UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ

Bacharelado em Farmácia/CCS
Controle de Qualidade Microbiológico de
Medicamentos, Cosméticos e Correlatos
Profa. Dra. Marcília Costa

ENSAIOS DE TOXICIDADE E INOCUIDADE

Alan André da Costa Cruz

Lara Polyana Silva Ramos
Leon Levillier Morais e Gonçalves
Sarah Daisy Mota Feitosa
Tainara Melo Lira
 Ensaios de Toxicidade e Inocuidade

Implante intramuscular
TOXICIDADE
AGUDA LOCAL

Implante subcutâneo
IN VIVO

Injeção intradérmica
TOXICIDADE
AGUDA
SISTÊMICA
Administração oral

ENSAIOS DE Aplicação dérmica percutânea

TOXICIDADE E
INOCUIDADE SUBCRÔNICA

Injeção sistêmica

Produtos biológicos

CRÔNICA

Teratogenicidade

Citotoxicidade por
IN VITRO contato Sobre reprodução
direto/eluição
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TOXICIDADE AGUDA COM EFEITO SISTÊMICO

DL 50
CONSIDERA-SE NOS TESTES:

VIA DE ADM. PRETENDIDA

DOSE

FREQUêNCIA DE ADM.

TEMPO DE OBSERVAÇÃO

EFEITOS TOXICOS SISTÊMICOS

Fonte:ANVISA,2018;https://www.google.com/url?
sa=i&source=images&cd=&ved=2ahUKEwjcxqSC- fTiAhUsL
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TESTE DE TOXICIDADE ORAL AGUDA

RECOMENDAÇÕES GERAIS:
• Duração: observação de 14dias após adm.;
• Animais: ratos são mais usados;
• Idade inicial: aproximadamente 5 semanas de vida
• Via adm.: geralmente oral;
• Grupo de teste: min. 4 grupos com 5 machos e 5 fêmeas; com
doses diferentes;
• Dieta: ad libitum, suspensa 12h antes e restituída 4h depois;
• Observações: 8h após adm. e a cada 12h; sinais (início,
duração intensidade)
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TESTE DE TOXICIDADE ORAL AGUDA

DL50 - Diretriz nº 401 (OECD, 1981)

• 5 animais por sexo, por dose, por grupo,

sa=i&source=images&cd=&ved=2ahUK
com 3 grupos de doses (30 animais)

Fonte:https://www.google.com/url?
• Doses (estudos prévios ou dados
históricos)
• DL 50 estimada
• Dose limite: 5g/Kg
• 1987: várias doses em 1 sexo, 1 dose no
outro sexo (comparativo); dose limite
2g/Kg; redução de 30 para 20 animais
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TESTE DE TOXICIDADE ORAL AGUDA

ANVISA, definição: 1 ou + doses em 24h,

observação 14dias;

Modelo animal: mínimo 2 espécies de

mamífero;

Via adm.: a pretendida em humano + via

parenteral*;

Fonte: BRASIL, 2013.

Dosagem: roedores e não roedores ≤ 1000
mg/kg/dia.
Ou menor dose entre 10x dose clínica e
2000 mg/kg/dia ou a máxima dose
disponível.
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TESTE DE TOXICIDADE ORAL AGUDA

Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Económico

Fonte: OECD, 2019

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TESTE DE TOXICIDADE ORAL AGUDA

Quadro 1. Testes alternativos de toxicidade oral aguda.

Dose Fixa Classe Tóxica “Up an Down”
(OECD420) (OECD423) (OECD425)
DOSES Dose fixa de 5, 50, 300, Dose fixa de 5, 50, 300, Dose inicial estimada
2000mg/kg, 5 animais por 2000mg/kg, 3 animais por (175mg/kg), fator de progressão
dose dose de 3.2, 1 animal
PRINCÍPIOS Identificar a menor dose Identificar a menor dose que Estimar a DL50
que cause toxicidade cause mortalidade
evidente
DADOS Faixa estimada da DL50, Faixa estimada da DL50, Estimar a DL50, sinais de
OBTIDOS sinais de toxicidade sinais de toxicidade aguda. toxicidade aguda. Órgão alvo
aguda. Órgão alvo Órgão alvo
ÓBITOS 1 2-3 por teste 2-3
ESPERADOS

Fonte: OECD, 2019

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TESTE DE TOXICIDADE ORAL AGUDA

AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE

sa=i&source=images&cd=&ved=2ahUKEwijst2xg_XiAh
MORTE (DL50) e...

