Garcia 2005

SLVIA MARIA PIRES GARCIA
BIOCATLISE EM MEIOS NO CONVENCIONAIS:

SOLVENTES ORGNICOS, FLUIDOS SUPERCRTICOS E LQUIDOS INICOS
LISBOA 2005
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N. de arquivo: copyright:
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SLVIA MARIA PIRES GARCIA
BIOCATLISE EM MEIOS NO CONVENCIONAIS:

SOLVENTES ORGNICOS, FLUIDOS SUPERCRTICOS E LQUIDOS INICOS
Dissertao apresentada para obteno do Grau de Doutor em Bioqumica, especialidade em Biotecnologia, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Cincias e Tecnologia
LISBOA 2005
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A meus Pais, Irmos, Marido e, especialmente, ao meu filho, Bruno.
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AGRADECIMENTOS
minha orientadora, Professora Susana Barreiros, agradeo, no apenas toda a sua disponibilidade, elevada competncia cientfica e mestria com que assistiu o meu trabalho, mas tambm a amizade e confiana demonstrada ao longo destes anos. Eng. Conceio Almeida, minha querida amiga So, que para alm das suas qualidades profissionais, me proporcionou, todo o seu apoio, amizade, companheirismo e boa disposio. Eng. Clia Peres, companheira de longa data, e Dr. M. Joo Amorim, duas colegas e, acima de tudo amigas, que apesar de em muito diferentes, contriburam de uma forma determinante, com o seu o saber, amizade e disponibilidade para ultrapassar as dificuldades encontradas. Ao Eng. Pedro Vidinha, que interveio directamente nos trabalhos presentes nesta dissertao, pela sua amizade e sua profcua colaborao no desenvolvimentos dos mesmos. Eng. Helena Harvana, pela sua amizade e capacidade de trabalho, que se revelou uma preciosa ajuda no trabalho laboratorial. Ao Dr. Nuno Fontes, pela sua amizade, disponibilidade e transmisso de conhecimentos. Ao Dr. Neil Harper pela sua disponibilidade e contributo cientfico, fundamentais na anlise e consolidao dos resultados obtidos. s colegas Vera Augusto, Diana Lousa, Ana Sequeira e Paula Mimoso pelo contributo no trabalho experimental. Ao Professor Carlos Afonso e Nuno Loureno, pela disponibilidade e colaborao trabalhos desenvolvidos com os lquidos inicos, essenciais para a consecuo do presente trabalho. Professora Eugnia Macedo, Dr. Olga Ferreira e Eng. Adriano Ribeiro, pela contribuio no que respeita s analises termodinmicas, que consubstanciaram e complementaram as concluses alcanadas. Ao Professor Cludio Soares e Nuno Micaelo pelos trabalhos de modelao, que em muito contriburam para um maior aprofundamento dos resultados adquiridos. Ao Professor Marco Gomes da Silva pela disponibilidade demonstrada na resoluo de problemas relacionados com a parte analtica por GC e pelo emprstimo da coluna que proporcionou este tipo de anlise.
D. Maria Jos, Eng. Lcia e Isabel por solucionarem os problema burocrticos, e ao Sr. Lus Leandro e Sr. Louro pela resoluo do problemas tcnicos. fundao para a Cincia e Tecnologia pelo apoio financeiro que tornou possvel a realizao deste trabalho. Aos meus Pais e irmos por toda sua dedicao e apoio prestado. Em especial, minha Me, a quem muito devo todas conquistas por mim alcanadas, por toda a sua devoo e amor e, principalmente, pelo seu inestimvel auxlio na educao e criao do meu filho. Ao meu filho e marido, os alicerces da minha vida, por to simplesmente existirem. E a todos aqueles que de algum modo contriburam para o desenvolvimento deste trabalho. A todos, muito obrigada.
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RESUMO
Realizou-se um estudo comparativo da actividade da enzima cutinase de Fusarium solani pisi imobilizada nos zolitos NaA e NaY, em n-hexano, acetonitrilo, etano supercrtico (etano-sc) e dixido de carbono supercrtico (CO2-sc), a duas actividades da gua diferentes (aW) fixadas com pares de sais hidratados in situ, e em condies cido-base fixadas com tampes slidos possuindo valores de pKa em meio aquoso entre 4,3 e 10. A reaco estudada foi a transesterificao do butirato de vinilo pelo (R,S)-2-fenil-1propanol. A actividade da cutinase para a transesterificao foi mais elevada e semelhante em etano-sc e n-hexano, cerca de uma ordem de grandeza mais baixa em acetonitrilo e ainda mais reduzida em CO2-sc. Os coeficientes de actividade () calculados para os dois substratos indicam que os mesmos esto mais bem solvatados em acetonitrilo e por isso menos disponveis para se ligarem ao centro activo da enzima do que nos outros trs solventes. Os valores de sugerem ainda velocidades de reaco mais elevadas em etano-sc do que em n-hexano, conforme se observou experimentalmente, e evidenciam um efeito negativo directo do CO2-sc na actividade da enzima. A manipulao das condies cido-base do meio no permitiu melhorar as velocidades iniciais de transesterificao relativamente aos brancos (ausncia de tampo cido-base, adio apenas do par de sais hidratados), excepto no caso da cutinase imobilizada no zelito NaA e em etano-sc, a aW = 0,7. O mau resultado para o branco neste caso e o grande melhoramento observado na presena de um tampo bsico sugerem a existncia de um efeito negativo de acidez do meio que, atravs da realizao de uma experincia sem aditivos, se confirmou no ser devido ao reconhecido carcter acdico do par de sais hidratados utilizado para fixar aW = 0,7. Em acetonitrilo, o aumento de aW foi acompanhado por uma diminuio das velocidades iniciais de transesterificao, ao contrrio do que se observou nos outros solventes. Registou-se uma hidrlise considervel em acetonitrilo, solvente no qual as velocidades iniciais de hidrlise aumentaram cerca de 20 vezes quando se passou de aW = 0,2 para aW = 0,7. A hidrlise foi menos pronunciada em etano-sc e em n-hexano, e foi apenas
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observada a aW = 0,7. Em CO2-sc, s se detectou cido butrico aps tempos de reaco muito longos, o que est de acordo com uma actividade cataltica genericamente baixa neste solvente. Mediram-se ainda as actividades catalticas da cutinase imobilizada no zelito NaY na mesma reaco modelo de transesterificao em trs lquidos inicos (LIs) contendo como catio o io imidazlio, a aW = 0,2 e 0,7. Para comparao, mediram-se tambm as actividades catalticas da lipase B de Candida antarctica imobilizada numa resina acrlica (Novozym 435) nos mesmos LIs, em etano-sc, em CO2-sc e em n-hexano. A actividade de transesterificao da cutinase foi mais elevada e semelhante em 1-n-butil3-metilimidazlio hexafluorofosfato ([C4mim][PF6]), etano-sc e n-hexano, e aumentou com o aumento de aW. Em LIs, observou-se hidrlise apenas a aW = 0,7. Quer as velocidades iniciais de transesterificao, quer de hidrlise da Novozym diminuiram com o aumento de aW. O CO2-sc no teve um efeito negativo na actividade desta enzima que foi to elevada em CO2-sc quanto em etano-sc e em n-hexano. As velocidades de reaco baixas registadas neste caso nos LIs sugerem a existncia de limitaes difusionais internas que no se verificam no caso da preparao de cutinase, na qual a enzima se encontra adsorvida apenas superfcie do suporte. O CO2-sc no afectou de forma negativa a actividade cataltica da cutinase suspensa em [C4mim][PF6], o que sugere um efeito protector do LI. No caso da Novozym, obteve-se um aumento acentuado da velocidade de transesterificao no sistema [C4mim][PF6]/CO2-sc, relativamente ao [C4mim][PF6] sozinho. Este facto pode reflectir um melhoramento da transferncia de massa dos solutos para os poros da matriz de imobilizao, devido elevada concentrao de CO2 dissolvido e reduo da viscosidade do LI. temperatura de 35 C, tinha-se verificado que a enantioselectividade (E) da cutinase relativamente ao (R,S)-2-fenil-1-propanol era baixa e no era afectada por qualquer manipulao das condies do meio. Este estudo foi complementado com outro sobre a influncia da temperatura (T) e do solvente em E, a valores de T iguais ou inferiores a 0 C.
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Para o efeito, comeou por se medir a actividade cataltica da cutinase imobilizada superfcie do zelito NaY na transesterificao do butirato de vinilo com o 2-fenil-1propanol em n-hexano, a temperaturas entre 18 e 35 C e valores de aW fixados temperatura ambiente. Para comparao, mediu-se tambm a actividade cataltica da lipase B de Candida antarctica (CALB) imobilizada (Novozym 435). A 0 e 18 C, a cutinase exibiu em n-hexano cerca de 50 e 20 % da actividade exibida a 35 C, respectivamente, valores que desceram para cerca de 30 e 10 % no caso da CALB. O clculo dos coeficientes de difuso a diluio infinita dos dois substratos em n-hexano sugeriu que aquelas variaes de actividade no devero reflectir quaisquer limitaes difusionais externas. A diminuio de T no afectou substancialmente a razo das velocidades de transesterificao e de hidrlise para as duas enzimas. A enantioselectividade da cutinase foi medida em n-hexano, em acetonitrilo e em [C4mim][PF6]. O valor de E praticamente duplicou quando T desceu de 35 para 0 C, mas manteve-se constante (E 4,6) com uma diminuio adicional de T at 25 C. O valor de E obtido em n-hexano para valores de T iguais ou inferiores a 0 C foi idntico ao obtido em [C4mim][PF6] a 18 C, apesar da provvel existncia de limitaes difusionais externas devido elevada viscosidade deste solvente. Ainda, a informao existente sobre o equilbrio de fases nos sistemas binrios formados por cada um daqueles solventes com a gua sugere que ter havido separao de fases s temperaturas de trabalho mais baixas. Em acetonitrilo, E da cutinase no variou com T, e o mesmo se observou para a CALB. No entanto, em n-hexano, E da CALB teve uma variao com a temperatura que conduziu a uma relao linear de ln E com o inverso de T, como esperado (E aumentou cerca de 5 vezes entre 35 e 25 C).
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ABSTRACT
We performed a comparative study on the activity of Fusarium solani pisi cutinase immobilized on zeolites NaA and NaY, in n-hexane, acetonitrile, supercritical ethane (scethane) and sc-CO2, at two different water activity (aW) values set by salt hydrate pairs insitu and at acid-base conditions fixed with solid-state buffers of aqueous pKa between 4,3 and 10,6. The reaction studied was the transesterification of vinyl butyrate by (R,S)-2phenyl-1-propanol. The transesterification activity of cutinase was highest and similar in sc-ethane and in nhexane, about one order of magnitude lower in acetonitrile and even lower in sc-CO2. Activity coefficients () generated for the two substrates indicated that they were better solvated in acetonitrile and thus less available for binding at the active site than in the other three solvents. data also suggested higher reaction rates in sc-ethane than in n-hexane, as observed, and provided evidence for a direct negative effect of sc-CO2 on enzyme activity. Manipulation of the acid-base conditions of the media did not afford any improvement of the initial rates of transesterification relative to the blanks (no added acid-base buffer, only salt hydrate pair), except in the case of cutinase immobilized on zeolite NaA in sc-ethane at aW = 0,7. The poor performance of the blank in this case and the great improvement observed in the presence of a basic buffer suggest a deleterious acidic effect in the medium, which an experiment without additives confirmed was not due to the known acidic character of the salt hydrate pair used to set aW = 0,7. In acetonitrile, increasing aW was accompanied by a decrease in initial rates of transesterification, unlike in the other solvents. There was considerable hydrolysis in acetonitrile, where initial rates of hydrolysis increased about 20-fold from aW = 0,2 to aW = 0,7. Hydrolysis was less pronounced in sc-ethane and in n-hexane, and only at aW = 0,7, and in sc-CO2 butyric acid was detected only at very long reaction times, in agreement with a generally low catalytic activity. We also measured the catalytic activities of cutinase immobilized on zeolite NaY in the same model transesterification reaction in three imidazolium cation-based ionic liquids (RTILs), at aW = 0,2 and 0,7. For comparison, the catalytic activities of Candida antarctica
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lipase B immobilized on an acrylic resin (Novozym 453) were measured in the same RTILs, in sc-ethane, in sc-CO2 and in n-hexane. The transesterification activity of cutinase was highest and similar in 1-n-butyl-3methylimidazolium hexafluorophosphate ([C4mim][PF6]), sc-ethane and n-hexane, and increased with an increase in aW. In RTILs, hydrolysis was detected at aW = 0,7 only. Both initial rates of transesterification and of hydrolysis of Novozym decreased with an increase in aW. Sc-CO2 did not have a deleterious effect on Novozym activity, which was as high as in sc-ethane and n-hexane. The low reaction rates obtained in this case in RTILs suggested the existence of internal diffusion limitations absent in the cutinase preparation where the enzyme is only adsorbed at the surface of the support. Sc-CO2 did not adversely affect the catalytic activity of cutinase suspended in [C4mim][PF6], suggesting a protective effect of the RTIL. In the case of Novozym, a marked increase in the rate of transesterification was obtained in the [C4mim][PF6]/sc-CO2 system, compared to the RTIL alone. This may reflect improved mass transfer of solutes to the pores of the immobilization matrix due to a high concentration of dissolved CO2 and a reduction in viscosity of the RTIL. At 35 C, we had found that the enantioselectivity (E) of cutinase towards (R,S)-2-phenyl1-propanol was low and unaffected by any manipulation of medium conditions. This study was complemented by another on the influence of temperature (T) and solvent on E, at T values equal to or below 0 C. We first measured the catalytic activity of cutinase immobilized at the surface of zeolite NaY in the transesterification of vinyl butyrate by 2-phenyl-1-propanol in n-hexane, at temperatures between 18 and 35 C and aW values fixed at room temperature. For comparison, the catalytic activity of immobilized Candida antarctica lipase B (Novozym 453; immobilized CALB) was also measured. At 0 and 18 C, cutinase exhibited in n-hexane approximately 50 and 20 % of its activity at 35 C, respectively, values that went down to 30 and 10 % for CALB. Diffusion coefficients at infinite dilution calculated for the two substrates in n-hexane suggested that those changes in activity should not reflect any external diffusion limitations. The ratio of
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the rates of transesterification and hydrolysis for the two enzymes was not significantly affected by the lowering of T. The enantioselectivity of cutinase was measured in n-hexane, in acetonitrile and in [C4mim][PF6]. The value of E practically doubled when T was lowered from 35 to 0 C, but remained constant (E 4,6) when T was further lowered to 25 C. The value of E obtained in n-hexane at T values equal to or below 0 C was the same as that obtained in [C4mim][PF6] at 18 C, although the high viscosity of the latter solvent makes it likely that there were external diffusion limitations in that case. Also the information available on phase equilibria for the binary systems formed by each of those solvents with water suggests that a phase separation occurred at the lower working temperatures. In acetonitrile, E for cutinase did not vary with T, and the same behavior was observed with CALB. However, in n-hexane E for CALB responded to changes in T that led to a linear relationship between ln E and the inverse of T, as expected (E increased approximately 5 times between 35 and 25 C).
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NOMENCLATURA
ai Actividade de uma espcie i genrica. aW Actividade da gua . BSNA Biocatlise em solventes no aquosos CO2 Dixido de carbono. E Razo enantiomrica, tambm designada apenas por enantioselectividade. e.e. Excesso enantiomrico. Fluido-sc Fluido supercrtico. G# Diferena entre as energias de Gibbs de activao para os dois enantimeros. GC Cromatografia gasosa . H# Diferena entre as entalpias de activao para os dois enantimeros. Km Constante de MichaelisMenten para a dissociao.
LI Lquido inico (room-temperature ionic liquid).
Pc Presso crtica. S# Diferena entre as entropias de activao para os dois enantimeros. T Temperatura. Tc Temperatura crtica. Tinv Temperatura de inverso. Tr Temperatura racmica. Vi Velocidade inicial. xi fraco molar da espcie i. i Coeficiente de actividade da espcie i na conveno simtrica (i.e. ai = xi i).
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NDICE GERAL
1 2
INTRODUO GERAL E OBJECTIVOS ..............................................................3 REVISO BIBLIOGRFICA ...................................................................................9 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.3 2.4 2.5 2.6 2.6.1 2.6.2 2.6.3 2.7 BIOCATLISE EM SOLVENTES NO AQUOSOS (BSNA) ............................................9 PARMETROS CRTICOS NA BSNA........................................................................11 gua .............................................................................................................11 Estado de ionizao efeitos cido base ....................................................13 Solvente........................................................................................................15 Suporte enzimtico.......................................................................................16 Baixa temperatura .......................................................................................19 BIOCATLISE EM FLUIDOS SUPERCRTICOS ..........................................................20 BIOCATLISE EM LQUIDOS INICOS .....................................................................23 BIOCATLISE EM LQUIDOS INICOS/CO2-SC .........................................................24 LIPASES E ESTERASES DE SERINA .........................................................................25 Cutinase de Fusarium Solani Pisi ...............................................................27 Lipase B de Candida antarctica (CALB).....................................................29 Mecanismo reaccional das lipases e das esterases de serina .....................30 ENGENHARIA DE PROTENAS E OUTRAS ABORDAGENS .........................................33
ACTIVIDADE DA CUTINASE EM MEIOS SUPERCRTICOS E
ORGNICOS: EFEITOS DA ACTIVIDADE DA GUA E DA SOLVATAO E EFEITOS CIDO-BASE ..................................................................................................37 3.1 3.2 3.3 RESUMO ................................................................................................................37 INTRODUO ...................................................................................................38 MATERIAIS E MTODOS................................................................................41 Materiais......................................................................................................41 Imobilizao da enzima ...............................................................................42 Ensaios enzimticos.....................................................................................42 Mtodos de anlise ......................................................................................43 Coeficientes de actividade ...........................................................................44
3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5
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3.4 3.5
RESULTADOS E DISCUSSO ...................................................................................44 CONCLUSO .....................................................................................................52
ESTUDO COMPARATIVO DE BIOCATLISE EM SOLVENTES NO-
CONVENCIONAIS: LQUIDOS INICOS, FLUIDOS SUPERCRTICOS E MEIO ORGNICO .......................................................................................................................57 4.1 4.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.4 4.5 RESUMO .............................................................................................................57 INTRODUO ...................................................................................................58 MATERIAIS E MTODOS ........................................................................................60 Materiais ......................................................................................................60 Imobilizao da cutinase .............................................................................60 Ensaios enzimticos em Batch .....................................................................61 Reaces em reactor continuo .....................................................................62 Mtodos de anlise ......................................................................................62 RESULTADOS E DISCUSSO ...................................................................................63 CONCLUSO ..........................................................................................................70
ACTIVIDADE E ENANTIOSELECTIVIDADE DA CUTINASE A BAIXA
TEMPERATURA EM MEIOS NO-CONVENCIONAIS...........................................73 5.1 5.2 5.3 RESUMO .............................................................................................................73 INTRODUO ...................................................................................................74 MATERIAIS E MTODOS ................................................................................76 Materiais ......................................................................................................76 Imobilizao da cutinase no zelito NaY.....................................................77 Ensaios enzimticos .....................................................................................77 Mtodos de anlise ......................................................................................78 RESULTADOS E DISCUSSO ...................................................................................79 CONCLUSO .....................................................................................................85
5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.4 5.5
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CONCLUSO GERAL.............................................................................................89 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.....................................................................97
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NDICE DE FIGURAS
Fig. 1.1 Reaco alvo: Transesterificao do butirato de vinilo com o 2-fenil-1-propanol. ................................................................................................................................4 Fig. 1.2 Reaco secundria: hidrlise do butirato de vinilo. ..............................................4 Fig. 2.1 Estruturas dos caties mais comuns em LIs. (a) tetralquilamnio. (b) tetralquilfosfnio. (c) 1,3-dialquilimidazlio. (d) alquilpiridnio.........................23 Fig. 2.2 Estrutura da cutinase, destacando a trade cataltica [Carvalho et al., 1999] .....28 Fig. 2.3 Estrutura da CALB, destacando a trade cataltica...............................................29 Fig. 2.4 Mecanismo ping-pong bi-bi aplicado transesterificao do butirato de vinilo com o 2-fenil-1-propanol e reaco secundria de hidrlise do ster substrato. ..............................................................................................................................32 Fig. 3.1 Efeito dos tampes cido-base slidos e de aW nas velocidades iniciais de transesterificao da cutinase imobilizada no zelito NaY, em fluidos-sc e solventes orgnicos. O eixo esquerdo dos yy refere-se ao etano-sc e ao n-hexano (dados do lado esquerdo da linha a tracejado). pKa em meio aquoso dos tampes (25C): 10,3 (Na2CO3/NaHCO3), 9,6 (CAPSO/CAPSONa), 7,2 (MOPS/MOPSNa), 4,3 (GLU/GLUNa). T = 35 C. P = 100 bar (fluidos-sc). [2fenil-1-propanol] = 25 mM. [butirato de vinilo] = 170 mM. [preparao enzimtica]: 1 g L1 ou 4 g L1 (CO2-sc). ........................................................45 Fig. 3.2 Efeito dos tampes cido-base slidos e de aW nas velocidades iniciais de transesterificao da cutinase imobilizada no zelito NaA, em fluidos-sc e solventes orgnicos. O eixo esquerdo dos yy refere-se ao etano-sc e ao n-hexano (dados do lado esquerdo da linha a tracejado)....................................................46 Fig. 3.3 Velocidades iniciais da hidrlise em fluidos-sc e em solventes orgnicos. O eixo do yy esquerdo foi usado para o etano-sc e n-hexano (dados do lado esquerdo da linha a tracejado)..................................................................................................48 Fig. 4.1 Montagem utilizada nos ensaios efectuados em contnuo. P1, P2 = bombas de HPLC. B1, B2, B3 = banhos termostticos. S1, S2 = amostragem. sb = barra de agitao. ...............................................................................................................62 Fig. 4.2 Concentrao da gua em LI a aW = 0,2 (barras brancas), aW = 0,7 (barras cinzento claro), e na saturao (barra cinzento escuro), a T = 25 C.. ...............64
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Fig. 4.3 Velocidades iniciais de transesterificao para a cutinase imobilizada no zelito NaY em LIs, fluidos-sc e n-hexano, a aW = 0,2 e aW = 0,7. O cdigo para as barras o mesmo da Fig. 4.2 T = 35 C, P = 100 bar (fluidos-sc). [2-fenil-1propanol] = 60 mM. [butirado de vinilo] = 170 mM. [cutinase imobilizada] = 6 g L-1 (LIs), 1 g L-1 (etano-sc e n-hexano), 4 g L-1 (CO2-sc). As velocidades so dadas por mg de preparao de enzima imobilizada. ..........................................64 Fig. 4.4. Velocidades iniciais de hidrlise para a cutinase imobilizada no zelito NaY em LIs a aW = 0,7. As condies reaccionais so as mesmas da Fig. 4.3. ...............66 Fig. 4.5 Velocidades iniciais de transesterificao para a Novozym em LI, fluidos-sc e nhexano, a aW = 0,2 e aW = 0,7 (no se recolheram dados a aW = 0,7 em fluidossc). [Novozym] = 2 g L-1 ou 4 g L-1 (LI). As restantes condies reaccionais so as indicadas na Fig. 4.3. As velocidades so dadas por mg de Novozym. ...........66 Fig. 4.6 Velocidades iniciais de hidrlise para a Novozym em LIs, fluidos-sc e n-hexano a aW = 0,2 e aW = 0,7 (no se recolheram dados a aW = 0,7 em fluidos-sc). Condies reaccionais iguais s da Fig. 4.5. ......................................................68 Fig. 5.1 Efeito da temperatura nas velocidades iniciais de transesterificao (barras com rebordo fino) e de hidrlise (barras com rebordo grosso) para a cutinase imobilizada no zelito NaY (barras cinzentas) e para a Novozym (barras brancas), em n-hexano. No se detectou hidrlise com a cutinase a 35 C. Todos os componentes da mistura reaccional foram pr-equilibrados a aW = 0,7, temperatura ambiente. [2-fenil-1-propanol] = 100 mM. [butirado de vinilo] = 300 mM. As velocidades iniciais so dadas por mg de protena (cutinase) ou por mg de preparao enzimtica (Novozym).............................................................80
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NDICE DE TABELAS
Tabela 2.1 Temperatura e presso crticas das algumas substncias utilizadas como fluidos-sc em biocatlise....................................................................................22 Tabela 3.1 Coeficientes de actividade a diluio infinita calculados para as misturas binrias (soluto + solvente)...............................................................................49 Tabela 3.2 Coeficientes de actividade calculados para as misturas quaternrias a aW = 0,7. .....................................................................................................................51 Tabela 5.1 Efeito da temperatura nos coeficientes de difuso dos dois substratos a diluio infinita, em n-hexano. ........................................................................................82 Tabela 5.2 Efeito da temperatura e do solvente na enantioselectividade da cutinase e da CALB..................................................................................................................84
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Intriduo Geral e Objectivos
CAPTULO 1
Introduo Geral e Objectivos
Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 1
INTRODUO GERAL E OBJECTIVOS
A conscincia cada vez maior da necessidade de utilizao de tecnologias ambientalmente sustentveis (verdes) tem conduzido adopo de metodologias catalticas mais eficientes para a produo de compostos qumicos, como a catlise enzimtica, e utilizao de solventes alternativos, como os fluidos supercrticos e os lquidos inicos [Sheldon, 2005]. Os primeiros podem ser facilmente eliminados por simples descompresso, e os segundos no tm presso de vapor mensurvel. A presente dissertao tem como principal objectivo contribuir para um melhor conhecimento do comportamento das enzimas em meios no convencionais e, em particular, nas duas classes de solventes verdes acima referidas. As propriedades enzimticas abordadas no presente estudo so a actividade e a enantioselectividade. A ltima talvez a mais importante do ponto de vista de aplicaes industriais das enzimas [Klibanov, 2001, Krishna, 2002, Ghanem e Abul-Enein, 2005]. Ao longo da dissertao, faz-se sempre o contraponto com os solventes orgnicos, nos quais foi realizada a maioria dos estudos fundamentais de biocatlise em solventes no aquosos at data. A enzima em que se baseia o presente estudo a cutinase de Fusarium solani pisi, uma esterase de serina produzida e purificada no Centro de Engenharia Biolgica e Qumica (Instituto Superior Tcnico). Para comparao, utiliza-se a lipase B de Candida antarctica que provavelmente a lipase mais utilizada em biocatlise. A reaco alvo foi a transesterificao do butirato de vinilo pelo 2-fenil-1-propanol (Fig. 1.1), podendo tambm ocorrer a reaco secundria de hidrlise do butirato de vinilo (Fig. 1.2).
H3C
OH OH H3C O H3C O
H3C O
CH2
H2C
Butirato de Vinilo
2-fenil-1-propanol
Butirato de 2-fenil-1-propilo
cool Vinlico
H3C Tautomerizao O
O H3C +
H3C O Acetaldedo
Butirato de 2-fenil-1-propilo
Fig. 1.1 Reaco alvo: Transesterificao do butirato de vinilo com o 2-fenil-1-propanol.
OH H3C O Butirato de Vinilo gua O CH2 + H2O H3C O cido Butrico lcool Vinlico OH + H2C
H3C Tautomerizao O cido Butrico
OH
H3C O Acetaldedo
Fig. 1.2 Reaco secundria: hidrlise do butirato de vinilo.
ORGANIZAO
Esta dissertao foi organizada da seguinte forma: Captulo 2 Reviso bibliogrfica Este captulo aborda de uma forma sucinta a rea de estudo biocatlise em meios no aquosos. Comea com uma sumarizao dos principais parmetros relevantes nos estudos de catlise enzimtica em solventes no convencionais: actividade da gua, estado de ionizao da enzima, solvente e suporte enzimtico. Refere-se depois brevemente a utilizao de baixas temperaturas, em especial do ponto de vista da enantioselectividade enzimtica. Segue-se uma referncia aplicao, na biocatlise, de dois tipos de solventes verdes: fluidos supercrticos e lquidos inicos. Por fim, faz-se a descrio das duas enzimas estudadas uma esterase de serina e uma lipase e indicam-se brevemente outras abordagens para optimizar o comportamento das enzimas em meios no aquosos. Captulo 3 Actividade da Cutinase em Meios Supercrticos e Orgnicos: Efeitos da Actividade da gua e da Solvatao e Efeitos cido-Base Neste captulo estuda-se o modo como os parmetros actividade da gua, estado de ionizao da enzima, suporte enzimtico (zelitos) e solvente afectam a actividade da cutinase em dois solventes supercrticos e em dois solventes orgnicos. Captulo 4 Estudo Comparativo de Biocatlise em Solventes No-Convencionais: Lquidos Inicos, Fluidos Supercrticos e Meio Orgnico Neste captulo comparam-se as actividades da cutinase e da lipase B de Candida antarctica imobilizadas em trs lquidos inicos, dois fluidos supercrticos e um solvente orgnico. Utilizou-se ainda um sistema combinado de lquido inico/dixido de carbono supercrtico. Captulo 5 Actividade e Enantioselectividade da Cutinase a Baixa Temperatura em Meios No-Convencionais Neste captulo comparam-se, numa gama de temperaturas que vo desde 35 C at cerca de 20 C, as actividades e enantioselectividades da cutinase imobilizada, em dois solventes
orgnicos e num lquido inico. Apresenta-se ainda um estudo comparativo para a lipase B de Candida antarctica imobilizada. Captulo 6 Concluso geral No final desta dissertao apresenta-se um captulo de concluses gerais e sugestes para trabalho futuro. Captulo 7 Referncias Bibliogrficas Neste captulo esto includas todas as referncias bibliogrficas indicadas nos vrios captulos da dissertao. Os contedos dos captulos 3 e 4 foram reproduzidos dos seguintes artigos: Garcia S.,Vidinha, P., Arvana, H., Gomes da Silva, M. D.R,. Ferreira, M. O., Cabral, M.S. J., Macedo E. A., Harper, N. e Barreiros, S., Cutinase activity in supercritical and organic media: water activity, solvation and acidbase effects, J. Supercrit. Fluid., 2005, 35 62 69 (captulo 3). Garcia S., Loureno, N. M. T., Lousa D., Sequeira, A. F., Mimoso, P., Cabral, J. M. S., Afonso, C. A. M. e Barreiros, S., A comparative study of biocatalysis in non-conventional solvents: Ionic liquids, supercritical fluids and organic media, Green Chem., 2004, 6, 466470 (captulo 4).
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CAPTULO 2
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REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 BIOCATLISE EM SOLVENTES NO AQUOSOS (BSNA)

