Universidade Federal de Uberlândia

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

CURSO: Engenharia Biomédica
Profa. Ana Graci Brito Madurro

2022
 Breve Descrição do Curso Prático de Bioquímica

O curso consta de aulas teóricas, práticas e discussão de exercícios e casos clínicos.

As aulas teóricas cobrem todos os assuntos, mas não esgotam a matéria. Elas procuram
condensar um material que geralmente é muito extenso, introduzindo, orientando e
estimulando os alunos a procurar os livros texto recomendados.
As aulas práticas, além de demonstrarem alguns aspectos tidos como “teóricos” do curso,
procuram estimular a sua curiosidade e seu poder de observação que serão úteis na vida
profissional.

Organize seu período livre semanal para consultar livros na biblioteca, fazer exercícios e tirar
dúvidas com o professor.

Antes das aulas práticas leiam o roteiro e programem seu experimento.

- Ao iniciar uma experiência, verifique se a concentração da solução é dada em porcentagem,

molaridade ou normalidade.
- Verifique em que temperatura a experiência deverá ser executada e em que ordem, os
regentes serão adicionados.
- Após o uso, cada reagente deverá ser colocado em seu lugar, para que outro colega possa
utilizá-lo.
- Devem-se tomar alguns cuidados com os vidros de reagentes e as soluções nele contidas, a
fim de se evitar contaminações e estragos.
a) Não trocar as tampas;
b) Não introduzir pipetas nas soluções padrão (transferir um pouco da solução para um tubo e
depois pipetar);
c) Não devolver ao frasco original as soluções retiradas em excesso.

Material do estudante

Cada estudante deverá trazer para os trabalhos práticos:

a) Avental: Não será permitida a presença do aluno sem avental – Utilize aventais de algodão
b) Guia de laboratório: sem o qual o aluno não executará as experiências.
c) Caderno de protocolo (opcional): para anotações dos experimentos realizados.

Execução dos trabalhos práticos e limpeza

a) Para os trabalhos práticos, exige-se atenção, rigor técnico, responsabilidade e disciplina.
b) Para maior eficiência é necessário que o aluno seja pontual, assíduo, ordeiro e tenha o
prévio conhecimento teórico da prática executada.
c) Finalizados os trabalhos práticos, o aluno deverá proceder à limpeza de seu lugar e seu
material, deixando-o limpo e em condições de ser utilizado novamente.
d) A vidraria deve ser lavada após o seu uso.
Prevenção de acidentes:
a) Não é permitido fumar no laboratório;
b) Usar avental de algodão;
c) Não utilizar substâncias inflamáveis (álcool, éter, etc) nas proximidades de uma chama;
apague-a antes;
d) Ao abrir a torneira do bico de gás já ter a mão a chama com que vai acendê-lo;
e) Reagentes corrosivos e tóxicos concentrados não deverão ser pipetados e sim,
medidos com cilindros graduados;
f) Certifique-se do lugar onde se encontra o extintor de incêndio;
 g) Ao aquecer um tubo de ensaio, certifique-se de que a solução, ao sofrer um
superquecimento, não seja projetada na direção do seu rosto ou no rosto do seu
colega. Para evitar um superaquecimento da parte inferior da solução, agite-a
fortemente durante o aquecimento.

RELATÓRIOS DE AULAS PRÁTICAS

Toda aula prática será acompanhada obrigatoriamente da elaboração de um Relatório,
cujo prazo de entrega coincide sempre com a próxima aula prática ou a apresentação e
discussão de resultados, na forma de seminários.
O relatório é considerado a continuidade da própria aula; e aula prática não se encerra
quando o aluno deixa o laboratório, mas quando conclui seu relatório. Para efeitos do que se
exige na disciplina, sugerimos a seqüência abaixo:
ITEM CONTEÚDO

IDENTIFICAÇÃO
Nome:
Assunto:
Turma:
Data:
Demais dados de identificação:

INTRODUÇÃO Deverá cobrir aspectos teóricos do assunto objeto da aula prática. Na sua elaboração o
aluno deverá recorrer à literatura relativa ao assunto e discutir a teoria que envolve o
trabalho realizado em aula.

MATERIAL E MÉTODOS
Deverá conter a relação do material utilizado, bem como sua descrição sumária e
principais utilizações. Quando o material já foi usado em aula prática anterior, dispensa-
se essa descrição. Descrever sumariamente a metodologia, baseado geralmente no
roteiro de aulas fornecido. Cabe ao aluno desenvolver a capacidade de resumir a
metodologia, sem contudo comprometer o conteúdo das informações necessárias à
compreensão daquilo que foi realizado no laboratório.

RESULTADOS Devem ser apresentados, tanto quando possível, na forma de tabelas gráficos, quadros,
etc... sempre de forma a facilitar a rápida visualização do trabalho produzido durante os
experimentos.

DISCUSSÃO É, provavelmente, o ítem mais importante de um relatório. Aqui se discutem os

resultados obtidos, principalmente frente aos dados disponíveis na literatura pertinente,
objetivando-se uma conclusão final, onde o aluno poderá relacionar o aprendizado
obtido com a prática médica a ser vivenciada. Além da consulta sistemática à literatura,
poderá o aluno também dialogar com profissionais da área no sentido de compreender
o significado de cada resultado encontrado, bem como, a potencialidade e aplicação real
de cada metodologia executada.

BIBLIOGRAFIA Indicar corretamente a(s) fonte(s) de pesquisa utilizada. Relacionar sempre o autor, a
obra, a página e demais informações que permitam uma fácil consulta.

QUALQUER ACIDENTE COMUNICAR IMEDIATAMENTE COM O PROFESSOR

 Experimento 1

SOLUÇÃO TAMPÃO: PREPARAÇÃO E PROPRIEDADES

1. OBJETIVOS
Preparação de uma solução tampão e determinação de sua capacidade tamponante.

2. INTRODUÇÃO TEÓRICA
Uma solução-tampão consiste de um par ácido fraco/base conjugado que resiste a
variações no pH quando pequenas quantidades de ácidos ou bases lhe são adicionadas ou
quando ocorre diluição.
Os tampões têm um papel importante em processos químicos e bioquímicos, nos quais
é essencial a manutenção do pH. Assim, muitos processos industriais e fisiológicos requerem
um pH fixo para que determinada função seja desempenhada. Por exemplo, o sistema tampão
HCO3–/H2CO3 é importante fisiologicamente, uma vez que controla o transporte de CO2 no
sangue e o pH do mesmo.
Os cálculos de pH em sistemas tampões são realizados com o auxílio da equação de
Handerson-Hasselbach.

