDS_A1a
0,20 5uM_MB_1,5mM_SDS_A2a
0,2
5uM_MB_16mM_SDS_A3a 0,3
0,15
Absorbncia
0,2
0,10 0,1
0,1
0,05
Fig. 7 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 5 M e
concentra-es de 0 mM, 1,5 mM e 16 mM do surfactante SDS.
43
50uM_MB_0 SDS_B1a
50uM_MB_1,5mM_SDS_B2a
0,30
0,12 50uM_MB_16mM_SDS_B3a
0,4
0,25 0,10
0,3
0,20 0,08
Absorbncia
0,15 0,06
0,2
0,10 0,04
0,1
0,05 0,02
Fig. 8 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 50 M, e
concentraes de 0 mM, 1,5 mM e 16 mM do surfactante SDS. O espectros obtidos dos dados adquiridos
durante a aula a partir das amostras preparadas pelos alunos deve ser semelhante a esse, considerando as
amostras B1a, B2a e B3a.
150uM_MB_0 SDS_C1a
150uM_MB_1,5mM_SDS_C2a
0,7 150uM_MB_16mM_SDS_C3a
0,35
0,6 1,0
0,30
0,5 0,8
0,25
Absorbncia
0,4
0,20
0,6
0,3 0,15
0,4
0,2 0,10
0,2
0,1 0,05
Fig. 9. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 150 M, e
concentraes de 0 mM, 1,5 mM e 16 mM do surfactante SDS.
44
0_CTAB_5uM_MB_A1b
0,20 0_CTAB_50uM_MB_B1b (Cubeta 0.1)
0,7
0_CTAB_150uM_MB_C1b (Cubeta 0.1)
0,25
0,6
0,15
0,20
0,5
Absorbncia
0,15 0,4
0,10
0,3
0,10
0,2
0,05
0,05
0,1
Fig. 10. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 5 M, 50
M e 150 M e concentrao de 0 mM do surfactante CTAB.
0.75_CTAB_5uM_MB_A2b
0.75_CTAB_50uM_MB_B2b (Cubeta 0.1)
0,3
0.75_CTAB_150uM_MB_C2b (Cubeta 0.1) 0,7
0,25
0,6
0,20
0,2 0,5
Absorbncia
0,15 0,4
0,3
0,10
0,1
0,2
0,05
0,1
Fig. 11. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50
M e 150 M e concentrao de 0,75 mM do surfactante CTAB.
45
8mM_CTAB_5uM_ MB_A3b
8mM_CTAB_50uM_MB_B3b (cubeta 0.1)
0,30
8mM_CTAB_150uM_MB_C3b (cubeta 0.1) 0,7
0,25
0,25 0,6
0,20 0,5
0,20
Absorbncia
0,15 0,4
0,15
0,3
0,10 0,10
0,2
0,05 0,05
0,1
Fig. 12 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentraes de 5 M, 50
M e 150 M e concentrao de 8 mM do surfactante CTAB.
5uM_MB_0_CTAB _A1b
0,20 5uM_MB_0.75mM_CTAB_A2b 0,30
5uM_MB_8mM_CTAB_A3b
0,25
0,25
0,15
0,20
0,20
Absorbncia
0,15
0,10 0,15
0,10
0,10
0,05
0,05 0,05
Fig. 13. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 5 M, e
concentraes de 0 mM, 0,75 mM e 8 mM do surfactante CTAB. O grfico obtido dos espectros
adquiridos durante a aula a partir das amostras preparadas pelos alunos deve ser semelhante a esse,
considerando as amostras A1b, A2b e A3b.
46
50uM_MB_0_CTAB (cubeta 0.1)_B1b
50uM_MB_0.75mM_CTAB (cubeta 0.1)_B2b
50uM_MB_8mM_CTAB )cubeta 0.1)_B3b
0,3
0,25 0,25
0,20 0,20
0,2
Absorbncia
0,15 0,15
0,10 0,10
0,1
0,05 0,05
Fig. 14 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 50 M e
concentraes de 0 mM, 0,75 mM e 8 mM do surfactante CTAB.
0,4 0,4
0,4
0,3 0,3
0,3
Fig. 15. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) com concentrao de 150 M e
concentraes de 0 mM, 0,75 mM e 8 mM do surfactante CTAB.
47
MB_5uM_SDS_0_A1a
1,0 MB_50uM_SDS_0_B1a (cubeta 0.1)
MB_150uM_SDS_0_C1a (cubeta 0.1)
1.5mM_SDS_5uM_MB_A2a
1.5mM_SDS_50uM_MB_B2a (cubeta 0.1)
1.5mM_SDS_150uM_MB_C2a (cubeta 0.1)
16mM_SDS_5uM_MB_A3a
16mM_SDS_50uM_MB_B3a (cubeta 0.1)
16mm_SDS_150uM_MB_C3a (cubeta 0.1)
Absorbncia
0,5
0,0
500 550 600 650 700 750 800 850
Comprimento de onda (nm)
Fig. 16. Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) e do surfactante SDS nas diversas
concentraes.
0_CTAB_5uM_MB_A1b
8mM_CTAB_5uM_ MB_A3b
0,4 8mM_CTAB_50uM_MB_B3b (cubeta 0.1)
8mM_CTAB_150uM_MB_C3b (cubeta 0.1)
0,2
0,0
550 600 650 700 750 800 850
Comprimento de onda (nm)
Fig. 17 . Espectros de absorbncia das solues de azul de metileno (MB) e do surfactante CTAB nas
diversas concentraes.
48
Tabela 1 - Volumes de adio referentes s amostras apresentadas nos grficos
Grupo A q.s.p. 5 M de MB
2a 3a 2b 3b
1a 1b
(1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente
20
Azul de Meliteno 20 L 20 L 20 L 20 L L 20 L
Grupo B q.s.p. 50 M de MB
2a 3a 2b 3b
1a 1b
(1.5 mM) (16 mM) (0,75mM) (8 mM)
Reagente
200
Azul de Meliteno 200 L 200 L 200 L 200 L L 200 L
49
Cyan Cyan
Royal
Fig. 18 . Fotos das solues referentes Tabela 1 e aos grficos apresentados. Em cada foto, os tubos
Eppendorfs da esquerda contm 0; 1,5 e 16 mmol/L de SDS e os da direita contm 0; 0,75 e 8 mmol/L de
CTAB. Nas fotos da esquerda, centro e direita, as concentraes de azul de metileno so respectivamente, 5,
50 e 150 mmol/L. Observar as diferenas de tonalidade de azul. A tonalidade royal indica predominncia de
dmeros do corante e a tonalidade cyan indica predominncia de monmero do corante.
Exerccios
1) Analise os grficos apresentados para o surfactante SDS, os quais esto todos representados na Figura 16, e as
imagens da Figura 18. Considere os espectros A, B e C mostrados abaixo, que correspondem a diferentes condies de
solues aquosas de azul de metileno (MB) e indique o estado de agregao predominante e a tonalidade de cor da
soluo correspondente a cada espectro.
0,35
0,2 C
0,10 A B 0,30
0,08 0,25
Absorbncia
0,20
0,06
0,1
0,15
0,04
0,10
0,02 1.5_SDS_5uM_MB_A2a
1.5_SDS_50uM_MB_B2a (cubeta 0.1) 0,05
1.5_SDS_150uM_MB_C2a (cubeta 0.1)
0,0 0,00 0,00
450 500 550 600 650 700 750
Comprimento de onda (nm)
Obs: Ao analisar os espectros desconsidere a intensidade de absorbncia, est sendo feita uma anlise
apenas qualitativa. Cada espectro sobreposto ao outro foi plotado em uma escala diferente na ordenada (y),
portanto as intensidades no so comparativas. Os valores do eixo y correspondente a cada grfico esto na
mesma cor da linha do grfico.
50
Considere as condies listadas abaixo, em relao s possveis combinaes quanto concentrao de MB
(baixa ou alta em relao a induo de sua prpria agregao ou para modificar a CMC do SDS),
concentrao de micelas (excesso ou no) e a razo micela/corante (forma monomrica ou dimrica do
corante na micela), e indique para cada uma delas a caracterstica de seu respectivo espectro, ou seja, se ser
semelhante ao espectro A, B ou C.
Desafio: Explique o que levou a amostra de azul de metileno 150 microM em 1.5 mM SDS apresentar mais
monmeros do que a amostra de menor concentrao do corante, ou seja, 50 microM em 1.5 mM SDS.
2) Um analista recebeu uma amostra de albumina bovina (BSA) e precisou determinar a concentrao da
soluo antes de fazer os ensaios necessrios. Para isso, fez uma anlise por espectroscopia UV-Visvel
(espectrofotmetro de varredura) seguindo o protocolo:
A- adicionar gua em uma cubeta de caminho ptico 1 cm e fazer o branco;
B- descartar a gua e adicionar a amostra concentrada na mesma cubeta. Fazer o espectro da
amostra. O resultado encontrado foi um espectro muito ruidoso (Figura 17 , linha preta).
Aps observar esse resultado, o analista resolveu diluir 8 vezes a amostra (125 L de amostra + 875 L de
gua deionizada) e fazer uma nova leitura usando a mesma cubeta (Figura 17, linha vermelha).
Concentrada
Diluida
4.0
3.5
3.0
Absorbncia
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2
Fig. 17. Direita: Espectros UV-Vis de BSA em gua. Linha preta: amostra concentrada. Linha vermelha:
Amostra diluda. Esquerda: valores de absorbncia das amostras concentrada e diluda nos devidos
comprimentos de ondas (wavelength).
-1 -1
Sabendo que a BSA tem 280nm = 38360 M cm . Calcule a concentrao original da amostra de BSA e
explique de forma sucinta por que ela precisou ser diluda.
