Quantificação de proteínas UV-Vis

Práticas Laboratoriais de
Bioquímica
Quantificação de
proteína
João Ricardo Sousa

Departamento de Biologia e Ambiente
Escola das Ciências da Vida e do Ambiente
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
jricardo@utad.pt
Extensão: 4352
A espectroscopia de absorção molecular no
ultravioleta (UV) e visível (Vis) é uma
técnica muito usada em laboratório, que se
baseia na interação da radiação
electromagnética com a matéria
(medir a quantidade de energia absorvida em

função do comprimento de onda  usado)
(principio da técnica)
João Ricardo Sousa (UTAD)

... com base neste principio a espectroscopia
de absorção molecular no ultravioleta (UV)
e visível (Vis) permite:
 identificar substâncias químicas (análise qualitativa);
 determinar a sua concentração (análise quantitativa);

A região ultravioleta (UV) do espectro é
considerada na faixa dos 200 a 400 nm, enquanto
a região do visível (Vis) entre os 400 a 800 nm

Absorção molecular no UV/Vis
 absorção da radiação electromagnética de

 na faixa de 160 a 780 nm;
  inferiores a 150 nm são altamente

energéticos que levam à ruptura de ligações
químicas;
 acima de 780 nm atinge-se o IV próximo, onde a energia, com

níveis relativamente baixos, começa a promover apenas vibrações
moleculares e não transições electrónicas;
 devido ao elevado número de estados vibracionais e rotacionais, um

espectro de absorção no UV/Vis apresenta um formato alargado
(banda);

Espectros de absorção
Riscas Abs. Atómica Bandas Abs. Molecular
(nº limitado de frequências absorvidas) (maior nº de estados de energia)
Energia E1
E = h.
E0
átomo molécula
Absorvância
Absorvância
Absorvância
(nm) (nm) (nm)

Características da radiação electromagnética
Carácter ondulatório Carácter corpuscular

natureza dual
(reflexão; refração) (absorção; emissão)

Características da radiação electromagnética
Carácter natureza dual

Carácter corpuscular
(absorção; emissão)
ondulatório
(reflexão; refração)
Comprimento Comprimento
de ondas longo de ondas curto
Reduzida frequência () Elevada frequência ()

Reduzida energia (E) Elevada energia (E)

Carácter ondulatório da radiação electromagnética
Relação entre o comprimento de onda () e a energia (E)
()1
espaço
1distância
entre 2 pontos consecutivos na
mesma fase de vibração (nm; m)
h: constante de Planck (6,63*10-34 Js);
c: velocidade da luz no vazio (2,99*108 ms-1);
: frequência;
: comprimento de onda;
ENERGIA (E) é inversamente proporcional ao COMPRIMENTO DE ONDA ()

Na espectrometria os máximos de absorção são a principal
diferença que se observa no espectro de substância diferentes
Fenómeno menos energético
Espectrograma do -caroteno Espectrograma da Ag coloidal
O QUE FAZ QUE A ABSORÇÃO DA LUZ SEJA

DIFERENTE ENTRE SUSBTÂNCIAS
… as substâncias absorvem radiação devido à presença de
GRUPOS CROMÓFOROS …
Absorve em vários
comprimentos de onda
diferentes (vários grupos
funcionais) ASPARTAME
grupos cromóforos:
São grupos funcionais que apresentam absorção característica na
região do UV ou Vis
ex: carboxilo (-COOH) (200-210 nm)

Outros grupos cromóforos:
 Carboxilo (-COOH): 200 – 210 nm;

 Aldeído (-COH): 210 nm; 280 – 300 nm;
 Amino (-NH2): 195 nm;
 Brometo (-Br): 208 nm;
 Dissulfeto (-S-S-): 194 nm; 255 nm;
 Éster (-COOR): 205 nm; Substâncias diferentes
 Éter (-O-): 185 nm; diferentes grupos funcionais
 Nitro (-NO2): 210 nm;
 Nitroso (-NO): 302 nm;
 Tiocarbonilo (=C=S-): 205 nm;
 Tioeter (-S-): 194 nm; 215 nm;
 Tiol (-SH): 195 nm;