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Materiais e Reagentes:
Acetato de sódio;
Ácido acético;
Ácido Clorídrico (0,1 M);
Agitador Magnético;
Água destilada;
Barra magnética pequena;
Béquer de 20 e 200 mL;
Hidróxido de sódio (0,1 M);
Papel Absorvente;
Pipeta Graduada 10 mL;
Pipeta Pasteur;
Pipeta volumétrica de 25 mL;
Piceta; -
Potenciometro medidor de pH;
Soluções tampão pH 2,0. 7,0 e 9,0.

Procedimento
I. Calibrar o potenciometro com as soluções tampões de pH 2,0. 7,0 e 9,0.
A- Após cada calibração, lavar o eletrodo com água destilada. Tomar o devido cuidado, para
não tocar com as mãos a superfície do eletrodo e não permitir que a base do mesmo apoie no
fundo do béquer em que se está realizando a leitura.

II – Preparação da Solução Tampão Acetato pH 4,5.

Prepare 0,1 L de uma solução de acetato de sódio 0,1M. A esta solução, adicione ácido
acético concentrado (98,8% p/p, 1,05 g/cm3, 60,05g/mol), por gotejamento e sob agitação, até
que o valor de pH da solução atinja 4,5.

III - Determinação da capacidade tamponante da solução tampão acetato

III.1. Adição de ácido forte à solução tampão
A uma alíquota de 5 mL da solução tampão acetato preparada no item I, adicione 1 mL de HCl
0,1M.
Meça o pH da solução resultante.

III.1. Adição de base forte á solução tampão

A uma alíquota de 5 mL da solução tampão acetato preparada no item I, adicione 1 mL de
NaOH 0,1M.
Meça o pH da solução resultante.

IV – A uma alíquota de 5mL de água destilada, repita as etapas III.1 e III.2.

Tabela I – valores de pH para a solução tampão e água pura antes e após a adição de ácido ou
base fortes.

Solução Adição de HCl Adição de NaOH

Tampão acetato, pH inicial pH final pH pH inicial pH final pH
pH 4,5
Água destilada

Questões:
1) Com base nos resultados obtidos na tabela I, discuta o efeito da composição das soluções
sobre a capacidade tamponante.

2) A partir de uma amostra de Na2HPO4 (MM: 142) e NaH2PO4 (MM: 120), descreva a
preparação de 1 litro de tampão 0,1M, pH 7,4.
 Experimento 2

TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DE AMINOÁCIDOS

I- Objetivo: Determinar graficamente os pKs, PI e observar o efeito tampão de aminoácidos.

II- Introdução: Em geral os aminoácidos em solução, dissociam-se em meio ácido,

comportando-se como bases fracas e atuam como ânions em meio básico, podendo agir como
doadores e aceptores de prótons.

R-CH2-COO-
 (Forma ácida)
R-CH-COOH  R-CH-COO- NH2
 
NH2 NH3+
(Forma não (Zwetterion) R-CH2-COOH
dissociada)  (Forma básica)
NH3+

Substâncias que tem essa dupla propriedade são ditas anfotéricas (do grego
amphi=”ambos”. Este pronunciado caráter anfótero dos aminoácidos é transferido também
para peptídeos e proteínas, devido a existência em uma mesma molécula de grupos ácidos e
básicos.
Tanto a forma ácida como a forma básica de um aminoácido apresenta um pK
característico, que pode ser determinado experimentalmente através de titulação com ácido
ou uma base forte. Estas constantes podem ser identificadas através da curva de titulação,
pois nestes pontos a capacidade de tamponamento da solução é máxima.
Quando a dissociação do aminoácido dá origem a quantidades iguais de cargas
negativas e positivas no conjunto das moléculas, a espécie iônica que predominará é a do íon
duplo (“zwetterion”) que não apresenta carga elétrica líquida. O pH onde a concentração deste
íon é máxima chama-se ponto isoelétrico e na curva de titulação do aminoácido
correspondente ao ponto médio entre os dois valores de pH, referentes aos seus respectivos
pKs.

III- Parte Experimental

Materiais e Reagentes:
- Agitador Magnético
- Barra magnética pequena
- Béquer de 50 e 100 mL
- Bureta graduada de 25 mL
- Funil de Vidro pequeno
- Garra metálica para bureta
- Piceta
- Papel Absorvente
- Pipeta Graduada 10 mL
- Pipeta volumétrica de 25 mL
- Potenciômetro medidor de pH
- Suporte Universal
- Ácido Clorídrico (1 mol/L)
- Água destilada
- Alanina (0,02 mol/L)
- Hidróxido de sódio (0,1 mol/L)
- Soluções tampão pH 2,0. 7,0 e 9,0.

IV- Procedimento

Calibrar o potenciometro com as soluções tampões de pH 2,0. 7,0 e 9,0.

A- Após cada calibração, lavar o eletrodo com água destilada. Tomar o devido cuidado,
para não tocar com as mãos a superfície do eletrodo e não permitir que a base do
mesmo apoie no fundo do béquer em que se está realizando a leitura;
 B- Colocar 20 mL da solução de glicina em um frasco de erlenmeyer;
C- Adicionar 1,0 mL de ácido clorídrico 1mol/L;
D- Misturar por agitação e medir o pH, anotando-o no quadro abaixo;
Lavar o eletrodo com água destilada e secar com papel absorvente entre cada medida.
Não permitir que o eletrodo encoste a barra magnética. Proceder a leitura do pH desta
solução;
E- Adicionar 0,5 mL de hidróxido de sódio 0,1mol/L, misturar por agitação e medir o pH,
anotando o resultado no quadro abaixo,
F- Repetir o itens anteriores (E e F) até que o solução atinja um valor de pH=12.
G- Construir um gráfico de pHx volume de NaOH0,1 mol/L;
H- A partir da curva de titulação, determine os valores numéricos dos pKs, PI e as regiões
de tamponamento do aminoácido alanina.Compare-os com os valores da literatura.

Tabela I- Valores de volumes e pH obtidos na titulação da alanina

Volume de NaOH (mL) pH Volume de NaOH (mL) pH
0 6,5
0,5 7,0
1,0 7,5
1,5 8,0
2,0 8,5
2,5 9,0
3,0 9,5
3,5 10,0
4,0 10,5
4,5 11,0
5,0 11,5
5,5 12,0
6,0
 Experimento 3

PROPRIEDADES E REAÇÕES GERAIS DE CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

1) OBJETIVOS: Reconhecer algumas propriedades químicas e físicas das proteínas, utilizadas
em seu reconhecimento e sua análise qualitativa e quantitativa.
 Serão realizadas técnicas possíveis para a identificação de proteínas, através da reação
Xantoprotéica, reação do Biureto e as reações de precipitação e coagulação pela ação
do calor, para a identificação da albumina da clara do ovo.
2) INTRODUÇÃO: As proteínas são macromoléculas formadas por aminoácidos, unidos por
ligações peptídicas. Possuem uma ou mais cadeias polipeptídicas. De muitos tipos de
aminoácidos conhecidos, cerca de uns 20 constituem as proteínas, podendo existir em
quantidades e sequências muito variadas.