As enzimas so catalisadores extremamente eficientes do ponto de vista do aumento de velocidade que proporcionam relativamente reaco no catalisada. De um modo geral, a ligao do substrato enzima um processo que se d com uma variao de energia de Gibbs negativa e que, portanto, estabiliza o substrato. o facto de a afinidade da enzima para o estado de transio ser maior do que para o substrato que explica a diminuio da energia de Gibbs de activao associada aco das enzimas [Price et al., 2001]. A eficincia energtica destes catalisadores (funcionamento em condies experimentais suaves) constitui uma das suas principais vantagens relativamente aos catalisadores no biolgicos. Contudo, sem dvida a selectividade que est na base da procura crescente de enzimas para aplicaes industriais [Krishna, 2002, Turner, 2003, Ghanem e Abul-Enein, 2005], nomeadamente [Klibanov, 2001] a selectividade para o substrato (capacidade de discriminar substratos distintos mas estruturalmente semelhantes), a enantioselectividade (preferncia por um ou outro enantimero), a regioselectividade (preferncia por um entre vrios grupos funcionais idnticos na molcula de substrato) e a quimioselectividade (favorecimento de um determinado grupo funcional do substrato). Nas ltimas dcadas, a biocatlise emergiu como uma tecnologia poderosa para a produo de muitos compostos importantes, como materiais para a sntese de polmeros, intermedirios enantiomericamente puros para a produo de frmacos e agroqumicos, antibiticos, ingredientes para indstria alimentar, como adoantes e vitaminas, etc. [Bertau, 2002, Krishna, 2002, Schoemaker et al., 2003, Ghanem e Aboul-Enein, 2005]. As primeiras aplicaes das enzimas na indstria qumica envolviam biotransformaes realizadas em meios aquosos. A associao da funo enzimtica a este tipo de meios constituiu um impedimento para uma utilizao mais alargada das enzimas j que, em meio aquoso, a maior parte dos compostos orgnicos de interesse comercial so pouco solveis ou mesmo instveis, e muitos processos de interesse so pouco favorveis
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termodinamicamente [Klibanov, 2001]. Em 1984, desvaneceu-se o dogma relativamente impossibilidade de utilizar solventes no aquosos na bioctalise [Zaks e Klibanov, 1984]. Entre as vantagens potenciais que tornam aliciantes a BSNA, contam-se [Dordick, 1989]:
catlise de reaces difceis de realizar em gua, devido ao aumento da solubilidade de substratos, produtos e/ou outros componentes no polares;
deslocamento do equilbrio reaccional no sentido da sntese devido reduo do teor de gua;
facilidade de recuperao do biocatalisador e dos produtos da reaco; estratgias de imobilizao facilitadas, por exemplo atravs do recurso a mtodos fsicos, visto as enzimas no se desadsorverem facilmente (excepto no caso de processos em contnuo).
Apesar de tambm haver potenciais desvantagens da BSNA, como baixas actividades enzimticas, quando comparadas com meios aquosos, limitaes difusionais, sobretudo no caso de catalisadores imobilizados, ou toxicidade (de alguns solventes orgnicos), o estudo pioneiro de Zaks e Klibanov [1984] foi seguido de muitos outros, e as aplicaes comerciais deste tipo de sistemas tm-se multiplicado. So disso exemplo a produo de aminas e lcoois quirais para a produo de farmacuticos e pesticidas, obtidos por hidrlise numa mistura de ter t-butil-metlico e metoxi-acetato de etilo catalisada pela lipase de Burkholderia plantarii imobilizada, realizada pela BASF, a produo de um frmaco anti-colesterol obtido por acilao em tolueno catalisada pela lipase de Pseudomonas cepacia imobilizada, realizada pela Bristol-Myers-Squibb, ou a produo de palmitato e miristato de isopropilo para a produo de sabes, cremes e lubrificantes, obtidos por esterificao em 2-propanol catalisada pela lipase da Candida antarctica, realizada pela Uniquema [Krishna, 2002]. Actualmente, a comunidade acadmica e industrial v a biocatlise e, em particular, a BSNA, como uma rea de pesquisa promissora, especialmente no desenvolvimento de processos ambientalmente sustentveis. De facto, hoje em dia, entende-se como solventes no aquosos no apenas os tradicionais e problemticos solventes orgnicos (txicos e prejudiciais ao ambiente), mas tambm uma gama de solventes que vo ao encontro da
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recente rea de investigao e desenvolvimento denominada de qumica verde, caracterizada essencialmente pelo desenvolvimento de processos ambientalmente benignos [Poliakoff et al., 2002, DeSimone, 2002]. Entre estes ltimos, encontram-se os fluidos supercrticos (fluidos-sc) e os lquidos inicos (room-temperature ionic liquids, LIs). Os fluidos-sc j so utilizados em biocatlise h vrios anos [Randolph et al., 1985, Hammond et al., 1985, Nakamura et al., 1985], mas os LIs s mais recentemente tm sido utilizados para esse fim [Erbeldinger et al., 2000, Cull et al., 2000].
2.2 PARMETROS CRTICOS NA BSNA

2.2.1 gua A gua tem um papel preponderante na catlise em solventes no aquosos, essencialmente devido ao efeito relevante que desempenha nas propriedades que a enzima exibe (actividade, estabilidade e selectividade) [Bell et al, 1995]. Na realidade, quando a gua adicionada a sistemas enzimticos no aquosos, esta distribui-se entre a enzima, a fase do solvente e pelo suporte, quando utilizado. Assim, um dos aspectos importantes a ter em conta, mais do que a concentrao da gua no meio, a sua disponibilidade para a enzima (hidratao da enzima), nomeadamente a sua interaco com o centro activo. De facto, a adio de gua em solventes no aquosos leva a um aumento da mobilidade do centro activo, devido essencialmente a um incremento da sua flexibilidade e polaridade, atravs da formao de ligaes de hidrognio entre a gua e os grupos funcionais da enzima [Klibanov, 1997]. A gua tem, por assim dizer, um efeito plastificante na enzima [Rupley et al., 1983]. As enzimas so inactivas quando completamente secas, aumentando a sua actividade com o aumento do grau de hidratao, podendo funcionar com menos de uma monocamada de gua por molcula de enzima [Klibanov, 1989 e Halling, 1994]. A quantidade de gua ptima para a actividade enzimtica depende do tipo de enzima utilizada [Wehtje et al., 1997, Ma et al., 2002, Valivety et al., 1992 a, e Valivety et al., 1992 b]. O perfil tpico da actividade enzimtica em funo da hidratao da enzima apresenta um mximo correspondente ao valor ptimo de hidratao, abaixo e acima do qual actividade da
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enzima menor [Almeida et al., 1998]. Este perfil influenciado pelo tipo de suporte, quando a enzima est imobilizada [Valivety et al.,1992 a]. Na fase inicial de hidratao, o aumento da gua ligada enzima tem um efeito benfico a nvel da flexibilizao da mesma e do centro activo, em particular [Partridge et al., 1998]. No entanto, a presena de uma elevada quantidade de gua pode facilitar a agregao da enzima ou dificultar o acesso de substratos ou produtos de e para o centro activo da mesma, o que incorre, normalmente, numa reduo da actividade [Valivety et al., 1992 b]. Nveis elevados de gua disponvel para a enzima podem, ainda, conduzir desnaturao da mesma, j que a mobilidade conformacional acrescida que advm de uma elevada hidratao permite enzima ultrapassar o impedimento cintico que normalmente a impede de perder a estrutura nativa no meio no aquoso [Griebenow e Klibanov, 1996]. A disponibilidade da gua tambm tem uma importncia determinante na competio entre as reaces de sntese ou de hidrlise, como ser referido mais adiante [Halling, 1994]. Um dos parmetros normalmente utilizados em meios no aquosos para quantificar o nvel de distribuio da gua no meio (enzima, solvente e suporte enzimtico) o parmetro actividade da gua (aW) [Halling, 1994, Bell et al., 1995]. aW pode ser determinado atravs da equao aW = W xW, em que W o coeficiente de actividade da gua e xW a sua fraco molar. Os valores de aW variam entre 0, para meios completamente secos, e 1, em solventes imiscveis com a gua saturados, ou em solventes miscveis com a gua de tal forma diludos que a fraco molar da gua virtualmente 1. aW pode ser medida directamente com sensores de humidade [Halling, 1994, Dossat et al., 1999], ou indirectamente, atravs da medio da concentrao de gua no meio reaccional pelo mtodo de Karl-Fischer, e utilizao de uma escala de aW em funo da concentrao da gua [Almeida et al., 1998]. Esta escala pode ser construda utilizando uma metodologia de fixao de aW, ou ento uma metodologia de fixao e controlo simultneos daquele parmetro:
pr-equilibrio do solvente, dos substratos, preparao de enzima e tampes slidos (quando utilizados) com uma soluo saturada de um sal, atravs da fase de vapor [Greenspan, 1977]. A presso parcial da gua no sistema uma fraco da presso de vapor da gua mesma temperatura, e depende do sal utilizado. Este mtodo evita a
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utilizao de substncias adicionais no meio, mas no previne as alteraes de aW decorrentes do consumo ou formao de gua durante o processo reaccional;
adio in situ ao sistema reaccional de pares de sais hidratados (ou zelitos, para obteno de valores de aW muito baixos) que, tal como referido atrs, conduzem a um determinado valor de presso parcial da gua [Halling, 1992]. Este mtodo muito prtico para no s fixar, mas tambm controlar aW, mas dever ser utilizado com especial ateno dado que h evidncia de que estes agentes (e tambm os zelitos) poderem influenciar a actividade enzimtica [Fontes et. al., 2002, Fontes et al, 2003 b], e, no caso especifico de reaces de esterificao, podem no dar uma resposta suficientemente rpida s alteraes de concentrao de gua no meio [Peres et al., 2003].
Os estudos cinticos com enzimas em meios no aquosos devem ser efectuados a aW constante, de modo a garantir que o grau de hidratao da enzima seja constante. Quando um meio reaccional equilibrado a um determinado valor de aW, apesar de poderem existir diferentes concentraes de gua, aW o mesmo para todas as fases presentes. assim possvel determinar qual o valor de aW ptimo associado ao melhor comportamento enzimtico. Existe evidncia de que o valor ptimo de aW encontrado para uma determinada enzima o mesmo, independentemente do solvente utilizado [Bell et al 1995], sugerindo assim que os solventes no afectam directamente a enzima, apesar da gama de velocidades envolvidas poder ser distinta quando se muda de solvente para solvente. De notar que existem alguns casos em que a correlao entre aW e a hidratao da enzima pode no ser idntica entre os diferentes solventes, levando a que iguais actividades de gua possam originar diferentes graus de hidratao da enzima [Corra de Sampaio et al., 1996]. Estes desvios normalmente acontecem em solventes polares, os quais podem competir directamente com a gua para a hidratao de resduos menos polares da enzima e conduzirem a uma hidratao da enzima mais baixa relativamente a solventes menos polares [Bell et al., 1997]. 2.2.2 Estado de ionizao efeitos cido base
Tal como em meios aquosos, a actividade enzimtica muito influenciada pelo estado de ionizao da enzima. Contudo, enquanto que em solventes aquosos o estado de ionizao
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da enzima depende directamente do pH do meio, em meios no aquosos a enzima tende a assumir o estado de ionizao da ltima soluo aquosa qual foi exposta (memria de pH) [Zaks e Klibanov, 1985]. Na realidade, o estado de protonao da enzima em meios no aquosos no depende apenas da actividade dos ies H+ presente no meio, tal como nos meios aquosos, mas tambm da actividade dos contra-ies, como Na+e Cl-, cuja interveno determinante na compensao da carga resultante da ionizao dos grupos cdicos (a) e dos grupos bsicos (b) da enzima em meios de constante dielctrica baixa, como se mostra a seguir: (a) Protena-COOH + Na+ ' Protena-COO- Na+ + H+ (b) Protena-NH3+ + Cl- ' Protena-NH2 + H+ + ClA actividade enzimtica, em termos de efeitos cido-base no estado de ionizao, poder assim ser influenciada por dois parmetros independentes: pH-pNa e pH+pCl [Hallling et al., 1996]. Para o controlo destes parmetros existem dois tipos de tampes cido-base slidos especficos, que controlam um e outro parmetro atravs da troca com a enzima de H+ e Na+, no caso do pH-pNa, e de H+ e Cl-, no caso de pH+pCl [Zacaharis et al., 1997, Harper et al., 2000, Partrige et al., 2000]. O primeiro tipo de tampes efectua o controlo do estado de ionizao dos grupos acdicos da enzima, enquanto o segundo controla os grupos bsicos. Estes tampes slidos consistem essencialmente em pares de sais cristalinos contendo zwitteries. Cada par de sais, no equilbrio, estabelece um valor determinado da razo ou produto das actividades dos ies envolvidos. Existe outro tipo de tampes cido-base, solveis em solventes orgnicos, com capacidade de controlar o estado de ionizao das enzimas naqueles meios [Blackwood et al., 1993, Halling et al. 1996]. Contudo, no se generalizou a utilizao destes tampes, no s porque a baixa solubilidade da forma inica do sal em solventes orgnicos polares limitava o nmero de tampes apropriados para a biocatlise, mas tambm por poder ocorrer inibio da enzima pelos tampes, alm de se introduzir a necessidade de um processo extra de separao, neste caso entre os tampes solveis e os substratos/produtos [Partridge et al. 2000].
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A monitorizao do estado de ionizao de uma enzima pode ser efectuada atravs de indicadores apropriados. Com um indicador cromoionofrico solvel em meios no aquosos [Harper et al., 2000], monitorizou-se eficazmente o parmetro pH-pNa em solventes orgnicos [Harper et al., 2000, Vidinha et al., 2004] e em fluidos-sc [Harper e Barreiros, 2002]. A actuao deste indicador baseia-se no facto de, ao formar um complexo com Na+, apresentar um valor mximo da absorvncia no espectro UV/visvel. Existem espcies usualmente utilizadas em reaces em solventes no aquosos que, por terem a capacidade de permutar ies, podem exercer um efeito cido-base importante na enzima, tal como foi referido acima para os pares de sais hidratados [Fontes et al., 2003 b] e os zelitos [Fontes et al., 2002], embora sem aco tamponizante. 2.2.3 Solvente
O solvente utilizado afecta directa e indirectamente a actividade, estabilidade e selectividade da enzima. A interveno indirecta do solvente efectua-se a nvel da partio da gua, substratos e produtos para o microambiente da enzima. Quanto gua, este efeito devido propenso que determinados solventes tm para remover gua da enzima (water stripping) [Zaks e Klibanov, 1988], levando a uma insuficiente hidratao da mesma e, consequentemente, a um decrscimo da actividade enzimtica [Halling, 1994]. A extenso deste fenmeno maior nos solventes hidroflicos, pelo que os solventes hidrofbicos so normalmente preferidos [Bell, et al., 1995]. Para tal, utilizada por muitos autores uma correlao entre a hidrofobicidade do solvente e o efeito deste na actividade enzimtica [Laane et al., 1987]. Este aspecto vem reforar a ideia, anteriormente referida, de correlacionar a actividade cataltica da enzima com aW j que, ao mesmo valor de aW, a sede do solvente para a gua sensivelmente a mesma para todos os solventes, e o estado de hidratao da enzima ter tambm o mesmo valor. A nvel dos substratos e dos produtos, a interaco indirecta do solvente resulta do seu poder de solvatao que afecta a disponibilidade daqueles no meio reaccional. O solvente interfere assim na partio dos substratos para o centro activo, e dos produtos do centro activo para o solvente. Mais especificamente, o solvente afecta a estabilizao do
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substrato, normalmente traduzida pela diferena de energias de Gibbs (G) entre o complexo enzima-substrato e o substrato livre [Halling, 1994]. Em muitos casos, G pode ser quantificada pela constante KM de Michaelis (constante de dissociao) que tanto mais elevada quanto maior afinidade os substratos tiverem para o solvente, e portanto quanto menor disponibilidade tiverem para o centro activo da enzima [Bell et al., 1995]. Na literatura, encontram-se muitos outros exemplos deste efeito [Ryu e Dordick, 1992, Secundo et al., 1992, Corra de Sampaio et. al., 1996]. Os efeitos directos do solvente podem resultar da penetrao de molculas de solvente no centro activo da enzima, causando alteraes de polaridade no centro activo e afectando a ligao substrato - enzima, [Ryu e Dordick, 1992, Kim e Dordick, 1993]. A aco directa do solvente pode ainda resultar da competio directa entre as molculas de solvente e as do substrato para a ligao ao centro activo da enzima, levando a uma diminuio da actividade cataltica [Corra de Sampaio et al., 1996]. Foram efectuados estudos que indicaram que as espcies orgnicas menos polares apresentavam uma maior propenso para este tipo de competio [Halling, 1994]. Um exemplo que ilustra bem os efeitos directos do solvente no aquosos na actividade enzimtica o caso do CO2-sc que, apesar de apresentar uma srie de benefcios referidos adiante, pode afectar negativamente a actividade enzimtica [Almeida et al., 1998, Borges de Carvalho et al., 1996, Fontes et al. 2001 a, Harper e Barreiros, 2002, Kamat et al., 1995, Marty et al., 1992]. Supe-se que este efeito devido formao de cido carbnico no microambiente da enzima e/ou devido a ligaes covalentes com grupos amina da enzima, atravs da formao de cabarmatos [Kamat, et al., 1995]. 2.2.4 Suporte enzimtico
O recurso imobilizao de enzimas em suportes slidos deve-se essencialmente ao facto destes conferirem enzima uma maior estabilidade [Colacino e Crichton, 1997] e uma melhor disperso nos solventes no aquosos. Por outro lado, a enzima quando imobilizada encontra-se num ambiente (fora inica, pH, molculas de gua) totalmente diferente do existente quando no estado livre, sendo assim de prever que os suportes exeram uma
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grande influncia no comportamento da enzima [Reslow, et al., 1988, Gonalves et al., 1997]. A imobilizao da enzima num suporte pode fazer-se por ligao covalente, por adsoro fsica (mediante o estabelecimento de ligaes de hidrognio, foras de van der Waals, interaces hidrofbicas ou electrostticas entre enzima e suporte) [Bosley e Clayton, 1994, Gonalves, et al., 1997, Partidge et al., 1998, Palomo et al., 2002], atravs da ocluso da enzima numa matriz de plstico ou de sol-gel [Van Unem, 2001, Ozotop et al, 2003, Vidinha et al., 2005], ou ainda atravs do estabelecimento de ligaes cruzadas entre molculas de enzima (cross-linking), sem recurso a um suporte [St Clair e Navia, 1992, Fontes et al., 2001 a, Cao et al., 2003]. Se, por um lado, a interaco enzima suporte pode atribuir uma determinada conformao enzima, levando a um incremento da actividade [Vidinha et al., 2005], por outro pode levar a uma perda desta, por alterao das interaces que sustentam a estrutura tridimensional da enzima [Palomo et al., 2002]. No entanto, a estabilidade acrescida da enzima dever compensar os inconvenientes de uma eventual perda de actividade por imobilizao. As propriedades fsico-qumicas do suporte (rea superficial, dimenses dos poros e das partculas, composio qumica, estrutura, etc.), podem interferir na quantidade de enzima que ligada ao suporte, na partio dos substratos e produtos, e na quantidade de gua disponvel para a reaco enzimtica [Adlerceurtz, 1991, Lee e Parking, 2001, Secundo et al., 1999]. As propriedades do suporte influenciam em conjunto todos estes parmetros, sendo difcil discriminar o impacto de cada uma em separado. Em princpio, um suporte para imobilizao enzimtica dever ter uma boa rea superficial e apresentar dimetro de poro suficiente para que ocorra a difuso apropriada dos substratos e dos produtos, aspecto que assume particular importncia quando a enzima se encontra no interior da estrutura porosa. Por outro lado, a composio qumica do suporte (tipo e distribuio dos grupos funcionais presentes na superfcie ou no interior do suporte, hidrofobicidade, etc.) ter tambm que ser adequada, visto ser determinante nas interaces enzima suporte, na partio de gua, etc.
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Na presente dissertao, as enzimas estudadas encontram-se imobilizadas, uma por adsoro superfcie de um zelito (cutinase), e outra por ligao inica a uma resina acrlica macroporosa (lipase de Candida antarctica). Os zelitos pertencem classe dos silicoaluminatos. So formados por estruturas tetradricas de SiO4 e AlO4, ligadas entre si por tomos de oxignio, dando origem a uma estrutura cristalina de grandes dimenses, com poros e cavidades contendo caties (passveis de troca) e gua (passvel de remoo) [Weitkamp, 2000]. Os diferentes arranjos dos tetraedros do origem a uma grande diversidade de estruturas cristalinas, com diferentes tamanhos de poro (pequeno, entre os 3 e 5 ; mdio, entre os 5 e 6 ; largo, entre os 6 e 9 ; extra-largo, superior a 9 ) [Weitkamp, 2000]. As caractersticas dos zelitos levam sua utilizao em muitos processos, sendo j bem conhecida a sua aplicao na adsoro de vrias espcies qumicas (e.g. parafinas, xileno, olifinas, oxignio, etc.) [Mohanty e McCormic, 1999], como permutadores de ies [Ribeiro Rama et al., 1996] e, mais recentemente, como suportes de imobilizao de biocatalisadores [Gonsalves, 1996, Gonsalves, 1997, Knezevic Z., 1998, Serralha et al., 1998 e Serralha et al., 2001]. As principais caractersticas que tornam os zelitos atractivos para aquelas aplicaes so:
elevada rea superficial devido estrutura microporosa (o volume de poros pode atingir 50 % do volume do zelito);
selectividade de forma (tipo peneiro molecular) que resulta da existncia de uma grande variedade de microestruturas de zelitos (diferentes tamanhos de poros adequados a diferentes molculas), com interesse na catlise e na adsoro;
facilidade em modificar a razo slica / alumina, a natureza e o teor dos caties no seu interior, o que possibilita regular o carcter cido base (acidez de Brnsted e de Lewis) e o carcter hidroflico hidrofbico do zelito, conferindo-lhe uma capacidade de adsoro fortemente selectiva.
No presente trabalho, foram utilizadas as formas sdicas do zelito A (NaA) e Y (NaY), assim designadas por conterem nas suas cavidades o catio Na+. O zelito NaY, com uma razo Si/Al superior a 1,5, mais acdico e menos hidroflico do que o zelito NaA, com uma razo Si/Al igual a 1. O zelito NaY apresenta poros de 7,8 de dimetro (zelito de
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poro largo), enquanto o zelito NaA apresenta poros de 4,2 de dimetro (zelito de poro pequeno). Em ambos os casos, h tambm poros com dimetro de 2,2 . A utilizao de resinas acrlicas como suportes catalticos remonta dcada de 50, estando esta metodologia j vulgarizada em muitas aplicaes comerciais, na indstria farmacutica, indstria de detergentes, indstria alimentar, etc. [Kosugi et al., 1995, Pandey, 1999, Salunkhe e Nair, 2000]. Esto bem documentados os protocolos de imobilizao, caractersticas e aplicaes destes suportes a vrias classes de enzimas [Boller et al., 2002], e a sua utilizao em solventes no aquosos faz-se h duas dcadas [Reslow, et al., 1988]. O suporte utilizado na imobilizao da lipase de Candida antarctica utilizada no presente trabalho foi fornecido pela Bayer e tem a designao Lewatit VP OC 1600. constitudo por partculas com 160 a 1000 m, com uma porosidade de 35 a 45 %, e tem dimetros de poro entre 140 e 170 [informao fornecida pela empresa Novo Nordisk]. 2.2.5 Baixa temperatura
O recurso a baixas temperaturas foi utilizado como estratgia para retardar reaces enzimticas de modo a tornar possvel a deteco de intermedirios de vida curta e, assim, elucidar mecanismos reaccionais [Douzou et al., 1970]. Na altura, a BNSA no tinha surgido, e estes estudos foram realizados em meios aquosos com co-solventes ou aditivos que impedissem o congelamento. A anlise da funo enzimtica a baixas temperaturas recebeu um novo impulso nos ltimos anos. Os organismos psicrfilos vivem em habitats frios e produzem enzimas adaptadas a condies ambientais mais extremas do que as normalmente associadas ao seu funcionamento. Espera-se que o estudo da adaptao estrutural das enzimas a essas condies seja importante do ponto de vista fundamental e possa depois vir a ser explorado ao nvel das aplicaes [Georlette et al., 2004, Hoyoux et al., 2004]. Com o advento da BNSA e a verificao da estabilidade acrescida das enzimas em meios no aquosos com muito pouca gua [Zaks e Klibanov, 1984], comeou a olhar-se mais no sentido inverso, ou seja, no sentido da temperatura mxima a que as enzimas se mantm
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cataliticamente activas, o que depende da forma como as enzimas conseguem resistir ao efeito desnaturante das temperaturas elevadas [Turner e Vulfson, 2000]. No entanto, a utilizao de baixas temperaturas tambm tem sido relevante no contexto da BSNA, nomeadamente do ponto de vista da enantioselectividade. O impacto da temperatura nesta propriedade j foi reconhecido h cerca de vinte anos [Keinan et al., 1986, Lam et al., 1986]. Pham et al. [1989] verificaram inclusivamente a existncia de uma temperatura racmica qual se invertia a preferncia da enzima relativamente aos enantimeros. Tal como sugerido por Holmberg e Hult [1991] e Phillips [1996], a manipulao da temperatura tornou-se uma forma til de fazer um ajuste fino da estereoqumica de reaces catalisadas por enzimas, sobretudo desde que Sakai et al. [1997] utilizaram o abaixamento da temperatura de 30 para 40 C para aumentarem de cerca de cinco vezes a enantioselectividade de uma lipase. De facto, a utilizao de meios no aquosos possibilita a extenso da gama til de temperaturas at valores suficientemente baixos para causar um impacto elevado na enantioselectividade quando esta baixa temperatura ambiente [Ljubovic et al., 1999]. A abordagem de Sakai et al. [1997], agora conhecida como mtodo da baixa temperatura [Sakai et al., 2003 b], tem sido seguida desde ento, conforme revisto por Sakai [2004].
2.3 BIOCATLISE EM FLUIDOS SUPERCRTICOS