… o processo de absorção da radiação envolve transições

electrónicas bem definidas (energia quantizada) (E=h)
E = h.
E = h.
subnível
energético
Cada transição electrónica vem

Nível energético
acompanhada de uma transição rotacional
e vibracional (consequência?)
2,0
1,5
Absorvância
1,0
0,5
0,0
350 400 450 500 550 600 650 700 750
 (nm)
Absorção molecular: O espectro de absorção é caracterizado por bandas largas
devido aos vários níveis e subníveis energéticos dos orbitais moleculares.
Absorção da radiação
1ª Etapa:
Excitação electrónica da molécula “M”
M + h → M*
2ª Etapa:
Relaxamento
M* → M + calor
M* → M’ + M” (fotodecomposição)
M* → M + h (luminescência)

Características dos processos de absorção do visível
A cor de uma espécie em solução é a cor complementar àquela do  que absorve
A região que contém o  de máxima absorção de uma espécie de interesse pode ser
prevista se a solução da amostra for colorida
Medida da absorção e análise quantitativa
Quando um feixe de radiação monocromática atravessa uma
solução contendo uma espécie absorvente, uma parte da energia
desse feixe é absorvida e outra é transmitida
I0 – intensidade do feixe de luz incidente;

I – intensidade do feixe de luz emergente;
b – percurso óptico (1 cm);
Transmitância (T) – atenuação da intensidade sofrida pelo feixe de luz incidente (I0);
Absorvância (A) – depende do nº de centros absorventes (concentração);
QUANTO MAIOR A TRANSMITÂNCIA MENOR É A ABSORVÂNCIA

Absorvância
 adimensional;
 traduz a diferença de intensidade entre feixes de radiação monocromática
incidente (I0) e emergente (I);
 é proporcional à intensidade de absorção (concentração da espécie
absorvente na solução) (c);
 é proporcional à espessura da célula de leitura (cuvete) (b);

Relação entre a absorvância e concentração (lei de Beer-Lambert)
A quantidade de radiação monocromática absorvida por uma

amostra é descrita pela lei de Beer-Bernard-Bouguer-Lambert

Johann Heinrich Lambert (1728 – 1777):

observou que a intensidade da luz transmitida por um
meio absorvente era proporcional à espessura do meio
pelo qual a luz passava
Bouguer e Lambert observaram que quando a energia é absorvida a energia

transmitida decresce exponencialmente com o caminho óptico (a
proporção de luz incidente absorvida é directamente proporcional à
espessura da amostra atravessada pelo feixe de luz).

lei de
Lambert
Um aumento da distância
percorrida pelo feixe de radiação
implica um aumento do número
de moléculas absorvente da
radiação de energia (E=h)
A1<A2<A3<A4

August Beer (1825 – 1863):

observou que a intensidade da luz transmitida por um meio
absorvente era proporcional à concentração da espécie
absorvente
Beer e Bernard observaram que quando a energia é absorvida, a energia

transmitida decresce exponencialmente com a concentração (a proporção
de luz incidente absorvida é directamente proporcional ao número de
moléculas da substância atravessada pelo feixe de luz).

lei de Beer
A1<A2<A3<A4
Um aumento da
concentração da solução
implica um aumento do
número de moléculas
absorvente da radiação de
energia (E=h)

(i) combinando as duas equações:
(ií) como a A = - logT, temos:
(iií) a absorvância é directamente proporcional à concentração e espessura

do meio absorvente (percurso óptico)

(iv) A constante k3 é designada de absortividade () e é dependente do 

e da natureza do material absorvente
k3: coeficiente de absortividade (L g-1 cm-1);