Referncias Bibliogrficas
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3 . JUNQUEIRA, H. C.; SEVERINO, D.; DIAS, L. G.; GUGLIOTTI, M. S.; BAPTISTA, M. S. Modulation of
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espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes. Qum. Nova 21(6):787-793, 1998
49
Experimento 3 Propriedades cido-base das protenas e
seus efeitos sobre a solubilidade das mesmas: Aplicao na
purificao de protenas.
Abstract
This educational experiment has the purpose of making the students of Biochemical
Transformations understand that the side chains of the amino acid residues contribute to the
properties of a protein. The basic properties of proteins depend on their amino acid composition
and may be useful for separation and purification thereof using techniques that exploit the net
charge of a protein as a function of pH. A strategy for the purification of a protein is the
precipitation at the pH in which the net charge of the protein is zero (pI). One can use different
strategies to precipitate proteins at the pI such as the use of organic solvents or the polymer
polyethylene glycol. At the pI, the solubility of a protein can be increased by adding salt
constituting the salting-in phenomenon. At pH higher than pI, a protein can be precipitated by
the addition of salt at high concentrations (salting out). The specific pI values of each protein
can also be used to separate a mixture of proteins by electrophoresis and electrofocusing.
Resumo
Este experimento didtico tem como proposta fazer com que os estudantes de
Bioqumica: estrutura, propriedades e funes de Biomolculas entendam que os aminocidos
constituintes de uma protena contribuem para as propriedades das mesmas por meio de suas
cadeias laterais. As propriedades cido-base das protenas dependem de sua composio de
aminocidos e podem ser usadas para separao e purificao das mesmas por meio de tcnicas
que exploram a variao de carga de uma protena em funo do pH do meio. Uma tcnica de
purificao de protenas a precipitao no pH no qual a carga lquida da protena igual a
zero (pI). Pode-se utilizar diferentes estratgias para precipitar protenas no pI como por
exemplo o uso de solventes orgnicos ou o polmero polietilenoglicol. No pI, a solubilidade de
uma protena pode ser aumentada pela adio de sal constituindo o fenmeno de salting-in. Em
pH diferente do pI, uma protena pode tambm ser precipitada pela adio de sal em altas
concentraes (salting out). Os valores de pI especficos de cada protena tambm permite
separar uma mistura de protenas por meio de eletroforese e eletrofocalizao.
50
Introduo
Aminocidos
Aminocidos essenciais (no sintetizados pelo organismo humano): isoleucina, leucina,
lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina.
Contudo, esta classificao no pode ser tomada como algo geral para todos os
organismos superiores e em todas as etapas de seus ciclos de vida. Em crianas, por exemplo,
os aminocidos cistena, tirosina, histidina e arginina so considerados semi-essenciais uma vez
que as etapas metablicas para sintetizar estes aminocidos no esto completamente
desenvolvidas. Portanto, esta classificao de essencial e no-essencial no reflete a
importncia destes -aminocidos, uma vez que, todos os 21 -aminocidos so necessrios na
constituio de protenas e peptdeos, conseqentemente, de toda a matria viva.
O aminocido mais simples a glicina (Figura 1), e possui apenas um tomo de hidrognio em
sua cadeia lateral. A alanina vem a seguir, com um grupamento metila. Cadeias laterais
hidrocarbnicas maiores so encontradas na valina, leucina e isoleucina. A prolina tambm tem
uma cadeia lateral aliftica, mas difere dos outros membros do conjunto dos vinte por sua cadeia
lateral ser ligada tanto ao nitrognio quanto ao tomo de carbono . Esta resultante estrutura
51
cclica influencia fortemente a arquitetura das protenas. Trs aminocidos com cadeias laterais
aromticas fazem parte do conjunto dos vinte. A fenilalanina contm um substituinte fenila
ligado a um grupamento metileno. O anel aromtico da tirosina contm uma hidroxila, o que torna a
tirosina menos hidrofbica do que a fenilalanina. O triptofano tem um anel indlico ligado a um
grupamento metileno. Dois aminocidos, serina e treonina , contm hidroxilas alifticas, o que as
tornam muito mais hidroflicas e reativas. Vamos agora aos aminocidos com cadeias laterais muito
polares, sendo altamente hidroflicos. A lisina e a arginina tm cargas positivas em pH neutro. A
histidina pode no ter carga ou t-la positiva, dependendo de seu ambiente local. As cadeias laterais
da arginina e da lisina so as mais longas no conjunto dos vinte.
O O O O O
H2N S
OH OH OH OH OH
NH2 NH2 NH2 NH2 NH2
O O O O
OH O
H2N
OH OH OH OH
OH
O O O O O O O
HO
OH HS OH HO OH H2N OH OH
O NH2 NH2 NH2 NH2 NH2
O O O NH O O
H
N
HO OH N OH OH H2N N OH OH
NH2 H NH
NH NH
2 HO 2 HN 2
Existem dois aminocidos com cadeias laterais cidas, o cido asprtico e o cido glutmico.
Esses aminocidos so geralmente chamados de aspartato e glutamato para salientar que suas
cadeias laterais tm, quase sempre, cargas negativas no pH fisiolgico. A glutamina e a
asparagina so derivados no carregados de glutamato e aspartato que contm uma amida
terminal em vez de um carboxilato. Sete dos vinte e um aminocidos tm cadeias laterais
facilmente ionizveis. Um tomo de enxofre est presente nas cadeias laterais de dois
52
aminocidos. A cistena contm uma sulfidrila (-SH) e a metionina possui um tomo de enxofre
em uma ligao tioter (-S-CH3). Ambas as cadeias laterais que contm enxofre so
hidrofbicas. Deve-se destacar que a maioria destes aminocidos presentes em protenas possui
pelo menos um centro quiral definido com estereoqumica (S) com exceo da cistena que
(R) (notaes de Cahn-Ingold-Prelog) e da glicina que no possui centro quiral (Figura 1);
ainda, todos os aminocidos comuns em protenas so freqentemente denominados L-
aminocidos, baseados na nomenclatura do gliceraldedo (configuraes de Fisher). Estas
caractersticas conferem a estes compostos uma grande diversidade qumica e estrutural,
permitindo que estes possam constituir uma gama enorme de diferentes protenas com
diferentes arranjos espaciais e as mais diversas funes (Figura 2).
Alguns autores relatam que para formar uma protena necessria uma cadeia com mais de
70 aminocidos. J os peptdeos (fragmentos de protenas) podem ser formados por dois ou
mais aminocidos.
1
Fig. 2. Esquema representativo dos diferentes nveis de estrutura protica da hemoglobina
FUNDAMENTAO TERICA
HO OH HO O O O O O
+
+ NH NH2
+ NH 3
NH3 3
Zwitterion -1 -2
+1
O O
O O
H - H - -
+ OH + OH N -OH N O -
N OH N O -
O
+ + NH+ NH2
N
NH3 NH3 N 3
N N H H
H H
+2
+1 Zwitterion -1
O - O - O
- +
O
+ OH H3N - OH OH HN
HN HN 2 -
3 2 -
OH O O O
+ + + +
NH NH3 NH NH3
3 3
+2 +1 Zwitterion -1
Assim, os aminocidos atuam como tampes duplos ou triplos. Abaixo temos o exemplo da
curva de titulao da histidina na qual se observa a mxima capacidade tamponante exibida por
esse aminocido em 3 faixas de pH: de 0,8 a 2,8, de 5 a 7 e de 8,2 a 10,2.
54
- -
O H OH O H O O H O
+ + + O
H3N H ON H3N H ON H3N H N
N O N O N O
OH- OH-
+ + +
HN HN HN
NH NH NH
O
O OH OH O O-
+ + +
+3 NH3 +2 NH3 +1 NH3
OH-
- -
O H O- O H O O H O
+ +
H 2N H O N HN H O HN H O N
N O 3 N N O 3 N O
N OH- N OH- N
NH NH NH
- -
O O O O- O O
+
NH2 NH2 NH3
-2 -1 Zero
Fig. 4. Formas inicas formadas durante a titulao de glutamilhistidinillisina com base forte.
No ponto isoeltrico, uma protena apresenta carga lquida igual a zero e essa
propriedade pode ser utilizada para separar e purificar protenas. Uma estratgia bastante usada
em protemica a eletrofocalizao na qual uma mistura de protenas colocada em uma
matriz (fita) que apresenta diferentes valores de pH ao longo de sua extenso. Ao submeter a
amostra, nesse meio, a uma diferena de potencial, as protenas migraro para o polo oposto ao
de sua carga lquida no pH da regio de partida e estacionaro na regio da fita no qual o pH
igual ao seu pI. Em seguida, efetua-se a separao das protenas de mesmo pI e massas
moleculares diferentes submetendo a amostra a uma eletroforese em sentido perpendicular
(Fig.5). Essa tcnica chamada de eletroforese bidimensional.
Fig. 5. Eletroforese
bidimensional.
A precipitao de protenas pode ser induzida por: adio de sais (Precipitao salina),
adio de solventes, variao de pH (Precipitao isoeltrica) e adio de polmeros sintticos.
Esse ltimo parece ter efeitos diferentes quando combinado com variao de pH e adio de
sais e o mecanismo ainda no est totalmente elucidado. Sais se dissociam em soluo aquosa e
competem com as protenas pela gua de solvatao. Em baixa concentrao salina, a
55
solubilidade das protenas aumenta, pois os ons do sal ajudam a reforar a camada de
solvatao (salting in). Em alta concentrao salina, a solubilidade das protenas diminui pois
os ons do sal competem pelas molculas de gua disponveis para formar a sua prpria camada
de solvatao (salting out). Sais com nions divalentes so mais eficientes do que os
monovalentes na precipitao de protenas. Solventes miscveis com a gua diminuem a
constante dieltrica do meio e desorganizam a camada de solvatao das protenas. Os mais
utilizados so etanol e acetona. Protenas colocadas em meio com pH igual ao seu pI tendem a
precipitar, pois tendo carga neutra, suas molculas no se repelem e tendem se agregar.