Os prótidos identificam-se através de duas reações características: a reação

xantoproteíca e a reação do biureto. Na reação xantoproteíca (xanto=amarelo), os prótidos em
presença de ácido nítrico concentrado a quente, forma-se um coágulo amarelo
(nitroproteínas) e em meio básico, um complexo, de coloração alaranjada. A reação do biureto
é muito utilizada para a determinação da concentração de proteínas em material biológico. Na
reação do biureto, depois de se neutralizar a proteína com soda cáustica (NaOH) e adicionando
algumas gotas de sulfato de cobre, observa-se a formação de flocos azuis de hidróxido de
cobre. Deixando repousar, os flocos depositam-se e o líquido sobrenadante adquire coloração
violeta devido à presença da proteína. É a fixação do cobre sobre as ligações peptídicas que
origina a formação de um complexo de cor violeta.

O R O R
... C C C C ...
NH H NH H
cor
violeta Cu2+
NH H NH H
...
C C C C ...
O R O R

MATERIAL:
 01 pinça para tubo de ensaio
  01 pipeta graduada de 05 mL
 01 pipeta graduada de 05 mL
 1 béquer de 250 mL
 Bico de gás
 Papel indicador
 Tubos de ensaio

REAGENTES:
 H2O destilada
 HCl a 2%
 HNO3 concentrado
 Leite
 Solução de albumina de ovo
 Solução de CuSO4 a 0,1%
 Solução de hidróxido de sódio a 10%
 Solução de hidróxido de sódio a 40%
 Solução de ninidrina a 0,1%
 Solução de protease peptona
 Solução saturada de CaCl2

MÉTODODOLOGIA:
EXPERIMENTO A
Reação do biureto:
 A reação do biureto caracteriza ligações peptídicas das proteínas.

1 - Adicionar a um tubo de ensaio 2 mL de albumina do ovo.

2 - Adicionar 2 mL de NaOH 10% e agitar.
3 - Adicionar 02 gotas de sulfato de cobre (CuSO4) a 0,1%. Agitar.
4 - Repetir a reação com uma solução de protease-peptona
 Interpretar os resultados.

EXPERIMENTO B
Reação xantoprotéica
 Reação de nitração com reagentes fenólicos presentes na cadeia lateral de alguns
aminoácidos constituintes das proteínas.
1 - Adicionar a um tubo de ensaio 1mL de HNO3.
2 - Adicionar cuidadosamente pelas paredes do tubo, 2 mL de solução de albumina do ovo.
Agitar vagarosamente até observar a formação de um precipitado branco.
3 - Aquecer a chama por alguns minutos, até a dissolução do precipitado. Observar a coloração
amarela da mistura.
4 - Adicionar NaOH a 40% até que a coloração amarela se intensifique e mude para alaranjado.
Esta reação é devido ao grupamento fenólico presente nas proteínas.
 Interpretar os resultados.

EXPERIMENTO C
Reação de ninidrina
 Reação de oxidação pela ninidrina, dos -aminoácidos componentes das proteínas.
1 - Adicionar a um tubo de ensaio, 3 ml de solução de albumina de ovo.
2 - Adicionar 2 mL de solução de ninidrina a 0,1%. Agitar.
3 - Aquecer a chama até a ebulição. Resfriar.
4 - Observar o aparecimento de coloração rosa, vermelho ou azul.
 Esta reação é própria de -aminoácidos presentes na estrutura das proteínas.
 Interpretar os resultados.

Experimento D
Precipitação de proteínas pelo calor:
 Em determinadas temperaturas, as proteínas se denaturam e precipitam.
1 - Adicionar os seguintes reagentes, a 4 tubos de ensaio:
Tubo 1: 5 mL de leite
Tubo 2: 5 mL de solução de protease-peptona
Tubo 3: 5 mL de solução de albumina de ovo
Tubo 4: 5 mL de solução de albumina de ovo  05 gotas de solução saturada de cloreto de
cálcio (CaCl2)
Aquecer os tubos em banho Maria à ebulição.
 Observar os resultados. Interprete os resultados.

EXPERIMENTO E
Precipitação isoelétrica de proteínas
 As proteínas quando levadas a um pH que corresponda ao seu PI, tornam-se insolúveis e se
precipitam.
1 - Adicionar a um béquer de 250 mL, 25 mL de leite.
2 - Aquecer a água destilada até aproximadamente 50C
3 - Adicionar 25 mL de água aquecida ao béquer contendo leite
4 - Adicionar HCl a 2% gota a gota e com agitação constante até que o leite se coagule,
5 - Medir o pH da solução com papel indicador.
 Observar o resultado e interpretar.

Questões:
1) Explique o processo de desnaturação da proteína ovoalbumina.
2) Quais os aminoácidos estão envolvidos na reação com a ninidrina na ovoalbumina?
3) Quais os aminoácidos estão envolvidos na reação de xantoproteínas da ovoalbumina?
4) Explique a base do método da reação do Biureto.
5) Comente sobre outras técnicas de identificação de proteínas.
 Experimento 4
AULA PRÁTICA: PROPRIEDADE DE ENZIMAS
1-OBJETIVOS:
- Manipular experimentalmente soluções de enzimas.
- Observar experimentalmente algumas propriedades de enzimas.

2 – INTRODUÇÃO
Enzimas representam a maior classe de proteínas, e são classificadas como proteínas
globulares. O poder de catálise das enzimas é extraordinário, o que as tornam essenciais a
todos os processos biológicos. As enzimas apresentam elevada especificidade pelo substrato e
um amplo espectro de aplicações nas indústrias de alimentos, farmacêuticas e em laboratórios
clínicos.

Bromelina é uma enzima proteolítica ou protease, obtida no caule da planta do

abacaxi. Essa enzima tem ação similar as proteases cisteínicas de mamíferos como as
catepsinas B e L e as calpaínas. São amaciantes vegetais, bem como a papaína do mamão, a
ficina do fígado e a bromelina do abacaxi. Essas enzimas tem a propriedade de degradar não só
as proteínas miofibrilares como também apresentam uma atividade colagenolítica elevada .

Estrutura da papaína (Storer& Ménard, 1994). Os principais

resíduos do sítio catalítico estão assinalados. Bromelinas e
papaínas pertencem a classe de cisteíno-proteinases.

