Recetores de superfície celular

O cancro da mama é o tumor maligno mais comum nas mulheres em todo o mundo (32% de todos os cancros
em mulheres), sendo que quando está presente em homens é mais agressivo. Tem etiologia desconhecida,
mas com fatores ambientais e genéticos determinados (ERBB2, P53 e os BRCA1, BRCA2 que são marcadores
associados à doença hereditária).
o Terapêutica: radioterapia (terapêutica localizada), cirurgia (mais comum), quimioterapia e
terapêutica biológica

ERBB2 é uma proteína que está sobre expressa entre 15-20% de todos os tumores, sendo um indicador de
mau prognóstico e torna-se alvo terapêutico por trastuzumab (Herceptin®). Tem 4 funções essenciais do
ERBB2
o diferenciação de células o proliferar
o migração da célula o sobrevivência (evita apoptose)

Uma célula de cancro da mama tem na sua superfície naturalmente, moléculas chamadas epiderme
growth factor recptor tipe 2, ou ERBB2, esta é uma molécula transmembranar, e um recetor de cinase
tirosina, deste modo é um fator de crescimento epidérmico, estando associado a células epidérmicas.

O ERBB2 é ativado mediante a sua dimerização, após ligação com o ligando. Tem 4 componentes na
família (ERBB1, ERBB2, ERBB3 e ERBB4). Ele pode:
o Homodimerizar à 2 ERBB2 do mesmo tipo que se dimerizam
o Heterodimerizar à ERBB1 dimeriza com ERBB2, ou com qualquer um dos outros da família, ou
seja, 2 ERBB de tipos diferentes, mas da mesma família, ligam-se

As células normais da mama têm cerca de 20 mil recetores por célula na sua membrana. Assim temos a
ligação do ligando ao recetor, que vai desencadear o emparelhamento em heteródimos:
1. ligação com ligando
2. alteração conformacional
3. passa a ter afinidade para um segundo recetor
4. heterodimerização
5. leva a alterações intracelulares
6. provocando a autofosforilação cruzada
7. leva ao aumento da atividade cinase tirosina
8. Consequente criação de resíduos fosfotirusina e ligação de outras proteínas aos resíduos de
fosfotirusina

Celulas normais à Na parte interior da membrana temos as partes internas da proteína, a partir do
momento em que ela forma os resíduos de fosfotirosina, há atração de proteínas que se ligam, neste caso
da via das MAP cinases ou Mtor.

Celulas mutadas à célula a fica roxa uma vez que tem muitos recetores (podem chegar aos 2 milhões)
por célula o que vai resultar numa via Mtor muito ativa fazendo com que as 4 funções se mantenham, uma
vez que o ligando é muito comum no nosso corpo, fazendo com que o tumor cresça muito rápido.

Foi então criado o Transtusumab, que bloqueia o recetor. O Transtusumab é um anticorpo monoclonal que
se ligar á parte externa do recetor impedindo a sua dimerização, fazendo com que o ERBB2 fique inativo,
não ativando a via Mtor pelo que as celulas tumorais começam a morrer.
o Tudo o que acaba em MAB à anticorpo monoclonal humanizado (molécula grande)
o Tudo o que acaba em IMB à molécula química inibitória (molécula pequena)
O transtuzubam trabalha de forma tanto intra e extracelular
o Bloqueia as vias de sinalização à O Transtuzumab (anticorpo anti ERBB2) liga-se a porção externa do
ERBB2 impedindo-o de se dimerizar e consequentemente impede os seus efeitos intraceclulares

o Sinaliza a célula para morte (apoptose) sistema imunitário à As células tumorais são invisíveis para
o sistema imunitário, uma vez que têm o complexo MHC, mas estes anticorpos (Transtuzumab) são
estranhos e por isso o sistema imunitário vai destruir estas celulas

o Bloqueia o cheding (evita a quebra da sinalização da membrana) à Para além disto evita o cheding,
por exemplo, temos 2 milhões de proteínas cá fora, que estão constantemente a ser produzidas. O
que acontece ás vezes é que a parte superior do ERBB2 quebra/descama/cheding e por isso as
proteinas deixam de se conseguir ligar ao ERBB2, uma vez que o trabstuzumab se liga, evita esta
quebra, isto faz com que as células continuem crescendo mesmo não ligadas ao sistema imunitário.

o Promove a degradação do ERBB2 à Quando o ERBB2 está a mais acaba por ser internalizado, e como
a proteína não está a funcionar, a célula passe a internalizar, com muita velocidade, com a sua
consequente destruição (quebra a sinalização abaixo da membrana).