: coeficiente de absorvitividade molar ou de extinção molar (L mol-1 cm-1);
coeficiente de extinção molar () de uma substância é o valor da absorvância

exibido por uma solução dessa substância de concentração 1M, quando medida num
tudo com um percurso óptico de 1 cm
A=bc lei de Beer-Lambert

Os fotómetros (colorímetros) e espectrofotometros são
instrumentos utilizados para registo dos valores de
absorvância (Abs) ou transmitância (T) em função do
comprimento de onda ().
… aparelhos de medição da absorção de radiação ocorrida num feixe de
comprimento de onda () definido (radiação monocromática) que atravessa
uma solução em que se encontram presentes as moléculas a identificar ou
quantificar …
Espectrofotómetro de bancada Fotómetro de bancada

Componentes da instrumentação usada na
determinação da absorvância na zona UV/Vis
amostra
fonte de radiação indicador
detector
elemento dispersante
registador
Fotómetro: o  usado na avaliação é seleccionado de forma descontínua; a

selecção do  é realizada por filtros que limitam a radiação incidente a uma
determinada banda de  (380-780 nm);
Espectrofotómetro: o  usado na avaliação é selecionado em gamas limitadas, de
forma contínua e variável, em toda a zona do espetro (200 a 1000 nm); a seleção
do  usado é realizada por um monocromador;
Componentes do espectrofotometro
Fonte
Espectrofotometro de bancada

fonte de
radiação
Fonte de radiação:
 deve possuir um feixe de radiação com intensidade suficiente para
proporcionar a medida (ser facilmente detectada e medida);
 pode ter mais que uma fonte emissora;
 o feixe produzido deverá ser estável;
Zona do UV Zona do visível (Vis)
200 nm 390 nm 800 nm
(i) lâmpada de descarga lâmpada de Tungsténio de

eléctrica de hidrogénio (H) filamento incandescente
e (ii) lâmpada de deutério
(ii) (i)
Emissões, por comprimento de onda, das principais
lâmpadas para espectrofotometria

Zona do UV Zona do visível (Vis)
200 nm 800 nm
LED’s (díodos emissores de luz)
Arco de Xenon (Xe)

(gás nobre)

fonte de
radiação
(2)
(1)
(3)
(1) fendas
(2) Lentes ou espelhos Selecionadores de
(3) Unidades de dispersão da REM comprimento de onda ()
(elementos de resolução)

Fendas:
 entrada da REM
 saída da REM
tem como objectivo reduzir

ou fixar as dimensões do
feixe de radiação,
restringindo assim radiação
desnecessária, mas também,
radiação parasita.

Lentes ou
Espelhos
colimadores
tem como objectivo focar o

feixe de radiação
colimação da radiação
Tornar os feixes de luz quase paralelos aumentando a precisão
das trajectórias das suas partículas (fotões)
Lentes
Fonte de
radiação
Fenda
Rede de
difração
Detector
Cuvete Fenda Lentes


Fonte
Compartimento da célula de leitura

As células de leitura são colocadas no compartimento de células do
espectrofotometro, que deve garantir um elevado grau de estanquicidade à
luz ambiente (minimizar interferências) (compartimento fechado).
Porta células
material

micropipetas
100 – 1000 μl
200 – 1000 μl
1 – 5 ml
ponteiras
micropipetas (1)
(2)
(1) êmbolo; (3)
(2) botão de ejeção da ponteira; (4)
(3) ajuste do volume;

(5)
(4) leitura do volume;
(5) eixo de ejção da ponteira;
(6) fixação da ponteira;
(6)
Como usar a micropipeta
aspiração descarga