3. Enzimas:
a- Bromelina – Suco de abacaxi fresco diluído com 2 volumes (m/v) de água destilada.
Acertar o pH para 8,0 com NaOH.
b- Sacarase – Fermento biológico para pão 3% em água destilada.
 Amilase salivar: Saliva colhida de um componente do grupo pelo seguinte
procedimento: 
Lavar bem a boca com água e colocar em um chumaço de algodão sob a língua.
Quando o algodão estiver embebido de saliva, remove-lo e espremer para coletar  0,5
mL de saliva livre de espuma.
Diluir a saliva 10 vezes com água destilada (Ex. 0,5 mL de saliva + 4,5 mL de água)
Atenção: Solicitamos que somente o doador de saliva manipule a solução de amilase
salivar.

4. Reagentes
Substratos: Gelatina comercial 5%, sacarose 3%, amido 2% (soluções em água destilada).
Inibidor de bromelina: Lugol diluído (0,1 g de iodo metálico e 0,2 gramas de Iodeto de
Potássio em 100 mL de álcool.
 Desinibidor da bromelina frente ao iodo metálico: Cisteína 0,1% em água destilada.
Outros: Reagente de Benedict: 17,3 gramas de sulfato de cobre, 173 gramas de citrato de
sódio e 100 gramas de carbonato de sódio anidro, dissolvidos em 1,0 L de água.

5. EXPERIMENTOS:
A. Enzimas proteolíticas
As ligações peptídicas podem ser hidrolisadas quimicamente em condições drásticas
(Ex. HCl 6N ou NaOH 6N a 100 C por mais de 12 horas) ou por grupos de enzimas
denominadas enzimas proteolíticas (proteinases) ou proteases. De acordo com o sítio de
clivagem, estas enzimas podem ser clasificadas em dois grandes grupos: As exopeptidases,
que hidrolisam as ligações peptídicas terminais e endopeptidades, que hidrolisam
preferencialmente as ligações no interior das cadeias polipeptídicas. As enzimas
proteolíticas ainda podem ser classificadas de acordo com as características do sítio ativo
(Ex. Tiol proteinases, que contém enxofre. Serinoproteases que contém serina,
metaloproteinases, que contém metais (etc...) e esses grupos reativos podem ser inativados
pela ação de inibidores específicos e não específicos.

EXPERIMENTO 1
Proteólise da gelatina por bromelina e termoestabilidade da bromelina
Pipetar cerca de 2mL da solução de bromelina num tubo de ensaio e aquecer em banho
maria fervente por 5 minutos. Esfriar a solução em água corrente.

Tubos Gelatina 5%, mL Água, mL Bromelina, mL

1 3,0 1,0 -
2 3,0 - 1,0
3 3,0 1,0 1,0 (fervida)

Misturar bem e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos e colocar os tubos

em banho de gelo por cerca de 10 minutos (até o conteúdo do tubo 1 solidificar).
Observar e analisar os resultados.

EXPERIMENTO 2
Inibição da bromelina por iodo metálico (I2)
Tubos Água destilada, mL Lugol, mL Cisteína, mL Mistura bem Bromelina, mL
e
1 1,0 - pré-incubar 1,0
2 0,5 0,5 - 5 min a tem- 1,0
3 - 0,5 0,5 peratura 1,0
4 1,0 0,5 0,5 ambiente 1,0

Misturar bem e, novamente, pré-incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.

Posteriormente, adicionar 3,0 mL de gelatina 5% em todos os tubos. Incubar à
temperatura ambiente por 5 minutos e colocar os tubos em banho de gelo por cerca de 10
minutos. Observar e analisar os resultados.

B- Enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas.

Quimicamente os açucares simples ou monossacarídeos são definidos como
poliidroxialdeídos (Ex. glicoses) ou poliidroxicetonas (Ex. frutose).
 Uma das propriedades dos monossacarídeos é a capacidade redutora, que envolve a
carbonila (C=O) da função aldeído ou cetona livre. A capacidade redutora dos açucares
pode ser detectado pela reação de Benedict que contém íon cúprico. Na presença de
açucares redutores, o íon cúprico (Cu+2) é convertido em íon cuproso (Cu+) e esta mudança
no estado de oxidação do cobre resulta na mudança da coloração do reagente específico
(reagente de Benedict).
Dois ou mais monossacarídeos podem se ligar de diversas maneiras, por ligações
denominadas glicosídicas. Na molécula de sacarose (açúcar da cana), uma molécula de
glicose está ligada a uma molécula de frutose através das respectivas carbonilas, de modo
que este dissacarídeo não tem poder redutor. A ligação glicosídica presente na molécula
de sacarose (dissacaridase específica) liberando glicose e frutose.
O amido é um polímero constituído por inúmeros resíduos de glicose com o terminal
redutor bloqueado quimicamente. A amilase salivar é uma endoglucanase que hidrolisa
grande parte das ligações glicosídicas entre as moléculas de glicose na molécula de amido,
liberando dextrinas (oligossacarídeos de tamanhos variados), maltose (dissacarídeo),
isomaltose (dissacarídeo) e eventualmente glicose, e estes produtos de baixo pesos
moleculares apresentam um terminal redutor por molécula.

EXPERIMENTO 3 – Especificidade da sacarase e da amilase salivar

Tubo Sacarose, mL Amido, mL Sacarase, mL Amilase, mL
1 1,0 - 1,0 -
2 - 1,0 1,0 -
3 1,0 - - 1,0
4 - 1,0 - 1,0

Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. Adicionar 1,0 mL de reagente de Benedict

em cada um dos tubos e coloca-los em banho maria fervente de 1 a 2 minutos. Observar o
aparecimento ou não de precipitado com coloração alaranjada. Teste positivo para a presença
de açúcar redutor. Analisar os resultados.

EXPERIMENTO 4 – Influência da concentração de enzima (sacarase)

Tubo Sacarase, mL Agua destilada, Sacarose, mL
mL
1 0,2 0,8 1,0
2 0,5 0,5 1,0
3 1,0 - 1,0

Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. Adicionar 1,0 mL de reagente de Benedict

em cada um dos tubos e colocá-los em banho maria fervente por 1 minuto e observar o
aparecimento ou não da cor alaranjada. Analisar os resultados. Deixar em banho Maria por
mais 1 minuto. Observar e analisar os resultados.