SINAIS DE TOXICIDADE:

Fonte:https://www.google.com/url?
Peso, apetite, aparência, comportamento, e
tecidos anormais;

Avaliação patológica de orgãos e cortes

histológicos;

Direcionamento dos outros testes

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TESTE DE IMPLANTE INTRAMUSCULAR

• Avalia biocompatibilidade de material polimérico

• Formulações farmacêuticas
• Cosméticos
• Correlatos
• Determinadas substâncias podem sofrer
permeação
Screening de
• Substâncias ativas podem ser absorvidas pelo plásticos
recipiente
• Material polimérico pode ser fotodegradado
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TESTE DE IMPLANTE INTRAMUSCULAR

• Exigido desde a versão XVII da USP e VIII da Japonesa

LAVAGEM E
ESTERILIZAÇÃO

• Sem arestas e
ângulos
• 10 mm x 1 mm
• 12 fragmentos
(8+4)

Fonte: Disponível em ¹https://afinkopolimeros.com.br/o-que-sao-polimeros/

²https://www.saudemais.tv/noticia/32-nova-geracao-de-polimeros-para-eliminar-bacterias-em-ambiente-hospitalar
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TESTE DE IMPLANTE INTRAMUSCULAR

IMPLANTE DE 8
FRAGMENTOS DA
AMOSTRA E 4 DE
CONTROLE NEGATIVO
(POLIETILENTO DE ALTA
DENSIDADE)

• Adultos
• Saudáveis
• ≥ 2,5 kg
• Musculatura
paravertebral
desenvolvida TRICOTOMIA
• 2 animais/amostra
Fonte: Disponível em: ¹ https://pt.dreamstime.com/fotografia-de-stock-coelho-branco-isolado-no-branco-image8386462
²https://www.saudemais.tv/noticia/32-nova-geracao-de-polimeros-para-eliminar-bacterias-em-ambiente-Hospitalar
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TESTE DE IMPLANTE INTRAMUSCULAR

2,5-5 cm da linha da coluna

vertebral e 2,5 cm entre os
implantes

120 horas

Fonte: Disponível em: ¹https://www.jove.com/video/57994/a-versatile-model-of-hard-tick-infestation-on-laboratory-rabbits

²https://br.depositphotos.com/174876024/stock-photo-vials-sodium-thiopental-pentobarbital-used.html
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TESTE DE IMPLANTE INTRAMUSCULAR

• Amostras sem reações ou

Remoção de inferiores/iguais
Observação deaos controlesObservação
músculos cortes microscópica
paravertebrais negativos, indicam
transversais material • Enriquece o estudo
• Fixados em BIOCOMPATÍVEL.
• Hemorragias • Observação de
formaldeído (5%) • Filmes inflamação
• Localizar • Encapsulamentos
fragmentos

Fonte: Disponível em: ¹https://produto.mercadolivre.com.br/MLB-925458679-bisturi-inox-cabo-n3-laminas-n11-esterilizadas-uso-geral-_JM?quantity=1

¹https://www.globaltradebr.com.br/microscopio-biologico-binocular-otica-infinita-planacromatico-led.html
³https://www.mreferramentas.com.br/ferramentas/lupas/lupa-de-bancada/lupa-de-bancada-com-iluminacao-led-solver-hl-900-5x-bivolt
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TESTE DE IMPLANTE SUBCUTÂNEO

• Alternativa para materiais incompatíveis com implante

muscular
• Definido ou não sua BIOCOMPATIBILIDADE

PREPARO DE
AMOSTRAS

ANESTESIA
DE ANIMAIS

4 AMOSTRAS
• Saudáveis POR ANIMAL
• Adultos 225~350 mg
• 5 ratos
Fonte: Disponível em: https://scihigh.ca/courses/glowing-mus-musculus-mice/
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TESTE DE IMPLANTE SUBCUTÂNEO

Dissecação
entre fáscia

Mantidos
por 7 dias • Análise macroscópica
do tecido adjacente
• Necrose, discoloração,
infecções e
encapsulamentos
Sacrificados

Fonte: Disponível em: ¹http://revistagalileu.globo.com/Revista/Common/0,,ERT291108-17773,00.html ²http://boletim.med.br/2014/04/27/forca-tensil-de-

diferentes-tipos-de-fio-de-sutura-estudo-em-ratos/; Cymrot et al, 2004;
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Fonte: Disponível em: ¹https://pt.dreamstime.com/fotografia-de-stock-coelho-branco-isolado-no-branco-image8386462

TESTE DE INJEÇÃO INTRADÉRMICA DE EXTRATOS DE

²https://www.saudemais.tv/noticia/32-nova-geracao-de-polimeros-para-eliminar-bacterias-em-ambiente-hospitalar
POLÍMEROS