Como usar a micropipeta

Soluções de albumina
Solução aquosa de albumina Solução aquosa de albumina

(BSA) 0,4% (m/v) com concentração desconhecida

para 1L:
1,5 de sulfato de cobre (CuSO4);
6,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio (KNaC4H4O6·4H2O);
300 ml de solução de hidróxido de sódio (NaOH) 2,5M
1,0 g de iodeto de potássio (KI);
papel cientifico
Solução aquosa de
BIURETO
H2O destilada
Células de leitura de plástico com
espectrofotómetro um percurso óptico de 1 cm

Células de leitura
(cuvetes)

 Características de transparência;
 Tamanho;
 Forma;

As células de leitura deverão ser construídas em materiais que
não interfiram (não absorvam ou sejam transparentes) com a
radiação electromagnética na região espectral usada
QUARTZO (Q)
VIDRO ÓPTICO (G)
PLÁSTICO
Características de transparência
(MATERIAL)

O vidro absorve fortemente os comprimentos de onda na zona do UV.

Abaixo de 300 nm toda a radiação é absorvida. O quartzo começa a
absorver fortemente somente abaixo de 200 nm.
As células de leitura deverão ser construídas em
materiais que não interfiram (não absorvam ou sejam
transparentes) com a radiação electromagnética na
região espectral usada
Material cdo (nm) Zona espectral

Cristal óptico/vidro borossilicatado 380 – 780 Vis 1
Plástico 380 – 780 Vis 1
Quartzo fundido < 380 UV 2
Quartzo UV 185 UV 2
Quartzo ES 190 – 2000 UV 2/Vis 1
Quartzo IR 220 - 3500 IR 3
1Visível; 2Ultravioleta; 3Infravermelho


As células de leitura deverão ser construídas em
materiais que não interfiram (não absorvam ou sejam
transparentes) com a radiação electromagnética na
região espectral usada
(NSG Precision Cells, 2007)

Cuvetes - tipos
Cuvete padrão com tampa de teflon Semi-micro cuvete com tampa de teflon
Cuvete padrão e rectangular com tampa de teflon Cuvete de fluxo contínuo
Cuvete de anaeróbia Cuvete cilíndrica com rolha de teflon
Cuvete padrão com rolha de teflon ou vidro Cuvete padrão para fluorimetro com tampa de teflon
G – vidro óptico;
H – quartzo UV;
I – quartzo IR;
S – quartzo ES
Tamanho das células = percurso óptico
Cuvete Tipo 1 UV10
(1)
(1)
(2)
(3)
(1) Diâmetro interno (percurso óptico)
(2) Espessura da parede (2*1,25=2,50 mm)
(3) Diâmetro externo (12,5 mm)
(1) = (3) – (2) = 10,0 mm = 1,0 cm

Tamanho das células = percurso óptico
(mais usado)
100 mm
50 mm
40 mm
20 mm 2mm 1 mm
10 mm 5 mm
(2) (1)

Cuvete de percurso óptico duplo
Percurso óptico (luz) de 10 mm (1,0 cm)

Cuvete de volume variável
Volume de amostra reduzido

Formas das cuvetes
 Faces planas e perpendiculares à radiação

incidente;
 Cilíndricas (menor custo e repetibilidade);

Face lisa
(para leitura)
Face estriada ou
fosca
(para manipulação)
cuvete cuvete
cuvete
Manuseio das cuvetes

vortex
x7
Suporte de tubos de ensaio tubos de ensaio (7)

Computador portátil
(tratamento dos resultados; estimativa da recta padrão;
determinação dos valores de concentração da amostra e
respectiva correção (fd)
metodologia
1ª parte:
Identificação do valor de  em que a coloração violeta do método de
BIURETO tem o valor máximo de absorvância
Tubo A: Tubo B:
 2 ml H2O;  2 ml BSA 0,4%;
 4 ml BIURETO  4 ml BIURETO
Tubo A Tubo B
Vortex (≈ 10 s) para homogeneizar

1ª parte:
Após vortizar (homogeneização),

deixar reagir durante um período
aproximado de 10 minutos para obter
desenvolvimento de cor (?)
Tubo A Tubo B

