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PRODUÇÃO DE ENZIMAS MICROBIANAS

PRODUÇÃO INDUSTRIAL DE ENZIMAS

A produção de enzimas em escala industrial se faz por fermentação.

A figura 1 mostra o conjunto de processos necessários á produção de enzimas

comerciais. Considerando o processo fermentativo como referência, posto que ele
concorre para a produção do produto alvo, pode-se denominar os demais como
processos a montante (“upstream”) ou a jusante (“downstream”).

PROCESSOS A MONTANTE (“upstream”) da fermentação

Poucos são os processos prévios á fermentação, no caso da produção de

enzimas, um dos mais importantes é o preparo do inoculo. Pode-se partir de um
cultivo em frasco agitado, inoculo com a cultura estoque liofilizada.

Controles nas transferências – para observar os seguintes aspectos:

- presença de contaminação;
- infecção por bacteriófagos;
- proliferação de mutantes de menor eficiência.
O número de transferências deve ser reduzido ao mínimo possível.

Cultura Crescimento em Pré-inoculo

frascos agitados fermentador
estoque
Fermentador
principal

Preparo esterilização separação

do meio
concentração

purificação

acabamento

O PROCESSO FERMENTATIVO

A linhagem microbiana utilizada industrialmente é fruto de trabalho de

melhoramento e portanto sigilosamente protegida.
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A manutenção da linhagem requer um trabalho constante de microbiologia.

Cuidados importantes – estocagem e manutenção – para reprodução de
resultados experimentais em trabalhos de pesquisa.

Do ponto de vista industrial, os m. sint., são muito caros, a opção é feita por meios
que contenham mat. Primas da agroindústria.

Meios – devem conter fontes de carbono e energia, fontes de nitrogênio, subst.

Minerais e fatores de crescimento.

Composição do meio de cultivo – usado industrialmente (sigilosos).

A literatura indica os constituintes empregados.

Fontes de carbono e energia – farinhas amiláceas, licores de milho, soja, melaços.
Fontes de nitrogênio – farinha de peixe, gelatinas, licores de milho e soja.
Fatores de crescimento e micronutrientes: extrato de levedura, licor de milho,
farinhas de sementes oleaginosas.

Fermentação:
Fermentadores, mecanicamente agitados.
Meios concentrados – pode conduzir a elevada viscosidade. Com isso a energia
gasta para agitação e aeração pode incidir sobre o custo final do produto. A
utilização de tais meios, pode provocar formação de espuma (utilizar
antiespumantes).

Produção industrial de enzimas – ocorre em fermentadores – capacidade – 10.000

a 100.000 litros, modo descontínuo (batelada).

Fermentadores – apresentam:
- camisas ou serpentinas internas para aquecimento e refrigeração;
- sistema de medidas – sensores de pH, temperatura, oxigênio dissolvido,
espuma.

Duração – 30 a 150 horas (ferment. Em bat para prod de enz.).

Atividade enzimática – parâmetro de controle mais importante para finalizar

fermentação.

Quando esta é muito demorada (tempos de resposta longos), outros parâmetros

de processo são utilizados para caracterizar o fim do processo de fermentação
(pH, oxigênio dissolvido).

Importante
O término de fermentação não é apenas ditado pelo valor de atividade enzimática;
outros fatores como:
- características do caldo – para promover a recuperação eficiente da enzima;
- duração do ciclo operacional – para melhor aproveitamento da planta industrial;
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são determinantes para a otimização do tempo de fermentação.

PROCESSO A JUSANTE (“downstream”) da fermentação

A figura mostra as etapas envolvidas na recuperação e processamento pós

fermentação.

Não é diretamente comercializado – caldo fermentado livre de células, sem

processamento adicional.

Muito comercializado – a enzima de interesse é recuperada do caldo fermentado ,

purificada até um certo grau.

Etapas de separação e purificação:

Finalidade:
- remover substâncias tóxicas
Para a obtenção de preparação enzimática de uso farmacêutico, processos mais
sofisticados de purificação, como as separações cromatográficas, são utilizadas.

ETAPAS INICIAIS DE SEPARAÇÃO E CONCENTRAÇÃO

Enzimas:
- o caldo é resfriado a ~ 50 C, com o objetivo de
- assegurar condições de estabilidade do produto;
- evitar crescimento de mos contaminantes;
- pH ajustado para valor ótimo da atuação da enzima produzida.

Separação das células:

- pode ser feita :
- centrifugação;
- filtração.
Fungos – centrifugação;
Bactérias e leveduras – prévia floculação (cloreto de sódio); eficiente; baixo custo.
A filtração, como alternativa a centrifugação – utilização de filtros prensa, filtros
rotativos á vácuo.

Solução concentrada – filtração em meio filtrante de celulose – preparado

enzimático líquido – diluído e acondicionado com estabilizantes da atividade
enzimática – embalado para comercialização.

ETAPAS FINAIS DE PRODUÇÃO: PURIFICAÇÃO E ACABAMENTO

À partir da obtenção de um concentrado enzimático:

Concentrado líquido – produto bruto comercializável em certos mercados.

Diversas razões (aplicação, transporte, estocagem) pode ser preferível a obtenção
de um preparado enzimático bruto na forma sólida.
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O concentrado deve ser seco á vácuo ou por atomização (spray drying).

Produto final – não pode apresentar baixa granulometria, pois a risco de geração
de poeira (saúde dos trabalhadores – manuseiam as preparações em pó).

Aglomeração – para obter partículas maiores, faixa de 200 500μm.

Para obter maior grau de pureza – submeter o concentrado líquido a técnicas de

fracionamento e purificação.

Técnicas que utilizam membranas:

- ultrafiltração;
- microfiltração;
- osmose inversa.
Desvantagem - não apresentam alta seletividade. Portanto utilizado em
combinação com outras técnicas ou nas etapas de concentração de solutos.

Técnicas cromatográficas
Busca de maior grau de pureza do produto

Cromatografia de troca iônica – utiliza resinas a base de celulose, géis de

dextrana. Alta seletividade, porém tempos de processamento elevados.

Cromatografia de filtração em gel – critério de separação – tipo e tamanho da

molécula. Utiliza – polímeros de ligação cruzada com diâmetros de poros
estabelecidos e apresenta alta seletividade.

Cromatografia de afinidade – baseia-se na ligação bioespecífica da enzima com

os ligantes (substratos ou inibidores). Alta seletividade, aplicada em laboratório
(restrição)

Exemplos de proteínas purificadas por processos cromatográficos:

- insulina;
- malato desidrogenase;
- glicoquinase.

Grau de purificação desejado está associado á aplicação do produto.

No mercado:
Disponíveis –
- preparações pouco purificadas para uso técnico ou industrial;
- preparações de alto grau de pureza para uso analítico ou farmacêutico.