• Indicado para extrato de polímeros

TRICOTOMIA
DORSAL

• Dez sítios, em cada lado

INJEÇÃO DE 0,2 da coluna
mL DO EXTRATO E
• Meio extrator é o
CONTROLE
controle

• Observação local
OBSERVAÇÕES (eritema, edema e
INTERVALADAS necrose)
• Adicionalmente, escala
de Draize
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TESTE COM APLICAÇÃO DÉRMICA PERCUTÂNEA

Permeável a certos tipos de substâncias

Compostos lipossolúveis;
Toxicidade à órgãos

Novos conservantes e
Ensaio de toxicidade dérmica percutânea
produtos

▪ Aplicação do material teste na pele de coelhos;

▪ Dose única (2 g/kg) ou doses múltiplas;
▪ Sítio de aplicação: Limpo após 3 horas;
▪ Observação diária (14 dias)
Fonte: http://www.inventiva.ind.br/blog/comopenetramosativos
https://www.cpt.com.br/cursos-pequenascriacoes
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TESTE COM APLICAÇÃO DÉRMICA PERCUTÂNEA

Toxicidade

Morte de 1 (6 animais)
2 g/kg: Ensaio completo de DL50

[ ] do material que, quando aplicado, causa a morte de 50% dos animais

✔Sinais avaliados: Semelhantes ao teste de

Avaliação histopatológica,
toxicidade oral (sistêmicos);
hematológica, parâmetros
✔Avaliação dos danos causados aos órgãos químicos, efeitos
internos: Necropsia terminal. neurológicos e mutagênicos.
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TESTE COM INALAÇÃO

Fabricação, Exposição a Quando inalados,

embalagem ou compostos, inalação alguns compostos
durante o uso do de vapores ou podem provocar
produto terminado aerossóis danos

Avaliação da potencial toxicidade

✔Animais respiram substância em teste;

✔Características da substância teste devem ser verificadas
(tamanho da partícula, concentração transportada pelo ar e
sedimentação de partículas de aerossol).
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TESTE COM INALAÇÃO

✔Expor ratos de 1-4 horas ao ar com concentrações específicas de vapores de

líquidos voláteis ou aerossóis de substâncias sólidas pulverizadas;

▪ Ar ambiental:

Substância segura Tóxica

✔Medida quantitativa de
✔ Sem morte em [2 mg/L]
toxicidade: CL50 (mg/L ou ppm)

▪ Maior custo na execução: câmaras especiais e medidas químicas

(procedimentos analíticos sofisticados).
Fonte: https://pt.dreamstime.com/foto-de-stock-rato-branco-do-laborat
%C3%B3rio-no-branco-image42040471
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TESTE DE INJEÇÃO
SISTÊMICA
Avaliação da toxicidade sistêmica nos diferentes grupos de
produtos, correlatos e material de acondicionamento, além de
produtos biológicos.

✔Raça Swiss, machos e fêmeas;

✔Peso corporal: 17 a 23 g;
✔Via de inoculação: Intravenosa,

Fontehttp://pesquisa.unievangelica.edu.br/bioterio/animais/
intraperitonial, subcutânea e oral.

Extratos de • Intravenosa e intraperitonial

polímeros

Solução fisiológica • Dose de 50 L/kg

Polietilenoglicol 400 •Dose de 10 g/kg

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TESTE DE INJEÇÃO
SISTÊMICA
Dose para
fármacos e • 10x a dose terapêutica ou acima de 0,5 mL/animal.
medicamentos
▪ Toxicidade interente ao PA
▪ Relação risco-benefício do paciente: DE50 próxima DL50 –
menor segurança (resistência do animal)

✔Número de animais: 5 para teste e 5 para controle

✔Grupo controle: Veículo usado na preparação da amostra
✔Observação: Animais mortos e 4, 24, 48 e 72 horas;
✔Morte (2 ou mais), convulsão, prostração, perda de peso superior a 2 g em 3
ou mais camundongos ⇨ Amostra não atende aos requisitos;
✔Reatividade leve, e não mais que um apresentar reatividade intensa ⇨
Repetir o teste com 10 animais.
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TESTE PARA PRODUTOS BIOLÓGICOS

Dois camundongos com peso

Duas cobaias com peso < 400 g
< 22 g

• Volume injetado: 0,5 mL intraperitonealmente;

• Para produtos sem indicação do volume de reconstituição: dose, diluente e
via de administração – FDA.
• Animais observados por no mínimo 7 dias (respostas não específicas, perda
de peso);

