Laboratrio de Biodiversidade e Restaurao de Ecossistemas

Conservao da Biodiversidade Restaurao de Ecossistemas - Gentica de Plantas Nativas

Departamento de Biologia Animal e Vegetal - Departamento de Biologia Geral Centro de Cincias Biolgicas - Universidade Estadual de Londrina
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MTODO DE FEULGEN

O mtodo de Feulgen especfico para DNA e fornece preparaes limpas e de excelente contraste. Apesar de ser um mtodo um pouco mais trabalhoso e demorado, quando comparado com outras tcnicas de colorao convencional, os cromossomos aparecem visualmente mais delimitados, com as constries primrias e secundrias mais evidentes. Como desvantagem, podemos citar a instabilidade do corante. As lminas perdem a colorao com mais facilidade, enquanto que o Giemsa, a haematoxilina e o verde de metila permanecem por muito mais tempo. MATERIAL NECESSRIO - reativo de Schiff - placas de Petri, pequena, mdia e grande - pinas de ponta fina, de metal - lminas para microscopia - lamnulas 18x18 - lamnulas 24x24 - seringas de insulina - frascos de vidro p/ 10 ml - papel de filtro ROTEIRO 1. retire as razes fixadas do frasco e lave-as em gua destilada. Normalmente utilizamos dois banhos de 5 minutos com um volume de gua contendo cerca de 20 vezes o volume de raiz, 2. transfira as razes para um frasco contendo HCl 1N, e deixe durante 11 minutos a 600C, ou para HCl 5N, e deixe durante 30 minutos a temperatura ambiente, - carmim actico 1% - cido actico 45% - lcool etlico P.A. - cido actico P.A - lamparina de vidro - bastes de vidro ou metal, lisos - carmim actico 1% - 8-hidroxiquinolena 2mM - gua destilada

3. transfira as razes para outro frasco contendo gua destilada limpa e deixe por 5 minutos. bom tomar cuidado no manuseio das razes, pois a hidrlise cida torna-as frgeis e movimentos bruscos podem quebr-las, 4. retire as razes do frasco com gua e transfira-as para outro frasco contendo cerca de 1 mL de reagente de Schiff. Deixe neste corante por uma a duas horas no escuro. O tempo de exposio ao corante e a eficcia na colorao depender de uma boa hidrlise. aconselhvel verificar a cor das regies meristemticas durante este intervalo de tempo, 5. aps a colorao, retire as razes e transfira-as para uma placa de Petri contendo gua destilada, 6. coloque uma raiz para uma lmina, e com a ajuda de duas agulhas de seringa (insulina) corte a ponta da raiz (local contendo o meristema), 7. retire da lmina a poro da raiz que no contm o meristema e pingue uma gota de cido actico 45% sobre a ponta da raiz. Se a colorao no estiver boa ou se houver necessidade de acentuar a colorao, misture gota de cido actico 45% outra gota de carmim actico 1%. Lembre-se de reduzir o tamanho da gota para no haver perda de clulas durante o preparo, 8. com o auxlio das agulhas de seringa, fragmente a ponta da raiz em pedaos bem pequenos e cubra com uma lamnula. importante que os fragmentos sejam bem pequenos e estejam bem espalhados na rea da lamnula para que possamos obter clulas mais isoladas e cromossomos mais espalhados, 9. bata suavemente com a ponta de um lpis sobre a lamnula para que o material se espalhe. importante que as batidas no sejam muito fortes, pois o material hidrolisado frgil e as clulas podem romper-se,

10. coloque a lmina entre um pedao de papel de filtro dobrado, e com a polpa dos dois polegares pressione a lamnula sobre a lmina, tomando o cuidado para que a lamnula no deslize. Para obtermos um bom espalhamento dos cromossomos necessrio pressionar bem a lamnula contra a lmina, 11. caso apaream bolhas, coloque ao lado da lamnula uma pequena gota de cido actico 45%, enxugue bem e vede as beiradas da lamnula com esmalte incolor, se desejar uma lmina semi-permanente, caso queira uma lmina permanente, retire a lamnula por congelamento ou com cido actico (mergular a lmina em um Jarro de Coplin com cido actico 45% at que a lamnula se despregue), deixe a lmina secar e monte com blsamo do Canad, Entellan ou outro meio de montagem. OBS: Se a colorao estiver fraca, pode ser feito um reforo com Giemsa 1%.