O estado supercrtico ocorre quando uma substncia se encontra em condies de presso e temperatura acima da presso e temperatura do ponto crtico respectivo (Pc, Tc). A temperaturas superiores a Tc, a forma gasosa da substncia no pode ser liquefeita por maior que seja a presso aplicada, essencialmente devido ao movimento molecular intenso que impede um balano positivo favorvel das atraces intermoleculares necessrias formao de um lquido. A importncia e vantagens da utilizao dos fluidos-sc so perfeitamente reconhecidas nas vrias vertentes da engenharia qumica e bioqumica, como a extraco/processamento de frmacos [Duarte et al., 2005], de substncias relevantes na indstria alimentar [Simes et al., 1998, Ruivo et al., 2004], de metais [Erkey, 2000], de compostos biolgicos [Andrich et al., 2005], de gorduras naturais na indstria de curtumes [Marsal et al., 2000], em
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sistema integrado com tecnologia de membranas [Sarrade et al., 2003], no desenvolvimento de novos materiais [Cansell et. al., 2003], como polmeros [Casimiro et al., 2005], partculas finas [Hakuta et al., 2003], aerogis [Moner-Girona et al., 2003], na catlise [Milewska et al., 2005] e, em particular, na biocatlise [Peres et al., 2005, Vidinha et al., 2005]. Aps a primeira evidncia da viabilidade da utilizao de solventes orgnicos em biocatlise com impacto na comunidade cientfica [Zaks e Klibanov, 1984], a aplicao de fluidos-sc como solventes alternativos rapidamente mostrou ser uma possibilidade promissora [Randolph et al., 1985, Hammond et al., 1985, Nakamura et al., 1985]. A principal caracterstica que torna estes fluidos verdadeiramente aliciantes resulta do facto de aliarem as propriedades especficas de um lquido (densidade e condutividade trmica elevadas) e de um gs (baixas viscosidade e tenso superficial, e elevada difusividade), conjugando um bom poder de solvatao e transferncia de calor, prprios dos lquidos, com uma transferncia de massa mais eficaz, normalmente aliada aos gases. Para alm deste aspecto, a utilizao de fluidos-sc como solventes em biocatlise tem vantagens efectivas sobre os seus homlogos orgnicos, tais como:
maior facilidade na penetrao dos poros do bicatalisador, muitas vezes inacessveis aos lquidos convencionais [Kamat et al., 1995];
possibilidade de variar o poder de solvatao do solvente, ajustando a presso e temperatura [Mesiano et al., 1999], especialmente prximo do ponto crtico;
o fraccionamento da mistura reaccional, sem ocorrer alterao de solvente, possvel atravs de passos sequenciais com reduo sucessiva de presso;
facilidade de eliminao do solvente, visto os fluidos-sc poderem ser eliminados por simples descompresso.
Os fluidos-sc mais adequados para biocatlise apresentam valores de Tc entre 35 C e 50 C e valores de Pc abaixo dos 100 bar (Tabela 2.1).
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Tabela 2.1 Temperatura e presso crticas das algumas substncias utilizadas como fluidos-sc em biocatlise. Fluido Dixido de Carbono Etano Etileno Hexafluoreto de Enxofre Fluorofrmio Tc (C) 31,1 32,3 9,3 45,6 25,9 Pc (bar) 73,8 48,8 50,3 37,6 48,8
As variaes de densidade do meio supercrtico por manipulao de presso e/ou temperatura conduzem a efeito significativos na constante dieltrica e no poder solvente dos fluidos-sc, podendo ter consequncias importantes na actividade, especificidade e enantiselectividade enzimticas [Randolph et al., 1988, Kamat el al., 1993, Fontes et al., 1998 b, Mesiano et al., 1999]. Nestes solventes, e para alm de todos os factores condicionantes da BSNA j referidos no ponto 2.2, acresce a presso [Boonyaratanakornkit, 2002]. Para alm das alteraes das propriedades do solvente que as variaes de presso causam [Almeida et al., 1998], podem por si s ter efeitos directos na velocidade da reaco. De facto, quanto maior o volume do estado de transio face ao volume dos substratos (volume de activao positivo), maior ser a diminuio da constante de velocidade da reaco e, consequentemente, da eficincia cataltica da enzima por aumento da presso [Fontes et al., 1998 a]. A estabilidade do biocatalisador pode, por sua vez, ser afectada pela presso mediante alteraes na estrutura e conformao da enzima [Mozhaev et al., 1996]. A inactivao da enzima ocorre normalmente a partir de 1 kbar [Mozhaev et al., 1994], o que deixa uma margem de segurana bastante confortvel biocatlise em fluidos-sc que se realiza geralmente a presses entre os 100 e os 300 bar.
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2.4 BIOCATLISE EM LQUIDOS INICOS

Os LIs emergiram recentemente como solventes alternativos aos meios orgnicos em processos biotecnolgicos [Erbeldinger et al., 2000, Cull et al., 2000]. Deste ento, a sua utilizao tem sido amplamente estudada como solventes em catlise [Webb et al., 2003, Najdanovic-Visak et al., 2003] e, em particular, na biocatlise [Rantwijk et al., 2003, Sheldon, 2005]. Os LIs so inteiramente constitudos por ies, diferindo dos clssicos sais fundidos devido aos seus baixos pontos de fuso, geralmente abaixo dos 100-150 C, sendo igualmente menos corrosivos. Os lquidos que usualmente so utilizados em catlise e, principalmente, em biocatlise apresentam pontos de fuso inferiores temperatura ambiente. Os LIs mais comuns baseiam-se em caties orgnicos, como tetralquilamnio, alquilpiridnio, 1,3dialquilimidazlio e tetralquilfosfnio (Fig. 2.1), associados a anies com fortes cargas negativas, tais como BF4 , PF6 , SbF6, NO3 e CF3SO3, entre outros [Sheldon, 2005].
Fig. 2.1 Estruturas dos caties mais comuns em LIs. (a) tetralquilamnio. (b) tetralquilfosfnio. (c) 1,3-dialquilimidazlio. (d) alquilpiridnio. Entre as principais vantagens dos LIs relativamente aos solventes orgnicos, contam-se uma presso de vapor desprezvel, elevada estabilidade qumica e trmica [Wilkes e Zaworotko, 1992] e fcil reciclagem, o que coloca os LIs na classe de solventes ambientalmente sustentveis [DeSimone, 2002]. Em todo o caso, continuam os estudos focados na avaliao de riscos potenciais dos LIs no ciclo completo de vida dos mesmos [Jartorff et al., 2003, Jastorff et al., 2005].
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Um dos aspectos nicos dos LIs reside no facto de ser possvel conceber e sintetizar um LI com determinadas caractersticas de densidade, viscosidade, ponto de fuso, polaridade e miscibilidade com a gua, mediante a seleco do catio orgnico, do anio inorgnico e do tamanho da cadeia ligada ao catio inorgnico [Gordon, 2001]. A actividade cataltica das enzimas fortemente influenciada pela estrutura dos LIs [Itoh et al., 2001], bem como o seu estado de purificao [Park e Kazlauskas, 2001]. H evidncia de que, nalguns casos, estes solventes podem melhorar o comportamento das enzimas relativamente aos solventes orgnicos, em termos de actividade cataltica e enantioselectividade [Nol et al., 2004], e estabilidade [Kaar et al., 2003, Lozano et al., 2002]. Em particular, Sheldon et al. [2002] e Lozano et al. [2002] verificaram que uma determinada lipase, na forma livre, ou imobilizada, exibia uma estabilidade trmica bastante superior quando colocada num LI do que em solventes orgnicos, o que poderia ser explicado, segundo os autores, por uma espcie de cobertura protectora que o LI exercia no microambiente da enzima. Estudos espectroscpicos mais recentes com uma protease e uma lipase mostram que a estabilidade acrescida destas enzimas nos LIs se deve a alteraes estruturais que resultam numa estrutura mais compacta, com maior percentagem de folhas [De Diego et al., 2004, De Diego et al., 2005].
2.5 BIOCATLISE EM LQUIDOS INICOS/CO2-SC

Apesar da biocatlise em LIs ocorrer na ausncia de solventes orgnicos, a recuperao dos produtos da reaco era, at recentemente, normalmente efectuada com recurso queles solventes, o que era um obstculo classificao do processo como verde. No entanto, a combinao de um LI com CO2-sc constitui uma estratgia verde para biotransformao e separao que colmata a referida lacuna [Lozano et al., 2002, Reetz et al., 2002, Dzyuba e Bartsch, 2003]. Nestes processos, tem-se um sistema bifsico em que o LI actua como solvente para a reaco enzimtica, e o CO2-sc actua como fase de extraco dos produtos. Em processos em contnuo, o CO2-sc actua tambm como fase mvel para transporte dos substratos para a enzima.
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Na base da utilizao dos sistemas combinados de LI/CO2-sc na biocatlise esto os estudos efectuados por Blanchard et. al. [1999] que observaram que o equilbrio de fases entre o CO2-sc e o LI [C4mim][PF6] se caracterizava por uma dissoluo elevada do primeiro no segundo, sem que aquele LI se dissolvesse no CO2-sc. Outra caracterstica importante daquele sistema era a diminuio de viscosidade do LI com CO2 dissolvido e, consequentemente, uma maior facilidade na transferncia de massa. Mais tarde, os mesmos autores verificaram que estas particularidades se estendiam a outros LIs [Blanchard et. al., 2001]. Simultaneamente, surgiram publicaes que demonstravam a viabilidade de recuperar dos LIs solutos orgnicos, alifticos polares e no polares, e aromticos, utilizando CO2-sc [Kazarian, et al., 2000, Blanchard e Brennecke, 2001, Scurto et al., 2002]. Estavam assim criadas as condies para que surgissem os primeiros estudos de catlise em sistemas bifsicos LI/CO2-sc, nos quais catalisadores no biolgicos e intermedirios polares se encontravam dissolvidos no LI enquanto os reagentes e/ou produtos da reaco apolares se encontravam dissolvidos no CO2-sc [Liu et al., 2001, Brown et al., 2001]. Pouco depois, o conceito estendeu-se biocatlise [Lozano et al., 2002, Reetz et al., 2002, Lozano et al., 2003, Reetz et al., 2003, Lozano et al., 2004].
2.6 LIPASES E ESTERASES DE SERINA

