Diagnóstico Laboratorial

das
HEMOGLOBINOPATIAS
Métodos Laboratoriais para
diagnóstico das
hemoglobinopatias.
 Métodos Laboratoriais para diagnóstico
das hemoglobinopatias.

• O diagnóstico dos distúrbios da hemoglobina requer,

normalmente, uma combinação de métodos de
diagnóstico.
• Os testes laboratoriais de rotina apenas indicam as
características bioquímicas da hemoglobina, não
permitindo a identificação precisa do distúrbio.
• A sua identificação adequada requer a combinação de
pelo menos duas técnicas sendo posteriormente feita
uma comparação dos resultados obtidos com o quadro
clínico do doente, a sua etnia e com os resultados do
hemograma e esfregaço sanguíneo.
 Métodos Laboratoriais para diagnóstico
das hemoglobinopatias.

 Exames laboratoriais:
• Hemograma
• Teste de Falcização
• Teste de Solubilidade da Hb S
• Detecção de Inclusões da Hemoglobina H
• Detecção de corpos de Heinz
• Eletroforese das Hemoglobinas
• Focagem Isoelétrica
• Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC)
 Hemograma

• Toda suspeita de uma hemoglobinopatia, é recomendada

a realização de hemograma completo, com observação
do esfregaço de sangue periférico.
• A poiquilocitose pode ser um indicativo importante para
o diagnóstico.
• O RDW permite a medição do grau de anisocitose. As
anemias microcíticas decorrentes de talassemias tendem
a produzir eritrócitos microcíticos mas sem alterações de
tamanho, entanto, nas síndromes falcêmicas observa-se
um notável aumento do RDW.
Anisocitose e poiquilocitose
Anisocitose, poiquilocitose e policromasia
Anisocitose, poiquilocitose e cristais de HB
 Teste de Falcização de Hemácias

• As hemácias contendo hemoglobina S sofrem

falcização em presença de baixa tensão de oxigênio
produzida pelo metabissulfito de sódio.
• O fenômeno de falcização trata de uma reorganização
das moléculas (polimerização), que em estado
reduzido, forma longas cadeias denominadas tactoides
• Os tactoides são rígidos cristais alongados capazes de
deformar o eritrócito, fazendo com que o mesmo
assuma a forma de foice.
Teste de Falcização de Hemácias
 Teste de solubilidade (mancha)

• Este teste baseia-se no fato de que a Hemoglobina S,

no estado reduzido, é insolúvel.
• A Hemoglobina S desoxigenada, forma polímeros
insolúveis o que impossibilita sua absorção, sendo
retida em papel filtro, ou quando em solução, esta fica
turva.
• As hemoglobinas normais HbA, HbA2 e as variantes
comuns, como as hemoglobinas C, D, E, são solúveis.
• É um teste utilizado apenas para detectar a presença de
Hemoglobina S.
 Teste de solubilidade (mancha)

Teste da solubilidade para pesquisa de Hb S

Teste n°1157
positivo e os outros
negativos para
pesquisa de Hb S
 Detecção de Inclusões da Hemoglobina H

• As inclusões de hemoglobina H (agregados de Hb H)

são formados por cadeias polipeptídicas beta, oriundas
da desnaturação de tetrâmeros beta.

• Após a coloração vital estes corpúsculos apresentam-se

dispostos homogeneamente no interior dos eritrócitos,
como pequenos pontos azulados.

• Essas são facilmente diferenciadas dos reticulócitos,

pois apresenta pequenas inclusões azuis, semelhantes
a bolas de golfe, distribuídas ao longo de célula.
Detecção de Inclusões da Hemoglobina H
 Detecção de corpos de Heinz

• Os corpos de Heinz são partículas de polipeptídeos

oriundos de desnaturação de hemoglobinas, e que fixam
junto a membrana dos eritrócitos.

• São observados em anemias hemolíticas de várias

etiologias, na deficiência de G6PD, nas hemoglobinopatias
por hemoglobinas instáveis, na talassemia maior, nas
intoxicações por drogas, esplenectomizados e outros.
Detecção de corpos de Heinz
 Eletroforese das Hemoglobinas

• A eletroforese das hemoglobinas é um das técnicas mais

utilizadas na detecção inicial de variantes das hemoglobinas.
Eletroforese das Hemoglobinas
 Eletroforese alcalina pH 8,6

• As hemoglobinas como são moléculas carregadas, quando

aplicadas num campo elétrico a um pH de 8.6 (alcalina) todas
as hemoglobinas humanas apresentam carga total negativa e
consequentemente, migram em direção ao polo positivo
presente no sistema eletroforético.
Eletroforese alcalina pH 8,6
Eletroforese alcalina pH 8,6
 Eletroforese ácida pH 6,2

• A diferenciação entre hemoglobinas que migram para posições

semelhantes no acetato celulose (alcalina), pode ser obtida
através de técnicas como a eletroforese em pH ácido (pH 6,2),
em gel de ágar fosfato.
• Neste método, as hemoglobinas, migram em direção ao polo
negativo presente no sistema eletroforético.
Eletroforese ácida pH 6,2
Eletroforese ácida pH 6,2

A, D
S
PA

Normal AS AD
 Eletroforese alcalina e ácida

Eletroforese Alcalina Eletroforese Ácida

A
S, D

A2

Normal AS AD Normal AS AD
Eletroforese alcalina e ácida

Eletroforese Alcalina Eletroforese Ácida

Fetal

AS AA SS AS AA SS
Eletroforese alcalina
 Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC)

• A HPLC é um tipo de cromatografia em coluna geralmente

usada em bioquímica e análises de separação e identificação
de compostos ativos.

• Na técnica de HPLC para hemoglobinopatias, é possível a

separação de uma mistura de moléculas (como hemoglobina
normal e as suas variantes), através da sua carga positiva e
consequente absorção para uma fase estacionária carregada
negativamente, presente numa coluna de cromatografia.
 Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC)

• A fase móvel é um líquido que segue através da coluna, onde

as moléculas de hemoglobina, positivamente carregadas, são
eluídas da coluna para a fase líquida a um ritmo dependente da
sua afinidade para com a fase estacionária.

• Ao serem separadas desta forma, podem ser detectadas

opticamente, através do seu tempo de retenção e quantificadas
através da utilização de software específico.
 Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC)

• Quanto mais positivamente carregadas estiverem as

hemoglobinas, maior será o tempo de retenção.

• Esta tecnologia pode ser aplicada na identificação de variantes

de hemoglobina pois para cada variante, assim como para a
hemoglobina normal, existem tempos de retenção
característicos.
Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC)
 Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC)

HPLC - vantagens quando comparada com a eletroforese de

hemoglobinas:
1. Os analisadores são automáticos o que requer menos tempo
de manipulação pelos técnicos;
2. Permite o processamento de um grande número de amostras.
3. São necessários pequenos volumes de amostra. 5μL são
suficientes para uma análise.
4. Permite a quantificação de hemoglobinas normais e variantes
em cada amostra.
5. Podem ser realizadas várias identificações de um largo
número de variantes da hemoglobina.
6. Variantes da cadeia δ são facilmente detectadas.
Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC)

Separação de hemoglobinas através do método de HPLC

Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC)
Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC)
Diagnóstico neonatal das
Hemoglobinopatias e
Talassemias
Diagnóstico Neonatal