EXPERIMENTO 5 – Montar o protocolo e executar um experimento para testar a

termolabilidade da sacarase.
_______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

Tubo Sacarose, mL Agua destilada, Sacarase, mL

mL
1
 2

8 – Exercícios:
1. A bromelina é uma tiolproteinase. Qual o resíduo de aminoácido que caracteriza o sítio
dessa classe de enzimas?
2. Porque a gelatina hidrolisada por enzimas proteolíticas não gelifica?
3. Porque as enzimas podem perder a atividade quando fervidas? Em geral, em qual
temperatura as enzimas começam a perder atividade?
4. Como a desnaturação está relacionada com a perda da atividade catalítica?
5. Admitindo que o grupo tenha realizado o experimento realizado no protocolo que se segue?
Tubos Gelatina, mL Água HCl, 1,2 M Bromelina Pepsina 2% Resultado
destilada, mL
1 3,0 1,0 - 1,0 - líquido
2 3,0 - 1,0 1,0 - sólido
3 3,0 1,0 - - 1,0 sólido
4 3,0 - 1,0 - 1,0 líquido
Analisar e discutir os resultados apresentados.
6. Definir faixa de pH ótimo de uma enzima? Qual a sua relação com a estrutura do sítio ativo?
7. O iodo é capaz de oxidar os grupos –SH de proteínas. Porque a atividade da bromelina é
inibida pelo I2.
8. No experimento 2 foram feitas duas pré-incubações e uma incubação. Quais as respectivas
finalidades?
9. Não só o iodo, outros halogênios como o Cl são capazes de oxidar os grupos –SH. Qual a
base bioquímica para se utilizar hipoclorito de sódio ou álcool iodado como desinfetante?
10. No experimento 3 é possível constatar que a sacarose e o amido são açucares não
redutores. Em quais tubos?
11. Ainda no experimento 3 é possível afirmar que as soluções de sacarase e amilase utilizadas
não apresentam componentes que reduzem o cobre do reagente de Benedict? Justifique.
12. A papaína e a bromelina são enzimas proteolíticas presentes no mamão e abacaxi
respectivamente. Qual o princípio bioquímico envolvido no uso de casca de mamão ou abacaxi
para amaciar carnes?
13. A sacarase é termolábil? Foi comprovado?
14. As enzimas digestivas de origem pancreática apresentam pH ótimo em torno de 8,0.
Sabendo-se que o pH intraestomacal é ácido, pergunta-se:Qual a importância do bicarbonato
(HCO3-) presente em alta concentração na secreção pancreática?
15. As sulfas são antibióticos por inibirem a uma das enzimas microbianas responsáveis pela
biossíntese do ácido fólico(vitamina). Essa enzima requer p-aminobenzoato como substrato, e
as sulfas apresentam semelhanças estruturais com o p-aminobenzoato. Que tipo de inibidor
são as sulfas?
16. Foi observado algum resultado não esperado? Caso positivo, cite-o (s) e apresente uma
possível explicação.
 Experimento 5

ROTEIRO DE AULA PRÁTICA – Carboidratos

Introdução: Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na natureza, apresentam

como fórmula geral: [C(H2O)]n, daí o nome "carboidrato", ou "hidratos de carbono".
Apresentam como funções: fontes de energia, reserva de energia, estrutural, matéria-prima
para a biossíntese de outras biomoléculas. Podem ser classificados de acordo com seu
tamanho, conseqüentemente, complexidade de sua cadeia em monossacarídeos,
polissacarídeos e oligossacarídeos.

Objetivos: Mostrar que os monossacarídeos (aldoses e cetoses) ou substâncias, que por

hidrólise neles se transformem, podem reduzir íons cúpricos (Cu+2) a íons cuprosos (Cu+1)
resultando em uma mistura de acúcares ácidos. Os acúcares capazes de reduzir tais agentes
são denominados acúcares redutores. Já as reações com o iodo são importantes na
identificação qualitativa de carboidratos.

Parte Experimental:
1. Reação com o reativo de Fehling (para açúcares redutores):
Prepare sete tubos de ensaio contendo as seguintes soluções aquosas:
Tubo Água Glicose Frutose Maltos Lactose Sacarose Amido Reativo Resultados
destilada 0,1 M 0,1 M e 0,1 M 0,1 M 1% Fehling
(branco) 0,1 M Banho
1 1 mL 2 mL Maria
2 1 mL 2 mL fervent
3 1 mL 2 mL e por 10
4 1 mL 2 mL min.
5 1 mL 2 mL
6 1 mL 2 mL
7 1 mL 2 mL
O reativo de Fehling deverá ser recém-preparado.
Preparo do reativo de Fehling: em um béquer de 50 mL coloque 10 mL da solução A e 10,0 mL
da solução B. Homogeneíze.

2. Hidrólise da sacarose:
Coloque em um tubo de ensaio 5,0 mL da solução aquosa de sacarose (0,1 mol.L-1) e
adicione 1,0 mL de ácido clorídrico 1,0 M.
Coloque o tubo de ensaio durante 5 minutos em banho maria fervente. Retire-o do
banho, resfrie e alcalinize com 2 ou 3 gotas de hidróxido de sódio a 6 M. Acompanhe a
alcalinização com o papel de tornassol vermelho que ficará azul.
Adicione 2mL do reativo de Fehling (preparado anteriormente). Coloque-o novamente
em banho-maria fervente por um minuto.
 O que ocorre? Conclua.

3. Reação de Benedict (para ácucares redutores)

Prepare 5 tubos de ensaio com as seguintes soluções:
Tubo Água Glicose Frutose Sacarose Sacarose Amido Reativo Resultados
 destilada 0,1 M 0,1 M 0,1 M Invertida* 1% Benedict
(branco) 0,1 M Banho
1 1 mL 1,5 mL Maria
2 1,5 mL 1,5 mL por 5
3 1,5 mL 1,5 mL minutos
4 1,5 mL 1,5 mL
5 1,5 mL 1,5 mL
1,5 mL 1,5 mL
* Coloque 1,5 mL da solução de sacarose (0,1 M), adicione 1,0mL de HCl (1 M), deixe por 3
minutos em banho maria.

 O que ocorre? Explique.

4. Reação de Schiff (distinção entre glicose e frutose)

Em solução a glicose sofre mutarrotação e as formas da cadeia aberta, -D-glicose e -
D-glicose encontram-se em equilíbrio. A concentração da cadeia aberta é muito pequena no
equilíbrio. O reativo de Schiff requer uma quantidade relativamente alta de grupo aldeído
livre, para ocorrer. Por isso, o teste de Schiff é utilizado na distinção entre glicose e frutose.
Em um tubo de ensaio coloque 5,0 mL de solução de glicose (0,1 mol.L-1) e em outro
5,0 mL de solução de frutose (0,1 mol.L-1); em um terceiro tubo coloque 5,0 mL de água
destilada (branco) .
Adicione a cada um deles 3,0 mL do reativo de Schiff.
 Observe. O que ocorre? Explique a reação em questão.