As enzimas so classificadas, consoante o tipo de reaco que catalisam, em seis grupos principais: oxido-redutases (catalisam reaces de oxidao-reduo), transferases (catalisam a transferncia de um tomo ou grupo qumico entre dois compostos), hidrolases (catalisam reaces de hidrlise, actuando sobre vrios tipos de ligaes como ligao ster, peptdica, C-N no peptdica, C-C, P-N, etc.), liases (catalisam reaces de remoo ou fixao de grupos qumicos envolvendo ligaes C-C, C-N e C-O, de forma no hidroltica, deixando duplas ligaes), isomerases (catalisam reaces de isomerizao envolvendo estereoismeros) e ligases (catalisam reaces de ligao de duas molculas acoplada hidrlise do ATP) [Cabral et al., 2003]. Embora as aplicaes industriais das enzimas em geral estejam a aumentar [Cabral et al., 2003, Schnell et al., 2003, Krishna, 2002, Kirk et al., 2002, Schmid et al., 2002], as enzimas mais utilizadas na indstria, incluindo a BNSA, so as hidrolases (proteases,
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celulases, amilases, esterases e lipases). Entre as razes que tornam as hidrolases uma opo particularmente atractiva, contam-se a disponibilidade, custo, facilidade de operao, dado no necessitarem de co-factores, aceitao de uma grande gama de substratos e grande capacidade de distinguir a quiralidade molecular [Chikusa et al., 2003, Krishna, 2002]. De entre as hidrolases, as lipases so os biocatalisadores mais importantes, dado poderem ser produzidas em grandes quantidades por fungos e bactrias e estarem disponveis as estruturas cristalinas de muitas, o que facilita a racionalizao das suas propriedades [Jaeger e Eggert, 2002, Ema, 2004, Lutz, 2004, Micaelo et al., 2005, Ghanem e AboulEnein, 2005]. Em meios no aquosos, estas enzimas catalisam reaces de hidrlise, esterificao, transesterificao (acidlise, interesterificao, alcolise) e aminlise, com elevada selectividade, reduzindo assim os produtos secundrios e diminuindo o custo das operaes unitrias de recuperao dos produtos [Villeneuve et al., 2000]. As esterases de serinas, por exibirem um comportamento cataltico semelhante ao das lipases, apresentam idnticas potencialidades na BSNA [Carvalho et al., 1999]. As lipases e esterases de serina pertencem ao grande grupo das / hidrolases. Apresentam uma estrutura molecular semelhante, caracterizada por uma estrutura terciria formada por um ncleo central com cinco cadeias em folha , coberto num dos lados por duas hlices e, do outro, por trs. Tambm o centro activo semelhante nas lipases e nas esterases de serina. Este uma trade cataltica constituda pelo grupo reactivo propriamente dito, que o resduo de serina, e outros dois aminocidos com grande influncia no mecanismo cataltico o aspartato e a histidina, que funcionam numa espcie de rede de ligaes de hidrognio: o aspartato actua como nuclefilo na sua ligao histidina, a qual actua como nuclefilo na sua ligao serina, sendo esta o nico aminocido que se liga efectivamente ao substrato (ponto 2.6.3). A diferena principal entre as lipases e as esterases de serina reside na acessibilidade do centro activo, o que conduz a diferentes comportamentos consoante o solvente. As esterases de serina actuam apenas sobre monmeros em soluo aquosa, visto terem o centro activo acessvel ao solvente, e exibem actividade estereoltica elevada pois os substratos acedem livremente ao centro activo. As lipases apresentam uma actividade
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estereoltica muito baixa em soluo aquosa. Isto acontece porque o centro activo das lipases est coberto por um pequeno segmento de estrutura de natureza anfiflica (aminocidos de natureza polar na parte externa da hlice, e aminocidos apolares na parte interna, a qual est em contacto directo com o centro activo). Em solues aquosas, esta tampa encontra-se fechada, no permitindo o acesso do substrato ao centro activo [Brzozowski, 1991]. necessria a presena de uma interface de natureza hidrofbica que, ao interagir com a parte hidrofbica da tampa, estabilize a conformao da lipase na posio de tampa aberta, para tornar o centro activo acessvel. Assim, as lipases em meio aquoso apresentam um melhor desempenho no que respeita actividade lipoltica, ou seja, quando em presena de agregados de substrato. Um solvente no aquoso pode actuar da mesma maneira [Turner et al., 2001]. Na presente dissertao, utilizaram-se estes dois tipos de hidrolases, nomeadamente a cutinase de Fusarium solani pisi, que uma esterase de serina, imobilizada nos zelitos NaA NaY, e a lipase B de Candida antarctica, imobilizada numa resina macroporosa (Novozym 435). 2.6.1 Cutinase de Fusarium Solani Pisi
A cutinase provm de fungos fitopatognicos. Tem como principal funo a degradao da cutina, componente estrutural da cutcula que cobre os vegetais superiores. Os fungos excretam-na para o exterior da clula, degradando a cutina, conseguindo assim penetrar no interior das clulas e provocar infeco na planta [Lauwereys et al., 1990]. A cutinase de Fusarium solani pisi constituda por uma nica cadeia peptdica com um elevado nmero de aminocidos apolares. Tem um peso molecular de cerca de 22,5 kDa, e as dimenses de (45x30x30) 3. O centro activo constitudo pela trade cataltica Serina 120- Histidina 188-Aspartato 175 e pela cavidade de ligao ao oxianio, sendo este ltimo responsvel pela estabilizao do estado de transio [Carvalho et al., 1999, Haeffner et al., 1998]. O centro activo est acessvel ao solvente, encontrando-se numa das extremidades da enzima (Fig. 2.1). Contudo, localiza-se numa cavidade formada entre dois loops de carcter hidrofbico, e o acesso ao mesmo est parcialmente tapado por duas pontes formadas pelas cadeias laterais de dois pares de aminocidos. Na presena de substratos hidrofbicos, os loops reorientam-se, permitindo o acesso ao centro activo num movimento do tipo pulso,
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sem provocar alteraes na posio dos resduos da cavidade do oxianio, que j se encontram na posio adequada para a catlise. Esta caracterstica distingue a cutinase das suas homlogas lipases. [Carvalho et al., 1999].
Loop de ligao
Fig. 2.2 Estrutura da cutinase, destacando a trade cataltica [Carvalho et al., 1999] A cutinase apresenta um comportamento intermdio entre as lipases e as esterases, devido essencialmente topografia e natureza do seu centro activo. Por um lado, a cutinase apresenta, tal como prprio das esterases, o centro activo acessvel ao substrato (os dois loops apenas o cobrem parcialmente), no necessitando assim de activao interfacial. Contudo, apresenta actividade lipoltica, tpica das lipases, dado os resduos do centro activo se encontrarem, como foi referido, numa cavidade de natureza hidrofbica, permitindo a ligao da enzima a agregados de substrato. Assim, a cutinase apresenta um tipo de estrutura e propriedades catalticas nicas ao combinar vantagens das esterases e das lipases [Carvalho et al., 1999]. A cutinase pode por isso ser utilizada em quase todos os processos que envolvam lipases, como na indstria dos detergentes, do papel, alimentar, cosmtica, farmacutica, agroqumica, etc. Pode ainda ser utilizada como biocatalisador sob diversas formas: liofilizada, microencapsulada, modificada quimicamente, e imobilizada [Carvalho et al., 1999]. Neste trabalho, utilizou-se cutinase produzida a partir de uma estirpe de Escherichia coli.
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2.6.2 Lipase B de Candida antarctica (CALB) De entre as vrias lipases utilizadas em biocatlise, a CALB uma das mais referidas. Esta enzima tem-se demonstrado particularmente til na sntese de steres e aminas, sendo altamente regioselectiva na sntese de monosteres de carbohidratos, e enantioselectiva na resoluo de inmeros compostos, nomeadamente aminas, lcoois e cidos [hrner et al., 1996, Rotticci et al., 2001]. A CALB uma lipase constituda por 317 aminocidos, com um peso molecular de cerca de 33 kDa. O centro activo desta enzima constitudo pela trade catalca Serina 105Histidina 224-Aspartato 187 [Uppenberg et al. 1994]. Ao contrrio da maioria das lipases, a CALB no apresenta activao interfacial, dado no possuir a tampa caracterstica da maior parte das lipases. No entanto, o acesso ao centro activo faz-se por um estreito canal, existindo ainda uma pequena hlice com uma elevada mobilidade perto do centro activo (Fig. 2.3) [Uppenberg et al., 1994].
Trade cataltica: Ser(105); His (224); Asp (187)
Fig. 2.3 Estrutura da CALB, destacando a trade cataltica.
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Existem vrias preparaes da CALB disponveis no mercado, na forma livre ou imobilizada atravs de ligaes covalentes, mais indicadas para reaces em meios aquosos, ou imobilizada atravs de ligao inica, mais utilizada em meios no aquosos [Rotticci et al., 2001]. Quando imobilizada, a CALB apresenta elevada estabilidade na gama de temperaturas 60-80 C, por longos perodos de tempo [Anderson et al., 1998]. Neste trabalho, utilizou-se CALB produzida a partir do microorganismo geneticamente modificado Aspergilus. 2.6.3 Mecanismo reaccional das lipases e das esterases de serina
Estas enzimas seguem um mecanismo denominado de ping-pong bi-bi que consiste na adio ordenada de um primeiro substrato e libertao de um primeiro produto, seguida da ligao de um segundo substrato e libertao de um segundo produto. O primeiro passo, de acilao, inicia-se com a formao de um complexo no covalente enzima-substrato e prossegue com a libertao do primeiro produto e a formao de um intermedirio estvel denominado de acil-enzima. O segundo passo, de desacilao, inicia-se com a actuao do segundo substrato na acil-enzima e leva formao de um segundo complexo no covalente enzima-produto que seguidamente origina o segundo produto [Warshel et al., 1989, Daggett et al., 1991, Schmitke et al., 1996, Hedstrom, 2002]. Inicialmente, o oxignio do grupo hidroxilo da Serina ataca o tomo de carbono do grupo carbonilo do substrato. A ligao C=O do substrato transforma-se numa ligao simples e o tomo de oxignio adquire uma carga negativa. Forma-se um estado de transio de geometria tetradrica em torno daquele carbono, atravs de pontes de hidrognio entre o oxianio e dois grupos NH de cadeias principais. Com a formao desta entidade, ocorre a transferncia de um proto da Serina para a Histidina. O aspartato (o cido asprtico tem que estar desprotonado) neutraliza em parte a carga que se desenvolve no estado de transio. A ligao carbonilo ento refeita, com o auxlio da forma protonada da Histidina que perde o proto, e d-se o colapso do intermedirio tetradrico com expulso de um primeiro produto (o lcool). A cadeia alquilo do primeiro substrato permanece ligada covalentemente Serina, formando o intermedirio acil enzima. Completa-se assim o passo de acilao. Seguidamente ocorre o passo de desacilao que se desenrola de
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forma semelhante, mas por ordem inversa. Inicia-se assim com o ataque nucleoflico acilenzima, por parte do reagente lcool (na reaco de transesterificao) ou da gua (na reaco de hidrlise), resultando na formao, mais uma vez com o auxlio da Histidina, de um novo intermedirio tetradrico que colapsa com libertao de um segundo produto (ester, na reaco de transesterificao, e cido, na reaco de hidrlise). A enzima regressa ao estado inicial. A reaco alvo utilizada nesta dissertao a transesterificao do butirato de vinilo com o 2-fenil-1-propanol, encontrando-se na figura Fig. 2.4 esquematizada a aplicao do referido mecanismo quela reaco.
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Acilao
O Ser O CH2 CH2 O O Ser CH2 O H N H N
+
H3C
O CH3 Ser CH2 CH 2 O N O CH3
HO
CH2
N H O O
-
N H His O O
-
N H His O O
-
His
CH3
Asp
Asp
Asp
Ligao da enzima ao butirato de vinilo
1 intermedirio tetradrico
Acil- enzima
Libertao do lcool vnilico, e respectiva tautomerizao em acetalatedo
Desacilao
Transesterificao
O
-
O CH2 Ser O CH3
Ser
CH2 O
O H N H3C
CH3 O
CH3 H3C O
OH H3C O
-
N H His O
-
N H
His
Asp
Asp
Ligao do 2-fenil- 1- propanol acil - enzima.
Libertao do butirato de 2-fenil-1-propililo. A enzima volta sua forma original.
Hidrlise
Ser O CH 2 Ser O H O H N H O O
-
CH2 O
OH CH3 H N
CH3
N H His O
-
H3C
OH
His
Asp O Asp
Ligao da gua acil- enzima.
Libertao do acido butrico . A enzima volta sua forma original
Fig. 2.4 Mecanismo ping-pong bi-bi aplicado transesterificao do butirato de vinilo com o 2-fenil-1-propanol e reaco secundria de hidrlise do ster substrato.
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2.7 ENGENHARIA DE PROTENAS E OUTRAS ABORDAGENS

Uma das formas de optimizar o comportamento das enzimas em meios no aquosos o recurso a alteraes do meio reaccional e/ou do suporte do biocatalisador, como se referiu atrs. A engenharia de protenas outra abordagem utilizada para alterar as propriedades das enzimas com vista a determinadas aplicaes [Schoemaker, 2003, Hult e Berglund, 2003]. A engenharia de protenas compreende um conjunto de tcnicas que permitem modificar a sequncia de aminocidos da protena atravs de alteraes do gene que a codifica (mutagnese). O gene mutado clonado e expresso num hospedeiro adequado, de forma a produzir a protena alvo. Existem duas estratgias principais neste tipo de abordagem: o design racional de protenas e a evoluo dirigida [Krishna, 2002, Huisman e Sligar, 2003]. O design racional de protenas foi a primeira metodologia a ser utilizada nesta rea. Tem como base a mutagnese dirigida, pelo que requer o conhecimento da estrutura da enzima. Deste ponto de vista, muito til a contribuio dos mtodos de modelao molecular na identificao dos locais da protena potencialmente com impacto numa determinada propriedade, e no tipo de substituies de aminocidos a introduzir para esse fim, normalmente na vizinhana do centro activo da enzima [Ottosson et al., 2001, Ottosson et al., 2002, Soares et al., 2003, Lutz, 2004, Micaelo et al., 2005]. O facto de nem sempre a estrutura tridimensional das enzimas ser conhecida e ainda o facto de a actividade, selectividade e estabilidade das enzimas serem controladas por vrios locais da protena limita a aplicabilidade da tcnica do design racional, o que levou ao desenvolvimento da tcnica da evoluo dirigida [Lutz e Patrick, 2004, Reetz, 2004]. Nesta abordagem, faz-se a mutagnese aleatria do gene alvo no sentido de criar diversidade molecular, testam-se os mutantes produzidos e seleccionam-se aqueles que conduzem a resultados mais promissores da propriedade enzimtica em estudo. Estes mutantes so submetidos a novo processo de mutagnese aleatria, numa ptica de evoluo dirigida. O nmero de ciclos a realizar depende dos resultados obtidos. A tcnica a seleccionar depende do caso em estudo, e por vezes os melhores resultados so obtidos com a combinao do design racional e da evoluo dirigida [Eggert et al., 2004].
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Neste momento, d-se tambm muita ateno seleco de enzimas produzidas por microorganismos que j esto naturalmente adaptadas a funcionar em condies extremas, como por exemplo, temperaturas elevadas ou muito baixas [Georlette et al., 2003, Hoyoux et al., 2004].
Actividade da Cutinase emm Meios Supercrticos e Orgnicos: Actividade de gua, Solvatao e Efeito cido-Base
CAPTULO 3
Actividade da Cutinase em Meios Supercrticos e Orgnicos: Efeitos da Actividade da gua e da Solvatao e Efeitos cido-Base
Este captulo foi publicado como: Garcia, S., Vidinha, P., Arvana, H., Gomes da Silva, M. D. R., Ferreira, M. O., Cabral, J. M. S., Macedo, E. A., Harper, N., Barreiros, S., Cutinase activity in supercritical and organic media: water activity, solvation and acid-base effects, J. Supercrit. Fluid., 2005, 35, 62-69.
ACTIVIDADE DA CUTINASE EM MEIOS SUPERCRTICOS E ORGNICOS: EFEITOS DA ACTIVIDADE DA GUA E DA SOLVATAO E EFEITOS CIDO-BASE
3.1 RESUMO
Realizou-se um estudo comparativo da actividade da enzima cutinase de Fusarium solani pisi imobilizada nos zolitos NaA e NaY, em n-hexano, acetonitrilo, etano supercrtico (etano-sc) e dixido de carbono supercrtico (CO2-sc), a duas actividades da gua diferentes (aW) fixadas com pares de sais hidratados in situ, e em condies cido-base fixadas com tampes slidos possuindo valores de pKa em meio aquoso entre 4,3 e 10. A reaco estudada foi a transesterificao do butirato de vinilo pelo (R,S)-2-fenil-1propanol. A actividade da cutinase para a transesterificao foi mais elevada e semelhante em etano-sc e n-hexano, cerca de uma ordem de grandeza mais baixa em acetonitrilo e ainda mais reduzida em CO2-sc. Os coeficientes de actividade () calculados para os dois substratos indicam que os mesmos esto mais bem solvatados em acetonitrilo e por isso menos disponveis para se ligarem ao centro activo da enzima do que nos outros trs solventes. Os valores de sugerem ainda velocidades de reaco mais elevadas em etano-sc do que em n-hexano, conforme se observou experimentalmente, e evidenciam um efeito negativo directo do CO2-sc na actividade da enzima. A manipulao das condies cido-base do meio no permitiu melhorar as velocidades iniciais de transesterificao relativamente aos brancos (ausncia de tampo cido-base, adio apenas do par de sais hidratados), excepto no caso da cutinase imobilizada no zelito em NaA e em etano-sc, a aW = 0,7. O mau resultado para o branco neste caso e o grande melhoramento observado na presena de um tampo bsico sugerem a existncia de um efeito negativo de acidez do meio que, atravs da realizao de uma experincia sem aditivos, se confirmou no ser devido ao reconhecido carcter acdico do par de sais hidratados utilizado para fixar aW = 0,7. Em acetonitrilo, o aumento de aW foi acompanhado por uma diminuio das velocidades iniciais de transesterificao, ao contrrio do que se observou nos outros
solventes. Registou-se uma hidrlise considervel em acetonitrilo, solvente no qual as velocidades iniciais de hidrlise aumentaram cerca de 20 vezes quando se passou de aW = 0,2 para aW = 0,7. A hidrlise foi menos pronunciada em etano-sc e em n-hexano, e foi apenas observada a aW = 0,7. Em CO2-sc, s se detectou cido butrico aps tempos de reaco muito longos, o que est de acordo com uma actividade cataltica genericamente baixa neste solvente. A enantioselectividade da cutinase relativamente ao substrato lcool foi baixa e no foi afectada por qualquer manipulao das condies do meio.
3.2 INTRODUO
Actualmente, as preocupaes ambientais so um dos factores determinantes na opo por uma qumica verde, e a utilizao de fluidos supercrticos (fluidos-sc) uma boa estratgia para responder a essas preocupaes [DeSimone, 2002, e Poliakoff et al., 2002]. Uma das reas em que a utilizao de fluids-sc se afigura promissora a biocatlise [Mesiano et al., 1999]. Hoje em dia, est firmemente estabelecido que, em meios no aquosos, as enzimas so capazes de catalisar reaces difceis ou impossveis de realizar em gua, tornam-se mais estveis e podem exibir uma selectividade diferente da manifestada em gua [Klibanov, 2001], e j se encontram comercializadas algumas aplicaes desta tecnologia [Klibanov, 2001, e Krishna, 2002]. Em meios no aquosos, a preservao da funo enzimtica resulta do facto de a enzima reter essencialmente a sua estrutura nativa, o que evidenciado por estudos de raios X [Fitzpatrick et al., 1993, Yennawar et al., 1994, e Schmitke et al., 1997]. A limitao da quantidade de gua disponvel assegura que a enzima se mantenha cineticamente aprisionada na sua conformao nativa [Griebenow e Klibanov, 1996]. A gua actua como um lubrificante molecular. E apesar de a enzima necessitar de um determinado nvel de hidratao para ter uma dinmica que lhe permita ser cataliticamente activa [Rupley et al., 1983, e Rupley et al., 1991], o aumento da hidratao para alm de um certo valor pode permitir enzima vencer a barreira energtica que conduz desnaturao. A actividade da gua (aW) o parmetro mais conveniente para correlacionar a actividade enzimtica em meios no aquosos [Bell et al., 1995, e Halling, 1994]. A um valor de aW fixo, os efeitos do solvente devidos a diferenas na partio da gua so praticamente
eliminados, e a enzima dever exibir o mesmo nvel de hidratao em todos os solventes (em meios mais polares que, a valores de aw elevados, possam competir com molculas de gua mais fracamente ligadas enzima, esta ltima pode atingir nveis de hidratao comparativamente mais baixos do que o que seria de esperar a esse valor de aw) [Bell et al., 1997, McMinn et al., 1993]. No caso das reaces de transesterificao, e para hidrolases como a cutinase que actuam atravs do mecanismo da acil-enzima, o aumento de aW afecta a competio pelo nuclefilo no passo de desacilao, o que em muitos casos dever conduzir a um aumento das velocidades iniciais de formao do produto secundrio acdico, por via da hidrlise do substrato ster. Existe geralmente uma gama de valores de aW que conduzem a um mximo nas velocidades de transesterificao, embora factores como a imobilizao da enzima e a natureza do suporte possam ter um efeito acentuado no perfil de velocidade vs. aW observado [Valivety et al., 1994, Vidinha et al., 2004]. A valores de aW muito baixos, um aumento de aW dever conduzir a um aumento da actividade da enzima atravs de um incremento na dinmica da mesma [Affleck et al., 1992, Partridge et al., 1998, Toba et al., 1996]. A valores de aW elevados, podem ocorrer fenmenos como a agregao das partculas da enzima ou uma diminuio da velocidade de passagem dos substratos atravs da camada de hidratao do catalisador [Vzquez Lima et al., 1995] que podem ter um impacto negativo nas velocidades iniciais de transesterificao. A solvatao dos substratos (ou produtos) variar provavelmente de solvente para solvente, o que dever reflectir-se na actividade da enzima [Borges de Carvalho et al., 1996, Corra de Sampaio et al., 1996, Fontes et al., 1998 a, Sandoval et al., 2002]. Quanto melhor o solvente solvatar as molculas de substrato, menos disponvel este estar para aceder ao centro activo da enzima [Kim, et al., 2000]. Este facto dever dar origem a valores de Km mais elevados (em que Km a constante de MichaelisMenten para a dissociao) e ter um impacto negativo na actividade cataltica [Bell et al., 1997]. Tal como para a gua, a anlise da disponibilidade dos substratos requer que se tomem em linha de conta as actividades respectivas [Halling et al., 1994]. O efeito de aW na capacidade de solvatao do solvente dever ser tido em conta nos casos em que as alteraes de aW forem acompanhadas por alteraes considerveis da concentrao da gua [Bell et al., 1997], como acontece com o acetonitrilo, e no dever ser relevante em solventes imiscveis com
a gua que saturem nesta espcie em condies de diluio infinita, como acontece com o n-hexano, o etano-sc ou o CO2-sc. O solvente tambm pode afectar a actividade cataltica atravs de interaces moleculares directas solvente/enzima. A ligao de molculas de solvente directamente no centro activo da enzima foi evidenciada por estudos de raios X [Fitzpatrick et al, 1993, Yennawar et al, 1994, Schmitke et al., 1998]. Este facto pode provocar alteraes de polaridade e afectar a estabilizao de estados de transio carregados [Kim et al., 2000], como os que esto envolvidos no mecanismo cataltico das hidrolases de serina, como a cutinase, que requerem que se estabelea uma carga negativa formal no centro activo para exibirem actividade completa. A ligao de molculas de solvente no centro activo pode tambm dar lugar a uma inibio competitiva com os substratos [Corra de Sampaio et al., 1996]. Aparentemente, no existe registo de efeitos negativos directos do n-hexano (ou do etano-sc) na actividade enzimtica, contrariamente ao que acontece com o acetonitrilo [Bell et al., 1997] e o CO2-sc. As explicaes avanadas para o efeito adverso do CO2 incluem a formao de cido carbnico na camada de hidratao da enzima, que muito difcil de ultrapassar, mesmo a valores de aW muito baixos [Harper e Barreiros, 2002], e a formao de carbamatos com grupos amina livres de resduos de lisina, que mais relevante a valores de aw baixos e a uma basicidade elevada [Kamat et al., 1995]. O estado de protonao da enzima outro factor que pode ter um efeito acentuado na actividade cataltica [Halling, 2000]. A imobilizao da enzima num suporte normalmente feita a partir de uma soluo tampo a um pH ptimo. Neste caso, a subsequente remoo de gua atravs da fase de vapor no causa alteraes no estado de protonao dos resduos da protena, e as molculas de enzima exibiro uma memria de pH, ou seja, lembrar-se-o do pH da ltima soluo aquosa com a qual contactaram [Zaks e Klibanov, 1985, Xu et al., 1996]. No entanto, na presena de agentes de permuta inica ou de espcies acdicas ou bsicas, podem ocorrer alteraes do estado de protonao da enzima. Estas alteraes podem impedir a observao do verdadeiro efeito de aW na actividade cataltica; ou seja, uma actividade cataltica mais baixa a aW elevado pode ser simplesmente o reflexo da produo de um produto secundrio acdico no meio reaccional, cuja eliminao, com um tampo apropriado, tornaria possvel que se
observasse a activao da enzima a valores de aW elevados [Fontes et al., 2003 a]. Tm sido apresentados na literatura tampes slidos que controlam o estado de ionizao da enzima na fase no aquosa atravs da permuta de protes e ies estreitamente associados aos grupos ionizveis da protena [Harper et al., 2000, Partridge et al., 2000, Zacharis et al., 1997]. No presente trabalho, aborda-se o impacto da maioria dos efeitos descritos acima na actividade da cutinase imobilizada nos zolitos NaA e NaY, em n-hexano, acetonitrilo, etano-sc e CO2-sc, na transesterificao do butirato de vinilo pelo (R,S)-2-fenil-1-propanol.
3.3 MATERIAIS E MTODOS