BIURETO:
Biureto obtém-se a partir da decomposição da ureia, quando esta é submetida a uma temperatura
de aproximadamente 180 ºC.
Soluções alcalinas que contenham biureto

desenvolvem uma coloração violeta, quando em
presença de sulfato de cobre (CuSO4). Esse
fenômeno deve-se à formação de um complexo
entre o íão Cu2+ e os átomos de azoto (N)
presentes na molécula do biureto. O esquema ao
lado representa um modelo da formação do
respetivo complexo:
interação biureto – Cu2+

BIURETO:
As ligações existentes na molécula de biureto são similares às ligações peptídicas
estabelecidas entre os aminoácidos durante a formação de peptídeos e proteínas, tal
como observado na figura que representa a interação entre as ligações peptídicas de
uma proteína ou peptídeo com o ião Cu2+:
interação biureto – Cu2+ interação ligação peptídica – Cu2+

BIURETO:
A reação de peptídeos e proteínas com o sulfato de cobre recebeu o nome de Teste do
Biureto, e é utilizada para pesquisa de ligações peptídicas.
Reagente de biureto
(CuSO4; NaOH)
Proteína
Complexo de cor violeta

1ª parte:
Tubo A Tubo B
Branco Solução com o

(controlo) analito (BSA)

varrimento
A
máx

A
Absorvância
B
mA
mB
C
mC
D
mD
Concentração (mg/ml)
Maior declive da recta maior sensibilidade do modelo

Sensibilidade:
medida da capacidade do modelo descriminar entre
pequenas diferenças na concentração de um analito.
-Dois fatores limitam a sensibilidade: a

inclinação da curva de calibração e a
reprodutibilidade ou precisão do dispositivo
de medida;
-Para dois métodos que tenham a mesma

precisão, aquele que tem a curva de
calibração mais inclinada será o mais
sensível;
sensibilidade analitica: γ = m/Ss
m: inclinação da curva de calibração;
Definição: INCLINAÇÃO DA CURVA Ss: desvio padrão de medida;
DE CALIBRAÇÃO A UMA DADA
CONCENTRAÇÃO DE INTERESSE (m);

2ª parte:
2.1 determinação da recta padrão ou curva de calibração
2.1.1 determinação dos valores de absorvância (A) em

soluções de concentração conhecida (soluções padrão);
2.1.2 estabelecimento da equação de regressão linear pelo

método dos quadrados mínimos, através do Excel;
2.2 determinação da concentração de albumina (proteína) na

solução de concentração desconhecida;
2.2.1 determinação do valor de absorvância (A);
2.2.2 interpolação do valor de concentração (c) com base no

modelo matemático de regressão;

2.1.1 determinação dos valores de absorvância (A) em soluções
de concentração conhecida (soluções padrão);
Soluções padrão
Tubo Albumina H2O dest. BIURETO Concentração Abs
nº 0,4% (ml) (ml) (ml) (mg/ml)
1 0,0 2,0 4,0 0 ?
2 0,5 1,5 4,0 1 ?
3 1,0 1,0 4,0 2 ?
4 2,0 0,0 4,0 4 ?
aplicação dos reagentes no tubo de ensaio

2.1.1 determinação dos valores de absorvância (A) em soluções
de concentração conhecida (soluções padrão);
Soluções padrão Cálculos ?
Tubo Albumina H2O dest. BIURETO Concentração Abs

nº 0,4% (ml) (ml) (ml) (mg/ml)
1 0,0 2,0 4,0 0 ?
2 0,5 1,5 4,0 1 ?
3 1,0 1,0 4,0 2 ?
4 2,0 0,0 4,0 4 ?
que volumes ? João Ricardo Sousa (UTAD)

Cálculos
Vpip ? Vpip ? Vpip ? Vpip ?
Sol. Padrão 1 Sol. Padrão 2 Sol. Padrão 3 Sol. Padrão 4
Vtubo = 2 ml Vtubo = 2 ml Vtubo = 2 ml Vtubo = 2 ml