A C
B D
Fig. 6: Solubilidade da albumina modulada pelo pH do meio, de valor abaixo, igual e acima de seu pI
(4,7) e pela adio salina (dois diferentes sais em diferentes concentraes). Em A, solues de
albumina bovina (BSA) em tampo acetato de potssio nos valores de pH indicados nos tubos, ou seja,
3, 4,7 e 7,0, respectivamente nos pares de tubos, 1/4, 2/5 e 3/6; em B, temos os tubos nas mesmas
condies descritas para o quadro A, com a diferena que 0,37 g de KCl e 0,40 g de sulfato de amnio
foram adicionadas os tubos 1, 2, 3 e 4, 5, 6, respectivamente. Em C e D as condices so idnticas s de
B, exceto pelas concentraes de sal adicionadas que foram 0,74 g de KCl e 0,80 g de sulfato de amnio
(C) e 1,11 g de KCl e 1,20 g de sulfato de amnio (D).
Fig. 7: Solubilidade da albumina em valores de pH do meio abaixo, igual e acima de seu pI (4,7), e modulada
pela adio do polmero sinttico polietilenoglicol na ausncia e presena de sais de nions monovalentes e
divalentes (cloreto de potssio e sulfato de amnio, respectivamente): Cada tubo de ensaio contm 1,5 mL de
soluo de albumina bovina (BSA) em tampo acetato de potssio nos pHs 3, 4,7 e 7 e 0,5 ml de soluo de
PEG 4000 40%, seguida da adio de 0,74 g de KCl e de 0,80 g de (NH4)2SO4.
No pI, uma protena apresenta a mais baixa solubilidade em meio aquoso e pode ser
facilmente precipitada pelo uso de solventes ou do polmero polietilenoglicol. Os fatores que
56
governam a precipitao da albumina pelo polmero sinttico polietilenoglicol (PEG) foi
5
previamente investigado por Ingham (1978) para determinar as bases moleculares da precipitao
de protenas por polmeros sintticos. A concentrao de PEG 4000 requerida para precipitao da
albumina foi mnima no ponto isoeltrico da protena. Porm, o aumento da concentrao de sal
desviou para valores mais altos a quantidade de PEG necessria para precipitao no pI. Efeito
oposto do sal foi observado em pH abaixo do pI. Assim, essa propriedade pode ser explorada no
processo de separao e purificao de protenas. Se tivermos, por exemplo, uma mistura de duas
protenas sendo uma com pI = 4 e outra com pI = 7, podemos nos valer do uso de PEG para separ-
las. Se ajustarmos o pH para um valor igual ao pI de uma delas e adicionarmos PEG, a protena que
esteja no pI ir precipitar em grande quantidade e a outra protena permanecer em soluo. O uso
de polietilenoglicol para precipitao de albumina no pI e o efeito de sal na solubilidade da
albumina ser o tema da presente aula.
Objetivo
Materiais
Uso coletivo
KCl (cloreto de potssio),
Papel de alumnio (para pesar o KCl),
Balana,
57
Observaes para os tcnicos de laboratrio
Soluo aquosa de PEG a 40% : Em um bquer, pesar a massa de PEG 4000,
correspondente a 40% para o volume total da soluo desejada (ex. 100 mL de soluo,
adicionar 40 g de PEG 4000). Nesse recipiente adicionar um pouco de gua, observando
o limite do volume total da soluo e solubilizar o PEG 4000 sob aquecimento a 50 C e
agitao. Transferir o volume para o balo volumtrico e completar com gua.
O tampo acetato de potssio (200mM) preparado com cido actico glacial e titulado
com KOH ou KCl at o valor de pH desejado. Vale ressaltar que o tampo acetato de
potssio possui pKa 4,7 e portanto a faixa de mximo tamponamento fica entre 3,7 e
5,7. cido actico e acetato so as formas cido e base conjugada do tampo acetato
cujas propores determinam o pH da soluo tamponada. No caso especfico dessa
aula dever ser preparada a soluo com cido actico glacial (0,2 mol/L) e, durante o
experimento, os alunos iro acrescentar o KOH ou HCl, caracterizando assim o tampo
acetato de potssio. Para preparar essa soluo s usar a frmula da molaridade e usar
o cido actico glacial como tampo. Ex.: Para 30 mL de soluo tampo, utilizar 343,5
L de cido actico e 29,656 mL de gua deionizada. Ficar acetato de potssio quando
os alunos adicionarem o KOH.
A soluo estoque de BSA pode ser preparada sob aquecimento controlado de at 40C
e agitao suave. Deve ser mantida na geladeira at o incio da aula.
Procedimento
(Cada grupo dever fazer os procedimentos dos seis tubos de ensaio)
58
deixando-o em torno de 3. Transfira essa soluo pH 3 para o tubo de ensaio 1. Anote na tabela
1. Lave cuidadosamente esse Becker.
7) Acrescente aproximadamente 220 L de soluo de KOH 1M, gota a gota, soluo
restante do Becker com PEG at que a soluo fique turva (esbranquiada). Verifique o valor
do pH dessa soluo nessa condio, esse deve corresponder ao pI da BSA.
Obs.: O KOH deve ser acrescentado aos poucos soluo de BSA para que no haja o risco da
protena desnaturar.
8) Retire 2,0 mL dessa soluo e guarde-a no tubo de ensaio 2. Anote na tabela 1.
9) Continue ajustando a soluo restante do Becker com PEG at pH neutro (pH=7). Faa
esse procedimento cuidadosamente utilizando pipeta, acrescentando aproximadamente 500
L de soluo de KOH, gota a gota. Mea o valor do pH a cada gota depositada. Quando estiver
prximo de atingir o valor do pH desejado, v adicione alquotas de apenas 5 L de KOH,
sempre conferindo o pH para que no haja o risco do valor ultrapassar o desejado.
10) Retire 2,0 mL dessa soluo e guarde-a no terceiro tubo de ensaio (tubo 3), anotando o
valor do pH na tabela 1;
11) Coloque os trs tubos, na ordem 1, 2, 3, na estante de tubos de ensaio e fotografe. Anote
na tabela 1 as observaes quanto ao aspecto das solues nos devidos pHs;
12) Pese e adicione 0,74 g de KCl em cada tubo de ensaio (1, 2 e 3). Agite vigorosamente as
solues, observe e fotografe. Anote na tabela 1 os aspectos das solues aps a adio de sal.
13) A partir desse tem voc ira utilizar a amostra sem PEG que foi reservada no Becker de
25 mL no tem 3. Retire 2 mL dessa soluo e transfira para o Bquer de 10 mL identificado
com pH 3 limpo e acrescente aproximadamente 5 L de soluo de HCl (1M) para ajustar
o pH deixando-o em torno de 3. Guarde essa soluo de pH 3 em um tubo de ensaio (tubo 4).
Anote na tabela.
14) Acrescente aproximadamente 220 L de soluo de KOH 1M, gota a gota, soluo que
havia ficado no Becker sem PEG at que essa fique turva (esbranquiada). Verifique o valor
do pH dessa soluo nessa condio, esse deve corresponder ao pI da BSA.
Obs.: O KOH deve ser acrescentado aos poucos soluo de BSA para que no haja o risco da
protena desnaturar.
15) Retire 2,0 mL dessa soluo e guarde-a no tubo de ensaio 5. Anote na tabela 1.
16) Continue ajustando a soluo do Becker sem PEG at pH neutro , como no tem 9.
17) Retire 2,0 mL dessa soluo e guarde-a no terceiro tubo de ensaio (tubo 6).
18) Coloque os trs tubos na estante de tubos de ensaio, na ordem 4, 5, 6, e fotografe. Anote
na tabela 1 as observaes em relao turbidez das solues (precipitao da protena) nos
devidos pHs;
59
19) Pese e adicione 0,74 g de KCl em cada tubo de ensaio (4, 5 e 6). Agite vigorosamente as
solues, observe e fotografe. Anote na tabela 1 os aspectos das solues aps a adio de sal.
Aparncia da amostra
(turbidez)
Aparncia da amostra
(turbidez)
60
EXERCCIOS
L-alanina
/ 3,9 / 4,3
61
62
63
2) Durante uma aula de bioqumica o professor props aos seus alunos que observassem as
propriedades cido-base da albumina bovina (BSA). Para isso os alunos prepararam trs solues
de BSA (270 mg/mL) em tampo acetato de potssio (0,2 M): uma em pH 3, outra em pH 4,7 e
a terceira em pH 7. Em seguida, os alunos numeraram seis tubos de ensaio como: pH 3; pH 4,7;
pH 7; pH 3 + KCl; pH 4,7 + KCl; pH 7 + KCl e adicionaram 1,5 mL de soluo em cada tubo,
respeitando os pHs descritos nos rtulos (figura 1).
Fig. 1: Solues de albumina (270 mg/mL) em tampo acetado de potssio (2 M), nos pHs
indicados nos tubos de ensaio.
Em seguida os alunos adicionaram 0,5 mL de PEG 4000 (40%) em cada tubo e observaram que
os tubos em pH 4,7 turvaram (figura2).
Na sequncia, os alunos adicionaram 7,4 mg de KCl nos tubos indicados com KCl. Esses tubos
foram agitados e verificou-se alteraes nos pHs 3 e 4,7 (figura 3).