3.3.1 Materiais
A cutinase de Fusarium solani pisi foi produzida a partir de uma estirpe WK-6 de Escherichia coli (oferecida pela Corvas International, Ghent, Blgica) e purificada no Centro de Engenharia Biolgica e Qumica, Instituto Superior Tcnico [Carvalho et al., 1999, Lauwereys et al., 1990]. A pureza da enzima foi controlada por electroforese e focagem isoelctrica. A actividade estereoltica da enzima (30 nM) foi determinada espectrofotometricamente a 400 nm atravs da hidrlise do butirato p-nitrofenlico (0,56 mM) em tampo fosfato de potssio de concentrao 50 mM, a pH = 8,5. O (R,S)-2-fenil-1-propanol (com 97 % de pureza) e os zelitos NaA e NaY, ambos em p, foram adquiridos Aldrich; o butirato de vinilo (com 99 % de pureza) era da Fluka; o tridecano, o cido 3-(ciclohexilamino)-2-hidroxi-1-propanosulfnico (CAPSO), o cido 3[(1,1-dimetil-2-hidroxietil)amino]-2-hidroxipropanosulfnico (AMPSO), o cido 3-(Nmorfolino) propanosulfnico (MOPS), o cido L-glutmico (GLU) e os respectivos sais de sdio (CAPSONa, AMPSONa, MOPSNa, GLUNa) eram da Sigma; o n-hexano, o acetonitrilo, o hidrogenofosfato dissdico, o hidrogenofosfato dissdico dihidratado, o hidrogenofosfato dissdico hepahidratado, o carbonato de sdio, o bicarbonato de sdio e o cloreto de sdio eram da Merck; o acetato de potssio e os reagentes de KarlFischer Hydranal Coulomat A e C eram da Riedel de Hean. O butirato de (R,S)-2-fenil-1-propilo foi preparado como se descreve em Vidinha et al. [2004]. Os solventes orgnicos, os
substratos e o tridecano foram armazenados na presena de peneiros moleculares (com orifcios de 3 , da Merck). O etano, o CO2 e o azoto foram fornecidos pela Air Liquide e tinham uma pureza indicada superior a 99.95 mol % (etano) e 99.995 mol %.. 3.3.2 Imobilizao da enzima
A cutinase foi imobilizada por deposio segundo o mtodo desenvolvido por Gonalves et al. [1996], e Serralha et al. [1998]. Dissolveu-se a enzima liofilizada numa soluo de fosfato de sdio de concentrao 50 mM (com uma concentrao de enzima de 10 mg mL1
), a pH 8,5. Adicionou-se o suporte soluo (na proporo 25 mg de cutinase por g de
suporte) e, depois de se misturar em vortex durante 1 min, secou-se a preparao sob vcuo durante pelo menos 24 h. O rendimento mdio de imobilizao foi de (51 8) % para o zelito NaA e de (72 12) % para o zelito NaY, conforme se determinou com um mtodo de Lowry modificado [Lowry et al., 1951]. 3.3.3 Ensaios enzimticos
Para as reaces em fluidos-sc, utilizaram-se clulas de ao inox de volume varivel (volume de reaco de aproximadamente 12 cm3), equipadas com uma janela de safira e com vlvulas para enchimento da clula e para amostragem. Os detalhes da instalao de alta presso e da tcnica experimental foram referidos por Fontes et al. [2001 b]. Todas as reaces realizadas em solventes orgnicos foram feitas em frascos fechados de polipropileno (volume reaccional de 3,5 cm3). Os pares de sais hidratados utilizados (42 g L-1 de cada elemento do par) e os valores de aW que fixam a 35 C (Halling, 1992) foram: Na2HPO42/0 (aW = 0,19), Na2HPO47/2 (aW = 0,69). No caso do acetonitrilo, ajustou-se aW antes da adio dos pares de sais hidratados (a quantidade de gua necessria foi calculada a partir dos dados fornecidos por Bell et al. [1997]). Os tampes cido-base slidos foram utilizados nas concentraes 11 g L-1 (forma bsica) e 3 g L-1 (forma cida). A reaco estudada foi a transesterificao do butirato de vinilo (170 mM) pelo (R,S)-2-fenil-1propanol (25 mM). Equilibraram-se sempre as preparaes de enzima com todos os outros componentes slidos presentes na fase no aquosa (solvente, (R,S)-2-fenil-1-propanol e tridecano) durante 2 h, tempo considerado suficiente para a partio de gua e a transferncia de ies, antes de se adicionar o butirato de vinilo para dar incio reaco.
Utilizou-se o tridecano (27 mM) como padro interno para anlise por cromatografia gasosa (GC). As misturas reaccionais foram agitadas com uma barra de agitao magntica. A concentrao da gua foi medida em todos os solventes por titulometria de Karl-Fischer. Nos fluidos-sc, os valores de aW foram calculados dividindo a concentrao da gua na mistura reaccional pela concentrao da gua na mesma mistura na saturao [Fontes et al., 2002]. As reaces em fluidos-sc foram realizadas em circuito fechado, contrariamente ao que se verificou com solventes orgnicos. Este facto pode explicar a interferncia observada do acetaldedo (resultante do lcool vinlico) nas medies de KarlFischer realizadas no decurso da reaco que, por esse motivo, foram abandonadas. Para se atingir aW = 0,7 nas experincias feitas em etano-sc na ausncia de tampes cidobase ou de pares de sais hidratados, adicionou-se a etano-sc a quantidade de gua necessria para o efeito, numa outra clula montada antes do reactor contendo a enzima, a fim de evitar efeitos de histerese na hidratao da mesma [Fontes et al., 2001 a] e/ou agregao. A enzima foi sempre pr-equilibrada atravs da fase de vapor com solues saturadas de sais a 25 C, durante cerca de 3 dias, para atingir os valores de aW = 0,22 (com acetato de potssio) e aW = 0,75 (com cloreto de sdio), retirados da literatura [Greenspan, 1977]. 3.3.4 Mtodos de anlise
Quer a converso, quer o excesso enantiomrico do substrato lcool no reagido (e.e.S) foram medidos por GC, num cromatgrafo gasoso da srie Trace 2000 da Unicam. Condies de anlise: coluna capilar no comercial de slica fundida com 30 m 0,32 mm (dimetro interno), revestida com um filme de 0,25 m de espessura de heptakis-(2,3-di-Ometil-6-O-terc-butildimetilsilil)--ciclodextrina (15 %) em SE 52 (DiMe); programa de forno: 90 C durante 5 min, rampa 90-136 C a 0,8 C min-1, 200 C durante 5 min; temperatura de injeco, 250 C; temperatura do detector de ionizao de chama (FID), 250 C; gs de arraste, hlio (2,0 cm3 min-1); razo de split, 20:1. No se detectaram produtos nos ensaios efectuados sem a presena de enzima. A razo enantiomrica, E, foi calculada atravs da expresso E = {ln[(1c)(1e.e.S)]}/{ln[(1c)(1+e.e.S)]}, em que c a converso e e.e.S relativo ao enantimero (R), a partir de dados obtidos para o substrato racmico no decurso da reaco (sempre que possvel, para converses at 0,5).
3.3.5
Coeficientes de actividade
Os coeficientes de actividade na conveno simtrica, , ( = a/x, em que a a actividade e x a fraco molar), para os substratos nos solventes orgnicos foram calculados utilizando uma modificao [Larsen et al., 1987] do mtodo de contribuio de grupos UNIFAC, e os valores de para os substratos nos fluidos-sc foram calculados utilizando a equao de estado de contribuio de grupos MHV2 (aproximao de segunda ordem regra de mistura de HuronVidal) [Dahl et al., 1990, Dahl et al., 1991]. Nestes clculos no se tomou em linha de conta nem enzima, nem aditivos.
3.4 RESULTADOS E DISCUSSO

As velocidades iniciais de transesterificao do butirato de vinilo pelo (R,S)-2-fenil-1propanol foram semelhantes em etano-sc e em n-hexano e consideravelmente mais elevadas do que em acetonitrilo e em CO2-sc, em todas as condies testadas (Fig. 3.1 e Fig. 3.2). Para alm de se ter controlado aW em todas as experincias, tambm se assegurou o controlo do estado de protonao dos grupos acdicos da enzima, atravs da utilizao de tampes cido-base que fixam o parmetro pHpNa [Halling, 2000]. As excepes foram os brancos (ausncia de tampo cido-base, adio apenas do par de sais hidratados). No entanto, verificou-se com um indicador que os pares de sais hidratados utilizados no presente estudo para controlar aW tambm podem ter efeitos cido-base nas enzimas em solventes no-aquosos [Fontes et al., 2003 b, Peres et al., 2005], embora quando em presena de tampes cido-base slidos seja a aco destes ltimos que prevalea. Assim, os brancos reflectem a acidez relativa dos pares de sais Na2HPO42/0 e Na2HPO47/2. O par Na2HPO42/0 conduziu a leituras do indicador semelhantes s obtidas na presena do tampo MOPS [Harper et al., 2000, Harper e Barreiros, 2002]. O par Na2HPO47/2 muito mais acdico e protonou completamente o indicador [Fontes et al., 2003 a, Peres et al., 2005]. Este facto tambm ocorreu na presena do tampo GLU [Harper et al., 2000], e portanto o indicador no consegue distinguir aqueles dois aditivos.
6000
700
NaY
600 500 400 300
Vi nmol min mg
4000
-1
-1
2000
200 100
acetonitrilo 0,2
acetonitrilo 0,7
0
hexano 0,2 hexano 0,7 etano 0,2 etano 0,7
0
CO2 0,7
carbonato
CAPSO
sem adio de tampo acido-base
CO2 0,2
MOPS
GLU
Fig. 3.1 Efeito dos tampes cido-base slidos e de aW nas velocidades iniciais de transesterificao da cutinase imobilizada no zelito NaY, em fluidos-sc e solventes orgnicos. O eixo esquerdo dos yy refere-se ao etano-sc e ao n-hexano (dados do lado esquerdo da linha a tracejado). pKa em meio aquoso dos tampes (25C): 10,3 (Na2CO3/NaHCO3), 9,6 (CAPSO/CAPSONa), 7,2 (MOPS/MOPSNa), 4,3 (GLU/GLUNa). T = 35 C. P = 100 bar (fluidos-sc). [2-fenil-1-propanol] = 25 mM. [butirato de vinilo] = 170 mM. [preparao enzimtica]: 1 g L1 ou 4 g L1 (CO2-sc). Em etano-sc e em n-hexano, a cutinase imobilizada quer no zelito NaY, quer no zolito NaA exibiu uma actividade de transesterificao mais elevada na presena de tampes cido-base de basicidade intermdia, tendo os tampes carbonato e GLU, aos quais correspondem os valores de pKa extremos, conduzido a velocidades de reaco mais baixas. Sabe-se que a cutinase funciona melhor para estados de protonao inicial estabelecidos por um pH de imobilizao entre 7 e 8,5 [Gonalves et al., 1996, Serralha et al., 1998]; seleccionou-se o valor de 8,5 para o presente trabalho. Num estudo anterior, verificou-se que quando a cutinase era imobilizada a pH 5, exibia apenas uma actividade marginal que aumentava na presena de tampes cido-base [Vidinha et al., 2004]. Este facto indica claramente que a cutinase tem memria de pH, e sugere que o pKa em meio aquoso do tampo GLU (4,3) muito provavelmente no traduz o comportamento deste
tampo em meios no aquosos [Fontes et al., 2003 b], ou seja, aquele valor de pKa sugere uma acidez mais elevada do que a que este tampo realmente confere. Mesmo assim, a cutinase menos sensvel s alteraes do estado de protonao dos seus resduos acdicos do que a subtilisina [Partridge et al., 2000, Fontes et al., 2002, Fontes et al., 2003 b]. A incapacidade dos tampes em aumentarem as velocidades iniciais da reaco relativamente aos brancos que aqui se observou com a cutinase pode ser devida ao facto de a enzima ter sido imobilizada a um pH ptimo, tal como foi sugerido para explicar resultados semelhantes obtidos com a subtilisina imobilizada [Partridge et al., 2000] e com a papana imobilizada [Theppakorn et al., 2003]. Mas tal como foi observado por Partridge et al. [2000], mesmo nesta situao a utilizao dos tampes pode ser vantajosa, na medida em que o estado de ionizao da enzima permanecer constante durante a reaco, independentemente da produo de espcies acdicas ou bsicas.
8000
600
NaA
500
-1
6000
400
Vi nmol min mg
-1
4000
300 200
2000
100
acetonitrilo 0,2
acetonitrilo 0,7
hexano 0,2
hexano 0,7
0
etano 0,2
etano 0,7
CO2 0,2
carbonato
CAPSO
sem adio de tampo acido-base
MOPS
GLU
Fig. 3.2 Efeito dos tampes cido-base slidos e de aW nas velocidades iniciais de transesterificao da cutinase imobilizada no zelito NaA, em fluidos-sc e solventes orgnicos. O eixo esquerdo dos yy refere-se ao etano-sc e ao n-hexano (dados do lado esquerdo da linha a tracejado). Os resultados obtidos para a cutinase com os brancos a valores de aW baixos so muito semelhantes aos que se obtiveram com o tampo MOPS aos mesmos valores de aW, quer
CO2 0,7
devido semelhana da acidez relativa do tampo MOPS e do par de sais Na2HPO42/0, quer devido apenas ausncia de descriminao que a cutinase revelou quando exposta a tampes cido-base de valores de pKa em meio aquoso na gama 9,6-7,2. A situao alterou-se ligeiramente a valores de aW elevados. Existe informao na literatura no sentido de que, quer o tampo MOPS, quer o tampo CAPSO formam hidratos a valores de aW superiores a 0,23 e 0,53, respectivamente [Harper et al., 2000]. A aW controlado, como acontece no presente estudo, a formao daqueles hidratos pode conduzir a valores de pH-pNa um pouco diferentes dos assegurados pelas formas andricas dos dois elementos do tampo. No entanto, esses valores no devero variar de solvente para solvente, e portanto os tampes devero continuar a funcionar como tal. Apesar disso, no foi possvel medir velocidades iniciais a aW elevada em acetonitrilo na presena dos tampes MOPS ou CAPSO. O tampo MOPS tambm no funcionou bem em etano-sc a aW elevada, apesar de o seu funcionamento ter sido normal em n-hexano ao mesmo valor de aW, e de ter proporcionado velocidades mais elevadas do que as obtidas com o tampo GLU. Quando se utilizou a cutinase imobilizada no zelito NaY, obtiveram-se velocidades muito mais elevadas na presena do par de sais Na2HPO47/2 sem mais aditivos (branco) do que na presena do tampo GLU, quer em etano-sc, quer em n-hexano. Este facto pode ser devido menor acidez do par de sais Na2HPO47/2 relativamente ao tampo GLU, ou a uma capacidade limitada do par de sais para permutar H+ e Na+, o que no de estranhar dado que no se trata de um tampo. de referir que, para alm da enzima, tambm o zelito que representa a maior parte da preparao enzimtica participa em todos os processos de permuta inica. J quando se utilizou a cutinase imobilizada no zelito NaA a aW elevado, verificou-se um abaixamento aprecivel da actividade de transesterificao no branco em etano-sc. O facto de o tampo CAPSO ou mesmo o tampo GLU conseguirem aumentar a actividade da enzima sugere que o fenmeno responsvel pela queda de actividade no branco era de natureza cido-base. Em experincias realizadas em etano-sc sem a adio de tampo cido-base nem do par de sais hidratos, nas quais se ajustou independentemente aW do solvente e da enzima a um valor de 0,7, obtiveram-se velocidades iniciais de transesterificao semelhantes (1341 nmol min1 mg1) s indicadas na Fig. 3.2. Este facto confirma que o par de sais Na2HPO47/2 no o agente responsvel pela queda de actividade da enzima, como alis indiciam os resultados obtidos para todos os brancos a aW = 0,7, excepto no caso especfico da cutinase imobilizada no zelito NaA em etano-sc.
Uma causa possvel para o aumento de acidez nos brancos a reaco de hidrlise. Tal como foi demonstrado por Vidinha et al. [2004], na presena dos tampes mais bsicos o cido butrico precipita como butirato de sdio e no pode ser quantificado por anlise de GC de rotina. No presente estudo, a quantificao do cido butrico foi apenas efectuada nos brancos e nos ensaios realizados na presena dos tampes MOPS e GLU. Os nveis de hidrlise registados foram semelhantes em etano-sc e em n-hexano, e mais acentuados quando se utilizou a cutinase imobilizada no zelito NaY (Fig. 3.3). A valores de aW baixos, no se detectou cido butrico dentro do erro experimental associado quantificao desta espcie durante o perodo de medio das velocidades de transesterificao. A valores de aW elevados, detectaram-se nveis baixos de cido butrico no meio reaccional quando se utilizou a cutinase imobilizada no zelito NaA, o que no ajuda a esclarecer a queda de actividade observada em etano-sc relativamente ao n-hexano
200 velocidade inicial

-1
14000 12000 10000
nmol min mg
100
8000 6000 4000 2000 hexano 0.7 NaY hexano 0.7 NaA
-1
0 etano 0.7 NaY
0 acetonit. 0.2 NaY acetonit. 0.2 NaA acetonit. 0.7 NaY acetonit. 0.7 NaA
Fig. 3.3 Velocidades iniciais da hidrlise em fluidos-sc e em solventes orgnicos. O eixo do yy esquerdo foi usado para o etano-sc e n-hexano (dados do lado esquerdo da linha a tracejado). Os resultados obtidos em acetonitrilo esto em bom acordo com os obtidos por Vidinha et al. [2004]. Contrariamente ao que se observou em etano-sc e em n-hexano, em acetonitrilo um aumento de aW foi acompanhado por uma diminuio da actividade de
etano 0.7 NaA
transesterificao; ainda, a valores de aW baixos a actividade da enzima foi semelhante para os dois zelitos, tendo-se registado mais hidrlise no caso do zelito NaA. Em acetonitrilo, a enzima mostrou-se claramente insensvel s condies cido-base do meio que se devem ter alterado muito nos brancos e nos ensaios realizados na presena do tampo GLU. De facto, foi em acetonitrilo que se registaram as velocidades de hidrlise mais elevadas. Em CO2-sc, a actividade da enzima foi baixa quando comparada com os outros solventes, circunstncia muito frequente quando se trabalha com hidrolases naquele meio [Borges de Carvalho et al., 1996, Fontes et al., 1998 a, Fontes et al., 2001 a, Fontes et al., 2002]. J se referiram anteriormente causas possveis para o efeito negativo do CO2-sc na actividade enzimtica. Neste solvente, o efeito de aW nas velocidades de transesterificao foi semelhante ao observado em etano-sc e em n-hexano. S se detectou hidrlise aps tempos de reaco muito longos, o que est de acordo com uma actividade cataltica genericamente baixa da cutinase em CO2-sc. Utilizaram-se concentraes dos substratos baixas (as fraces molares variaram entre cerca de 1E-03 e 3E-03, no caso do lcool, e entre cerca de 7E-03 e 2E-02, no caso do ster) e os coeficientes de actividade correspondentes devero estar muito prximos dos valores limite respectivos a diluio infinita, . So dados na Tabela 3.1 os valores de calculados para cada substrato nos quatro solventes. Tabela 3.1 Coeficientes de actividade a diluio infinita calculados para as misturas binrias (soluto + solvente). Soluto Solvente
Etano-sc n-hexano 2 fenil-1-propanol Acetonitrilo CO2-sc Etano-sc n-hexano Butirato de Vinilo Acetonitrilo CO2-sc Etano-sc cido Butrico n-hexano
ln soluto
3,86 2,74 0,902 4,51 2,46 1,11 0,824 1,55 3,01 1,88
Esta tabela evidencia de forma clara o efeito negativo do CO2-sc na actividade da cutinase. Os dados de mostram que a partio dos substratos do solvente para o centro activo da enzima mais favorvel em CO2-sc do que em n-hexano e em acetonitrilo. Actividades dos substratos mais elevadas sugerem velocidades de reaco mais elevadas, contrariamente ao que foi observado. Assim, o CO2-sc no tem sobre a cutinase um efeito negativo indirecto, mediado por diferenas de solvatao, mas antes um efeito directo muito acentuado. em acetonitrilo que os substratos esto mais bem solvatados e menos disponveis para a reaco. Verifica-se tambm uma solvatao mais eficiente em
n-hexano do que em etano-sc, o que concorda em termos qualitativos com a tendncia
observada nas velocidades iniciais de transesterificao. A presena do segundo substrato no afecta o valor de para o outro substrato de forma significativa, dadas as baixas concentraes envolvidas. Pelas mesmas razes, o impacto de aW nos valores de para os dois substratos muito pequeno nos solventes que saturam com concentraes de gua muito baixas. Em acetonitrilo, no entanto, o aumento de aW para 0,7 acompanhado por uma diluio aprecivel do solvente. Comparando os valores de calculados para as misturas quaternrias (Tabela 3.2) com os valores de calculados para as misturas binrias, verifica-se uma tendncia semelhante no que diz respeito ao impacto da gua nos valores de para os substratos, excepto no caso do substrato ster em acetonitrilo. No entanto, o aumento verificado no valor de pequeno. Assim, a diminuio das velocidades de transesterificao com o aumento de aW, que se observou apenas em acetonitrilo, dever reflectir um aumento da competio da gua com os substratos para a ligao ao centro activo da enzima, manifestado em velocidades de hidrlise mais elevadas do que nos outros trs solventes. Pensa-se que a aco da gua como inibidor competitivo contribui para o aumento observado dos valores de Km dos substratos quando se aumenta o valor de aW [Bell et al., 1997].
Tabela 3.2 Coeficientes de actividade calculados para as misturas quaternrias a aW = 0,7. Mistura Fraco Molar
ln 2,7E03 6,8 3,4 2,2 1,70E03 7,47 2,52 1,00 5,45E02 1,32 0,89 1,13 3,10E03 5,57 3,82 1,18
Etano-sc gua 2-fenil-1-propanol Butirato de Vinilo