Solução mãe de Tubo nº 1 Tubo nº 2 Tubo nº3 Tubo nº4
albumina 0,4% (m/v) (0,0 mg/ml) (1,0 mg/ml) (2,0 mg/ml) (4,0 mg/ml)
Que volume se deve pipetar da solução mãe (alb 0,4%) para, por diluição,
fazer soluções padrão de concentrações de 0,0, 1,0, 2,0 e 4,0 mg alb/ml

Solução mãe de
Cálculos
albumina
0,4% (m/v) ? mg/ml
0,4% (m/v) «» 100 ml de solução → 0,4 g de albumina
1 ml de solução → 0,004 g de albumina
1 ml de solução → 4,0 mg de albumina

Solução mãe:
C1V1 = C2V2
Csol. mãeV1sol. mãe= Csol. Padrão i Vfinal tubo
Vpip Vpip Vpip Vpip
0,0 ml 0,5 ml 1,0 ml 2,0 ml
Padrão 1 Padrão 2 Padrão 3 Padrão 4

Solução mãe de Tubo nº 1 Tubo nº 2 Tubo nº3 Tubo nº4
albumina 0,4% (m/v) (0,0 mg/ml) (1,0 mg/ml) (2,0 mg/ml) (4,0 mg/ml)
ou 4,0 mg/ml

H2O:
H2 O
Vpip Vpip Vpip Vpip
2,0 ml 1,5 ml 1,0 ml 0,0 ml

H2O destilada Tubo nº 1 Tubo nº 2 Tubo nº3 Tubo nº4
(0,0 mg/ml) (1,0 mg/ml) (2,0 mg/ml) (4,0 mg/ml)

Reagente de cor
BIURETO
Vpip Vpip Vpip Vpip
4,0 ml 4,0 ml 4,0 ml 4,0 ml

BIURETO Tubo nº 1 Tubo nº 2 Tubo nº3 Tubo nº4
(0,0 mg/ml) (1,0 mg/ml) (2,0 mg/ml) (4,0 mg/ml)

Amostra pré-diluída 10x (Porquê)
Solução de albumina
com concentração
desconhecida
Tubo nº Amostra diluída H2O (ml) BIURETO Abs

10x (ml) (ml)
5 1,0 1,0 4,0 ?

6 1,0 1,0 4,0 ?
7 1,0 1,0 4,0 ?

diluição
diluição de 10x
H2 O
(destilada)
amostra de soro com balão volumétrico de

concentração elevada 100 ml
de albumina

Amostra de BSA concentração desconhecida:
Vpip Vpip Vpip
1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Vtubo = 2 ml Vtubo = 2 ml Vtubo = 2 ml

Solução de BSA de Tubo nº 5 Tubo nº 6 Tubo nº7
concentração desconhecida (R1) (R2) (R3)
(diluída 10x)

H 2O
Vpip Vpip Vpip
1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml

H2O destilada Tubo nº 5 Tubo nº 6 Tubo nº7
(R1) (R2) (R3)

BIURETO
Vpip Vpip Vpip
4,0 ml 4,0 ml 4,0 ml
BIURETO Tubo nº 5 Tubo nº 6 Tubo nº7

(R1) (R2) (R3)

Quadro resumo: ??