5. Coloração de amido por iodo metálico e hidrólise enzimática do amido

Princípio: os homopolissacarídeos de glicose com ligação glicosídica (14) formam
complexos de coloração variável (glicogênio: parda; amido: azul escuro, dextrinas;
avermelhadas). Supõe-se que a cor seja devida a complexação e deposição de iodo na cadeia
espiralada destes polissacarídeos. O calor (80oC) pode cindir reversivelmente o complexo
tornando a solução incolor.
Tubo Glicose Maltos Amido Água Amilase Lugol Resultados
0,1 M e 1% destilada
0,1 M (branco)
1 1 mL 1 mL 3 gotas
2 1 mL 1 mL 3 gotas
3 2 mL 3 gotas
4 1 mL 1 mL 3 gotas
5 1 mL 1 mL 3 gotas

Aquecer a solução com resultado positivo diretamente na chama (bico de Bunsen) e observar
o desaparecimento da cor azul. Em seguida resfriar a solução em água corrente (torneira) e
observar o reaparecimento de cor azul.

6. Distinção entre glicose e frutose a partir do lugol

Prepare os tubos de ensaio com as seguintes soluções:
Tubo Água destilada Glicose Frutose Lugol/KOH*
(branco) 0,1 M 0,1 M
1 5 mL 2 mL
2 5 mL 2 mL
3 5 mL 2 mL
* Coloque 5mL da solução de lugol a adicione 2 mL da solução de hidróxido de potássio a 5%
(coloração amarelo ouro). Agite. Coloque em banho-maria fervente e deixe aquecer por cinco
minutos.

Observe atentamente o que ocorre.

Preparo das soluções usadas nos experimentos:

Solução A:

Sulfato de cobre (CuSO4.5H2O).......................................................................35,0 gramas

Ácido sulfúrico (H2SO4)......................................................................................2,7 mL

Água destilada (q.s.p)........................................................................................1000 mL

Solução B:

Tartarato duplo de sódio e potássio (sal de Rochelle)...........................................150 gramas

Hidróxido de sódio a 40% ......................................................................................300 mL

Água destilada (q.s.p).............................................................................................1000 mL

Reativo de Benedict:

Sulfato de cobre (CuSO4.5H2O).....................................................................17,3 gramas

Citrato de sódio........................................................................................................173 gramas

Carbonato de sódio anidro.......................................................................................100 gramas

Água destilada (q.s.p).............................................................................................1000 mL

Reativo de Schiff:

Dissolver 0,1 gramas de fucsina em 60 mL de água destilada quente. Deixar esfriar e adicionar
solução de sulfito de sódio anidro (1,0 grama em 9,0 mL de água destilada) e 1,0 mL de ácido
clorídrico concentrado. Em seguida diluir com água destilada e completar o volume até 100
mL. Usa-se esta solução após cinco horas de decantação.

Solução de amido 1%

Dissolver 1,0 grama de amido em 100mL de água destilada e sob agitação aquecer até a
ebulição. Esfriar até atingir a temperatura ambiente.

Solução de lugol:
Iodo metálico..............................................................................................................5,0 gramas

Iodeto de potássio....................................................................................................10,0 gramas

Água destilada q.s.p.........................................................................................................200 mL

Nota: Aldeídos e cetonas apresentam reatividade diferente para oxidações brandas. Aldeídos
sofrem oxidações brandas e cetonas não. Extretanto cetoses podem sofrer reações de
oxidação devido a interconversão entre cetoses e aldoses passando pela forma enólica
(instável). Álcalis favorecem a ocorrência deste equilíbrio dinâmico devido ao rearranjo que
provoca em torno do grupo funcional.

D-frutose  forma enólica  D-glicose

Questões:
1) A celulose e amido são polissacarídeos que apresentam a mesma unidade de composição.
Qual é a fórmula estrutural destes compostos? O que difere um do outro?
2) Qual a diferença estrutural básica entre a glicose e a frutose?
3) Escreva a fórmula estrutural básica dos dois açúcares em questão e diga que tipo de
isômeros são.
4) o que é um açúcar invertido?
5) Ao degustarmos um pedaço de pão salgado, em poucos minutos percebemos que o sabor
salgado é substituído pelo sabor adocicado. Sugira uma possível explicação para o sabor doce.
6) Pacientes portadores de galactosemia, diabetes melito e frutosemia podem apresentar
excreção urinária de galactose, glicose e frutose, respectivamente. Os testes laboratoriais
baseados na redução do cobre (Ex: Reação de Benedict) se prestam para identificar o açúcar
excretado na urina.
 Experimento 6

ROTEIRO DE AULA PRÁTICA – Lipídios

Introdução: Lipídios podem ser caracterizados através de suas propriedades físico-químicas.

Em geral são insolúveis em água e solúveis em solventes apolares ou de baixa polaridade. Em
geral são insolúveis em água e solúveis em solventes de baixa polaridade.

Objetivos: Reconhecer algumas propriedades químicas e físicas dos lipídios.

Reagentes:
- Ácido acético (C2:0), ácido oléico(C18:1), ácido esteárico (C18:0)
- Óleo de soja (TAGs) e margarina
- Solução alcoólica de NaOH
- NaCl saturado
- HCl 2M
- Solução de lugol
- Amido 2%

Parte Experimental:

1. Características físicas dos ácidos graxos e solubilidade em água

A maioria dos ácidos graxos encontrados na natureza tem número par, podendo ser
saturados ou insaturados, hidroxilados ou ramificados. Os saturados com poucos carbonos
como o ácido acético são líquidos a temperatura ambiente, voláteis com odor característico;
os que apresentam mais de 10 carbonos são sólidos a temperatura ambiente, apresentam
aspecto de cera e são praticamente inodoros. Já os insaturados, mesmo com mais de 10
carbonos são líquidos a temperatura ambiente.

Tubo Ac. Ac. Ac. esteárico Estado físico e Água Solubilidade

acético oléico odor
1 5 gotas 1 mL
2 5 gotas 1 mL
3 Fragmentos 1 mL

2. Saponificação de triacilgliceróis

As ligações do tipo éster presente na estrutura dos TAGs podem ser hidrolisados pela
ação de vários agentes, incluindo enzimas (lípases), ácidos graxos e bases fortes, vapor de água
super aquecido. A hidrólise por bases é denominada saponificação, pois o ácido graxo livre
combina-se com o álcali formando sabão (sais de ácidos graxos). Na prática podemos usar
solução alcoólica de hidróxido de sódio ou potássio, pois o álcool solubilizando as gorduras,
aumenta a superfície de contato entre os reagentes e a hidrólise é mais rápida e eficiente.
Quando se utiliza hidróxido de sódio (NaOH) o sabão resultante apresenta consistência mais
sólida em comparação com o sabão de potássio (“sabão mole”).
7
Tubo Óleo de NaOH em Ferver em banho maria até Água
soja álcool obter uma mistura homogênea Agitar e observar a
1 20 gotas 2mL 3 mL formação de espuma