n-Hexano
9,82E01 8,10E04 2,27E03 1,54E02 9,75E01 3,97E04 3,20E03 2,18E02 8,05E01 1,87E01 1,06E03 7,23E03 9,83E01 2,66E03 1,83E03 1,24E02
gua 2-fenil-1-propanol Butirato de Vinilo Acetonitrilo gua 2-fenil-1-propanol Butirato de Vinilo CO2-sc gua 2-fenil-1-propanol Butirato de Vinilo
[2-fenil-1-propanol] = 25 mM; [butirato de vinilo] = 170 mM.
A enantioselectividade da cutinase relativamente ao substrato lcool foi muito baixa (valores de E entre 1 e 2), em todas as condies reaccionais testadas.
3.5 CONCLUSO
A aW constante, as diferenas de actividade enzimtica observadas em vrios solventes podem simplesmente reflectir diferenas de solvatao, o que pode ser elucidado atravs do clculo das actividades dos substratos, tal como foi efectuado no presente estudo. Curiosamente, em etano-sc e em n-hexano os tampes cido-base com os valores de pKa em meio aquoso mais alto e mais baixo conduziram a velocidades iniciais de transesterificao do butirato de vinilo pelo (R,S)-2-fenil-1-propanol mais baixas do que as obtidas com tampes de basicidade intermdia, enquanto em acetonitrilo a actividade da cutinase no foi sensvel s alteraes das condies cido-base do meio. Estas diferenas na sensibilidade da actividade da cutinase aos tampes cido-base podem estar relacionadas com as diferenas de polaridade dos solventes. No existe uma explicao bvia para a velocidade de transesterificao comparativamente baixa que foi obtida no branco para a cutinase imobilizada no zelito NaA, em etano-sc. O facto de a actividade da enzima ter sido elevada na presena de tampes com capacidade para trocar Na+ com H+ sugere que o cido butrico formado no branco pode ser a causa da diminuio de actividade. razovel esperar que este produto secundrio tenha uma difusividade mais elevada em etano-sc do que em n-hexano, o que parece ir contra o que se observou experimentalmente. No entanto, o valor mais elevado de para o cido butrico em etanosc do que em n-hexano (Tabela 3.1) e consequentemente uma maior disponibilidade do cido para a enzima em etano-sc pode, pelo menos em parte, explicar o comportamento observado, que tambm deve estar relacionado com o tipo de suporte. De facto, a imobilizao da cutinase no zelito NaA ou no zelito NaY efectuada em condies que no saturam a superfcie do suporte [Gonalves et al., 1996]. Alm disso, o rendimento de imobilizao da cutinase no zelito NaA mais baixo do que no zelito NaY. Dever portanto haver um nmero comparativamente maior de locais disponveis para a ligao dos solutos superfcie do zelito NaA. Uma vez que o zelito NaA o mais hidrofbico dos dois zelitos, o cido butrico dever ter maior afinidade para os locais disponveis superfcie deste zelito do que para os locais disponveis superfcie do zelito NaY.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi financiado pela Fundao para a Cincia e a Tecnologia atravs dos contratos PRAXIS/P/BIO/14314/1998 e POCTI/35429/QUI/2000 e a bolsa PRAXIS XXI/BD/21615/99 (S. Garcia), e pelo FEDER. Agradece-se o apoio do Ricardo Baptista na produo da cutinase.
Estudo Comparativo da Bioctalise em Solventes No-Convencionais: Lquidos Inicos, Lquidos Supercrticos e Meios Orgnicos
CAPTULO 4
Estudo Comparativo de Biocatlise em Solventes NoConvencionais: Lquidos Inicos, Fluidos Supercrticos e Meio Orgnico
Este captulo foi publicado como:
Garcia S., Loureno, N. M. T., Lousa D., Sequeira, A. F., Mimoso P., Cabral, J. M. S., A. M. A. Carlos, e Barreiros, S.,. A comparative study of biocatalysis in non-conventional solvents: Ionic liquids, supercritical fluids and organic media, Green Chem., 2004 , 6, 466-470.
ESTUDO COMPARATIVO DE BIOCATLISE EM SOLVENTES NO-CONVENCIONAIS: LQUIDOS INICOS, FLUIDOS SUPERCRTICOS E MEIO ORGNICO
4.1 RESUMO
Mediram-se as actividades catalticas da cutinase imobilizada no zelito NaY e da lipase B de Candida antarctica imobilizada numa resina acrlica (Novozym 435) numa reaco modelo de transesterificao em trs lquidos inicos (LIs) contendo como catio o io imidazlio, em etano supercrtico (etano-sc), CO2-sc e n-hexano, a valores de actividade da gua (aW) de 0,2 e 0,7. A actividade de transesterificao da cutinase foi mais elevada e semelhante em 1-n-butil-3-metilimidazlio hexafluorofosfato ([C4mim][PF6]), etano-sc e
n-hexano, mais de uma ordem de grandeza inferior em CO2-sc, e aumentou com o aumento
de aW. No se detectou hidrlise em fluidos-sc e em n-hexano. Em LIs, observou-se hidrlise apenas a aW = 0,7. Quer as velocidades iniciais de transesterificao, quer de hidrlise da Novozym diminuiram com o aumento de aW. O CO2-sc no teve um efeito negativo na actividade desta enzima que foi to elevada em CO2-sc quanto em etano-sc e em n-hexano. As velocidades de reaco baixas registadas neste caso nos LIs sugerem a existncia de limitaes difusionais internas que no se verificam no caso da preparao de cutinase, na qual a enzima se encontra adsorvida apenas superfcie do suporte. O CO2-sc no afectou de forma negativa a actividade cataltica da cutinase suspensa em [C4mim][PF6], o que sugere um efeito protector do LI. No caso da Novozym, obteve-se um aumento acentuado da velocidade de transesterificao no sistema [C4mim][PF6]/CO2-sc, relativamente ao [C4mim][PF6] sozinho. Este facto pode reflectir um melhoramento da transferncia de massa dos solutos para os poros da matriz de imobilizao, devido elevada concentrao de CO2 dissolvido e reduo da viscosidade do LI.
4.2 INTRODUO
A utilizao de lquidos inicos (LIs) ou de fluidos supercrticos (fluidos-sc) pode ser uma boa estratgia no sentido da exigncia, cada vez maior, da introduo de tecnologias limpas nos processos industriais [DeSimone, 2002]. Os LIs no tm presso de vapor mensurvel e os fluidos-sc podem ser facilmente eliminados por simples descompresso. Para alm de irem ao encontro de preocupaes ambientais, os LIs e os fluidos-sc tm propriedades consideradas originais face aos solventes mais convencionais. Essas propriedades, que conduziram designao de solventes neotricos [Seddon, 1996, Wilkes, 2002], esto na base do potencial que reconhecido a estes solventes para competirem com os solventes mais convencionais a nvel de aplicaes industriais. Os primeiros trabalhos sobre biocatlise em fluidos-sc [Randolph et al., 1985, Hammond et al., 1985, Nakamura et al., 1986] foram publicados logo depois do artigo que, h vinte anos atrs [Zaks e Kliblanov, 1984], despoletou o interesse desde ento crescente na biocatlise em meios no aquosos. Os primeiros trabalhos sobre biocatlise envolvendo um LI apareceram muito mais recentemente, e descrevem a utilizao de um LI como meio de disperso de uma enzima para uma reaco de catlise [Erbeldinger et al., 2000] e como meio no aquoso num sistema bifsico gua-LI com clulas inteiras [Cull et al., 2000]. O nmero de publicaes semelhantes tem vindo a aumentar continuamente, conforme se pode ver em artigos de reviso recentes [Sheldon et al., 2002, Rantwijk et al., 2003]. De facto, as vantagens proporcionadas pela utilizao de enzimas em solventes orgnicos tambm se verificam nos LIs. A escolha do solvente, um aspecto importante da abordagem de engenharia de meio biocatlise em meios no aquosos pode, no caso dos LIs, ser ainda mais livre j que pode envolver a concepo do prprio LI [Freemantle, 2001]. Entre os desenvolvimentos recentes neste domnio, inclui-se a concepo de LIs quirais, funcionalizados ou sintetizados a partir de fontes renovveis [Handy, 2003, Davis e Fox, 2003, Ishida et al., 2002, Branco et al., 2002]. O aspecto importante da toxicologia dos LIs est tambm a ser investigado com vista ao desenvolvimento sustentvel de tecnologia baseada em LIs [Jastorff et al., 2003]. A combinao de LIs com fluidos-sc pode ser um meio de evitar a utilizao de solventes orgnicos para extrar solutos de LIs [Blanchard et al., 1999, Blanchard et al., 2001, Scurto
et al., 2002]. Estudos de diagramas de fase de sistemas binrios do tipo LI-CO2 com alguns dos LIs mais comuns mostrou que esses LIs no expandiam de forma aprecivel mesmo quando continham grandes quantidades de CO2 dissolvido e que, apesar disso, a solubilidade do LI na fase rica em CO2 estava abaixo dos limites de deteco [Blanchard e Brennecke, 2001]. Uma solubilidade elevada do fluido-sc no LI facilita o contacto do fluido-sc com os solutos de interesse, e alm disso reduz a viscosidade do LI, melhorando assim a transferncia de massa. Os sistemas do tipo LI-CO2 tm sido aplicados com sucesso na sntese qumica [Bortolini et al., 2003, Kawanam et al., 2003], na catlise homognea e bifsica [Webb et al., 2003, Najdanovic-Visak et. al., 2003, Bsmann et al., 2001, Brown et al., 2001], e na biocatlise [Laszlo, 2001, Lozano et al., 2002, Reetz et al., 2002, Lozano et al., 2003, Reetz et al., 2003]. O estudo efectuado por Reetz et al. [Reetz et al., 2003] demonstra bem o potencial que existe na combinao da biotransformao num LI com a extraco com CO2-sc num processo de reaco/separao eficiente, realizado em condies ambientalmente benignas. A cutinase uma enzima verstil que catalisa reaces de sntese e de hidrlise com uma larga gama de substratos. A cutinase tem sido aplicada como enzima lipoltica em detergentes, para remover gorduras. Outras aplicaes incluem a hidrlise da gordura do leite na indstria de lacticnios, e a sntese de triglicridos com determinadas estruturas [Carvalho et al., 1999]. A lipase B de Candida antarctica provavelmente a lipase mais utilizada em biocatlise. Esta enzima tem sido aplicada na produo de sabes, cremes e lubrificantes, atravs de reaces de esterificao [Krishna, 2002], e tem-se revelado um excelente biocatalisador para a resoluo de lcoois secundrios [Orrenius et al., 1998]. No presente estudo, comparam-se as actividades da cutinase imobilizada no zelito NaY e da lipase B de Candida antartica imobilizada numa resina acrlica macroporosa (Novozym 435), a valores de actividade da gua (aw) constantes, em trs classes de solventes: os LIs 1-n-butil-3-metilimidazlio hexafluorofosfato ([C4mim][PF6]), 1-n-octil-3-metilimidazlio hexafluorofosfato ([C8mim][PF6]) e 1-n-butil-3-metilimidazlio tetrafluoroborato ([C4mim][BF4]), etano-sc e CO2-sc, e n-hexano, um solvente orgnico vulgarmente utilizado. Tambm se explora a combinao de [C4mim][PF6] com CO2-sc num reactor contnuo.

4.3.1 Materiais
A cutinase de Fusarium solani pisi foi produzida a partir de uma estirpe WK-6 de
Escherichia coli (oferecida pela Corvas International, Ghent, Blgica) e purificada no
Centro de Engenharia Biolgica e Qumica, Instituto Superior Tcnico [Carvalho et al., 1999, Lauwereys et al., 1990]. A lipase B de Candida antarctica imobilizada foi gentilmente cedida pela Novo Nordisk Bioindustrial, Espanha. O (R,S)-2-fenil-1-propanol (com 97 % de pureza), o (R)- e o (S)-2-fenil-1-propanol (com 98 % de pureza), e o zelito NaY, em p, foram adquiridos Aldrich, o butirato de vinilo (com 99 % de pureza) era da Fluka, o tridecano e o cloreto de sdio eram da Merck, o acetato de potssio e os reagentes de KarlFischer Hydranal Coulomat A e C eram da Riedel de Hean. O butirato de (R,S)-2-fenil-1-propilo foi preparado como se descreve em Vidinha et al. [2004]. Os substratos e o tridecano foram armazenados na presena de peneiros moleculares (com orifcios de 3 , da Merck). Os LIs [C4mim][PF6], [C8mim][PF6] e [C4mim][BF4] foram preparados segundo os procedimentos descritos por Park e Kazlauskas [2001], Huddleston et al. [2001] e Dupont et al. [2002],confirmou-se que estavam em condies de pH neutro antes da utilizao. O etano, o CO2 e o azoto foram fornecidos pela Air Liquide e tinham uma pureza indicada superior a 99.95 mol % (etano) e 99.995 mol %.
4.3.2 Imobilizao da cutinase
A cutinase foi imobilizada por deposio [Gonalves et al., 1996, Serralha et al., 1998]. Dissolveu-se a enzima liofilizada numa soluo de fosfato de sdio de concentrao 50 mM (com uma concentrao de enzima de 10 mg mL-1), a pH 8,5. Adicionou-se o suporte soluo (na proporo 25 mg de cutinase por g de suporte) e, depois de se misturar em vortex durante 1 min, secou-se a preparao sob vcuo durante pelo menos 24 h. O rendimento mdio de imobilizao foi de (72 12) % para o zelito NaY, conforme se determinou com um mtodo de Lowry modificado [Lowry et al., 1951].
4.3.3
Ensaios enzimticos em Batch
Para as reaces em fluidos supercrticos (FSC), utilizaram-se clulas de ao inox de volume varivel (volume de reaco de aproximadamente 12 cm3 na maioria das experincias), equipadas com uma janela de safira e com vlvulas para enchimento da clula e para amostragem. Os detalhes da instalao de alta presso e da tcnica experimental foram referidos por Fontes et al. [2001 b]. As reaces realizadas em LIs e em n-hexano foram feitas em frascos de vidro (volume reaccional at 3,5 cm3), colocados num agitador orbital ajustado para 450 rpm, a temperatura constante. Em experincias realizadas com as duas enzimas em [C4mim][PF6] e nas quais a agitao foi feita com uma barra de agitao magntica a velocidade elevada, obtiveram-se os mesmos resultados que os obtidos no agitador orbital, o que indica a ausncia de limitaes difusionais externas. Com excepo dos fluidos-sc, todos os componentes das misturas reaccionais foram prequilibrados atravs da fase de vapor ao valor de aW seleccionado para cada experincia, com solues saturadas de sais a 25 C durante cerca de 3 dias, para atingir os valores aW = 0,22 (acetato de potssio) e aW = 0,75 (cloreto de sdio), retirados da literatura [Greenspan, 1977]. Para se atingir aW = 0,7 em CO2-sc, adicionou-se gua directamente ao reactor antes da pressurizao. Para se atingir aW = 0,7 em etano-sc, adicionou-se a etano-sc a quantidade de gua necessria para o efeito, numa outra clula montada antes do reactor contendo a enzima, a fim de evitar efeitos de histerese na hidratao da mesma [Fontes et al., 2001 a] e/ou agregao. A reaco estudada (Esquema 1) foi a transesterificao do butirato de vinilo (170 mM) pelo (R,S)-2-fenil-1-propanol (60 mM). A reaco foi iniciada com a adio do lcool. Utilizou-se o tridecano (15 mM) como padro externo para anlise por cromatografia gasosa (GC). A concentrao da gua foi medida por titulometria de Karl-Fischer. Nos fluidos-sc, os valores de aw foram calculados dividindo a concentrao da gua na mistura reaccional pela concentrao da gua na mesma mistura na saturao [Fontes et al., 2002].
enzima butirato de vinilo
OH
O O
Esquema 1
4.3.4
Reaces em reactor continuo
Fez-se passar uma corrente de CO2-sc com os substratos dissolvidos (caudal = 1 mL min-1, T = 35 C, P = 100 bar, aW = 0,12, [2-fenil-1-propanol] = 60 mM, [butirato de vinilo] = 170 mM) atravs de [C4mim][PF6] (5 mL) com a enzima suspensa (6 g L-1 para a cutinase imobilizada, 4 g L-1 para a Novozym), colocado no fundo de um reactor cilndrico de alta presso montado verticalmente (Fig. 4.1). A amostragem da corrente de CO2 entrada e sada do reactor permitiu o clculo da converso da reaco, bem como a monitorizao de aW..
S1 S2
P1
B1
B2 RTIL/ enzima B3
P2 CO2
sb
substratos
Fig. 4.1 Montagem utilizada nos ensaios efectuados em contnuo. P1, P2 = bombas de
HPLC. B1, B2, B3 = banhos termostticos. S1, S2 = amostragem. sb = barra de agitao.

4.3.5 Mtodos de anlise
Quer a converso, quer o excesso enantiomrico do substrato lcool no reagido (e.e.S) foram medidos por GC, num cromatgrafo gasoso da srie Trace 2000 da Unicam. Condies de anlise: coluna capilar no comercial de slica fundida com 30 m 0,32 mm (dimetro interno), revestida com um filme de 0,25 m de espessura de heptakis-(2,3-di-Ometil-6-O-terc-butildimetilsilil)--ciclodextrina (15 %) em SE 52 (DiMe); programa de forno: 90 C durante 5 min, rampa 90-136 C a 0,8 C min-1, 200 C durante 5 min; temperatura de injeco, 250 C; temperatura do detector de ionizao de chama (FID), 250 C; gs de arraste, hlio (2,0 cm3 min-1); razo de split, 20:1. No se detectaram produtos nos ensaios efectuados sem a presena de enzima. A razo enantiomrica, E, foi
calculada atravs da expresso E = {ln[(1c)(1e.e.S)]}/{ln[(1c)(1+e.e.S)]}, em que c a converso e e.e.S relativo ao enantimero (R), a partir de dados obtidos para o substrato racmico no decurso da reaco (sempre que possvel, para converses at 0,5). Os resultados fornecidos so a mdia de pelo menos duas medies.

A actividade da gua (aW) o parmetro mais conveniente para correlacionar a actividade enzimtica em meios no-aquosos [Halling, 1994]. Determinou-se a correspondncia entre a concentrao da gua e aW nos vrios LIs testados mediante o equilbrio dos mesmos atravs da fase de vapor com solues saturadas de sais (Fig. 4.2). O [C4mim][BF4] miscvel com a gua e, como tal, so necessrias maiores quantidades de gua para atingir os valores de aW pretendidos. Os dados obtidos com o [C8mim][PF6] e o [C4mim][PF6] esto em bom acordo com os que foram apresentados por Anthony et. al. [2001]. Berberich et al. [2003] tambm apresentam dados de solubilidade da gua no [C4mim][PF6]. Estes autores compararam os resultados que obtiveram utilizando solues saturadas de sais com os que obtiveram utilizando pares de sais hidratados in situ. Referem que houve boa concordncia entre os dois conjuntos de resultados, que tambm estavam em bom acordo com os publicados por Anthony et al. [2001]. O aumento de aW de 0,2 para 0,7 teve um impacto positivo nas velocidades de transesterificao da cutinase imobilizada no zelito NaY em todos os solventes (Fig. 4.3). A enzima exibiu uma actividade de transesterificao mais elevada em etano-sc, n-hexano e [C4mim][PF6], que foi mais de uma ordem de grandeza inferior em CO2-sc. Os coeficientes de actividade calculados para os substratos [Garcia et al., 2004] mostraram que quer o lcool, quer o ster, esto mais bem solvatados em n-hexano do que em CO2-sc, e portanto esto menos disponveis para a reaco em n-hexano. Assim, a baixa actividade que a cutinase exibe em CO2-sc no resulta de uma menor tendncia para os substratos acederem ao centro activo da enzima, mas sim de um efeito negativo directo do CO2-sc sobre a enzima. S uma anlise termodinmica semelhante para os LIs testados poderia elucidar em que medida as diferenas observadas na Fig. 4.3 se devem a diferenas de solvatao dos substratos.
100
75
Conc. de gua
-1
gL
50
25
Fig. 4.2 Concentrao da gua em LI a aW = 0,2 (barras brancas), aW = 0,7 (barras cinzento
claro), e na saturao (barra cinzento escuro), a T = 25 C..

150
nmol mg min
Vi
-1
-1
100
50
[C4mim][BF4]
0
CO2-sc
[C8mim][PF6]
[C4mim][PF6]
n-hexano
[C4mim][BF4]
etano-sc
[C8mim][PF6]
Fig. 4.3 Velocidades iniciais de transesterificao para a cutinase imobilizada no zelito
NaY em LIs, fluidos-sc e n-hexano, a aW = 0,2 e aW = 0,7. O cdigo para as barras o mesmo da Fig. 4.2 T = 35 C, P = 100 bar (fluidos-sc). [2-fenil-1-propanol] = 60 mM. [butirado de vinilo] = 170 mM. [cutinase imobilizada] = 6 g L-1 (LIs), 1 g L-1 (etano-sc e n-
[C4mim][PF6]
hexano), 4 g L-1 (CO2-sc). As velocidades so dadas por mg de preparao de enzima imobilizada. no entanto de referir que as velocidades de transesterificao no do uma verdadeira medida da actividade da cutinase. O mecanismo cataltico das duas enzimas utilizadas no presente estudo envolve a ligao do ster num primeiro passo e prossegue com a ligao do nuclefilo. Consoante a quantidade de gua disponvel no meio, pode ocorrer inibio competitiva entre a gua e o lcool. No se detectou hidrlise em etano-sc, n-hexano ou em CO2-sc aos dois valores de aW testados; em LIs, observou-se hidrlise apenas a aW = 0,7 (Fig. 4.4). Dado que a solubilidade da gua maior em [C4mim][BF4], a um dado valor de aW haver um maior nmero de molculas de gua disponveis para a enzima neste LI do que nos outros dois. De facto, as velocidades de hidrlise foram mais elevadas em [C4mim][BF4]. No entanto, a solubilidade de gua em [C4mim][PF6] superior solubilidade da gua em [C8mim][PF6], e apesar disso a hidrlise foi mais pronunciada neste ltimo solvente. Entrando em linha de conta com a hidrlise, pode-se verificar que, apesar de as velocidades de transesterificao terem sido claramente mais elevadas para a cutinase imobilizada no zelito NaY em [C4mim][PF6] a aW = 0,7 do que nos outros dois LIs, as velocidades iniciais totais (transesterificao + hidrlise) foram muito semelhantes nos trs LIs. Observou-se uma maior discriminao dos solventes a aW baixa. Como se v na Fig. 4.3, a aW = 0,2 no se detectou o produto ster em [C4mim][BF4], e a velocidade inicial de transesterificao em [C4mim][PF6] foi quase o dobro da registada em [C8mim][PF6]. Ao contrrio do que se verificou com a cutinase, a actividade de transesterificao da Novozym diminuiu com o aumento de aW (Fig. 4.5) Existem na literatura resultados semelhantes para esta enzima em diferentes reaces de transesterificao [Berberich et al., 2003, Lozano et al., 2002] e de esterificao [Peres et al., 2005, Chamouleau et al., 2001].
100
nmol mg min
-1
Vi
50
-1
0
[C4mim][BF4] [C8mim][PF6] [C4mim][PF6]
n-hexano etano-sc CO2-sc
Fig. 4.4. Velocidades iniciais de hidrlise para a cutinase imobilizada no zelito NaY em
LIs a aW = 0,7. As condies reaccionais so as mesmas da Fig. 4.3.
1000
750
nmol mg min
-1
Vi
500
-1
250
0
[C4mim][BF4] [C4mim][PF6] [C8mim][PF6]
Fig. 4.5 Velocidades iniciais de transesterificao para a Novozym em LI, fluidos-sc e n-
hexano, a aW = 0,2 e aW = 0,7 (no se recolheram dados a aW = 0,7 em fluidos-sc).
[Novozym] = 2 g L-1 ou 4 g L-1 (LI). As restantes condies reaccionais so as indicadas na Fig. 4.3. As velocidades so dadas por mg de Novozym. Observou-se hidrlise em todos os solventes (Fig. 4.6). A extenso da hidrlise a aW = 0,2 foi muito superior observada com a cutinase a aW = 0,7, o que mostra que a Novozym menos selectiva para a transesterificao do que a cutinase. Curiosamente, o impacto negativo do aumento de aW na actividade da Novozym conduziu a uma diminuio das velocidades de hidrlise tanto ao valor de aW mais elevado, como ao valor de aW mais baixo. Um aspecto que chama logo a ateno na Fig. 4.5 relativamente Fig. 4.3 a semelhana da actividade de transesterificao desta enzima em etano-sc ou n-hexano e em CO2-sc. Este facto dever estar relacionado com a prpria enzima, e tambm com o tipo de imobilizao. A imobilizao em zelitos no confere cutinase proteco contra o CO2, ao contrrio de outros tipos de imobilizao [Vidinha et al., 2005]. Os zelitos tm uma estrutura microporosa, estando a cutinase apenas adsorvida superfcie externa do suporte [Gonalves et. al., 1996, Serralha et al. 1998]. A Novozym, por outro lado, tem uma estrutura macroporosa na qual a enzima est oclusa. Peres et. al. [2003] e Almeida et al. [1998] tambm referem um efeito negativo do CO2-sc menos pronunciado na Novozym do que noutras proteases. Outra diferena aprecivel entre a Fig. 4.3 e a Fig. 4.5 so as baixas velocidades de reaco obtidas para a Novozym em LIs, quando comparadas com as obtidas para a cutinase. Apesar de Schfer et al. [2001] terem apresentado converses muito baixas para esta enzima em [C4mim][PF6] e [C4mim][BF4], Park e Kazlauskas [2001], Lau et al. [2000] e Sheldon et al. [2002] obtiveram velocidades de reaco naqueles LIs semelhantes s velocidades medidas nos solventes orgnicos vulgarmente utilizados. Uma vez que a disponibilidade dos substratos a mesma num dado solvente e que as velocidades de reaco para a cutinase nos dois LIs testados foram semelhantes s medidas em etano-sc e em n-hexano, as baixas velocidades de reaco para a Novozym em LIs no podem ser justificadas com base em argumentos assentes na solvatao dos substratos. Os resultados obtidos no presente estudo em LIs podem muito provavelmente reflectir a existncia de limitaes difusionais internas resultantes da elevada viscosidade dos solventes [Branco et al., 2002, Huddleston et al., 2001] e, como tal, uma dificuldade acrescida para os substratos penetrarem nos poros da Novozym. Esta dificuldade pode ter sido ultrapassada pela seleco das concentraes dos substratos utilizadas por Berberich
et al. [2003] que reportam velocidades de transesterificao semelhantes para esta enzima em n-hexano e em [C4mim][PF6], na gama de valores de aW do presente estudo. de referir que, no presente estudo, a Novozym exibiu uma actividade mais elevada em [C8mim][PF6] do que em [C4mim][PF6], ao contrrio da cutinase. O [C8mim][PF6] o mais viscoso dos trs LIs utilizados (a sua viscosidade quase o dobro da do [C4mim][PF6]) [Branco et al., 2002,. Huddleston et al., 2001]. Assim, o perfil de velocidade observado para a Novozym em LIs deve reflectir a influncia de outro factor para alm das limitaes difusionais.
400
nmol mg min
-1
Vi
200
-1
0
[C4mim][BF4] [C4mim][PF6] [C8mim][PF6] n-hexano etano-sc CO2-sc
Fig. 4.6 Velocidades iniciais de hidrlise para a Novozym em LIs, fluidos-sc e n-hexano a
aW = 0,2 e aW = 0,7 (no se recolheram dados a aW = 0,7 em fluidos-sc). Condies reaccionais iguais s da Fig. 4.5. Como se referiu atrs, a combinao de LIs com fluidos-sc tem sido aplicada com sucesso [Laszlo, 2001, Lozano et al., 2002, Reetz et al., 2002, Lozano et al., 2003, Reetz et al., 2003]. No presente estudo, utilizou-se um processo em contnuo em que a enzima se encontrava suspensa em [C4mim][PF6] e o CO2-sc actuava como veculo de transporte dos substratos e produtos para/da enzima. A converso da reaco aumentou no incio mas
assumiu rapidamente um valor constante. Os resultados obtidos foram notveis. No caso da cutinase, a velocidade de transesterificao medida foi de (130 15) nmol mg-1 min-1. A presena do LI evitou o efeito negativo pronunciado que o contacto directo da cutinase com o CO2-sc tem nesta enzima (Fig. 4.3). Este facto sugere que o microambiente da enzima maioritariamente determinado pelo LI, mesmo para as concentraes elevadas de CO2 dissolvido que possvel atingir em [C4mim][PF6] [Anthony et al., 2002]. Uma das vantagens apontadas para este tipo de sistema exactamente um efeito protector do LI contra o CO2 [Lozano et al., 2002, Lozano et al., 2003]. O valor de velocidade de reaco referido acima, medido a um valor de aW menos favorvel (aW = 0,12) do que o utilizado nas experincias em descontnuo, sugere que algo mais dever ter contribudo para o melhor funcionamento da cutinase nas experincias com o reactor contnuo. Este efeito adicional pode ter por base o impacto, na solvatao dos substratos, da concentrao elevada de CO2 dissolvido no LI, por via de coeficientes de actividade mais elevados do que no caso do LI sozinho, e consequentemente uma maior disponibilidade dos substratos para a reaco. Tambm se testou a estabilidade do sistema reaccional. Realizou-se um ensaio durante cerca de quatro horas, lavou-se depois o sistema com CO2-sc e manteve-se a presso de CO2 durante dois dias antes de recomear a adio dos substratos; repetiu-se o processo logo a seguir, ou seja, no total, a enzima foi mantida dentro do LI sob presso de CO2 durante seis dias e catalisou trs reaces. As trs velocidades de transesterificao obtidas estavam em bom acordo. J tinha sido referido que a cutinase era muito estvel em CO2-sc [Sereti et al., 1997]. A velocidade de transesterificao medida para a Novozym no reactor contnuo foi de (412 45) nmol mg-1 min-1. Neste caso, o valor de aW ao qual as experincias em contnuo foram realizadas dever ter sido benfico para a actividade da enzima [Berberich et al., 2003], apesar de tal no ser suficiente para explicar o aumento acentuado da velocidade da reaco relativamente ao LI sozinho (Fig. 4.5). Mais uma vez, este resultado dever reflectir a influncia do CO2 dissolvido no LI que provoca uma diminuio da viscosidade deste ltimo, facilitando assim a transferncia de massa e aliviando as limitaes difusionais. A enantioselectividade das duas enzimas relativamente ao 2-fenil-1-propanol foi baixa (valores de E entre 1,5 e 2,5, para a cutinase, e entre 2 e 3, para a Novozym) em todas as
condies reaccionais testadas. Vidinha et al. [2004] apresentam uma racionalizao dos baixos valores de E obtidos para a cutinase, baseada em estudos de modelao molecular.
4.5 CONCLUSO
A actividade das enzimas em meios no aquosos pode depender muito de factores como a actividade da gua, a solvatao dos substratos, as condies de imobilizao e interaces directas solvente-enzima, tal como se demonstrou no presente estudo. Ao testar-se enzimas em condies comparveis em LIs, fluidos-sc e solventes orgnicos, consegue-se ter uma perspectiva mais global dos parmetros importantes nas diferentes classes de meios no convencionais, ter uma base mais slida para optimizar o comportamento das enzimas nesses meios, e fazer uma melhor anlise das opes disponveis. Tal como foi demonstrado por Laszlo [2001], Lozano et al. [2002], Reetz et al. [2002], Lozano et al. [2003], Reetz et al. [2003] e tambm no presente estudo, os sistemas LI/CO2-sc tm um grande potencial na biocatlise. As vantagens incluem a proteco proporcionada pelo LI contra um possvel efeito negativo do CO2 sobre a enzima, e o alvio dos problemas de transferncia de massa que frequentemente se verificam com preparaes de enzimas imobilizadas. Outro aspecto muito importante o de os sistemas LI/CO2-sc permitirem a concepo de processos integrados de biocatlise/separao ambientalmente favorveis.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi financiado pela Fundao para a Cincia e a Tecnologia atravs dos contratos PRAXIS/P/BIO/14314/1998 e POCTI/35429/QUI/2000 e pelas bolsas PRAXIS XXI/BD/21615/99 (S. Garcia) e ITQB/039/BIC/2001 (N. Loureno), e pelo FEDER. Agradece-se o apoio do Ricardo Baptista na produo da cutinase. Agradece-se Novo Nordisk Bioindustrial, Espanha, a oferta da Novozym.
Actividade e Enantioselectividade da Cutinase a Baixa Temperatura em Meios No-Convencionais
CAPTULO 5
ACTIVIDADE E ENANTIOSELECTIVIDADE DA CUTINASE A BAIXA TEMPERATURA EM MEIOS NO-CONVENCIONAIS
5.1 RESUMO
Mediu-se a actividade cataltica da cutinase de Fusarium solani pisi imobilizada superfcie do zelito NaY e da lipase B de Candida antarctica (CALB) imobilizada numa resina acrlica macroporosa (Novozym 435) na transesterificao do butirato de vinilo com o 2-fenil-1-propanol em n-hexano, a temperaturas entre 18 e 35 C e valores de actividade da gua (aW) fixados temperatura (T) ambiente. A 0 e 18 C, a cutinase exibiu cerca de 50 e 20 % da actividade exibida a 35 C, respectivamente, valores que desceram para cerca de 30 e 10 % no caso da CALB. O clculo dos coeficientes de difuso a diluio infinita dos dois substratos no n-hexano sugeriu que aquelas variaes de actividade no devero reflectir quaisquer limitaes difusionais externas. A diminuio de T no afectou substancialmente a razo das velocidades de transesterificao e de hidrlise para as duas enzimas. A enantioselectividade (E) da cutinase foi medida em n-hexano, em acetonitrilo e no lquido inico 1-n-butil-3-metilimidazlio hexafluorofosfato ([C4mim][PF6]). O valor de E praticamente duplicou quando T desceu de 35 para 0 C, mas manteve-se constante (E
4,6) com uma diminuio adicional de T at 25 C. O valor de E obtido em n-hexano
para valores de T iguais ou inferiores a 0 C foi idntico ao obtido em [C4mim][PF6] a