Varrimento:
 máxima
Absorvância

Curva de calibração (recta de regressão):
Soluções padrão de BSA recta de regressão:
 inserir;
 gráfico (dispersão; pontos);
 adicionar linha de tendência;
 modelo linear;
 mostrar equação do gráfico;
 mostrar valor de r2 do gráfico;
 identificar as variáveis;


Este modelo matemático permitirá

transformar o sinal espectroscópico,
absorvância (A), da amostra com
concentração desconhecida em valores
de concentração de albumina (mg/ml)

Interpolação do valor de concentração (c) com base no
modelo matemático de regressão:
Valores de
concentração da
amostra original?
Não – existiram diluições; logo o valor de concentração é
inferior ao da amostra original (1ª diluição)
 diluição durante a preparação da

amostra (fd1=10x);

Não – existiram diluições; logo o valor de concentração é
inferior ao da amostra original (2ª diluição)
1 ml 1 ml
(solução de BSA de (H2O destilada)
concentração
desconhecida)
 diluição durante o modo

Tubo nº (5,6,7) preparatório (fd2=2x);
Concentração da amostra original (correção):
diluição prévia do soro

toma da amostra
Valor de concentração de
albumina da amostra original
Fim João Ricardo Sousa (UTAD)

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Práticas Laboratoriais de

João Ricardo Sousa

(medir a quantidade de energia absorvida em

João Ricardo Sousa (UTAD)

 identificar substâncias químicas (análise qualitativa);

 determinar a sua concentração (análise quantitativa);

João Ricardo Sousa (UTAD)

João Ricardo Sousa (UTAD)

 absorção da radiação electromagnética de

  inferiores a 150 nm são altamente

 acima de 780 nm atinge-se o IV próximo, onde a energia, com

 devido ao elevado número de estados vibracionais e rotacionais, um

João Ricardo Sousa (UTAD)

João Ricardo Sousa (UTAD)

Carácter ondulatório Carácter corpuscular

João Ricardo Sousa (UTAD)

Carácter natureza dual

Reduzida frequência () Elevada frequência ()

João Ricardo Sousa (UTAD)

Relação entre o comprimento de onda () e a energia (E)

ENERGIA (E) é inversamente proporcional ao COMPRIMENTO DE ONDA ()

João Ricardo Sousa (UTAD)

Fenómeno menos energético

Espectrograma do -caroteno Espectrograma da Ag coloidal

O QUE FAZ QUE A ABSORÇÃO DA LUZ SEJA

ex: carboxilo (-COOH) (200-210 nm)

Outros grupos cromóforos:

 Carboxilo (-COOH): 200 – 210 nm;

João Ricardo Sousa (UTAD)

… o processo de absorção da radiação envolve transições

Cada transição electrónica vem

350 400 450 500 550 600 650 700 750

João Ricardo Sousa (UTAD)

A cor de uma espécie em solução é a cor complementar àquela do  que absorve

I0 – intensidade do feixe de luz incidente;

QUANTO MAIOR A TRANSMITÂNCIA MENOR É A ABSORVÂNCIA

João Ricardo Sousa (UTAD)

A quantidade de radiação monocromática absorvida por uma

João Ricardo Sousa (UTAD)

Johann Heinrich Lambert (1728 – 1777):

Bouguer e Lambert observaram que quando a energia é absorvida a energia

João Ricardo Sousa (UTAD)

João Ricardo Sousa (UTAD)

August Beer (1825 – 1863):

Beer e Bernard observaram que quando a energia é absorvida, a energia

João Ricardo Sousa (UTAD)

João Ricardo Sousa (UTAD)

(i) combinando as duas equações:

(ií) como a A = - logT, temos:

(iií) a absorvância é directamente proporcional à concentração e espessura

João Ricardo Sousa (UTAD)

(iv) A constante k3 é designada de absortividade () e é dependente do 

k3: coeficiente de absortividade (L g-1 cm-1);

coeficiente de extinção molar () de uma substância é o valor da absorvância

A=bc lei de Beer-Lambert

João Ricardo Sousa (UTAD)

Espectrofotómetro de bancada Fotómetro de bancada

João Ricardo Sousa (UTAD)

Fotómetro: o  usado na avaliação é seleccionado de forma descontínua; a

João Ricardo Sousa (UTAD)

200 nm 390 nm 800 nm

(i) lâmpada de descarga lâmpada de Tungsténio de