INSTITUTO SUPERIOR POLITÉCNICO DE MANICA

DIVISÃO DA AGRICULTURA
4O ANO
LICENCIATURA EM BIOTECNOLOGIA
MODULO: BIOPROSPECÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
TEMA

BIOPROSPECÇÃO DE LEVEDURAS KILLER COM POTENCIAL PARA

APLICAÇÃO EM BIOTIPAGEM DE MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS
HUMANOS

Discentes
Elisa José Simango
Ester António Mozangar
Wilma Miguel Nhamuave

Docente: Gisela Bettencourt, Ph.D.

Matsinho, Abril 2023

Índice
Capitulo I: Introdução........................................................................................................3

Introdução..........................................................................................................................3

Objetivos............................................................................................................................4

Metodologias.....................................................................................................................4

Revisão Bibliográfica........................................................................................................5

Leveduras killer.................................................................................................................5

As principais linhagens killer............................................................................................5

Atividade killer..................................................................................................................6

Biotipagem........................................................................................................................6

Biotipagem de microrganismos de importância clínica utilizando o sistema killer..........6

Potencial biotecnológico das leveduras e toxinas killer....................................................7

O sistema killer de leveduras e a medicina.......................................................................8

CAPITULO III: ESTUDO DE CASO............................................................................10

Material e Método...........................................................................................................10

Teste de triagem para detecção de linhagens com fenótipo killer...................................10

Identificação das leveduras killer pelas características fenotípicas.................................11

Confirmação da identificação fenotípica através da análise de sequenciamento de

regiões do rDNA..............................................................................................................11

Caracterização do genótipo killer....................................................................................12

Caracterização do material genético extracromossomal.................................................12

RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................12

Conclusão........................................................................................................................14

Referencia Bibliográfica..................................................................................................15

2
Capitulo I: Introdução

Introdução
A bioprospecção de leveduras killer (assassinas) ganhou uma atenção significativa nos
últimos anos devido à sua potencial aplicação na biotipagem de microrganismos
patogênicos humanos. 

Essas leveduras, também conhecidas como leveduras micocinogênicas, secretam toxinas

chamadas toxinas assassinas ou micocinas que são letais para outras espécies de
leveduras e vários microrganismos, incluindo bactérias cocoides gram-positivas, Fungos
Filamentosos, Mycobacterium tuberculosis e Pneumocystis (FUENTEFRIA., 2007).

O primeiro uso de leveduras killer para discriminação inter ou intraespepecífica de

microrganismos foi descrito para isolados de Candida albicans, demonstrando ser uma
ferramenta epidemiológica de grande valor na identificação de casos presuntivos de
infecções hospitalares (POLONELLI et al., 1983)

A capacidade das leveduras assassinas de visar e eliminar microrganismos específicos

torna-as candidatas promissoras à biotipagem, um processo que envolve a identificação
e classificação de microrganismos com base em suas características biológicas. Neste
trabalho, exploraremos o potencial das leveduras killer (assassinas) na biotipagem de
microrganismos patogénicos humanos e seu papel no campo da bioprospecção.

3
Objetivos
Objetivos Geral

Explorar o potencial das leveduras Killer na biotipagem de microrganismos patogénicos

humanos.

Objetivos específicos

 Mencionar e explicar as principais linhagens killer;

 Explicar como é realizada a biotipagem de microrganismos de importância
clínica utilizando o sistema killer;
 Descrever os testes de triagem utilizado para detecção de linhagens com
fenótipo killer.

Metodologias
Trata-se de um estudo de revisão bibliográfica de natureza exploratória e descritiva,
realizado através levantamentos de artigos e revisões em língua inglesa e portuguesa. As
bases de dados utilizadas para o devido trabalho foram: Scielo, Google Acadêmico nos
quais foram os artigos publicados nos últimos 10 anos, em teses e dissertações nos sites:
Google académico, Scielo, ScienceDirect e PubMED foram utilizados os seguintes
indicadores: Em português: Leveduras killer, Biotipagem de microrganismos
patogénicos em humanos, Em Inglês: Killer yeasts, Biotyping of pathogenic
microorganisms in humans, bioprospecting of killer yeasts.

4
Leveduras killer
Toxinas killer ou proteínas killer são substâncias proteicas secretadas por algumas cepas
de leveduras que tem efeitos letais sobre outros fungos e uma variedade de bactérias. As
leveduras que produzem essas toxinas são conhecidas como leveduras killer que são
imunes à ação das suas próprias toxinas, mas podem ser sensíveis às proteínas killer
produzidas por outros organismos (POLONELLI et al., 1983).