18 C, apesar da provvel existncia de limitaes difusionais externas devido elevada
viscosidade do LI. Ainda, a informao existente sobre o equilbrio de fases nos sistemas binrios formados por cada um daqueles solventes com a gua sugere que ter havido separao de fases s temperaturas de trabalho mais baixas. Em acetonitrilo, E da cutinase no variou com T, e o mesmo se observou para a CALB. No entanto, em n-hexano E da CALB teve uma variao com a temperatura que conduziu a uma relao linear de ln E com o inverso de T, como esperado (E aumentou cerca de 5 vezes entre 35 e 25 C).
5.2 INTRODUO
A selectividade das enzimas e, em particular, a enantioselectividade, uma das caractersticas que tornam a biocatlise to apelativa do ponto de vista de aplicaes industriais [Krishna, 2002, Turner, 2003, Schoemaker, 2003, Chikusa et al., 2003, Ghanem e Abul-Enein, 2005]. Nestes casos, qualquer aumento da razo enantiomrica, E, pode ser muito importante. A temperatura um dos parmetros experimentais que podem ter impacto em E, como foi verificado por Keinan et al. [1986] na reduo de cetonas em meio aquoso catalisada por uma desidrogenase entre 7 e 50 C e por Lam et al. [1986] na hidrlise de steres em meio aquoso catalisada por uma esterase entre 10 e 20 C. Este facto foi racionalizado por Pham et al. [1989] e Pham e Phillips [1990] no decurso da resoluo de lcoois simples secundrios, catalisada por uma desidrogenase em meio aquoso, entre 15 e 65 C. Estes autores introduziram o conceito de temperatura racmica (Tr), a temperatura qual, aplicando a teoria do estado de transio, no se espera que a enzima descrimine os enantimeros. De facto, sendo a relao entre E e a diferena entre as energias de Gibbs de activao para os dois enantimeros, G#, dada por G# = RT ln E = H# T S#, em que H# e S# so a diferena entre as entalpias e entropias de activao, respectivamente, para os dois enantimeros, tem-se, para G# = 0, E = 1, vindo Tr =
H# /S#. Esta anlise prev que se verifique a inverso da preferncia da enzima
relativamente aos enantimeros com a variao da temperatura. Para o caso do 2-butanol, os autores comprovaram experimentalmente a existncia de uma temperatura abaixo da qual a enzima deixava de preferir o enantimero -(R) para passar a preferir o enantimero
-(S). Estes resultados levaram os autores a sugerir que a temperatura poderia ser uma
varivel crtica em reaces assimtricas catalisadas por enzimas. Tambm Holmberg e Hult [1991], com base nos resultados obtidos com a lipase de
Candida rugosa em reaces de hidrlise em meio aquoso e de transesterificao em
ciclohexano entre 6 e 37 C, propuseram que a temperatura fosse considerada como mais um instrumento para o aumento de E, nos casos em que a diminuio de velocidade da reaco associada a essa diminuio de temperatura fosse aceitvel. Este tema foi revisto
por Phillips [1996] que, com base nos aumentos de 4 a 5 vezes verificados at ento nos valores de E, como resultado de variaes de temperatura, sugeriu que manipulaes deste parmetro seriam uma forma prtica de fazer um ajuste fino da estereoqumica de reaces catalisadas por enzimas, embora no em detrimento da manipulao de outros parmetros experimentais. Tal como o autor refere, para T < Tr, a contribuio dominante ser o termo
#, e E dever diminuir com o aumento de T, at atingir o valor 1 a T = Tr. Para T > Tr,
o termo TS# ser a contribuio dominante para G#, e E dever aumentar com o aumento de T (a temperatura racmica foi mais recentemente denominada de temperatura de inverso, Tinv [Cainelli et al., 2000]). O termo H# resulta das diferenas entre os modos como os dois enantimeros se ajustam ao local de ligao enzima, do ponto de vista da estereoqumica, e o termo S# reflecte a influncia de interaces hidrofbicas dos enantimeros com o solvente, bem como perdas de mobilidade rotacional e translacional dos enantimeros no estado de transio. O impacto do abaixamento da temperatura nos valores de E obtidos em biotransformaes tem continuado a ser explorado desde ento. Contudo, a aplicabilidade desta abordagem aumentou bastante com o advento da biocatlise em meios no aquosos [Zaks e Klibanov, 1984]. Nestes meios, como se tem verificado nos ltimos vinte anos, as enzimas so normalmente mais estveis do que em meio aquoso, conseguem catalisar reaces que so termodinamicamente desfavorveis em gua e podem exibir uma selectividade diferente da observada em meio aquoso [Klibanov, 2001, Krishna, 2002]. Nos casos em que os valores de E so baixos temperatura ambiente, a utilizao de meios no aquosos possibilita a realizao de reaces enzimticas a temperaturas suficientemente baixas para que o aumento de E associado atinja valores de utilidade prtica [Ljubovic et al., 1999]. Este facto foi explorado pela primeira vez por Sakai et al. [1997] que, aps uma seleco de lipases, solventes e agentes acilantes, utilizaram o abaixamento da temperatura de 30 para 40 C para aumentarem de 17 para 99 o valor de E na resoluo de um lcool catalisada pela lipase de Burkholderia cepacia (lipase PS). Para que as converses de interesse fossem atingidas em tempo til, aqueles autores acompanharam a diminuio da temperatura com um aumento da quantidade de enzima utilizada. Desde ento, vrios exemplos do denominado mtodo da baixa temperatura [Sakai et al., 2003 b] se seguiram [e. g. Miyazawa et al., 1997, Wegman et al., 1999, Ljubovic et al., 1999, Aoyagu
et al., 2003], conforme revisto por Sakai [2004]. Em particular, Sakai e colaboradores implementaram metodologias de imobilizao com vista a reduzir o impacto negativo da temperatura nas velocidades de reaco [Sakai et al., 2003 a, 2003 b, 2005]. No presente trabalho aborda-se o impacto do abaixamento da temperatura na actividade da cutinase imobilizada superfcie do zelito NaY em n-hexano, bem como na enantioselectividade da enzima naquele solvente, em acetonitrilo e no lquido inico (LI) 1-n-butil-3-metilimidazlio hexafluorofosfato ([C4mim][PF6]). Os LIs emergiram recentemente como solventes alternativos aos meios orgnicos em biotecnologia [Erbeldinger et al., 2000, Cull et al., 2000], e tm sido cada vez mais utilizados desde ento, conforme revisto por Rantwijk et al. [2003] e Sheldon [2005]. Uma das principais vantagens dos LIs a presso de vapor desprezvel que possuem. Esta e outras caractersticas colocam os LIs na classe de solventes ambientalmente sustentveis [DeSimone, 2002], embora estejam em curso estudos focados na avaliao de riscos potenciais dos LIs no ciclo completo de vida dos mesmos [Jastorff et al., 2003, Jastorff et al., 2005]. No presente estudo, utilizou-se tambm a lipase B de Candida antarctica (CALB) imobilizada numa resina acrlica macroporosa (Novozym 435), para comparao.

5.3.1 Materiais
A cutinase de Fusarium solani pisi foi produzida a partir de uma estirpe WK-6 de
Escherichia coli (oferecida pela Corvas International, Ghent, Blgica) e purificada no
Centro de Engenharia Biolgica e Qumica, Instituto Superior Tcnico [Carvalho et al., 1999, Lauwereys et al., 1990]. A pureza da enzima foi controlada por electroforese e focagem isoelctrica. A actividade estereoltica da enzima (30 nM) foi determinada espectrofotometricamente a 400 nm atravs da hidrlise do butirato p-nitrofenlico (0,56 mM) em tampo fosfato de potssio de concentrao 50 mM, a pH = 8,5. A lipase B de
Candida antarctica (CALB) imobilizada numa resina acrlica macroporosa (Novozym
435) foi gentilmente cedida pela Novo Nordisk Bioindustrial, Espanha.
O (R,S)-2-fenil-1-propanol (com 97 % de pureza), o (R)- e o (S)-2-fenil-1-propanol (com 98 % de pureza), o zelito NaY, em p, o tridecano e o cloreto de sdio foram adquiridos Sigma-Aldrich, o butirato de vinilo (com 99 % de pureza) era da Fluka, o n-hexano e o acetonitrilo eram da Merck, os reagentes de KarlFischer Hydranal Coulomat A e C eram da Riedel de Hean. Os butiratos de (R)- e de (S)-2-fenil-1-propilo foram preparados como se descreve em Vidinha et al. [2004]. Os solventes orgnicos, os substratos e o tridecano foram armazenados na presena de peneiros moleculares (com orifcios de 3 , da Merck). O LI [C4mim][PF6] era da Solchemar.
5.3.2 Imobilizao da cutinase no zelito NaY
A cutinase foi imobilizada por deposio [Gonalves et al., 1996, Serralha et al., 1998]. Dissolveu-se a enzima liofilizada numa soluo de fosfato de sdio de concentrao 50 mM (com uma concentrao de enzima de 10 mg mL-1), a pH 8,5. Adicionou-se o suporte soluo (na proporo 25 mg de cutinase por g de suporte) e, depois de se misturar em vortex durante 1 min, secou-se a preparao sob vcuo durante pelo menos 24 h. O rendimento mdio de imobilizao foi de (72 12) %, conforme se determinou com um mtodo de Lowry modificado [Lowry et al., 1951].
5.3.3 Ensaios enzimticos
A reaco estudada (Esquema 1) foi a transesterificao do butirato de vinilo (300 mM) pelo (R,S)-2-fenil-1-propanol (100 mM). As concentraes de cutinase imobilizada em zelito e de Novozym variaram entre 1 e 12 e 1 e 5 mg mL-1, respectivamente, em nhexano. As reaces foram feitas em frascos fechados de vidro (volume reaccional de 4 mL, excepto no caso do LI em que aquele volume foi de 1 mL). O n-hexano e os substratos foram pr-equilibrados atravs da fase de vapor com uma soluo saturada de cloreto de sdio a 25 C durante cerca de 3 dias, para atingir o valor aW = 0,75, retirado da literatura [Greenspan, 1977]. Em acetonitrilo e no LI, aW foi fixado por adio directa de gua, de acordo com os dados fornecidos por Bell et al. [1997] e Garcia et al. [2004], respectivamente. A mistura reaccional, sem o substrato lcool, foi equilibrada durante 1 h temperatura do banho de termostatizao (mistura 1:1 de gua e etilenoglicol, para temperaturas negativas), aps o que se adicionou o lcool para dar incio reaco. As misturas reaccionais foram agitadas com uma barra de agitao magntica, excepto no caso
do LI, em que no houve agitao. A concentrao da gua foi medida em todos os solventes por titulometria de Karl-Fischer.
5.3.4 Mtodos de anlise
Quer a converso, quer o excesso enantiomrico do substrato lcool no reagido (e.e.S) e do ster produto (e.e.P) foram medidos por GC, num cromatgrafo gasoso da srie Trace 2000 da Unicam, utilizando o tridecano como padro externo. Condies de anlise: coluna capilar, da BGB Analytik, com 30 m 0,25 mm (dimetro interno), revestida com um filme de 0,25 m de espessura de 2,3-dimetil-6-ter-butildimetilsilil--ciclodextrina (20 %) dissolvido em SE-52 (5 % fenil-, 95 % metilpolisiloxano); programa de forno: rampa 115-137 C a 1 C min-1; temperatura de injeco, 250 C; temperatura do detector de ionizao de chama (FID), 250 C; gs de arraste, hlio (4,8 mL min-1); razo de split, 20:1. Tempos de reteno: 3,10 min (cido butrico), 10,19 min (tridecano), 11,29 min ((R)-2-fenil-1-propanol), 11,70 min ((S)-2-fenil-1-propanol), 20,61 min (butirato de (R)-2fenil-1-propilo), 20,77 min (butirato de (S)-2-fenil-1-propilo). No se detectaram produtos nos ensaios efectuados sem a presena de enzima. A razo enantiomrica, E, foi calculada atravs das expresses E = {ln[(1c)(1e.e.S)]}/{ln[(1c)(1+e.e.S)]} e E = {ln[1c(1+e.e.P)]}/{ln[1c(1e.e.P)]} [Straathof e Jongejan, 1997], em que c a converso e e.e.S e e.e.P so relativos ao enantimero (R), a partir de dados obtidos para o substrato racmico no decurso da reaco (dados recolhidos para converses at 0,5). Todos os resultados fornecidos so a mdia de, pelo menos, duas medies.
OH
enzima butirato de vinilo
O O
Esquema 1

O efeito da temperatura na actividade de transesterificao em n-hexano foi semelhante para a cutinase imobilizada no zelito NaA e para a Novozym, embora o impacto da diminuio da temperatura tenha sido mais acentuado para a Novozym. Na realidade, a 0 C, a cutinase exibiu cerca de 50 % da actividade manifestada a 35 C, valor que desceu para perto dos 20 % a 18 C. No caso da Novozym, aquelas duas percentagens baixaram para cerca de 30 e 10 %, respectivamente. Este facto poder estar relacionado com a mobilidade conformacional das enzimas. No estudo de Zaks e Klibanov [1984] sobre a eficincia cataltica de uma lipase a 100 C em meios no aquosos contendo muito pouca gua, que marca o advento da biocatlise neste tipo de meios, aqueles autores correlacionaram a estabilidade acrescida da enzima e a selectividade da mesma para o substrato com uma mobilidade conformacional mais reduzida da enzima desidratada. Por outro lado, estudos realizados com enzimas produzidas por microorganismos psicrfilos e termfilos, naturalmente adaptados a habitats frios e quentes, respectivamente [Georlette, 2003, Hoyoux, 2004], permitiram de igual modo correlacionar a actividade aumentada a baixa temperatura, exibida pelas enzimas produzidas por pricrfilos, com uma desestabilizao estrutural das molculas de enzima, especialmente na zona do centro activo, e com uma flexibilidade conformacional elevada. , no entanto, de referir que ambas as enzimas esto imobilizadas e que as interaces com o suporte sero tambm importantes neste contexto.
2000
velocidade inicial (nmol min-1 mg-1)
1500 1000 500 0 35 0 T ( C) -18
Fig. 5.1 Efeito da temperatura nas velocidades iniciais de transesterificao (barras com
rebordo fino) e de hidrlise (barras com rebordo grosso) para a cutinase imobilizada no zelito NaY (barras cinzentas) e para a Novozym (barras brancas), em n-hexano. No se detectou hidrlise com a cutinase a 35 C. Todos os componentes da mistura reaccional foram pr-equilibrados a aW = 0,7, temperatura ambiente. [2-fenil-1-propanol] = 100 mM. [butirado de vinilo] = 300 mM. As velocidades iniciais so dadas por mg de protena (cutinase) ou por mg de preparao enzimtica (Novozym). Tal como se indica na legenda da figura 5.1, os constituintes da mistura reaccional foram pr-equilibrados a um valor de actividade da gua (aW) de 0,7, temperatura ambiente (aW o parmetro mais conveniente para correlacionar a actividade enzimtica em meios no aquosos [Halling, 1994]). A seleco deste valor de aW deveu-se ao facto de a actividade da cutinase imobilizada em zelitos ser mais elevada a aW = 0,7 do que a aW = 0,2, por exemplo [Garcia et al., 2005], e a cutinase ser o foco principal do presente trabalho. No entanto, com a Novozym acontece o inverso [Garcia et al., 2004]. Na realidade, e como as reaces foram realizadas a um valor de aW pr-ajustado mas no controlado in-situ com tampes apropriados, as misturas reaccionais devero ter saturado durante as manipulaes das mesmas que no decorreram em circuito fechado. Este aspecto poder ter contribudo para o facto de a razo das velocidades de transesterificao e de hidrlise para as duas enzimas ter sido pouco afectada pela temperatura, como os dados da Figura 5.1 indicam.
Se as misturas reaccionais no tivessem saturado por aquela via, o abaixamento da temperatura teria conduzido ao mesmo resultado. O sistema binrio (n-hexano + gua) caracterizado por uma reduzida miscibilidade mtua. Dados de equilbrio lquido-lquido em funo da temperatura para este sistema na gama 0 a 40 C [Sorensen et al., 1979] indicam que, no domnio bifsico, aW (que igual em ambas as fases) tem aproximadamente o valor 1 (a fase aquosa praticamente gua pura, com uma fraco molar, xW 1, sendo o coeficiente de actividade na conveno simtrica, W 1; vem portanto aW = xW W 1). Assim, quando se estabelece no sistema (n-hexano + gua) um valor de aW a uma temperatura prxima da ambiente e se reduz depois a temperatura, mantendo a composio da mistura constante, aW aumenta, atingindo o valor 1 na regio bifsica. Para temperaturas inferiores a 0 C, e na gama de composies considerada, poder-se- esperar o aparecimento de uma fase slida de gua em equilbrio com uma fase lquida rica em n-hexano. importante mencionar que estes resultados constituem apenas uma aproximao, na medida em que incluem somente a influncia do solvente e da gua no equilbrio de fases. tambm de referir que uma fase de gua pode existir como lquido sobrearrefecido at 38 C presso atmosfrica, se a nucleao for evitada [Weik, 2003]. Em todo o caso, a gua da primeira camada de hidratao das protenas no cristaliza [Rupley e Careri, 1991]. Assim, e uma vez que no presente estudo as enzimas se encontravam imersas numa fase no aquosa e se demonstrou que, nestas circunstncias, no termodinamicamente favorvel a formao de uma monocamada completa de gua em torno da superfcie de uma protena [Parker et al., 1995], as enzimas devero ter estado sempre razoavelmente expostas ao solvente. Outro aspecto a ter em conta que a Figura 5.1 no reflecte apenas o impacto da diminuio da temperatura na actividade enzimtica, mas inclui tambm o efeito da variao da temperatura na transferncia de massa de solutos de e para o biocatalisador, quer no filme estagnado de fluido que rodeia as partculas (difuso externa), quer dentro do suporte poroso (caso do Novozym). A influncia da transferncia de massa normalmente analisada com base no clculo de parmetros adimensionais que permitem comparar as velocidades de reaco e de difuso (mdulo de Thiele, nmero de Biot, factor de efectividade). Com os dados cinticos disponveis, a forma mais conveniente de fazer esta anlise examinar a variao tpica das constantes cinticas e dos coeficientes de difuso
com a temperatura. Os coeficientes de difuso dos dois substratos a diluio infinita (as fraces molares do lcool e do ster no excederam 1.5 e 3.5 %, respectivamente) em
n-hexano (Tabela 5.1) foram estimados atravs do mtodo de Wilke-Chang [Reid et al.,
1987]. Para este clculo, estimou-se o volume molar do butirato de vinilo temperatura de ebulio normal pelo mtodo de Le Bas [Reid et al., 1987], sendo os valores das restantes propriedades retirados de uma base de dados [DIPPR801 Database]. A 35 C, e dadas as velocidades de agitao utilizadas, no houve certamente limitaes difusionais externas. Como se v pela tabela 5.1, uma diminuio de temperatura de cerca de 50 C conduziu a uma reduo dos coeficientes de difuso de cerca de 50 %. Por outro lado, as constantes cinticas exibem uma variao exponencial com a temperatura, de acordo com a lei de Arrhenius. portanto razovel assumir que, apesar de as velocidades de difuso diminurem com a diminuio de temperatura, a diminuio concomitante das velocidades de reaco ser mais abrupta. Deste modo, o impacto da resistncia difuso ser comparativamente menos significativo a baixa temperatura, sendo o processo controlado pela velocidade da reaco que muito mais baixa nessas condies.
Tabela 5.1 Efeito da temperatura nos coeficientes de difuso dos dois substratos a diluio
infinita, em n-hexano. 2-fenil-1-propanol T/C 35 0