3. Propriedades dos sabões (sabão do experimento anterior diluído 5 vezes)

Tubo Sabão dilúido HCl 2M NaCl saturado Água
1 1 mL 1 mL Agitar e observar as propriedades
2 1 mL 1 mL
3 1 mL 1 mL

4. Identificação da presença de ácidos graxos insaturados:

Esta reação é usada para investigar a presença de ácidos graxos insaturados ou
determinar o grau de insaturação das gorduras e óleos. Os ácidos graxos insaturados podem
fixar halogênios nas suas ligações duplas, havendo a adição de dois átomos do halogênio na
ligação dupla presente no ácido graxo. A incorporação do iodo ao ácido graxo pode ser
determinada pelo teste com amido. O iodo ligado ao ácido graxo é incapaz de reagir com o
amido. A adição do iodo a um ácido graxo saturado resultará na presença de todo o iodo livre
que poderá, então, reagir com o amido adicionado, produzindo a coloração azul característica.
A adição de iodo a um ácido graxo não saturado provocará adição de iodo nas duplas ligações
do ácido graxo, impedindo a presença do iodo livre que produziria a reação azul com o amido.
Este dado deverá ser interpretado com cautela, pois a adição de uma quantidade de iodo livre
que ultrapasse a capacidade de fixação por um ácido graxo insaturado também ocasionará a
presença de iodo livre.

Tubo Óleo de soja margarina lugol Aquecer em banho Amido 2% Resultado

1 2 mL 6 gotas Maria por cerca de 10 3 gotas
2 ~2 mL 6 gotas min* 3 gotas
3 6 gotas 3 gotas
* Após o aquecimento, aguardar o resfriamento dos tubos em temperatura ambiente antes de
adicionar as gotas de amido. O aparecimento de coloração azul indica reação entre o iodo e o
amido.

Exercícios:
1. Na saponificação os TAGs são convertidos em sais de ácidos graxos. Mostre estruturalmente
a reação que ocorre quando os TAGs estão na presença de base forte (NaOH).
2. Como os sabões ou detergentes atuam para remover os óleos e gorduras (TAGs)? Á água é
necessária nesse processo?
3. Que reação química ocorre com os sabões após a adição de HCl? Sabe-se que o pKa médio
dos ácidos graxos é próximo de 4,8.
 Experimento 7
ROTEIRO DE AULA PRÁTICA – Determinação quantitativa de glicose

Introdução:
Vários métodos são utilizados para a dosagem de glicose em líquidos biológicos. Os
autoanalisadores utilizam métodos extremamente precisos (método de Hoffman, do
ferricianeto) mas de difícil execução manual. Os métodos clássicos de dosagem da glicemia
correspondem ao da orto-toluidina e da glicose-oxidase, onde a normalidade encontra-se
entre valores de 70 a 110 mg/dl. Um aumento na concentração de glicose circulante pode
estar relacionado à predisposição para diabetes.
Este método baseia-se na condensação (a 100oC) da orto-toluidina com o grupamento
aldeídico da glicose formando uma mistura em equilíbrio de glicosilamina e a base de Schiff
correspondentes (um cromogênio verde). A intensidade da coloração é proporcional à
concentração da glicose presente no soro ou plasma, seguindo, portanto, a Lei de Lambert-
Beer, possibilitando a determinação da absorvância máxima em 630 nm.

Objetivo: Elaboração da Curva de Calibração e Determinação da glicemia

Material e Reagentes:
Material: a) 1 pipeta automática de 50 µL; b) 12 ponteiras; c) 1 pipeta volumétrica de 3mL; d) 1
sistema para banho maria fervente (caneca de alumínio, tripé e tela de amianto); e) 12 tubos
de ensaio limpos e secos f) 2 cuvetas de vidro, f) espectrofotômetro.

Reagentes: a) reagente cromogênico; b) solução de ácido benzóico a 0,25% em água

deionizada; c) solução estoque de glicose a 1g/dL-1 de a 0,25%; d) soluções padrão de glicose a
50 (P50), 100 (P100), 150 (P150), 200 (P200), 250 (P250), 300 (P300) mg.dL-1 em ácido
benzóico a 0,25%.

Parte Experimental:
Prepare os tubos abaixo, seguindo os dados da tabela:
Tubo Reagente Ácido Padrões Amostras Abs Glicose
Cromogênico benzóico (µL) de plasmas (630 nm)*
(mL) 0,25% (µL)
(µL)
Branco 3 50 - Incubação 0
P50 3 50 em banho 50
P100 3 50 fervente 100
P150 3 50 durante 10 150
P200 3 50 minutos. A 200
P250 3 50 seguir 250
P300 3 50 resfriá-los 300
A0 3 50 sob água
A30 3 50 corrente
A90 3 50
A120 3 50
B0 3 50
B3 3 50
B90 3 50
B120 3 50
* A leitura deverá ser realizada contra o branco
A e B se referem às amostras de plasma de pacientes A e B no tempo 0 (sob jejum) a após 30,
90 e 120 minutos da ingestão da solução padrão de glicose.

Curva padrão e testes a serem realizados consecutivamente:

Construir o gráfico da absorbância a 630 nm em função da concentração de glicose a

partir dos valores obtidos no experimento acima;
Determinar a equação da reta de regressão linear que melhor se ajuste aos pontos
experimentais,
Determinar à glicemia do paciente nos diferentes momentos do teste de tolerância a
glicose por interpolação gráfica, na reta-padrão obtida,
Construir a curva glicêmica do paciente.

PREPARO DOS REAGENTES

A- Reagente Cromogênico: dissolver 9,5 g de borato de sódio com 50 mL de água destilada a

56oC; adicionar 1,5 g de tiouréia; misturar com 800 mL de ácido acético glacial; adicionar 80
mL de ortotoluidina; completar o volume para 1000mL com água deionizada.
B- Ácido benzóico a 0,25%: dissolver 2,5 g de ácido benzóico em 900 mL de água deionizada;
completar o volume para 100 mL de água deionizada.
C- Solução estoque de glicose a 1000 mg/100 mL de ácido benzóico a 0,25%: pesar 1g de
glicose anidra e colocar dentro de um balão volumétrico de 100 mL, adicionar ácido benzóico a
0,25% em quantidade suficiente para dissolver a glicose e a seguir, completar o volume para
100 mL também com ácido benzóico a 0,25%.