O fenômeno killer foi descrito pela primeira vez em linhagens de Saccharomyces

cerevisiae por Bevan e Makower em 1963, e então proposto que algumas cepas de S.
cerevisiae podiam ser classificadas em três fenótipos: killer (K+R +), sensíveis (K-R -)
ou neutras (K-R +). As leveduras killer matam as sensíveis, enquanto as neutras
resistem ao ataque das killer e não atacam letalmente as sensíveis (WOODS; BEVAN,
1968; WICKNER, 1974; SILVA, 1996). As toxinas produzidas pelas leveduras killer
são sensíveis ao calor e a protease e dependentes das condições do pH e oxigênio
(WOODS, BEVAN, 1968; VAZ et al., 2002).

Quando as células killer e sensíveis crescem juntas no mesmo meio de cultura, uma alta
proporção destas últimas é morta. Células neutras não matam células sensíveis nem são
mortas por células killer. A morte pode ocorrer sem contato celular entre células
assassinas e células sensíveis oxigênio (WOODS, BEVAN, 1968). O agente liberado
pelas células assassinas que causa a morte das células sensíveis foi chamado de 'fator
killer.  Os estudos realizado por Woods & Bevan (1988), mostram que se trata de uma
substância proteica com um espectro de ação altamente específico, dependente de
condições específicas de pH, temperatura e aeração. A ação do fator assassino
assemelha-se à das bacteriocinas que não causam lise dos organismos sensíveis e cuja
ação é, portanto, bactericida, não bacteriolítica.

As principais linhagens killer

As principais linhagens killer de S. cerevisiae pertencem as classes K1 e K2, a atividade
killer de K1 permanece estável dentro de uma faixa estreita de pH ácido, é instável a
temperaturas acima de 25˚C, e pode ser inativada por meio de agitação. Pouco depois da
descoberta deste fenômeno verificou-se que cepas com esse potencial além de não se
limitar a Saccharomyces, pode ser encontrado em outros gêneros incluindo Candida,

5
Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Sporidiobolus,
Tilletiopsis e Zygosaccharomyces (MARQUINA; SANTOS; PEINADO, 2002).

Atividade killer
A atividade killer, de acordo com Somers, Bevan (1969), corresponde á produção de
proteínas de baixo peso molecular que são letais às leveduras sensíveis. Suas toxinas
killer possuem massa molecular que varia de 18 a 300 kDa (Quilodaltons), dependendo
da espécie de levedura.

O fenômeno killer é útil na diferenciação de leveduras dentro da própria espécie,

podendo ser usado como marcador epidemiológico. A capacidade de produção de toxina
killer pode representar uma vantagem seletiva entre espécies competidoras em um
mesmo habitat (POLONELLI; CONTI; GERLONI, 1991).

Biotipagem
A biotipagem de microrganismos patogénicos humanos é uma ferramenta importante no
diagnóstico e tratamento de doenças infecciosas. Ao identificar a estirpe específica de
um agente patogénico causador de uma infeção, os profissionais de saúde podem
escolher as opções de tratamento mais eficazes (BUZZINI et al., 2007). No entanto, os
métodos tradicionais de biotipagem podem ser demorados e dispendiosos. As leveduras
assassinas oferecem uma solução potencial para este problema (BUZZINI et al., 2007).
Ao utilizar os compostos antimicrobianos produzidos pelas leveduras assassinas, os
investigadores podem identificar rápida e facilmente a susceptibilidade de diferentes
estirpes de microrganismos patogénicos humanos. Isso pode ajudar a simplificar o
processo de biotipagem e melhorar a precisão do diagnóstico e do tratamento (BUZZINI
et al., 2007).

Biotipagem de microrganismos de importância clínica utilizando o sistema killer

Uma das formas de se realizar estudos epidemiológicos de dispersão de patógenos em
ambientes hospitalares, ou onde se faça necessário o controle de infecção, é pela
discriminação intra-específica (biotipagem) desses microrganismos em subgrupos
(biotipos). Biotipagem de microrganismos em pequenos laboratórios geralmente são
realizados por padrões de susceptibilidade antimicrobiana (antibiograma por discos de
difusão), principalmente pela facilidade de execução e eficácia do resultado. O sistema
killer, baseado em padrões de sensibilidade à toxina ou (KSPs), pode representar uma
ferramenta simples, de baixo custo, sensível e reprodutível para discriminação de

6
microrganismos de importância clínica em laboratórios com poucos recursos
tecnológicos (BUZZINI et al., 2007). O primeiro uso de leveduras killer para
discriminação inter ou intraespecífica de microrganismos foi descrito para isolados de
Candida albicans, demonstrando ser uma ferramenta epidemiológica de grande valor na
identificação de casos presuntivos de infeções hospitalares (POLONELLI et al., 1983;
BUZZINI et al., 2007).

