DIAGNÓSTICO

LABORATORIAL DE
HEMOGLOBINOPATIAS
MARITZA CAVALCANTE BARBOSA
FA R MA CÊ U TI CA
E SP E CI A L I S TA EM H EM ATO L O G I A C LÍ N I CA
M ES T RE EM CI Ê N CI A S FA RM A C ÊU T I CA S
D O U TO R A N D A E M CI ÊN CI A S FA R M A CÊU TI CA S
HEMOGLOBINA
 Proteína composta por quatro tetrâmeros
 Grupo Heme: ferro

 Função: absorção, transporte e distribuição de oxigênio para

os diversos tecidos do organismo.
MOLÉCULA DE HEMOGLOBINA
HbA= α2β2
TIPOS DE HEMOGLOBINA
 Hemoglobinas embrionárias
-Gower 1 (ζ2ε2)
-Gower 2 (α2ε2) Até o 3º mês de gestação

-Portland (ζ2γ2)

Hemoglobinas da fase adulta

-Hb Fetal (α2γ2) HbF < 2%
HbA até 97,5%
-Hb A (α2β2) HbA2 até 3,5%
-Hb A2 (α2δ2)
O QUE SÃO
HEMOGLOBINOPATIAS?
 Doenças que afetam a porção proteica da molécula de
hemoglobina.

Estruturais Síntese

• Alteração da estrutura • Redução ou ausência da

do aminoácido formado síntese de uma cadeia
• Hemoglobinas variantes polipeptídica
• Talassemias
HEMOGLOBINAS VARIANTES
 Mais de 1000 tipos de hemoglobina.

Mais comuns: HbS, HbC e HbD.

 Menor afinidade pelo O2.

Formas heterozigóticas são assintomáticas.

A HbS é a hemoglobina variante mais prevalente no Brasil

Cerca de 1.000 RN com HbS / ano (MS, 2013)
ANEMIA FALCIFORME
 Homozigose da HbS
Hemoglobina variante mais comum.
Associação com outras variantes de hemoglobina ou com
talassemia.
SS
AS
Doença falciforme SC
SC
βS
Fisiopatologia da anemia falciforme

Inflexível
Rígida
Expressão de moléculas de adesão
Fisiopatologia da anemia falciforme

1. Hemólise intravascular
2. Processo inflamatório
3. Vaso-oclusão

(Adaptado de SWITZER et al., 2006)

Manifestações clínicas
• Crises álgicas
• Úlceras de membros inferiores
• Síndrome torácica aguda (STA)
• Priapismo
• Necrose asséptica de fêmur
• Retinopatia
• Insuficiência renal crônica
• Acidente vascular cerebral (AVC).
Tratamento
o Hidroxiuréia

• Único medicamento aprovado para o tratamento da AF.

• Inibe a ribonucleotídeo redutase e mantem as células na fase S do

ciclo celular.

• Utilizado no tratamento de doenças neoplásicas.

Tratamento
oHidroxiuréia na AF
Eleva a expressão de γ globina;
Doadora de NO;
Diminui os níveis de mediadores inflamatórios (TNF-α, IL-6, IL-5);
Diminui a expressão de moléculas de adesão;
Tratamento

(WARE, 2013)
Talassemias
Redução parcial ou total de uma ou mais cadeias polipeptídicas.

Causa desequilíbrio entre as cadeias.

 Hemoglobinização ineficiente.

 alfa e beta-talassemia.
Prevalência da talassemia no Brasil
Fisiopatologia da Beta-talassemia
 Redução da produção de globina.
Cadeia em excesso forma agregados intracelulares.
Lesão de Membrana.
Hemólise.
Hemoglobinas da fase adulta
 Aumento da absorção do ferro.
-Hb Fetal (α2γ2)
Expansão da medula óssea. -Hb A (α2β2)
-Hb A2 (α2δ2)
Manifestações Clínicas
Elevada necessidade transfusional
Hemossiderose
Dano de múltiplos órgãos
Deformidades ósseas
Esplenomegalia
Tratamento
Suporte transfusional

