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ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE

I.

Coleta do sangue de coelho

I.0 Usar uma lmina de barbear ou barbeador eltrico para depilar a regio da orelha do coelho prximo ao local que voc for retirar o sangue. I.1 Passar no locar raspado o xilol ou xilieno (vaso dilatador local) usando um cotonete ou algodo. Obs: No passar o vaso dilatador no local do corte ou perfurao. I.2 Preparar um Becker para coletar o sangue adicionado o anticogulante Heparina 1 L/mL de sangue coletado. I.3 Caso seja necessrio, remover o excesso Sangrar o coelho com auxlio de um bisturi (A) ou de uma agulha de seringa hipodrmica (B). I.4 Receber o sangue em um tubo com alguns microlitros de heparina (0,01%) ou outro anticoagulante. I.5 Estancar o sangue com algodo e limpar novamente a orelha com lcool comercial. Obs.: Se no for usar o sangue de imediato guarde na geladeira

II. 1.0

Lavagem do sangue Distribuir o sangue nos tubos de ensaio para centrifugao devendo-se colocar no mximo 2 mL por tubo, em seguida adiciona-se 3x o volume de soluo salina (NaCl 0,15M) em cada tubo (a soluo nesta concentrao pois apresenta uma molaridade semelhante do sangue concentrao salina fisiolgica 8,76g de NaCl/100mL de gua). Equilibrar os tubos das centrfugas e centrifugar a 3000 rpm por15min. Retirar o sobrenadante. Ressuspender as hemcias com NaCl 0,15M Centrifugar por mais 5 minutos
1

2.0

3.0 4.0 5.0

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6.0

Retirar, ressuspender e centrifugar por 5 minutos mais umas 3 ou 4 vezes, ou at que o sobrenadante fique incolor. Na ltima, agita-se sem NaCl; O precipitado de hemcias (eritrcitos glbulos vermelho) e guarda para a utilizao.

Obs. A lavagem do sangue tem por objetivo a retirada do plasma e glbulos brancos e anticoagulante. Ficando-se apenas com as clulas vermelhas (eritrcitos) hemcias.

III. Determinao do hematcrito HEMATCRITO o volume de massa eritride de uma amostra de sangue expressa em percentagem ou frao decimal do volume da mesma Mtodo 1 micro-hematcrito

1.0 Centrifugar o sangue a 11000 rpm em tubos capilares por cinco minutos

2.0 Ler a leitura da coluna do eritride em rgua apropriada ou medir com uma rgua a altura do capilar ocupada por qualquer lquido e divide pela altura do capilar ocupada por hemcias (vermelho).
1.0

Mtodo 2 Bicarbonato de sdio Depois do sangue lavado (um pouco diludo), retirar uma alquota de 0,1mL e adicionar 1,9mL da soluo de bicarbonato de sdio (NaHCO3) a 0,1%. Fazer a leitura no espectrofotmetro 541nm. Usar a seguinte frmula: C% = A541 X 5 0,7

2.0

Obs.: A concentrao de hemcias do sangue utilizado no ensaio de 2% logo depois de determinado o hematcrito, devemos diluir o sangue de modo que fique nesta concentrao. IV. Esquema de ensaio de atividade hemaglutinante Este ensaio auxilia a identificao de lectina numa dada amostra pela capacidade que esta protena tem de aglutinar eritrcito mas para isso precisamos analisar amostra pois outros compostos podem precipitar clulas e dar um resultado falso. Obs.: O primeiro cuidado que voc deve ter ao fazer este ensaio com a lavagem da vidraria a ser utilizada tem que est bem limpa e sem vestgios de sabo.
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1.0Para cada tubo adicionar 200 L de NaCl 0,15M (se o ensaio for realizado em tubo

e 50 L se for realizado em placa).

2.0 Fazer diluies de 200 L (50 L) de extrato total (ET) homogeneizando bem. 3.0 Depois de completada as diluies colocar 200 L (50 L) de sangue 2% por tubo

exceto no ltimo tubo para se hemaglutinar at o penltimo tubo continuarmos as diluies. Veja esquema abaixo: 200 L ET
NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl NaCl 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L 200 L

Sangue 200 L

Sangue 200 L

4.0 Colocar na estufa a 37 0C por 30 min. e na bancada por 30 min. e centrifugar na

rotao 1 (centrfuga de bancada) por 30 segundos. 5.0 A visualizao dos aglutinados feita a olho nu e os resultados expressos como atividade especfica (UH/mL). Se estiver dosando a protena da amostra os resultados podem sem expressos em UH/mgP ou UH/DO (no ltimo caso tem que medir a densidade tica da amostra a 280 nm anteriormente). Obs.: UH representa o inverso da maior diluio ainda capaz de aglutinar eritrcitos. V Consideraes com a amostra

1.0 Se sua amostra for desconhecida temos que delipidar quando esta apresentar alto teor de lipdio. 2.0 A aglutinao pode no ser visualizada dentro de 24 horas ento devemos guardar o experimento por at 24horas ou mais para em seguida observarmos o resultado 3.0 Para verificar se realmente to da aglutinao do sangue devido a lectina, deve-se esquentar a amostra e em seguida esfri-la e verificar se a atividade ainda se mantm ou se mantm com a mesma intensidade. Se se mantiver a aglutinao no devido a lectina pois por sua origem protica esta deveria se desnaturar, pode ser atribuda por exemplo a compostos fenlicos se esta atividade diminuir pode ser atribuda a restante a compostos fenlicos e a perdida a lectina.
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