Potencial biotecnológico das leveduras e toxinas killer

As leveduras killer e suas toxinas apresentam inúmeras aplicações em potencial, sejam
elas de caráter biotecnológico ou não. Dentre os campos biotecnológicos de aplicação,
destacam-se a fermentação de bebidas, taxonomia e medicina. Além desses,
MARQUINA et al. (2002) destacaram a aplicações em estudos dos mecanismos de
processamento e secreção de proteínas, além da interação das toxinas com as células
sensíveis (SCHMITT, 1995), controle biológico na agricultura (WALKER et al., 1995)
e tecnologia de alimentos (LOWES et al., 2000). Vale salientar que elas vêm sendo
utilizadas como sistemas de modelo em pesquisa básica para estudar os mecanismos de
regulação de processamento, secreção e ligação de polipeptídeos eucarióticos a
receptores. Através da tecnologia de DNA recombinante, plasmídeos killer de S.
cerevisiae e Kluyveromyces lactis podem ser úteis como vetores de clonagem para
secreção efetiva de polipeptídeos exógenos expressados (SUGISAKI et al., 1985;
DIGNARD et al., 1991).

Na área biomédica estão sendo utilizadas particularmente na biotipagem das leveduras

patogênicas como Candida albicans (YOUNG, 1987) e Cryptococcus spp. (YOUNG &
YORGIU, 1978). Há também diversos estudos que destacam o notável potencial das
toxinas killer como novos agentes antimicóticos no tratamento de infecções fúngicas em
humanos e animais (BUZZINI & MARTINI, 2001).

O sistema killer de leveduras e a medicina

Uma das principais aplicações das leveduras killer na área médica ocorre na biotipagem,
principalmente de leveduras patogênicas como C. albicans e C. neoformans (HAMAL
et al., 1998). As diversas toxinas killer produzidas e caracterizadas também têm sido
sugeridas como novos agentes antimicóticos em potencial para o tratamento de infeções
(POLONELLI et al., 1991; CAILLIEZ et al., 1994). No entanto, como elas são
frequentemente muito lábeis às condições fisiológicas de pH e temperatura, sua adição

7
em soluções tamponadas pode resultar no tratamento efetivo de infeções de pele e
membrana mucosas por leveduras patogênicas. As toxinas killer não podem ser
diretamente utilizadas como antibióticos sistêmicos porque induzem uma forte resposta
imunológica, o que é uma característica de certa forma já esperada por se tratar de
grandes proteínas exógenas (MAGLIANI et al., 1997). Entretanto, em muitos trabalhos
já foi possível obter anticorpos e antibióticos anti-idiotípicos, sintéticos ou naturais, que
exercem as mesmas atividades antimicrobianas das toxinas killer correspondentes, como
também vacinas idiotípicas, capazes de desempenhar um importante papel preventivo e
terapêutico (MAGLIANI et al., 2001, 2004, 2005; POLONELLI et al., 2003; FIORI et
al., 2006). POLONELI et al. (1991) produziram estes anticorpos, os quais
aparentemente compartilhavam o sítio ativo da toxina de Pichia anomala e que
mimetizaram, in vitro, o efeito killer da toxina secretada contra C. albicans.

As toxinas killer de leveduras demonstram uma alta especificidade de ação de modo

que as linhagens produtoras são imunes às suas próprias toxinas. Dessa forma, o fator
killer age efetivamente como um antifúngico específico, implicando na existência de
receptores de superfície específicos. A busca por agentes antifúngicos alternativos pode
ser baseada na suposição de que sítios específicos para um fator killer possuem outras
funções essenciais cujos inibidores podem ser antibióticos (BUSSEY & SKIPPER,
1976).

Diante do exposto, seria de grande valor para a medicina a obtenção de antibióticos

derivados das toxinas killer de leveduras, que tenham como alvos estruturas celulares
essenciais de importância fisiológica ou funcional e que in vivo não sejam tóxicos às
células eucarióticas superiores (MAGLIANI et al., 2004, 2005). A alta prevalência de
susceptibilidade das leveduras patogênicas às toxinas killer produzidas por certas
leveduras, particularmente pertencentes aos gêneros Picchia e Williopsis, pode levar a
aplicações práticas, como, por exemplo, o desenvolvimento de derivados sintéticos a
serem utilizados como agentes antifúngicos.