64
Aps esse experimento, pergunta-se:
A-Por que o PEG 4000 (40%) precipitou a BSA em pH 4,7 e no precipitou a albumina nos
demais valores de pH (figura 2)?
B- Por que o KCl solubilizou a BSA em pH 4,7 e precipitou a BSA em pH 3 (figura 3)?
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Albumin. Arch. Biochem. Biophys. 186, 106-113, 1978.
Resultados esperados
65
Experimento 4 - Propriedades de surfactantes e lipdios
Abstract
The aim of this experiment is to introduce the students of the Federal University of ABC
to the procedures related to the characterization of lipids employing soybean as a source of
triacylglycerol, one type of biologic lipids. Furthermore the students will learn the
saponification concept through the alcaline hydrolysis of soybean triacylglycerol and the
physical and chemical properties of the soap obtained will be exploited.
Resumo
Introduo
66
(A)
(B)
67
Grupo
carboxila
Insaturao
Cadeia
carbnica
(A) (B)
Fig. 2. Estrutura de cidos graxos. Os cidos graxos so compostos anfipticos formados por
uma longa cadeia carbnica apolar e um grupo carboxila polar. As cadeias carbnicas dos
cidos graxos no possuem ramificaes e podem ser saturadas, como no caso do cido
esterico, (A) ou insaturadas, como no caso do cido oleico (B).
68
Glicerol
Triacilglicerol
cidos graxos insaturados Cadeia carbnica possui uma ou mais ligaes duplas entre
tomos de carbono contendo o nmero mximo possvel de hidrognios.
69
O tipo de estrutura formada determinado pela geometria da molcula do lipdio
anfiptico (Figura 4). Lipdios com uma nica cadeia carbnica, como sabes de detergentes,
devido a forma cnica e afilada de suas molculas, formam, preferencialmente, micelas. Nesta
estrutura esfrica, as cadeias carbnicas organizam-se no interior, isolando-se da gua, e os
grupos polares posicionam-se na superfcie externa, interagindo com o solvente. A formao de
micelas uma etapa importante na digesto dos lipdios da dieta. A maioria dos fosfolipdios e
glicolipdios associam-se em uma camada dupla de molculas, chamada bicamada lipdica. Esta
estrutura permite uma agregao mais estvel das molculas desses lipdios, que tm forma
cilndrica pela presena de duas cadeias apolares.
Cavidade Aquosa
Fig. 4. Estruturas formadas por lipdios anfipticos em meio aquoso. (A) Micelas so formadas
por molculas de lipdios com uma nica cadeia carbnica, cadeias estas que se localizam no
interior dessas estruturas. (B) Bicamada lipdica uma estrutura bidimensional na qual as
cadeias carbnicas formam um domnio central hidrofbico, isolando-se da gua, exceto nas
extremidades da bicamada; a estrutura comumente formada por lipdios anfipticos com duas
cadeias de hidrocarbonetos. (C) Liposssomo uma vescula oca, resultante do fechamento de
uma bicamada lipdica, dotada de uma cavidade central preenchida por solvente.
70
1. Fundamentao Terica
Grupo carboxilato
Cadeia carbnica
Micela
Sabo
Fig. 6. Formao de micelas a partir das interaes entre sabes dispersos em soluo aquosa.
Sob condies especficas, os cidos graxos dos sabes podem ser precipitados. A adio
de cidos fracos, como cido actico, leva a formao de cidos graxos insolveis por causa do
baixo grau de dissociao (Figura 7).
(A)
AGITAO TEMPO
SABO
(B)
AGITAO
MICELA
MISTURA EMULSO
Fig. 9. Propriedade emulsificante dos sabes. Uma mistura de dois lquidos imiscveis pode
formar uma emulso atravs de agitao (fornecimento de energia). Contudo, as emulses so
instveis e tendem a tornar-se misturas com o passar do tempo (A). Os sabes agem como
surfactantes estabilizando a emulso formada atravs da formao de micelas com leos ou
solventes orgnicos. As cadeias hidrocarbnicas no-polares dos sabes dissolvem-se no leo
ou solvente orgnico enquanto os grupos inicos polares na fase aquosa. As gotculas
carregadas negativamente repelem-se mutuamente (B).
73
casa guardavam o excesso de leo e gorduras de cozinha e o devolviam para a recuperao da
glicerina.
2. Objetivos da aula
OBS: Nessa aula tambm dever ser iniciado o experimento referente a aula de Acares
(Aula 5), o qual encontra-se na Parte III dessa aula.
Parte I
Materiais e vidrarias
Azeite de oliva extra virgem e leo de algodo puro (armazenados em temperatura ambiente)
manteiga, gordura vegetal hidrogenada e banha de porco (armazenados em geladeira)
Termmetro
1 recipiente com gelo e sal de cozinha, por bancada, contendo um tubo de ensaio com 2 mL
de azeite de oliva extra virgem e um tubo de ensaio com 2 mL de leo de algodo que foram
mantidos no freezer por no mnimo 30 min
74
a) Numa primeira etapa, cada grupo dever pipetar 1 mL de cada leo e colocar em tubos de
ensaio separados. Fotografar lado a lado o tubo de ensaio contendo o leo de algodo e o tubo
de ensaio contendo o azeite de oliva temperatura ambiente.
Em seguida comparar os referidos leos com o seu similar que se encontra no recipiente com
gelo colocado sobre cada bancada. Observar o turvamento das amostras. Fotografar lado a lado
as amostras semelhantes.
b) Numa segunda etapa, cada grupo dever colocar os tubos de ensaio contendo a manteiga, a
gordura vegetal hidrogenada e a banha de porco em banho-maria, partindo de cerca de 30C.
Ligar o aquecimento somente aps colocar os tubos de ensaio. Acompanhar, atravs do
termmetro, a faixa de temperatura de fuso de cada lipdeo e anotar. Fotografar as amostras
aps todas atingirem o ponto de fuso.
Discuta:
1) O que explica a ordem de fuso dos diferentes lipdeos concomitante com o aumento de
temperatura?
2) O que explica a mudana de estado fsico (evidenciada pela turbidez da amostra) para os
dois leos colocados no gelo? Pesquise a composio de cidos graxos desses leos indicando o
ponto de fuso dos principais.
As tabelas a seguir, baseadas na referncia (6), indicam o total em cidos graxos saturados e
insaturados de 21 leos e gorduras vegetais, avaliados por cromatografia a gs (GC-FID).
75
leo Total cidos leo Total cidos Total cidos ndice
graxos graxos
BOR 12,96 BOR 25,25 61,79 4,77
CAN 6,98 EPR 7,99 83,90 10,34
CRN 13,46 CAN 64,42 28,60 4,10
COR 13,87 CRN 26,11 60,43 4,49
SUN 12,36 COR 24,76 61,37 4,42
SUR 11,92 SUN 15,93 71,71 5,80
COT 25,73 SUR 17,11 70,97 5,95
EPR 8,11 COT 17,49 56,78 2,20
FCO 8,15 FCO 22,04 69,81 6,56
SOY 15,10 SOY 21,73 63,17 4,18
SYB 15,12 SYB 23,92 60,64 4,01
OEV 12,98 OEV 77,44 9,58 0,74
OPR 13,53 OPR 75,37 11,10 0,82
ORF 15,28 ORF 77,00 7,72 0,50
PEA 18,38 PEA 50,33 31,29 1,70
RBO 20,68 RBO 41,41 37,91 1,83
RIO 18,22 RIO 44,51 37,27 2,04
PAL 49,45 PAL 39,66 10,83 0,22
PLK 80,34 PLK 16,90 2,76 0,03
COC 90,69 COC 7,51 1,80 0,02
76
Parte II
Materiais
Reagentes
Soluo de sabo de coco obtida da diluio em gua deionizada aquecida e sob
agitao de sabo de coco puro em barra na proporo de 1:9 (m/v)
Soluo de NaOH (10 M)
Soluo de HCl ( 1 M)
gua deionizada
Materiais e vidrarias
3 tubos de ensaio por grupo
Estante para tubos de ensaio
Pipetador automtico e ponteiras de 1000 e de 100
L Bquer pequeno
1
2 3
(controle)
gua 1 mL 1 mL 1 mL
Soluo NaOH - - 50 L
Aspecto da soluo
(turvo,precipitado,lmpido)
77
Discuta:
Exercicos:
1) Para a produo de sabo caseiro usa-se uma mistura denominada potassa alcolica (1,75M
KOH, 95% etanol) misturada ao leo desejado (leo de cozinha, por exemplo), seguido de
aquecimento lento. Responda as questes abaixo:
A) Sabendo que a peso molecular do KOH 57, demonstre como preparar 2 litros de potassa
alcolica. B) Se adicionarmos um cido forte em uma soluo de sabo, qual o resultado
observado? Justifique.
Resultado esperado
76
Parte III ( incio do experimento referente a Aula 5)
8 frascos de vidro com tampa (um por grupo e dois frascos para os controles PLA e
PLA /10% TPS)
Micropipetas de 10 L, 100 L e de 1000 L (um conjunto para cada grupo)
Reagentes
3 placas de PLA (grupos A,B e C uma placa por grupo) mais uma placa controle
3 placas de PLA /10% TPS (grupos D, E e F uma placa por grupo) mais uma placa
controle
Soluo alcolica de Cumeno hidroperxido 300 mM
Soluo aquosa de Cloreto de ferro II (FeCl2) 2 mM
Observaes:
1 - Preparar a soluo estoque de cumeno hidroperxido (300 mM) em etanol P.A.