D- Soluções padrão de glicose:

1- P50 (50 mg/100 mL): 0,5mL C + 9,5mL de B
2- P100 (100 mg/100 mL): 1,0mL C + 9,0 mL de B
3- P150 (150 mg/100 mL): 1,5mL C + 8,5mL de B
4- P200 (200 mg/100 mL): 2,0mL C + 8,0 mL de B
5- P250 (250 mg/100 mL): 2,5mL C + 7,5 mL de B
6- P300 (300 mg/100 mL): 3,0 mL C + 7,0 mL de B

D- Soluções Amostra de glicose (para simular plasma sanguíneo humano):

1- Série normal:
A0 (90 mg/100 mL): 0,9 mL C + 9,1 mL de B
A30 (150 mg/100 mL): 1,5 mL C + 8,5 mL de B
A90 (120 mg/100mL): 1,2 mL C + 8,8 mL de B
A120 (100 mg/100 mL): 1,0 mL C + 9,0 mL de B

2- Série diabética

B0 (120 mg/100 mL): 1,2 mL C + 8,8 mL de B

B30 (240 mg/100 mL): 2,4 mL C + 7,6 mL de B
B90 (250 mg/100mL): 2,5 mL C + 7,5 mL de B
B120 (200 mg/100 mL): 2,0 mL C + 8,0 mL de B

NOTAS
a. A urina e o líquor podem seguir a metodologia direta para o soro ou plasma.
b. A hemoglobina até 350 mg/dl e a bilirrubina até 20 mg/dl não interferem no método sem
desproteinização. Quantidades maiores dão erros positivos.
c. A lactose e a galactose, presentes em casos de gravidez e durante a lactação ou em casos
raros de galactosemia infantil, podem reagir com a ortotoluidina, manose também.
d. É importante o uso de ortotoluidina, a mais incolor possível. A adição de tiouréia como
antioxidante confere ao reativo uma cor ligeiramente amarelada. A absorbância desta solução
frente a um branco de ácido acético não deve ser superior a 0,015
e. É recomendável não desproteinizar com ácido perclórico. O resfriamento, em água muita
fria, pode provocar turvação.
f. A reação segue a lei de Beer até 1.500 mg/dl. Quando os valores forem maiores que 300
mg/dl, diluir a solução final com reativo de cor, efetuar novamente as leituras e calcular,
multiplicando o resultado final pelo fator de diluição, até 1.500 mg/dl.
g. Somente os métodos do ortotoluidina e da hexoquinase fornecem resultados exatos para a
glicose urinária, em concentrações inferiores a 0,2 g/dl.

VALORES DE REFERÊNCIA
Soro e plasma – 70 a 110 mg/dL
Sangue total – 60 a 100 mg/dL
Líquor – 40 a 70 mg/dL
Urina – até 30 mg/dL ou até 0,25 g/24 horas.
 Experimento 8

Experiemnto 9: ROTEIRO DE AULA PRÁTICA – Colesterolemia: determinação quantitativa do

colesterol

O colesterol é um esterol pertencente a classe de esteróis, classificados como lipídios.

É sintetizado metabolicamente e também é obtido da dieta. Quando há um aumento em sua
concentração metabólica, favorece a formação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL).
Estas lipoproteínas tendem a se depositar na parede das artérias conduzindo a aterosclerose.
Princípio do método: o anidrido acético condensa-se com a hidroxila do colesterol
originando o éster correspondente. Se o esterol original tem uma insaturação na molécula,
ocorre uma desidratação pela ação do ácido sulfúrico concentrado, com a formação de um
produto corado. Através da dupla ligação entre C5 e C6, o colesterol reage com o reagente de
Lieberman Burchard (anidrido acético, ácido acético e ácido sulfúrico), formando um produto
corado. A intensidade da cor do produto corado é proporcional a concentração do colesterol
total (livre e esterificado) presente na amostra.

Objetivo: Nesta aula prática determinaremos a quantidade ou concentração de

colesterol no plasma pela reação de Lieberman Burchard (método de Huang).

Material e Equipamento:
a) 1 pipeta automática de 100 µL e 15 ponteiras; b) 01 pipeta de 5 mL e 1 pipetador
automático; c) 1 banho-maria a 37oC com tampa; d) 10 tubos de ensaio limpos e secos; e) 01
colorímetro ou espectrofotômetro; f) 1 par de cubetas de vidro.

Reagentes:
1- Reativo cromogênico
2- Solução-estoque de 400mg de colesterol em 100 mL de ácido acético glacial
3 – Soluções padrão de colesterol em ácido acético glacial: P100 (100 mg.dL-1), P200 (200
mg.dL-1), P300 (300 mg.dL-1), P400 (400 mg.dL-1).
4 – Ácido acético glacial.

Parte Experimental:
Prepare os tubos abaixo, de acordo com os dados da tabela:
Tubo Reagente Padrões Amostras Ácido Abs Colesterol
cromogênico (µL) (µL) acético (410 mg.dL-1
(mL) (µL) Agitar os nm)*
tubos e
Branco 5 - - 100 incubá-los 0
P100 5 100 - - durante 15 100
P200 5 100 - - min a 37oC 200
P300 5 100 - - em banho 300
P400 5 100 - - tampado 400
Paciente A 5 - 100 -
Paciente B 5 - 100 -
* A leitura deverá ser realizada contra o branco

Resultados:

1- Plotar a absorvância em 410 nm contra as concentrações de colesterol dos padrões, e

traçar a reta de regressão linear que melhor se ajuste aos pontos experimentais;
2- Por meio de interpolações na reta anterior, determinar a concentração de colesterol
existente nos 100 µL de soro dos pacientes A e B.

PREPARO DOS REAGENTES

A- Reagente Cromogênico: colocar 150 mL de anidrido acético PA em um erlenmeyer de 1

litro; adicionar 75 mL de ácido acético glacial PA; misturar e colocar o erlenmeyer em um
banho de gelo-água durante 90 minutos; sob agitação, adicionar 27,5 mL de ácido sulfúrico
concentrado PA; deixar em repouso no banho de gelo-água por mais 30 minutos; transferir
para vidro âmbar; adicionar 5g de sulfato de sódio anidro e agitar até que ele se dissolva;
armazenar a 4oC).

B- Solução-estoque de colesterol: 400mg de colesterol em 100 mL de ácido acético glacial

(400 mg de colesterol de elevado grau de pureza, transferi-lo para um balão volumétrico de
100 mL, adicionar 80 mL de ácido acético glacial, incubar em banho-maria a 37oC durante 12
horas, agitando periodicamente, completar o volume para 100 mL com ácido acético glacial,
conservar à temperatura ambiente.

C- Soluções padrão de colesterol em ácido acético glacial:

1) P100 (100 mg/ 100 mL): 2,5 mL C + 7,5 mL B

2) P200 (200 mg/ 100 mL): 5,0 mL C + 5,0 mL B

3) P300 (300 mg/ 100 mL): 7,5 mL C + 2,5 mL B

4) P400 (400 mg/ 100 mL): 10 mL C

Soluções amostras de colesterol (para simular soro sanguíneo):

1) Paciente A: P200
2) Paciente B: P400