A toxina de 10.721 kDa, produzida por W. mrakii age inibindo seletivamente a síntese
de ß-glicano na parede celular de leveduras susceptíveis através de um mecanismo
similar ao de antibióticos antifúngicos como Aculeacina A, Echinocandina B e
Papulocandina B (YAMAMOTO et al., 1986). Estes agentes também inibem a
atividade in vitro da enzima ß-1,3-glicano sintetase de leveduras (YAMAGUCHI et al.,
1982). Esta inibição geralmente causa um enorme desequilíbrio estrutural e osmótico na
8
célula da levedura, o que fatalmente resulta em morte. Ambas as formas morfológicas
dos fungos podem ser susceptíveis à mesma toxina killer (POLONELLI et al., 1989).
Isto sugere que esta aparente uniformidade de susceptibilidade implica na existência de
receptores de parede celular comuns durante os eventos celulares e moleculares que
acompanham as variações morfológicas em fungos dimórficos e afetam a
susceptibilidade a antibióticos (BETANCOURT et al., 1985).

9
CAPITULO III: ESTUDO DE CASO
TEMA
BIOPROSPECÇÃO DE LEVEDURAS KILLER COM POTENCIAL PARA

APLICAÇÃO EM BIOTIPAGEM DE MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS

HUMANOS

Objetivos do Estudo

Este estudo teve como objetivo geral realizar bioprospecção de leveduras killer com

potencial para aplicação na biotipagem de microrganismos de interesse clínico.

O estudo foi conduzido por Alexandre Meneghello Fuentefria em outubro, 2007

Material e Método
Prospecção das leveduras killer

Culturas de leveduras

As culturas de leveduras e fungos semelhantes a leveduras utilizadas para avaliar a

presença do fenótipo killer foram obtidas da Coleção de Culturas de Leveduras do
Departamento de Microbiologia da UFRGS, onde estão depositados isolados de
substratos de origem animal, como leite in natura, leite de cabra in natura, queijo e
requeijão, e de origem vegetal, como filoplano do Hibiscus rosasinensis, filoplano de
bromélias e frutos.

Teste de triagem para detecção de linhagens com fenótipo killer

O teste de triagem de leveduras micocinogênicas foi realizado de acordo com
BUZZINI & MARTINI (2000). Células de leveduras patogênicas foram cultivadas por
48h a 22ºC em ágar YEPG, para a obtenção de células metabolicamente ativas, e
ressuspendidas em água destilada até uma concentração celular de 105 células/mL
sendo posteriormente semeadas em superfície, com auxílio de swab estéril, em placas
contendo Ágar YM-MB. Culturas puras de leveduras potencialmente micocinogênicas
foram inoculadas em caldo YEPG e incubadas a 22ºC por 48h, sendo posteriormente
semeadas no ágar YM por replicador de microrganismos. As placas, contendo cada uma
25 leveduras potencialmente micocinogênicas, foram incubadas a 22ºC por 72h. As

10
cepas foram consideradas micocinogênicas quando o crescimento esteve envolto por
uma zona de inibição do microrganismo sensível, onde não ocorre o crescimento da
cepa sensível, e uma zona azul adjacente à zona de inibição, indicando morte celular. O
indicador da atividade micocinogênica é a zona azul de células mortas envolvendo a
zona de inibição. A zona de inibição foi mensurada, através de uma régua milimetrada,
para cada cepa sensível.

Identificação das leveduras killer pelas características fenotípicas

As culturas isoladas foram identificadas por características macromorfológicas
(morfologia colonial, presença de balistosporos) micromorfológicas (características
celulares, formação de ascósporos), bioquímicas (testes de fermentação, testes de
assimilação de fontes de carbono e nitrogenadas) e por fim fisiológicas (produção de
urease, termotolerância, osmotolerância, produção de compostos amiloides), de acordo
com BARNETT et al. (2000).