Se anormalidade
• Repetir teste em duas ou mais espécies de animais;
• Se atender ao critério: produto atende aos requisitos
• Se anormalidades em não menos que 50% (considerando teste inicial e
reteste: Segundo reteste – dobro de animais do teste inicial.
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TESTE DE TOXICIDADE SUBCRÔNICA

• Período de tratamento de 30 dias a 10% da vida média da espécie animal;

Ex: Roedores 90 dias

• Vias de administração:

Fonte: https://www.google.com/search?biw=1517&bih=730&tbm=is.:
⮚ Oral (água ou alimentos);
⮚Tópica;
⮚Inalação;
⮚Injeções;

• Estudos subcrônicos incluem:

⮚Análises bioquímicas;
⮚Consumo de alimentos;
⮚Hematológicas; ⮚Avaliação histopatológica;
⮚Exame de olhos; ⮚Peso corpóreo
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TESTE DE TOXICIDADE SUBCRÔNICA

• Também fornece dados necessários para o estudo crônico

⮚Ex.: níveis de dose

Fonte: https://www.google.com/search?biw=1517&bih=730&tbm=is.:
• Permite entender o desenvolvimento e mecanismos de efeitos tóxicos;
• Planejamento experimental: obtenção máx. de dados.
• Delineamento estatístico N° de animais
• Aplica-se a substâncias químicas;
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TESTE DE TOXICIDADE CRÔNICA

• Estudos de longo prazo: boa parte da vida dos animais teste;

Fontehttp://pesquisa.unievangelica.edu.br/bioterio/animais/
18 a 24 meses 5 a 7 anos
• Vias de administração: mesmas dos estudos agudos e subcrônicos;
• Estudo de oncogenicidade é desejável;
• São empregados 2 ou 3 níveis de doses;
⮚Estudos subcrônicos;
⮚Conhecimento da farmacocinética;
⮚Propriedade tóxica;
⮚Devem ser incluídos machos e fêmeas no estudo.
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TESTE DE TOXICIDADE CRÔNICA

• Estudo típico:

3 doses
50 50
500

Fontehttp://pesquisa.unievangelica.edu.br/bioterio/animais/
2 animais
controles
50 50

• Todos os parâmetros devem ser criteriosamente registrados;

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AVALIAÇÃO DE TERATOGENICIDADE

• Substâncias que causam anormalidades no desenvolvimento fetal;

• Teratogenicidade ocorre precocemente no período fetal: organogênese;
• Efeitos teratogênicos:

Fonte: http://www.inventiva.ind.br/blog/comopenetramosativos
Morfológicas
Anormalidades Bioquímicas
Funcionais

• Modelos de teste:
⮚Animais
⮚In vitro alterações morfológicas e bioquímicas
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AVALIAÇÃO DE TERATOGENICIDADE

⮚Várias doses diárias;

• Fêmea prenhe ⮚Desde o início do desenvolvimento fetal;
• Ensaios de triagem:
⮚Mal formações grosseiras;

Fonte: http://www.inventiva.ind.br/blog/comopenetramosativos
⮚Anomalias do tecido mole ( exame histológico);
⮚Anomalias em ossos;

• Alterações bioquímicas e funcionais do SNC

recém-nascidos Ensaios bioquímicos, clínicos e comportamentais

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AVALIAÇÃO DE TERATOGENICIDADE

• Efeitos da exposição parental a substâncias que podem interferir:

⮚Acasalamento
⮚Implantação do feto
⮚Nascimento
⮚Desenvolvimento

• Podem se manifestar apenas na fase adulta;

• São difíceis de serem estudados;
• As substâncias químicas podem afetar a reprodução em diversos estágios:
⮚Gametas parentais (infertilidade);
⮚Embrião, feto, membrana fetal e placenta;
⮚Metabolismo materno;
⮚Parto;
⮚Lactação;
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AVALIAÇÃO DE TOXICIDADE: TESTES ALTERNATIVOS IN

VITRO

Protestos dos
Significativos Promovendo a
grupos de
e mais busca de
defesa dos
intensos nos métodos
direitos dos
últimos anos alternativos
animais

Busca de Motivos de
sistemas- natureza Forte
teste não científica e influência
animais econômica

Avaliação de sistemas mais

complexos que reproduzam a
totalidade de reações esperadas

Fonte: Disponível: ¹ https://veja.abril.com.br/ciencia/uso-de-animais-em-experimentos-nao-e-opcional-diz-pesquisadora/