Quelação de ferro

Transplante de medula óssea

Diagnóstico Laboratorial de
Hemoglobinopatias
 Hemograma
 Morfologia eritrocitária
Resistência osmótica com NaCl a 0,36%
Teste de solubilidade e falcização
Eletroforese de hemoglobina em pH alcalino
 HPLC
Biologia Molecular
Hemograma na anemia falciforme
Anemia (Hb 5 a 11g/dL) normocrômica e normocítica
 Anisocitose (RDW > 15%)
 Poiquilocitose: células falciformes (drepanócitos), células em alvo..
 Policromasia
Leucocitose
Trombocitose
Morfologia eritrocitária
Hemograma na Beta-talassemia
Anemia (Hb 5 a 11g/dL) microcítica e hipocrômica
RDW normal ou alterado
 Poiquilocitose: esquizócitos, codócitos
 Policromasia
Inclusões eritrocitárias
Morfologia eritrocitária
Resistência osmótica a NaCl 0,36%
PRINCÍPIO: Eritrócitos de portadores de beta talassemia
(homozigóticos e heterozigóticos) apresentam maior resistência
globular em solução de NaCl a 0,36%
 REAGENTE: NaCl a 0,36%

EXECUÇÃO: 2,0ml de solução de NaCl a 0,36% em tubo de hemólise

e adicionar 10 L de sangue total. Homogeneizar por inversão, e
deixar em repouso por 5 minutos. Fazer a leitura visual.
Resistência osmótica a NaCl 0,36%
INTERPRETAÇÃO:

Sofre influência
com a presença de
hemoglobinas
variantes
Teste de solubilidade
PRINCÍPIO: Baseia-se na insolubilidade da Hb S no estado reduzido
(quando desoxigenada).
Reagentes: saponina (lisante) e Ditionito de sódio (agente redutor)
 Execução: Quando a mistura é colocada em papel de filtro a
presença da hemoglobina S é visualizada pela formação de um
precipitado em forma de botão.
É um teste que serve apenas para detectar a presença da
hemoglobina S.
Teste de solubilidade
Interpretação
 Teste de falcização
PRINCÍPIO: O processo de desoxigenação é acentuado pela adição de
metabissulfito de sódio. Na presença da Hb S, quando desoxigenadas
adquirem a forma de foice.

REAGENTE: Metabissulfito de sódio a 2%.

EXECUÇÃO: Uma gota do sangue + uma gota do reagente

Lâmina e lamínula (selar com esmalte)
Aguarda 24 hs em câmara úmida
Microscópio
Teste de falcização
Eletroforese de hemoglobina em pH
alcalino (8,4-8,6)
PRINCÍPIO: Em pH alcalino a hemoglobina é uma proteína carregada
negativamente, migrando para o pólo positivo quando submetida a
eletroforese.

 Cada Hb variante tem um ponto isoelétrico

 REAGENTES: Saponina (lisante)

Solução Tampão: Tris - EDTA-Borato 0,025M pH 8,5

Eletroforese de hemoglobina em pH
alcalino (8,4-8,6)
INTERPRETAÇÃO
 HbS e HbD
 HbC e HbE
Quantificação da HbA2
 Solubilização da fração HbA2 presente na fita de agarose.

Determinação da densidade óptica por espectrofotometria.

 Compara com o padrão (sangue total).

HPLC

Diagnóstico de beta-talassemia
HPLC
Cromatografia líquida de alta eficiência

Fase estacionária: coluna de sílica contendo hidrocarbonetos

Fase móvel: solvente

As hemoglobinas são separadas com base na afinidade pela sílica

Cada hemoglobina tem um tempo de retenção.

 HPLC
INTERPRETAÇÃO:
-O tempo de retenção de cada Hb é
previamente conhecido.
-Softwares calculam a área do pico.

-Níveis de HbF mascaram outras Hb

variantes.
Estudo molecular
Reação em cadeia da polimerase
-Utilização de sondas específicas para a mutação.

- Revelação em gel de agarose.

-Padrão-ouro.
Obrigada!