Confirmação da identificação fenotípica através da análise de sequenciamento de

regiões do rDNA
Para a extração de DNA, as leveduras selecionadas para os testes de identificação
molecular foram esgotadas em placas de Petri, com meio ágar Sabouraud, onde foram
incubadas por 48h a 25ºC. Depois de selecionadas as colônias isoladas, estas foram
inoculadas em 0,5 mL de tampão de lise (NaCl 1 M; Tris-HCl pH 8,0 1 M; EDTA 0,5
M pH 8,0; SDS 10%) e incubadas por uma hora a 65°C. Em seguida, adicionou-se 1
volume de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) e as amostras foram
centrifugadas por 3 min a 13000 rpm. O sobrenadante foi transferido para outro tubo,
onde o DNA foi precipitado com isopropanol p.a. e centrifugado por 15 min a 13000
rpm. O DNA foi lavado em etanol a 70%, seco à temperatura ambiente e ressuspendido
em 100 µL de tampão Tris-EDTA. Após esta etapa, o DNA extraído foi tratado com a
enzima RNase A (por 30 minutos a 370 C) e amplificado utilizando os primers NL1-
5’GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG3’ e NL4-
5’GGTCCGTGTTTCAAGACGG3’ (O’DONNELL, 1993), específicos para a região
D1/D2 do gene 26S do rDNA e de acordo com condições de amplificação propostas por
KURTZMAN & ROBNETT (1998) e utilizadas por FUENTEFRIA et al. (2006).

A reação de sequenciamento foi realizada utilizando o kit DYEnamic ET dye terminator

cycle sequencing (MegaBACE) e empregando o sequenciador automático MegaBACE

11
1000 (Amersham Biosciences). As sequências foram obtidas usando o programa
phred/phrap/consed (http://www.phrap.org) e analisadas no programa BLAST
Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) (Altschul et al. 1997), disponível no site
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. O alinhamento das sequências de DNA foi
obtida através do programa CLUSTAL X (Thompson et al., 1997). As árvores
filogenéticas foram construídas pela análise Neighbour-Joining utilizando o programa
MEGA, version 3.0 (Kumar et al., 2001).

Caracterização do genótipo killer

Caracterização do material genético extracromossomal

O material genético extraído, das linhagens selecionadas para os testes de caracterização
do genótipo killer, foi analisado após eletroforese em gel de agarose 1,2%. A
caracterização desse material como DNA plasmidial, dsRNA ou ssRNA foi realizada
utilizando a digestão com as enzimas RNase A (Sigma) e S1 nuclease (Sigma) de
acordo com GOLUBEV et al. (2003). Cinco microlitros dos ácidos nucléicos totais
foram tratados com 0,5 μL de RNase (Sigma) na concentração de 50 μg ml-1, acrescido
de 4,5 μL de água ultra-pura e incubado por 30 min a 370 C, ou com 0,5 μL S1 nuclease
(Sigma) em 4,0 μL de água ultra-pura e 0,5 μL tampão 10 X S1 e, incubado por 30
minutos a 370 C. Após o tratamento enzimático, o material tratado foi observado numa
corrida eletroforética em gel de agarose 1,2%.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Prospecção das leveduras killer.

Quinhentos e noventa e cinco (595) leveduras isoladas de queijo, requeijão, leite de

vaca, leite de cabra, folhas de bromélias, folhas de Hibiscus rosa-sinensis e frutos foram
submetidas ao teste de triagem para avaliar a presença de atividade killer ou
micocinogênica contra dois isolados de importância clínica: Candida glabrata ATCC
2001 e Cryptococcus neoformans var. neoformans ATCC 28957. Deste método de
triagem, detectou-se 48 leveduras com atividade micocinogênica, que tiveram sua
atividade inibitória mensurada em Ágar YM com azul de metileno (Figura 2, Tabela 2).

12
Figura 1: A figura apresenta os halos típicos de inibição observados nos testes de
triagem em Ágar YM-MB para a detecção do fenótipo killer.

Listagem de leveduras isoladas de diferentes substratos e pertencentes à Coleção de

Culturas de Leveduras do Departamento de Microbiologia da UFRGS realçando as que
apresentaram a característica killer contra as leveduras sensíveis C. glabrata
ATCC2001 e/ou C. neoformans ATCC28957

Figura 2: Listagem de leveduras isoladas de diferentes substratos e pertencentes à

Coleção de Culturas de Leveduras.

* Leveduras que apresentaram atividade killer contra ao menos uma das duas.

13
Conclusão
As leveduras e toxinas killer apresentam uma grande potencialidade biotecnológica,
podendo ser exploradas em diversos setores de aplicação, principalmente na medicina,
na biotipagem de microrganismos patogénicos também é aplicado no controle contra
leveduras contaminantes de processos fermentativos, e taxonomia. Pelo fato das
leveduras killer serem mais predominantes em habitats naturais, uma nova perspectiva é
a exploração de novos nichos e, principalmente, ambientes ainda não estudados, pois
estes contribuirão para o conhecimento da diversidade e possibilitarão novas aplicações
do sistema killer.

14
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