18
butirato de vinilo DAB/cm2 s-1 3.8E-05 2.4E-05 1.8E-05
DAB/cm2 s-1 3.6E-05 2.3E-05 1.7E-05
Na Tabela 5.2, mostra-se o impacto da variao da temperatura e do solvente na enantioselectividade, E, das duas enzimas. A 35 C, j havia evidncia de que E para a cutinase era sensivelmente o mesmo em n-hexano, no LI [C4mim][PF6] e em acetonitrilo, independentemente do suporte de imobilizao e de aW [Vidinha, 2004, Garcia et al., 2004, Garcia et al., 2005]. Em n-hexano, E aumentou com a diminuio da temperatura de 35 para 0 C, mas manteve-se constante com uma diminuio adicional de temperatura de 25 C. Este tipo de comportamento foi tambm verificado em [C4mim][PF6]. Neste solvente,
dever tambm ter-se registado um aumento de aW com a diminuio da temperatura. De facto, dados de equilbrio lquido-lquido para o sistema binrio ([C4mim][PF6] + gua) presso atmosfrica [Anthony et al., 2001, Najdanovic-Visak et al., 2002] evidenciam uma diminuio da solubilidade mtua com a diminuio da temperatura. Para a composio de gua no LI fixada pelo ajuste de aW que se fez temperatura ambiente, verifica-se que dever ocorrer separao de fases a partir de 11 C [Najdanovic-Visak et al., 2002], primeiro com estabelecimento de equilbrio lquido-lquido at, pelo menos, 0 C, e eventualmente com formao de gua slida a temperaturas mais negativas. ainda de notar que a viscosidade dos LIs bastante mais elevada do que a viscosidade dos solventes orgnicos. Em particular, a viscosidade do [C4mim][PF6] aumenta de cerca de 70 cP C-1 entre 35 e 0 C [Tokuda et al., 2004], enquanto a viscosidade do n-hexano na mesma gama de temperatura aumenta apenas de cerca de 0,04 cP C-1 [DIPPR801 Database]. A 18 C, foi impossvel agitar o LI. Este facto poderia ter originado uma diminuio do valor de E, dado que, comparativamente, o enantimero mais reactivo mais afectado pela existncia de limitaes difusionais [Straathof e Jongejan, 1997]. No entanto, tal no se verificou, possivelmente porque a cutinase est imobilizada apenas superfcie do zelito (nico suporte utilizado no LI) e tambm porque o valor de E pouco elevado. Em acetonitrilo, E no foi afectado pela temperatura. O solvente uma das variveis ajustveis na determinao de condies experimentais que proporcionem valores de E elevados. A racionalizao deste efeito teve vrias abordagens, como a de Wescott et al. [1996] que utilizaram um modelo baseado na estrutura da enzima para determinar a parte do substrato que deixa de estar solvatada no estado de transio, e os coeficientes de actividade respectivos. Overbeeke et al. [2000] utilizaram misturas binrias de solventes e calcularam as contribuies entlpica e entrpica para a discriminao dos enantimeros, em funo da composio das misturas. Estes autores assumiram a existncia de dois estados termodinmicos distintos em equilbrio, com valores de E diferentes, e conseguiram assim dar conta da ocorrncia de valores extremos de E nas curvas de E em funo da composio do solvente. Tal como este estudo exemplifica, em solventes diferentes a resposta de E temperatura pode ser muito diferente. No caso do sistema binrio (acetonitrilo + gua), um valor de aW de 0,7 corresponde a uma fraco molar de gua, temperatura ambiente, de aproximadamente 0,18 [Sazonov e Shaw, 2002]. Para esta
composio, o sistema permanece monofsico at 18 C [Pence e Gu, 1996]. Nestas condies, e aplicando o modelo apresentado por Bell et al. [1997], possvel prever que, quando a temperatura diminui de 25 para 18 C, aW aumente para 0,77.
Tabela 5.2 Efeito da temperatura e do solvente na enantioselectividade da cutinase e da
CALB. E, cutinase T/C 35 0

18 25 n-hexano
E, CALB acetonitrilo 2,1 0,1 2,0 0,2 2,0 0,2

n-hexano
[C4mim][PF6] 2,1 0,2 4,6 0,5
acetonitrilo 2,0 0,2 2,0 0,2 2,3 0,3
2,0 0,2 4,5 0,4 4,7 0,7 4,6 0,5
2,2 0,2 4,8 0,6 8,5 0,9 > 10
A sensibilidade da enantioselectividade da CALB temperatura conhecida. Embora em acetonitrilo E se tenha mantido constante, tal como para a cutinase, em n-hexano obteve-se uma variao linear de lnE com 1/T que conduziu a valores de H# e S# de 18 kJ mol-1 e 52 J K-1 mol-1, respectivamente. Ou seja, o enantimero favorecido pela entalpia desfavorecido pela entropia, e vice-versa [Ottosson et al. 2001], o que est de acordo com os resultados indicados por Ljubovic et al. [1999] e Irimescu et al. [2004] para a CALB. Irimescu et al. [2004], em particular, determinaram valores de E a 25 e 0 C para a resoluo do 2-fenil-1-propanol com um agente acilante diferente do utilizado no presente trabalho e observaram um aumento de E para cerca do dobro com o abaixamento da temperatura. No se fizeram ensaios com a CALB em [C4mim][PF6] a baixa temperatura por se ter verificado num estudo anterior [Garcia et al., 2004] que as velocidades iniciais para a CALB na presente reaco eram muito mais baixas do que em n-hexano. Este facto e o aumento considervel de velocidade registado quando o LI estava saturado com CO2 sugeriram a existncia de limitaes difusionais internas. Por que razo E da cutinase em n-hexano aumentou apenas com a diminuio de temperatura at 0 C, ao contrrio do que sucedeu com a CALB? Os resultados obtidos em
n-hexano e em [C4mim][PF6], que evidenciam uma diminuio de E com o aumento de T,
sugerem que as experincias foram realizadas a T < Tr. A teoria do estado de transio no
prev a existncia de mais do que uma temperatura de inverso. Tal como foi observado por Holmberg e Hult [1991], a relao entre E e T prevista pela teoria pressupe que no h uma alterao substancial da conformao da enzima na gama de temperaturas testada. Assim, uma hiptese para explicar o impacto de T em E para a cutinase em n-hexano seria a ocorrncia de algum fenmeno a nvel da conformao da enzima. Contudo, se tal tiver acontecido, no se reflectiu de forma equivalente na actividade da cutinase que, como se viu atrs, manteve uma actividade residual elevada, mesmo mais elevada do que a exibida pela CALB s temperaturas mais baixas de trabalho. de notar que h evidncia de que o congelamento de uma fase aquosa pode causar alteraes conformacionais com prejuzo da eficincia cataltica das enzimas [Terefe et al., 2004]. Este estudo foi realizado em meio aquoso, em condies muito diferentes, portanto, daquelas a que a enzima est submetida no presente trabalho. No entanto, o comportamento exibido pelas duas enzimas poder tambm reflectir em certa medida este tipo de efeito.
5.5 CONCLUSO
A temperatura pode afectar de uma forma importante o resultado das reaces assimtricas, no s pelo efeito que pode ter no grau de pureza enantiomrica dos compostos obtidos, mas tambm pelo impacto que pode ter ao nvel da preferncia da enzima por um ou outro dos enantimeros. Este aspecto tem sido explorado quer na sntese enzimtica, quer no enzimtica [James et al., 2005]. O presente estudo teve como objectivo principal a anlise do impacto da temperatura na enantioselectividade da cutinase. Desse ponto de vista, levantaram-se questes interessantes, como a forma como o solvente pode mediar a influncia de T em E, mas sobretudo o impacto que T teve em E em n-hexano, manifestado num aumento de E da cutinase com a diminuio de T at 0 C, mas sem expresso para temperaturas inferiores. Seria muito til dispor de dados de modelao molecular que pudessem elucidar os resultados obtidos, e outros obtidos na extenso do presente estudo a mais substratos e solventes. A utilizao de mutantes da cutinase poderia tambm contribuir de uma forma importante para clarificar a relao entre a estrutura e a enantioselectividade da enzima.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi financiado pela Fundao para a Cincia e a Tecnologia e pelo FEDER. Agradece-se o apoio do Ricardo Baptista na produo da cutinase. Agradece-se Novo Nordisk Bioindustrial, Espanha, a oferta da Novozym.
Concluso Geral
CAPTULO 6
Concluso Geral
Concluso Geral
Concluso Geral
CONCLUSO GERAL
A BSNA requer uma aproximao multidisciplinar que integra uma srie de conhecimentos/contribuies, nomeadamente na concepo do biocatalisador ideal, por via de processos de imobilizao mais adequados e/ou utilizao de novas enzimas obtidas por seleco de enzimas j existentes na natureza ou obtidas por mutagnese, na concepo/desenvolvimento de um reactor apropriado e operaes de separao eficazes, e na escolha de um solvente apropriado. Este ltimo aspecto, que faz parte integrante da vulgarmente designada engenharia de meio, cada vez mais alvo de ateno, nomeadamente no que respeita procura de solventes alternativos que no coloquem os problemas ambientais associados aos tradicionais solventes orgnicos. Enquadra-se nesta estratgia a utilizao de solventes ambientalmente sustentveis, solventes verdes como os fluidos-sc e os LIs. Na escolha do solvente que melhor se adequa a cada processo, necessrio entrar em linha de conta com aspectos como a solvatao de substratos e produtos, eventuais efeitos directos do solvente na enzima, formas de assegurar e controlar aW, o estado de ionizao da enzima e a forma de dispersar a enzima no meio. sobre estes tpicos que a presente dissertao se debrua, no sentido em que procura aprofundar o conhecimento sobre a influncia e o modo como estes parmetros interagem, no contexto da BSNA em solventes verdes. Com a anlise do comportamento de enzimas em condies comparveis em LIs, fluidos-sc e solventes orgnicos, pretende-se constituir uma base mais slida para optimizar o funcionamento das enzimas nesses meios, que permita olhar de uma forma mais fundamentada para as opes disponveis. Pelos estudos efectuados, verificou-se que: (i) A actividade de transesterificao da cutinase aumentou com o aumento de aW quando o valor deste parmetro subiu de 0,2 para 0,7, em n-hexano, etano-sc e CO2-sc, acontecendo o inverso em acetonitrilo. A actividade de hidrlise da cutinase aumentou com o aumento de aW em qualquer dos solventes testados, mas foi muito
Concluso Geral
mais elevada em acetonitrilo. Entre estes quatro solventes, o acetonitrilo o nico que miscvel com a gua. Comparativamente, o mesmo valor de aW corresponde, em acetonitrilo, a um nmero muito maior de molculas de gua do que nos outros trs solventes. Este facto poderia no s explicar os nveis de hidrlise registados no acetonitrilo, como as velocidades de transesterificao mais baixas devido competio mais acentuada com a hidrlise. No entanto, em LIs, a cutinase foi activada, em termos de transesterificao e hidrlise, pelo aumento de aW nos trs LIs testados, quer nos que so imiscveis com a gua ([C4mim][PF6] e [C8mim][PF6]), quer no que miscvel com a gua ([C4mim][BF4]). A aW = 0,7, este ltimo solvente tem uma concentrao de gua superior do acetonitrilo para o mesmo valor de aW. A actividade de transesterificao da cutinase foi mais elevada nos dois LIs imiscveis com a gua do que no terceiro. Em particular, as velocidades de transesterificao da cutinase foram muito semelhantes em n-hexano, etano-sc e [C4mim][PF6]. (ii) A CALB foi desactivada pelo aumento de aW quando o valor deste parmetro subiu de 0,2 para 0,7, em qualquer dos solventes testados (orgnicos, supercrticos, LIs). Mesmo os nveis de hidrlise baixaram com o aumento de aW, revelando uma diminuio global da competncia cataltica desta enzima. (iii) Os perfis de actividade da cutinase em funo de aW foram semelhantes quando a cutinase se encontrava imobilizada nos zelitos NaY ou NaA. As diferenas registadas devero reflectir diferenas nas interaces enzima/suporte. (iv) A cutinase foi pouco sensvel a variaes do estado de ionizao impostas por tampes cido-base, embora em n-hexano e etano-sc se notasse algum efeito menos favorvel dos tampes que tinham os valores mais extremos de pKa em meio aquoso. Surgiu, no entanto, uma situao invulgar com a cutinase imobilizada no zelito NaA, em etano-sc, em que mesmo a presena de um tampo relativamente acdico conseguiu aumentar a velocidade inicial de transesterificao para nveis semelhantes aos obtidos em n-hexano. A explicao poder ser o nvel de hidrlise mais elevado registado no zelito NaA, o facto do coeficiente de actividade para o cido butrico em etano-sc ser mais elevado do que em n-hexano, sugerindo assim uma maior
Concluso Geral
disponibilidade do cido para a enzima em etano-sc, o facto de a percentagem de imobilizao da cutinase no zelito NaA ser menos elevada do que no zelito NaY, e ainda o facto de o zelito NaA ser mais hidroflico, e ter maior apetncia para fixar o cido. Em acetonitrilo, a cutinase foi insensvel a qualquer manipulao das condies cido-base do meio, possivelmente devido maior polaridade do meio. (v) A estabilizao dos substratos no solvente era maior no n-hexano do que no etano-sc, e ainda maior no acetonitrilo, tal como indicado pelos coeficientes de actividade calculados para os substratos. Os resultados destes clculos esto em bom acordo com as actividades de transesterificao mais elevadas que se registaram para a cutinase em etano-sc do que em n-hexano, e com as actividades cerca de uma ordem de grandeza mais baixas observadas em acetonitrilo. O clculo efectuado em CO2-sc sugeria uma solvatao compatvel com uma razovel tendncia dos substratos acederem ao centro activo da enzima, e portanto velocidades de transesterificao elevadas, ao contrrio do que se observou. Esta constituiu mais uma evidncia para o efeito directo negativo do CO2 sobre uma enzima. De facto, a CALB exibiu uma actividade de transesterificao to elevada em CO2-sc quanto em n-hexano ou etano-sc, em bom acordo com as semelhanas de solvatao nestes trs solventes que os clculos de coeficentes de actividade revelaram. (vi) A CALB exibiu uma actividade diminuida nos LIs. Este facto poder ter sido devido existncia de limitaes difusionais internas resultantes da elevada viscosidade dos LIs relativamente aos outros solventes testados, no existentes no caso da cutinase que apenas se encontrava imobilizada superfcie dos suportes de imobilizao. O facto de se estar a comparar o comportamento de duas enzimas nos mesmos LIs permitiu eliminar a hiptese de que estes resultados se devessem a questes de solvatao. No entanto, o facto de a CALB ter exibido uma actividade mais elevada em [C8mim][PF6] do que em [C4mim][PF6], ao contrrio da cutinase, sendo o LI [C8mim][PF6] o mais viscoso dos trs LIs utilizados, indica que os resultados registados no reflectem apenas a influncia de limitaes difusionais. (vii) Uma lacuna da presente dissertao a falta de dados termodinmicos que possam clarificar o papel da solvatao nos LIs. Espera-se que seja em breve possvel dispor
Concluso Geral
de ferramentas de clculo para tal, a exemplo daquelas que esto acessveis para solventes orgnicos e fluidos-sc. (viii) No sistema combinado LI/CO2-sc, a presena do LI evitou que o CO2 exercesse o seu efeito negativo sobre a cutinase que as alternativas de imobilizao testadas no solucionaram. Obtiveram-se mesmo velocidades de transesterificao mais elevadas do que no LI sozinho, o que poder ter sido devido ao efeito, a nvel da solvatao dos substratos, da elevada concentrao de CO2 dissolvido no LI. No caso da CALB, os aumentos de actividade registados foram ainda mais acentuados. Este facto poder ter tido como causas adicionais o alvio das limitaes difusionais devido diminuio da viscosidade dos LIs contendo elevadas concentraes de CO2, e ainda uma reduo do valor de aW que favorvel CALB. (ix) O sistema combinado LI/CO2-sc revelou-se uma alternativa muito interessante para a biocatlise, possibilitando uma integrao de processos em solventes ambientalmente favorveis. Desenvolvimentos futuros podero incluir processos de separao baseados em diferenas de presso e suportados em estudos de equilbrios de fase, ou envolvendo membranas. (x) A temperaturas inferiores a 0 C, a cutinase e a CALB exibiram actividades no desprezveis em n-hexano. A 0 e 18 C, a cutinase exibiu cerca de 50 e 20 % da actividade exibida a 35 C, respectivamente, valores que desceram para cerca de 30 e 10 % no caso da CALB. O clculo dos coeficientes de difuso a diluio infinita dos dois substratos naquele solvente permitiu confirmar que, partindo de uma situao a 35 C em que no haja resistncias transferncia de massa, que seguramente o caso da cutinase, ento a 18 C haver ainda menos razes para que as limitaes difusionais externas mascarem a variao das constantes cinticas com T. transesterificao e de hidrlise para as duas enzimas. (xi) Confirmou-se que a temperatura constitui mais uma varivel a ajustar no controle da enantioselectividade (E) enzimtica. Com a cutinase, observou-se um aumento de E com a diminuio de T de 35 para 0 C, em n-hexano. Entre 0 e 25 C, no se A diminuio de T no afectou substancialmente a razo das velocidades de
Concluso Geral
observou nenhuma variao adicional de E. Esta tendncia foi confirmada em [C4mim][PF6], solvente no qual E a 35 C foi igual a E em n-hexano ao mesmo valor de T, e E a 18 C foi igual a E obtido em n-hexano a T igual ou inferior a 0 C, apesar de ser muito provvel a existncia de limitaes difusionais externas no LI cuja viscosidade aumenta extraordinariamente com a diminuio de T. J a CALB exibiu valores de E que variaram progressivamente com a diminuio de T, originando uma variao linear de lnE com o inverso de T. Em acetonitrilo, a discriminao dos enantimeros relativamente s duas enzimas foi a mesma a qualquer dos valores de T testados, evidenciando a influncia do solvente em E. de referir que muito provavelmente a gua solidificou no n-hexano e no [C4mim][PF6] s temperaturas mais baixas testadas, o que no entanto no parece ter afectado significativamente a influncia de T quer na actividade das enzimas, quer em E, pelo menos a julgar pelo comportamento registado com a CALB. (xii) Seria muito interessante dispor de dados de modelao molecular que pudessem clarificar a variao da enantioselectividade da cutinase com a variao da temperatura e do solvente. Nesse sentido, seria til fazer a extenso do estudo j realizado de modo a incluir mais substratos, e ainda utilizar mutantes da cutinase, de modo a elucidar a relao entre a estrutura da enzima e E.
Concluso Geral
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CAPTULO 7
7
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SLVIA MARIA PIRES GARCIA

BIOCATLISE EM MEIOS NO CONVENCIONAIS:

SLVIA MARIA PIRES GARCIA

BIOCATLISE EM MEIOS NO CONVENCIONAIS:

A meus Pais, Irmos, Marido e, especialmente, ao meu filho, Bruno.

ACTIVIDADE DA CUTINASE EM MEIOS SUPERCRTICOS E

3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5

RESULTADOS E DISCUSSO ...................................................................................44 CONCLUSO .....................................................................................................52

ESTUDO COMPARATIVO DE BIOCATLISE EM SOLVENTES NO-

ACTIVIDADE E ENANTIOSELECTIVIDADE DA CUTINASE A BAIXA

5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.4 5.5

CONCLUSO GERAL.............................................................................................89 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.....................................................................97

Intriduo Geral e Objectivos

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 1

Intriduo Geral e Objectivos

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 2

Intriduo Geral e Objectivos

INTRODUO GERAL E OBJECTIVOS

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 3

Intriduo Geral e Objectivos

Fig. 1.1 Reaco alvo: Transesterificao do butirato de vinilo com o 2-fenil-1-propanol.

H3C Tautomerizao O cido Butrico

Fig. 1.2 Reaco secundria: hidrlise do butirato de vinilo.

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 4

Intriduo Geral e Objectivos

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 5

Intriduo Geral e Objectivos

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 6

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 7

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 8

2.1 BIOCATLISE EM SOLVENTES NO AQUOSOS (BSNA)

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 9

deslocamento do equilbrio reaccional no sentido da sntese devido reduo do teor de gua;

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 10

2.2 PARMETROS CRTICOS NA BSNA

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 11

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 12

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 13

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 14

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 15

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 16

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 17

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 18

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 19

2.3 BIOCATLISE EM FLUIDOS SUPERCRTICOS

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 20

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 21

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 22

2.4 BIOCATLISE EM LQUIDOS INICOS

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 23

2.5 BIOCATLISE EM LQUIDOS INICOS/CO2-SC

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 24

2.6 LIPASES E ESTERASES DE SERINA

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 25

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 26

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 27

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 28

Trade cataltica: Ser(105); His (224); Asp (187)

Fig. 2.3 Estrutura da CALB, destacando a trade cataltica.

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 29

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 30

Biocatlise em Meios No Convencionais: Solventes Orgnicos, Fluidos Supercrticos e Lquidos Inicos 31

O CH3 Ser CH2 CH 2 O N O CH3

Ligao da enzima ao butirato de vinilo