( 110,8 L de cumeno e 1889,2 L de etanol = volume final de 2 mL)
2 - A soluo de Cumeno hidroperxido deve ser armazenada protegida da luz no freezer.e
descongelada a temperatura ambiente no momento da utilizao.
3 - A soluo de cloreto de ferro II deve ser armazenada protegida da luz a temperatura
ambiente.
4 - Agitar as solues antes da utilizao.
5 - Manipular as solues utilizando luvas.
6- As placas sero fornecidas pelo professor Derval Rosa. Essas devero serr cortadas com
2
tamanho mdio de 0,8 cm (ou adequado para ser colocada nos frascos).
Procedimento:
2) Cada GRUPO dever seguir o PROTOCOLO proposto PARA A SUA LETRA, conforme
especificado abaixo e na tabela 1. O grupo A e o grupo D devero fazer tambm,
respectivamente, os grupos CONTROLE PLA e CONTROLE PLA/10% TPS. Cada controle
corresponde a respectiva placa mantida individualmente em um frasco com gua durante todo
o experimento.
GRUPO A:
2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (A) e adicionar no interior desse frasco 1990 L
de gua deionizada.
77
3) Adicionar 10 L de FeCl2 (2mM). Agitar a soluo.
GRUPO B:
2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (B) e adicionar no interior desse frasco 1938 L
de gua deionizada.
5) Deixar a placa reagindo com a soluo por 7 (sete) dias. Obs.: O tcnicos do laboratrio
iro adicionar mais 62 L de cumeno hidroperxido a esse frasco, diariamente, at o dia da
prxima aula (de 4 a 5 adies).
GRUPO C:
2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (C) e adicionar no interior desse frasco 1928 L
de gua deionizada.
78
GRUPO D:
1) Fotografar a placa de PLA /10% TPS antes do incio do experimento. Observar o aspecto
da sua superfcie.
2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (D) e adicionar no interior desse frasco 1990 L
de gua deionizada.
6) Aps o perodo de incubao fotografar a placa de PLA /10% TPS e observar as mudanas
ocorridas.
GRUPO E:
1) Fotografar a placa de PLA /10% TPS antes do incio do experimento. Observar o aspecto
da sua superfcie.
2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (E) e adicionar no interior desse frasco 1938 L
de gua deionizada.
5) Deixar a placa reagindo com a soluo por 7 (sete) dias. Obs.: O tcnicos do laboratrio
iro adicionar mais 62 L de cumeno hidroperxido a esse frasco, diariamente, at o dia da
prxima aula (de 4 a 5 adies).
6) Aps o perodo de incubao fotografar a placa de PLA /10% TPS e observar as mudanas
ocorridas.
GRUPO F:
1) Fotografar a placa de PLA /10% TPS antes do incio do experimento. Observar o aspecto
da sua superfcie.
2) Anotar em seu frasco o nome do seu grupo (F) e adicionar no interior desse frasco 1928 L
de gua deionizada.
79
4) Adicionar a placa de PLA /10% TPS.
6) Aps o perodo de incubao fotografar a placa de PLA /10% TPS e observar as mudanas
ocorridas.
1) Identificar nos frascos o nome do grupo (em um controle PLA e no outro controle PLA
/10% TPS e adicionar no interior de cada frasco 2000 L de gua deionizada.
As placas devero permanecer reagindo com a soluo em mdia por 7 dias, sendo que
a adio de reagente quando indicado dever ser feita por 4 ou 5 dias, de acordo com o
permitido pelo calendrio do quadrimestre.
80
Referncias Bibliogrficas
1. MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioqumica Bsica, 3 ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2007.
2. ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P. Molecular
Biology of the Cell, 5 ed., Garland Science, New York, 2008.
3. LEHNINGER, ALBERT L.; NELSON, DAVID L.; COX, MICHAEL M. Princpios de bioqumica,
4 ed., So Paulo: Sarvier, 2006.
4. NEPOMUCENO, M. F.; RUGGIERO, A. C. Manual de Bioqumica: Roteiros de Anlises
Bioqumicas Qualitativas e Quantitativas, 1 ed., Ribeiro Preto: Tecmedd, 2004.
5. PETKOWICZ, I.; DE OLIVEIRA, C. L. Bioqumica: Aulas Prticas, 7 Ed., Editora UFPR, Paran,
2007.
6. ZAMBIAZI, R.C.; PRZYBYLSKI, R.; ZAMBIAZI, M.W.; MENDONA; C.B. Fatty acid
composition of vegetable oils and fats. B.CEPPA, Curitiba, v. 25, n. 1, p. 111-120, jan./jun. 2007.
7.CARVALHO, C.A.; OLIVARES-ORTEGA, C.; SOTO-ARRIAZA, M.A.; CARMONA-RIBEIRO
A. M. Interaction of gramicidin with DPPC/DODAB bilayer fragments. Biochimica et
Biophysica Acta 1818, 30643071, 2012.
81
Experimento 5 Acares para biologia e
materiais avanados.
Resumo
Introduo
O amido tem estrutura qumica muito parecida com o glicognio, porm possui menos
ramificaes. Tem funo nos vegetais semelhante do glicognio nas clulas animais, ou
seja, de reserva energtica. Sua sntese em plantas tambm bastante semelhante sntese do
glicognio em animais, com a substituio da forma ativada da glicose de UDP-glicose por
ADP-glicose, com catlise pela enzima amido sintase. No processo de digesto, a hidrlise do
amido catalisada enzimaticamente pelas -amilases salivar e pancretica, que clivam as
ligaes glicosdicas 14 da amilose originando uma mistura de maltose, amilopectina e
glicose, e tambm as ligaes 14 da amilopectina, originando uma mistura de
1
polissacardeos denominados dextrinas .
83
aplicaes biotecnolgicas, servindo como fonte de acares para reaes fermentativas para
produo de etanol em indstrias qumicas, na industira de alimentos, de bebidas ou de
combustveis. Nos pases europeus e nos Estados Unidos, mais de 50% da produo de amido
destinada produo de hidrolisados, tais como glicose, maltose, dextrinas e maltodextrinas.
Esses hidrolisados, por suas propriedades especficas e seus diferentes usos no setor
alimentcio, constituem uma excelente valorizao da fcula, sendo usado na fabricao de
2
xaropes, preparo de colas e gomas, como excipiente farmacutico, etc .
84
5
espectrofotomtricas, titulomtricas ou gravimtricas . Dissacardeos ligados pelas suas
hidroxilas redutoras como o caso da sacarose no apresentam poder redutor, porm quando
hidrolisados passam a exibir esta caracterstica. Tais propriedades so muito importantes e,
por muitas vezes, utilizadas para identificao de acares, verificao de adulterao e
5
falsificao de alimentos, entre outros .
1.Fundamentao Terica
CH2OH
O
H H AMILOPECTINA
H
OH H
AMILOSE ligao
O
H OH 16
CH2OH CH2OH
CH2 CH2OH
O O
H H H H O O
H H H H H H
H H
OH H OH H
O O OH H OH H
O O
H OH H OH n H OH H OH n
ligao ligao
14 14
1
Fig. 2 . Estruturas qumicas da amilose e amilopectina, evidenciando as ligaes glicosdicas .
85
Fig. 3. Representao da estrutura helicoidal de uma cadeia de amilose, polmero que compe a
A 1
estrutura do amido .
B
A B
Processamento
87
trmica. Estudos com blendas polimricas de TPS com PLA tem mostrado que as
propriedades do PLA podem ser moduladas pela variao da proporo dos enantimeros na
7,8,9
composio do material e pelo uso de aditivos .
Fig. 6. Estrutura de (a) Poli(cido ltico) e amido: (b) amilopectina e (c) amilose.
Tcnicas espectroscpicas
89
eletrnicos. Quando os tomos decaem de volta ao estado fundamental estvel, a energia
absorvida pode ser parcialmente emitida em forma de ondas eletromagnticas, sendo essa
energia detectada e utilizada para a anlise do material. Na espectroscopia de absoro, a
substncia a ser analisada posicionada entre o detector e uma fonte de energia que emite a
radiao eletromagntica com o comprimento de onda desejado, sendo a anlise feita
comparando-se a radiao transmitida ou refletida pela amostra, com a radiao da fonte. A
escolha da tcnica depende do material ou substncia a ser analisado, da informao desejada
10,11
e da radiao eletromagntica utilizada .
Espectroscopia de absoro
90
10
Tabela 1 - Subdivises da regio espectral do infravermelho .
-1
Nmero de onda (cm ) Frequncia (Hz) Comprimento de onda (m)
14 14
Infravermelho prximo 12800 - 4000 3,8x10 - 1,2x10 0,78 2,5
14 12
Infravermelho mdio 4000 200 1,2x10 6,0x10 2,5 50
12 11
Infravermelho distante 200 - 100 6,0x10 3,0x10 50 - 1000
91
Espectro
Amostra
Infravermelho
-
cm
2A profundidade de penetrao depende do comprimento de onda do feixe ,do ngulo de incidncia deste com a amostra, do
ndice de refrao do cristal do equipamento e do material analisado
92
diamante, ZnSe (Seleneto de Zinco) ou Ge (Germnio) o qual deve ser escolhido de acordo
com o material a ser analisado. A proporo de feixe refletido varia com o ngulo de
incidncia, havendo um ngulo crtico onde a reflexo total, que depende do tipo de cristal.