² http://olharanimal.org/oito-caes-foram-a-nova-iorque-protestar-contra-testes-em-animais/
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AVALIAÇÃO DE TOXICIDADE: TESTES ALTERNATIVOS IN

VITRO
• Órgãos isolados;
Podem ser • Culturas de células e de
Alternativas tecidos;
eliminados da
cientificamente • Ensaios químicos e físicos;
triagem
comprovadas • Tecidos simulados e fluidos
toxicológica
corpóreos;
• Organismos inferiores;
• Modelos mecânicos;
• Simulações em computador.
sensibilidade) relevância
ee confiabilidade e
reprodutibilidad mas existe
(repetibilidade, de validação,
realizado procedimento
de validação foi todo o
todo o processo concluíram
Validados: Válidos: não

Fonte: Disponível: ¹https://exame.abril.com.br/negocios/como-se-testa-um-cosmetico-sem-crueldade-animal-com-pele-3d/

² https://brasilescola.uol.com.br/biologia/monera.htm
³ http://www.ufjf.br/centralbio/laboratorio/equipamentos/banho-de-orgaos-isolados/
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AVALIAÇÃO DE TOXICIDADE: TESTES ALTERNATIVOS IN

VITRO

Sensíveis, Avaliar o potencial citotóxico

reprodutíveis, fáceis de componentes cosméticos,
Sistemas de cultura
de estabelecer e correlatos, produtos
celular
gerenciar, e menor farmacêuticos, químicos e
custo poluentes ambientais

Dissolvidos em Adicionados
Materiais solúveis
tampão isotônico diretamente

Extrato adicionado a
Materiais insolúveis Extraídos
culturas

Integridade Crescimento Alterações de

celular celular parâmetros

Fonte: Disponível: ¹https://www.labnetwork.com.br/noticias/cultura-de-celulas-e-a-importancia-da-qualidade-da-agua/

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AVALIAÇÃO DE TOXICIDADE: TESTES ALTERNATIVOS IN

VITRO
Citotoxicidade pelo método
de contato direto e eluição

• Lise celular;
Amostras ou • Formação de
Culturas de Incubação Exame
fragmentos vacúolos;
células (24h) microscópico
plásticos • Anormalidades
nucleares

Grau de Porcentagem de
citotoxicidade células afetadas

• CQ dos correlatos, material de

Exige cuidado para que amostras
acondicionamento e cosméticos;
com bordas cortantes ou muito
• Verificar se são seguros e
densas não promovam lise celular
biocompatíveis.

Fonte: Disponível: ¹https://www.labnetwork.com.br/noticias/cultura-de-celulas-e-a-importancia-da-qualidade-da-agua/

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AVALIAÇÃO DE TOXICIDADE: TESTES ALTERNATIVOS IN

VITRO
Citotoxicidade pelo método
de contato direto e eluição

Células Meio de cultura

Incubação [CO2] → pH 7,2
NCTC Clone Placa de Petri adicionado de soro
(24h – 37ºC)
929 (105) bovino (10%)

Exame
microscópio
Condição asséptica → o meio de cultura é
substituído por meio da mesma composição
→ ausência de soro bovino
Garantir
Amostras, ou fragmentos, devem uniformidade
estar estéreis e fragmentados
(10mmx1mm)
Fonte: Disponível: ¹https://www.labnetwork.com.br/noticias/cultura-de-celulas-e-a-importancia-da-qualidade-da-agua/
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AVALIAÇÃO DE TOXICIDADE: TESTES ALTERNATIVOS IN

VITRO
Citotoxicidade pelo método
de contato direto e eluição

✔Extratos do material a ser testado → próprio meio de cultura, que será empregado
sobre as células;
✔Extratos ou diluições em solução fisiológica → produtos cosméticos na forma líquida
ou pulverizada;
✔Incubadas → Examinadas →morte e outros efeitos.

Desprendimento da
parede da placa

Redução do Detectados nos Materiais

volume CP citotóxicos

Granulações

Fonte: Disponível: ¹https://www.griffuscosmeticos.com.br/produto/sabonete-liquido/

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REFERÊNCIA
S
• CHORILLI, Marlus et al. Toxicologia dos cosméticos. Latin American
journal of pharmacy, v. 26, n. 1, p. 144, 2007.
• PINTO, T. de J. A.,. Controle de qualidade de produtos médico-
hospitalares: característica de biocompatibilidade em materiais
poliméricos. 1984. Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo.
• PINTO, T. J. A.; KANEKO, T. M.; OHARA, M. T. Controle biológico de
qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. 2.ed. São
Paulo: Atheneu, 2003. 325p.