Protocolo Salmonella

Lista de Materiais:
Água peptonada (BPW - Acumedia®)
Alças descartáveis para plaqueamento
Swab
Ágar Xilose Lisina Tergitol-4 (XLT4 - Difco®)
Caldo Rappaport-Vassiliadis (Kasvi®) 
Caldo de Base Tetrationato (Difco®)
Caldo BHI + 20% de glicerol
Kits: EPM/ MiLi ou Citrato
Estufa 37º
Estufa 40º
Autoclave 115 º

Preparo dos reagentes:

Água peptonada: 20g da solução em 1l de água deionizada,
homogeneizar e autoclavar a 121º por 15 minutos.
Caldo Rappaport Vassiliadis Soja (RVS): 26,6g de meio em 1 litro
de água destilada. Mexer bem e dissolver por aquecimento e
frequente agitação. Ferver por 1 minuto até completa dissolução.
Dispensar em recipiente apropriado e esterilizar em autoclave a
115ºC por 15 min. NÃO SUPERAQUECER.
Caldo Base Tetrationato: 4,6g da solução em 100 ml de água
deionizada e adicionar 2ml da solução de iodo (6g de cristal de iodo
e 5g de iodeto de potássio em 20ml de água). Preparar a solução
em tubo âmbar.
Caldo XLT4: 59g da solução em 1l de água deionizada contendo
4,6ml de XLT4 suplementar.
  Preparo do Caldo BHI: Adicionar 37g em 1l de água destilada.
Misture bem e distribua nos recipientes. Esterilize em
autoclave a 121ºC por 15 min.

Coleta de material:
- Realizar um swab cloacal em cada ave encaminhada para
necropsia
- Realizar swab dos órgãos com lesões macroscópicas (Fígado,
baço ou intestino)
- Armazenar cada amostra separadamente em um frasco com BPW
devidamente identificado

Protocolo:

1) Incubação

- 9 ml de Água peptonada (BPW - Acumedia®) + 1 swab cloacal

(Diluição 1:9)
- Incubar a 34-38°C por 18 horas em seguida manter em
temperatura ambiente.

2) Enriquecimento

- Inocular 0,1 ml do caldo de BPW em 10 ml do Caldo Rappaport-

Vassiliadis (Kasvi®). Incubar a 41,5°C (importante não passar de
42,5°C) por 24h (± 3 h);
- Inocular também 1 ml do caldo da BPW em 10 ml do Caldo de
Base Tetrationato (Difco®) e incubar a 37°C por 24 horas (± 3 h).
- Homogeneizar bem os caldos à temperatura ambiente.

3) Isolamento e Identificação:
- Semear as culturas de RVS e Tetrationato por esgotamento em
placas com Ágar Xilose Lisina Tergitol-4 (XLT4 - Difco®), e incubar
a 37°C (± 1°C) por 24horas (± 3 h). Se negativas (sem colônias
suspeitas), deixar por mais 24 horas.
Obs: Agar XL4: Colônias amarelas a avermelhadas com centro
negro ou totalmente negras (exceção: SP e SG apresentam pouco
ou nenhum enegrecimento).
- Marcar com caneta, na placa as colônias selecionadas e suspeitas
em cada meio ágar, que estejam bem isoladas.
- Com a alça de inoculação, “pinçar” a(s) colônia(s) suspeita e
replaquea-las no mesmo meio cultura em que ela foi semeada
pela primeira vez. Incubar novamente a 37°C (± 1°C) por 24horas (±
3 h) e realizar a leitura posteriormente.
- Marcar com caneta, na placa as colônias selecionadas
compatíveis com Salmonella.
- Inexistindo colônias suspeitas, considerar o resultado “ausência”.

Armazenamento Caldo BHI + 20% de glicerol

4) Identificação Bioquímica: A partir do isolamento, selecionar

cinco unidades formadoras de colônias (UFC) (quando houver) com
características de Salmonella para triagem bioquímica.
Kits: IAL, ou Rugai com indol e lisina, ou kits como
EPM/MiLi/citrato.

5) PCR
 Extração de DNA – Protocolo de Guanidina (Pitcher et al

1989)

Referências:
ELSOHABY, I.; SAMY, A.; ELMOSLEMANY, A.; ALORABI, M.;
ALKAFAFY, M.; ALDOWERIEJ, AL. AL-MARRI, T.; ELBEHIRY, A.;
FAYEZ, K. Migratory Wild Birds as a Potential Disseminator of
Antimicrobial-Resistant Bacteria around Al-Asfar Lake, Eastern
Saudi Arabia. Antibiotics, v. 10, n. 3, p. 260, 2021.
MOOIJMAN, Kirsten A. The new ISO 6579-1: A real horizontal
standard for detection of Salmonella, at last!. Food microbiology,
v. 71, p. 2-7, 2018.