Com a absoro da radiao que penetrou na amostra, o feixe refletido tem sua intensidade
atenuada, e assim se consegue identificar as bandas de absoro. A utilizao do microscpio
como acessrio do equipamento caracteriza a tcnica de -ATR (Figuras 8B e 9), que
proporciona uma profundidade de penetrao da radiao da ordem de 0.66 m com o uso do
cristal de Ge e de 2 m de profundidade de penetao obtida com o cristal de Seleneto de
Zinco, ou com o de diamante, disponvel no modo ATR. Isso permite que o sinal analisado
fique restrito superfcie da amostra. No modo microscpio possvel realizar a anlise numa
11
rea de interesse previamente visualizadas .
Amostra A B
FONTE
Cristal de DETECTOR
AMOSTRA Ge
AMOSTRA
11
Fig. 8 - Esquema de funcionamento. A - FTIR com acessrio ATR; B - -ATR .
MICROESPECTRMETRO
FTIR
Cristal
Amostra
posicionada Placa de apoio
Fig. 9 - Microespectrmetro Varian 610 da CEM-UFABC, onde foram tomados os dados para
anlise composicional das placas de PLA e PLA/10%TPS.
93
2. Objetivos da aula
- estudar a aplicao dos acares, no caso o amido, na produo de materiais que tenham
propriedades de resistncia associada com maior rapidez e intensidade de degradao
ambiental.
3. Procedimento Experimental
Reagentes
- reagente de Benedict;
- soluo de glicose 1,0 % (m/v);
- soluo de sacarose 1,0 % (m/v);
- suspenso de amido 1,0 % (m/v);
Materiais e Vidrarias
3.1. Pesquisa de poder redutor. Tomar 4 tubos de ensaio e seguir o procedimento abaixo:
B - 1,5 1,0
94
Em seguida, ferver os tubos em banho-maria por 5 minutos e observar as possveis
alteraes. Sabendo que entre as amostras 1, 2 e 3 tratam-se de glicose, amido e sacarose,
identifique as amostras em funo da colorao observada e discuta os resultados.
Uso do amido termoplstico como aditivo ao policido lctico para produo de material
compsito de mais fcil degradao no meio ambiente por mecanismos oxidativos.
3.2. Exame a olho nu e ao microscpico ptico das placas de PLA e PLA/10% TPS submetidas
degradao desde a aula anterior, conforme procedimento resumido na Tabela 2.
Grupo CONTROLE
CONTROLE
A B C D E F PLA
PLA /10%
TPS
PLA PLA PLA
PLA /10%
Placa PLA PLA PLA /10% /10% /10% PLA
TPS
TPS TPS TPS
gua
deionizada
1990 1938 1928 1990 1938 1928 2000 2000
(microlitros=
L)
Cloreto de Fe
II (2mM)
10 -- 10 10 -- 10 -- --
(microlitros=
L)
Cumeno
hidroperxido
(300mM) -- 62 62 -- 62 62 -- --
(microlitros=
L)
Adio diria
de cumeno
Hidroperxido -- 62* 62* -- 62* 62* -- --
(microlitros=
L)
*Feito pelos tcnicos de laboratrio
95
2) Analisar as imagens da Tabela 3 que mostram a superfcie das diversas placas a olho nu e por
meio de microscopia eletrnica de varredura. Faa uma descrio das alteraes observadas nas
placas degradadas em relao placa controle e entre as placas com e sem TPS.
Soluo
para
degradao
Cloreto de Fe II
Cumeno
Cloreto de Fe II + Cumeno Controle
Imagens hidroperxido
da hidroperxido
superfcie
das placas
Imagens
a olho nu
(PLA)
Imagens
de MEV
(PLA)
Imagens
a olho
nu (PLA
/10%
TPS)
Imagens
de MEV
(PLA
/10%
TPS)
96
3.3. Discusso das anlises feitas previamente por -ATR-FTIR:
0,30 0,6
PLA hidratado A 1088
0,20 0,4
2356
0,15 0,3
0,00 0,0
0,30 0,5
PLA -TPS hidratado
PLA_TPS + cumeno
0,25
Gota Cumeno sobre PLA-TPS 0,4
Intensidade
0,20
0,3
0,15
3315
0,2
0,10
0,05 0,1
0,00
0,0
3600 3300 3000 2700 2400 2100 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800
-1
Nmero de onda (cm )
97
0,10 0,5
PLA hidratado
PLA + Fe II (liso)
PLA + Fe II (mancha escura) 0,4
Intensidade
0,3
0,05
0,2
0,1
0,00 0,0
0,10 0,5
PLA_TPS hidratado
PLA_TPS+Fe II (liso)
PLA_TPS+Fe II (rugoso) 0,4
0,3
Intensidade
0,05
0,2
0,1
0,00
0,0
3600 3300 3000 2700 2400 2100 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800
-1
Nmero de onda (cm )
Fig. 11 Espectros ATR/FTIR de PLA (painel superior) e de PLA_10% TPS (painel inferior).
Amostra controle (linha azul), regio lisa da amostra tratada com Cloreto de Ferro II
tetrahidratado Fe II (linha alaranjada) e regio de mancha escura ou rugosa da amostra tratada
com Fe II (linha vermelha). As regies lisas, de mancha escura ou rugosa foram identificadas por
meio de microscpio tico acoplado ao equipamento de FTIR (imagens no mostradas).
98
0,10 0,5
PLA hidratado
PLA+Fe+cumeno (sup-riscos)
0,4
Intensidad
0,3
e
0,05
0,2
0,1
0,0
0,00
0,10 0,5
PLA_TPS hidratado
PLA_TPS+Fe+Cumeno(sup-riscos)
0,4
0,3
Intensidade
0,05
0,2
0,1
0,00
0,0
3600 3300 3000 2700 2400 2100 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800
-1
Nmero de onda (cm )
99
Stretching C-O-C
C=O ( (1,4) e glicopiranose)
-1
(1759 cm )
C-OH
)
C-CH3
-OH
Intensidade
(Stretching )
(anel da glicose)
-1 -OH hidratado
3315 cm
amido -OH
do
O -CH (H 0 do
-OH (H 2 2
(TPS) amido)
-1
3400 cm
C-O
Deformao
PLA-hidratado (ster)
Fig. 13 - Espectros FTIR de PLA (linha preta) e PLA_10 %TPS (linha vermelha), com
indicao de modos de vibraes (estiramento), grupos funcionais (OH) ou ligaes qumicas
(C=O) correspondentes a alguns picos ou banda de absoro consideradas para o presente
estudo.
-1
A regio espectral de 2998-2985 cm corresponde vibrao de estiramento (stretching)
do grupo CH das cadeias alquila. Essa regio geralmente no fornece informao importante
porque quase todos compostos orgnicos possuem esse grupo. Entretanto, informaes
significativas sobre o tamanho da cadeia alquila podem ser obtidas pela comparao da
intensidade desses picos em relao a outros. Assim, os picos de baixa intensidade nessa regio
para o PLA e PLA/TPS so consistentes com a ausncia de longas cadeias alquila na estrutura do
PLA e do TPS. Para o compsito de PLA com 10 % de TPS, aparece um pico de absoro forte e
-1
largo prximo a 3380 cm , o qual geralmente atribudo ao lcool OH de resduos de glicose.
Nessa regio, h tambm a sobreposio da contribuio da vibrao OH da gua da camada de
-1 -1
hidratao do amido (3230 e 3114 cm ) . A regio de 1800 a 1700 cm contm uma banda com
-1
pico em 1752 cm atribuda a forte estiramento C=O tpico de PLA. Para PLA
100
-1 -1
amorfo, o pico dessa banda 1759 cm e esse sofre um desvio de 10 cm (blue-shifted) depois
-1
da cristalizao trmica. O pico em 1752 cm encontrado para essas amostras sugerem a presena
de material polimrfico. Essa banda est ligeiramente menos intensa e desviada (red-shifted) na
presena de TPS, mas sem perda das bandas adicionais. Esse resultado consistente com uma
-1
modificao no-covalente da PLA no compsito. Na regio de 1500 a 1300 cm , o espectro de
FTIR apresenta outras bandas tpicas de PLA, nomeadas estiramento assimtrico
1
as(CH3) e estiramento simtrico (CH3) na regio espectral de 1453 e 1359 cm ,
respectivamente. Essas bandas diminuram de intensidade na presena de 10% de TPS. Um
-1
efeito similar foi observado para as(COC) e s(COC) em 1182 e 1037 cm , r(CCH3) em
1 -1
1017 cm1 e (OCC) em 870 cm . O alargamento da banda na regio de 960 cm pode ser
atribudo a sobreposio da contribuio de unidades de glicopiranose na conformao de
9,12
cadeira .
Regio espectral
da banda ou
Grupo caracterstico Atribuio Peculiaridade
pico de
absoro
pico de
-1
3380 cm lcool OH de resduos de glicose absoro forte e
largo
conformao de sobreposio da
-1 alargamento da
960 cm cadeira da contribuio de banda
glicopiranose glicoranonose.
101
4. Discusso:
A reao de ferro e perxidos (Reao de Fenton) gera radicais livres. Pesquise esses
mecanismos de reao. Como voc explicaria que cada um dos componentes isolados tambm
foi capaz de causar danos? Veja a referncia 8.
5. Exerccios
1-Desenhe com uso de um programa como o ChemSketch (verso gratuita para uso
educacional), ou pegue imagens pela internet da estrutura do PLA e do amido. Identifique
nessas estruturas os grupos funcionais que aparecem na tabela 4 e Fig. 13.
2- Com base na identificao dos grupos funcionais presentes nas estruturas do PLA e do
amido termoplstico, faa uma anlise de cada grfico de FTIR que foi apresentado. Exemplo
para orientar as respostas: no espectro ... observa-se que a degradao do material contendo
10% de amido resultou em aumento do sinal vindo da contribuio da glicopiranose o que
consistente com a hidrlise do amido (...).
3-Um pesquisador precisava identificar qual era o tipo de acar dominante em um extrato
3
vegetal. Decidiu aplicar a reao de Benedict . Para isso preparou dois tubos de ensaio. O
primeiro, com 1,5 mL de H2O destilada. O segundo, com 1, 5 mL de extrato aquoso da planta.
Ento adicionou 1 mL do reagente de Benedict e incubou os tubos em H2O fervente por 5
minutos. Ele obteve os seguintes resultados:
102
Referncias Bibliogrficas
1.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princpios de Bioqumica, 4. ed. New
York: Worth Publishers, 2006, p.685-686.
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amilceas latino-americanas. v. 3, p. 377-448, 2002.
3
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e deteco de acares em amostras biolgicas)
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Termoplstico; Documentos 30, 27 p. Embrapa Instrumentao Agropecuria, So Carlos;
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8
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103
Experimento 6 Catlise enzimtica modulada
por nanopartculas metlicas
Resumo
Por meio de experimentos simples, nessa aula pretende-se estudar a correlao entre
estrutura proteica e atividade enzimtica, resgatar, ampliar e aplicar conceitos bsicos, como
teorias de ligao metlica, estrutura atmica, reaes de oxidao-reduo e espectroscopia
UV-Vis, ao mesmo tempo em que so introduzidos conceitos de nanocincia, como o efeito
de confinamento quntico e a ressonncia de plasmons de superfcie, conceitos de interesse
tecnolgico.
Para esse estudo ser analisada a atividade enzimtica de gelatinase (a gelatina contm
colgeno desnaturado) presente no extrato da polpa do abacaxi que possui um conjunto de
enzimas diversas conhecido como bromelana. A modulao da estrutura/atividade ser feita por
meio de aquecimento das amostras em duas temperaturas para promover desnaturao parcial e
total das enzimas e pela associao das enzimas com nanopartculas de ouro. Tambm ser
estudada a precipitao protica pela adio de lcool (coagulao) ou sulfato de amnio (salting
out) na soluo de colgeno, mostrando a alterao da solubilidade protica.
Nanopartculas de ouro sero produzidas em aula por meio de dois protocolos: a) uso
simultneo do HEPES e dos prprios componentes do suco de abacaxi como agentes
3+ 0
redutores do on ouro (Au ) sua forma atmica (Au ); b) uso do HEPES como nico
agente redutor, seguido pela adio do suco de abacaxi aps a formao das nanopartculas.
Os dois protocolos produziro nanopartculas de ouro que estaro recobertas por HEPES e
pelas biomolculas do suco de abacaxi, inclusive a bromelana.
1.Fundamentao Terica
Enzimas
1
Enzimas proteolticas ou proteases catalisam o rompimento das ligaes peptdicas em
protenas. So enzimas da classe 3, as hidrolases, e subclasse 3.4, as peptdeo-hidrolases ou
peptidases. Estas enzimas constituem uma grande famlia (EC 3.4), dividida em endopeptidases
ou proteinases (EC 3.4. 21-99) e exopetidases (EC 3.4.11-19), de acordo com a posio da
104
ligao peptdica a ser clivada na cadeia peptdica. Estas endopeptidases podem ser ainda
subdivididas de acordo com o grupo reativo no stio ativo envolvido com a catlise em serina-
2 3 4
(EC 3.4.21) , cistena- (EC 3.4.22) , asprtico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e
5
metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC 3.4.24). As enzimas cujo mecanismo de
ao no est completamente elucidado so classificadas no subgrupo EC. 3.4.99.
Exopeptidases
Endopeptidases
Tipos catalticos
Gelatina
106
Considerando-se a forma e tamanho da molcula de gelatina, observa-se que essa tem
baixo ponto isoeltrico (pI), a conformao de suas molculas predominantemente de
random coil com perda da habilidade de formar fibrilas e facilmente atacada por proteinase.
A gelatina possui uma grande habilidade de ligao com a gua (5 a 10 vezes seu peso) e suas
cadeias peptdicas de configurao helicoidal so importantes para a formao do gel. Por ser
um hidrocolide de origem proteica possui carter anftero, associado presena de grupos
amina e carboxlicos nos aminocidos. A viscosidade em soluo afetada pela concentrao
7
e pela temperatura .
Por definio, nanoestruturas devem possuir pelo menos uma dimenso na escala
nanomtrica (1 a 100 nm) (Fig.1B), ter uma alta razo superfcie/volume e suas propriedades
9
devem mudar em relao ao material na escala macroscpica (material bulk) . Assim, a
nanocincia e a nanotecnologia apresentam a possibilidade e o desafio de controle sobre os
componentes estruturais do nanosistema em escalas de tomos ou molculas individuais de
dimenses submicromtricas, bem como a integrao de nanoestruturas resultantes em sistemas
maiores, buscando a miniaturizao de dispositivos e a montagem de estruturas organizadas e
funcionais para gerar produtos inovadores (Fig. 1B- Things Manmade). Dentre esses produtos,
encontra-se dispositivos de converso e armazenamento de energia, estruturas para uso em
eletrnica e fotnica, melhores catalisadores de reaes qumicas e sensores para uso em reas
8,
estratgicas como as de energia, medicina, informao, segurana, ambiente e indstria .
107
B
A
10
Fig. 1: A- A escala das coisas ; B- esquema dos mtodos top down e bottom up de sntese
de nanopartculas, os quais so tambm aplicveis para outros nanomateriais e para a
nanotecnologia.
109
O comportamento ptico das nanopartculas metlicas (NPs-M) tem fascinado a
humanidade desde a antiguidade. Na figura 2A, visualiza-se a Taa de Lycurgus (sculo 4 a.
C) talvez o exemplo mais antigo conhecido de utilizao de nanomaterial. A anlise deste
vidro revelou que ele contm uma pequena quantidade de nanocristais metlicos (~ 70 nm)
contendo Ag e Au. Ainda em 1857, Faraday estudando a interao da luz em solues
coloidais de ouro percebeu que a cor vermelha era atribuda ao ouro nessa forma. conhecido
que o ouro, na forma macroscpica, um slido dourado dctil e com brilho metlico, que
pode ser dissolvido em gua-rgia, gerando uma soluo de cido tetraclorourico (H[AuCl4])
(figura 2B). O cido tetraclorourico ao ser reduzido em soluo, pode gerar nanopartculas
de ouro com a colorao da suspenso de nanopartculas variando do vermelho ao roxo
11,12
azulado dependendo do tamanho da nanopartcula e do estado de agregao (figura 2C) .
A B C
110
16
Fig. 3: Imagens de microscopia de nanopartculas de ouro (TEM e SEM) .
17 18
Fig. 4: Energia fotovoltaica . Marcador biolgico .
111
Figura 5: Propriedades pticas de nanopartculas de ouro: uma soluo avermelhada de nanopartculas de
ouro de 20 nm ( direita) no detalhe, imagem das partculas por microscopia eletrnica pode ter sua
agregao induzida por agentes qumicos, o que muda a colorao da soluo para azul. A agregao
tambm altera a intensidade do fenmeno de espalhamento de luz, o que interfere na visibilidade de um
8
feixe de luz laser que incide na soluo. Essas propriedades abrem amplas possibilidades de aplicao .
112
A C
B D
Fig. 6. Representaao esquemtica da origem de um dipolo eltrico induzido e efeito da fora restauradora
devido separao de cargas nas nanopartculas metlicas. A LSPR ocorre quando a oscilao coletiva dos
eltrons de valncia na nanopartcula metlica est em ressonncia com a frequncia da luz incidente. Em
A, excitao de plasmon de superficie em nanopartcula esfrica. Em B, a nanoparticula de ouro (Au) age
como uma nanoanena pela excitao de uma ressonancia de plasmon
a largura da banda plasmnica dependem de fatores que afetam a densidade de carga de eltrons
sobre a superfcie da partcula tais como o tipo de metal, tamanho, forma e estrutura da partcula,
agregao, a constante dieltrica do meio circundante e temperatura. No h BP para GNPs com
dimetro inferior a 2 nm nem para ouro macio (bulk).
114
A
115
menor energia (regio espectral do vermelho e infravermelho prximo) e apresenta-se alargada.
21
Estruturas complexas como NP agregadas apresentam um amplo espectro de absoro .
O efeito de confinamento quntico est relacionado com o a restrio espacial, nas trs
dimenses geomtricas, dos portadores de carga (eltrons e lacunas), fazendo com que as
propriedades eletrnicas e fsico-qumicas sejam fortemente dependentes da relao
superfcie/volume da nanoestrutura. Para o entendimento desse efeito nas NPs, necessrio
considerar alguns conceitos relacionados s propriedades eletrnicas de materiais condutores,
semicondutores e isolantes no estado slido. Pela mecnica quntica, conhecido que as rbitas
eletrnicas esto a distncias bem definidas em relao ao ncleo do tomo e esse fato faz com
que entre uma rbita e outra exista uma regio onde no possvel existir eltrons, denominada
banda proibida de energia (gap de energia), pois no h nveis eletrnicos que os comportaria.
116
O tamanho dessa banda proibida relativo ao ltimo orbital ocupado e o primeiro vazio define
o comportamento eltrico do material conforme pode ser observado na figura 9. Isolantes
apresentam uma grande banda proibida. Apenas quando a excitao feita com uma energia
superior em vrios eV da banda proibida (bandgap) a conduo possvel. Semicondutores
tm um bandgap mais estreito e mesmo temperatura ambiente poucos eltrons podem ser
conduzidos para a banda de conduo. Semicondutores dopados tm maior condutncia
eltrica, porque dopantes adicionais fornecem eltrons de conduo, pois estes se encontraro
em nveis de energia inseridos no gap do material. Condutores no apresentam gap. Os metais
em escala macroscpica (bulk) apresentam um arranjo peridico de uma enorme quantidade
de tomos em uma rede cristalina e muitos eltrons livres, alta condutividade e alta refletividade
da luz (desde que a frequncia no seja muito alta) e no possuem uma banda proibida de energia.
Porm ocorre a mudana dessa estrutura de energia quando as partculas metlicas se tornam
pequenas o suficiente para que efeitos de quantizao ocorram, ou seja, ao se considerar as
nanopartculas metlicas como aglomerado nanomtrico de poucas dezenas ou at de milhares
de tomos.
Banda de
Primeira Conduo Eltrons Banda de
banda de (BC) livres conduo
energia Metal na escala
vazia Banda macroscpica (bulk)
proibida
(gap)
ltima
banda de Lacunas Banda de
energia Banda de valncia
ocupada Valncia
(BV)
Isolante Semicondutor Condutor
117
Ao aglomerarem-se para formao de clusters, ou nanopartculas com algumas dezenas ou
mais de nanmetros, os orbitais eletrnicos dos tomos formadores das estruturas sobrepem-
se interagindo entre si, o que resulta na formao de orbitais moleculares. Com o aumento
progressivo da quantidade de tomos e, portanto, do tamanho da NP, os nveis centrais da
banda de energia se aproximam, tornando-se quase contnuos, enquanto as regies da base e
topo da banda ainda se mostram discretizadas (Fig. 10B nanopartcula). Com o aumento do
nmero de tomos a partir de determinados valores, as bandas de energia adquirem o carter
contnuo de volume metlico (bulk).
A B
BC
tomo BV
isolado
BV
Aglomerado de Nanopartcula Volume
tomo Molcula Quantun Semicondutor bulk poucos tomos metlica (bulk)
dot
Fig. 10. Representao esquemtica da estrutura de energia eletrnica em relao ao nmero de tomos e
densidade de estados. O diagrama de nveis de energia em um slido cristalino depende do nmero de
tomos combinados quimicamente. O aumento da quantidade de tomos (e da densidade de estados)
provoca a transio do discreto para o contnuo. Em A, representao comparativa para uma nanoparticula
de semicondutor (quantum dot): os nveis de energia discretos das orbitais atmicos tendem para bandas de
energia com o aumento do nmero de tomos. Em B, representao comparativa para NP metlica: com o
aumento progressivo da quantidade de tomos e, consequentemente, com o aumento do tamanho da NP, os
nveis centrais da banda de energia se aproximam, tornando-se quase contnuos, enquanto as regies da
base e topo da banda ainda se mostram com valores discretos. Assim, dependendo das dimenses da NP, h
a variao do gap entre o ltimo nvel de valncia e o primeiro de conduo, diferente do metal em escala
macroscpica. No limite em que o nmero de tomos apresenta-se suficientemente grande, consistindo em
um volume metlico, as bandas de energia adquirem o carter contnuo. Em cinza, estados eletrnicos
desocupados. (Adaptado das referncias 13 e 20)
118
que o dimetro da NP seja tal que os efeitos de confinamento quntico no mais estejam
presentes e sua estrutura de banda de energia aproxima-se do comportamento do material bulk
metlico (sem gap). De modo anlogo, com a diminuio do tamanho da nanopartcula a
quantidade de energia necessria para promover eltrons da ltima banda de energia ocupada na
banda de valncia para a primeira vazia na banda de conduo torna-se maior, estando ento
relacionada com ftons com valores menores de comprimento de onda (maior energia). As
diferentes energias de excitao esto relacionadas com os diferentes tamanhos de gap e esses
por sua vez esto relacionados aos diferentes dimetros das NPs metlicas. Assim, com o
aumento do tamanho de GNPs esfricas, a soluo coloidal passa dos tons de vermelho para a
14
cor azulada . importante lembrar que a cor observada na soluo coloidal resultado da
combinao dos comprimentos de onda que interagiram com a matria e chegaram aos olhos
humanos sendo ento decodificados pelo crebro.
A BULK
Energia
gap
120
Figura 12. Esquema das etapas ocorridas no processo da sntese qumica para obteno de
nanopartculas de ouro.
121
Figura 14: Tampo HEPES (esquerda) e cido tetraclorurico (direita).
122
potencialmente ampliam o uso de GNPs como uma ferramenta para pesquisadores com pouca
ou nenhuma experincia em sntese qumica, alm do uso didtico. A sntese e caracterizao
dessas NPs tm sido estudadas no Laboratrio de Nanoestruturas para Biologia e Biomateriais
Avanados da UFABC.
4 1,0
NP-HEPES
1 2 3 4 NP (HEPES+ abacaxi)
0,8
NP-HEPES add abacaxi
suco abacaxi
Tampao HEPES 30mM-pH10
Soluo agua+ouro_200uM
0,6
3
3
0,4 1
Intensidade
2
0,2
2 4
0,0
440 480 520 560 600 640 680 720 760 800
4
1
2 1
0 240 280 320 360 400 440 480 520 560 600 640 680 720 760 800
Figura 16: Espectros de absorbncia das solues coloidais de nanoparticulas de ouro sinteti-zadas
nessa aula, evidenciando as bandas de ressonncia plasmnica e a colorao das solues.
123
GNPs, mas, ao contrrio, apresenta uma banda em 280 nm tpica dos aminocidos aromticos
e pontes dissulfeto das protenas. Portanto, nessa condio, provavelmente, as protenas do
suco de abacaxi foram mais competitivas do que o HEPES e seus produtos para coordenao
com a superfcie das GNPs. Porm, no tempo observado nesse experimento, as protenas do
suco de abacaxi, quando esse foi adicionado nas GNP previamente sintetizadas com uso de
HEPES (linha verde), no conseguiram deslocar o HEPES e seus produtos da coordenao
com ouro e o espectro registrado apresenta a banda do suco de abacaxi sobreposta ao espectro
do HEPES e seus produtos coordenado com as GNPs.
2. Objetivos da aula
124
3. Procedimento Experimental
Materiais
8 tubos de ensaio de 20 mL
1 tubo de ensaio de 30 mL
8 flaconetes de vidro com tampa (5 mL) por
turma 5 eppendorfs de 2mL
Estante para tubos de ensaio
Estante para Eppendorfs
Bquer de vidro de 100 mL (para aquecer gua)
Bquer de 25 ou 50 mL (para gua destilada)
Funil de vidro pequeno e papel de filtro, tesoura para cortar o papel de
filtro Recipiente com gelo
Almofariz e pistilo
Luvas de ltex
Basto de vidro (para dissolver a gelatina)
Placa aquecida ou banho-maria 100C
Banho-maria 60C
Banho-maria 30C
Balana
Micropipetas de 10 L, 100 L e de 1000 L (um conjunto para cada grupo)
Reagentes
125
2 etapa : Sntese de nanopartculas de fruta com sal de ouro (GNP) - por bancada
Essa etapa dever ser feita com a TURMA separada em 2 grupos, ou seja, cada bancada
constitui um grupo.
Aps a sntese, reservar os frascos tampados para serem usados na 6 etapa dessa aula.
Soluo
GNP-HEPES GNP-HEPES
Extrato de
adicionado
GNP- HEPES + abacaxi abacaxi
Reagente abacaxi
Tampo
HEPES+Fosfato de
1390 L 1390 L 1390 L 1400 L
sdio (30 mM)
pH 10
L (microlitros)
gua destilada 100 L -- -- --
Soluo de sal de
ouro 10 L 10 L 10 L --
(30 mM)
Cor da soluo
Depois de 30
minutos
-- -- -- acrescentar --
100 L extrato
de abacaxi
Cor da soluo
126
3 etapa : Preparo da gelatina (por grupo)
127
5 etapa : Precipitao de protenas (por grupo).
gua 2,0 mL - -
Precipitao?
Caractersticas do
precipitado
128
Tabela 4. Resumo do procedimento experimental da 6 etapa
Grupo
A B C D E
Reagentes
gua
250 L -- -- -- --
deionizada
Soluo de
-- 250 L -- -- --
NP- HEPES
Soluo de
-- -- 250 L -- --
NP- HEPES +
abacaxi
NP-HEPES
adicionado -- -- -- 250 L --
abacaxi
Soluo de
extrato de -- -- -- -- 250 L
abacaxi
Digesto da
gelatina ?
(n de dias aps
sntese)
3) Feche bem os Eppendorfs. Esses devero ser mantidos a temperatura ambiente por 10
minutos e logo aps incubados no gelo por 7 minutos.
5) Na prxima aula (aula de discusso) cada grupo dever observar seus Eppendorfs em relao
digesto da gelatina (perda da consistncia de gel), anotando e fotografando os resultados.
129
ATENO : NO ABRIR OS EPPENDORFS EM NENHUM MOMENTO DO PERODO
DE OBSERVAO PARA QUE NO OCORRA CONTAMINAO DAS AMOSTRAS.
O descarte dos Eppendorfs dever ser feito no laboratrio em local adequado.
5. Para discusso:
130
6. Exerccio
Ana, uma dona de casa, resolveu fazer uma sobremesa a base de gelatina e abacaxi para os
amigos que viriam visit-la, procurou na internet uma receita bem simples e que parecia ser
muito boa.
Como Ana estava com pressa deixou o abacaxi pouco tempo no fogo (cerca de 2 minutos) e j
adicionou a gelatina. Aps deixar a sobremesa esfriar, observou que a gelatina no havia
endurecido. Explique por que nessa situao a gelatina no endureceu depois de resfriada. Por
que a sobremesa postada na internet tinha a gelatina com pedaos de abacaxi slida?
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