Percebeu-se que uma das formas do ERBB2 tem de ficar

sobre expresso é através da amplificação genica, pelo que
mulheres com amplificam têm doença mais cedo, que
mulheres sem amplificação, sendo que o mesmo se verificou
na mortalidade.
o Gene normal de ERBB2 temos 2 celula, se há mais
que dois já é amplificação
o Vamos usar 5 porque naturalmente podemos ter 4
genes na fase S à verifica que a amplificação é um
fator determinante

Quando se tenta aprovar uma terapêutica temos de garantir que a terapêutica tem efeito, uma vez que
posso dar a muitas pessoas, mas se o efeito de algumas for muito baixo, o efeito global vai ser muito
pequeno e assim não provo que o medicamente está a ter efeito.

Deste modo, preciso de escolher as pessoas onde o medicamento é mais provável de ter efeito e é a estas
pessoas que vamos aplicar a terapêutica, as outras têm que estar excluídas para efeitos de estudo, até se
provar que o medicamento é benéfico.

A partir desse momento posso abrir os meus critérios e aplicar a mais pessoas, uma vez que já foi
demonstrado que pode ser benéfico. Normalmente as primeiras a serem escolhidas são as que já tem
metástases uma vez que são as que têm menos hipóteses terapêuticas. Se se prova nestas situações
passam a ser feitos estudos em estádios mais cedo até chegar a um estadio primário.

A parir do momento em que dou medicamento às mulheres que são positivas

para o ERBB2, ou seja, que têm amplificação, estas mulheres passam a
progredir mais tarde que as mulheres que não têm amplificação.
 ERBB2
ERBB2
o erb-b2 receptor tyrosine kinase 2, ou seja, Human Epidermal growth factor Receptor-type 2
o HGNC name: ERBB2
o Homo Sapiens - cromossoma 17q12)
o Membro da família EGFR
o Gene: 47523 pb
o Transcrito: 4647 pb

É importante percebermos que o ERBB2, no cromossoma 17, tem alguns genes lá no meio. Estes genes vão
ser importantes uma vez que a quebra do gene ERBB2 dá origem a outros genes. O ERBB2 é um recetor de
proteína quinase-tirosina, sendo por isso um recetor transmembranar com atividade tirosina-quinase. Possui
5 isoformas:
o Isoforma 1 à 1255aa – corresponde ao transcrito principal

Quando ligada a outro recetor inicia a sua atividade

cinase de tirosina podendo homo ou
heterodimerizar, promovendo efeitos intracelulares,
como a ativação de vias de sinalização MAP cinase e
PI3K AKT, dando origem a mobilidade e invasão e
aumento da expressão de PDGF.

O PDGF é importante uma vez que é um fator de

crescimento vascular endotelial, permitindo assim a
angeogénese.

A amplificação do ERBB2 resulta em diversas cópias do gene, que leva à produção de proteína ERBB2 em
excesso resultando numa desregulação do ciclo celular. Assim, uma alteração da quantidade de genes dentro
da célula leva a uma alteração na quantidade de mRNA e de proteínas no seu exterior.
o Tecido mamário sem amplificação à 20.000 a 50.000 moléculas
o Tecido mamário com amplificação à + de 2 milhões de moléculas

A amplificação e sobrexpressão do gene ERBB2 e proteína ocorrem em 18 a 20% dos casos de carcinoma da
mama invasivo. Sendo que a podemos verificar a sua sobreexpressão proteica como a nível da amplificação
génica.

Mecanismos de amplificação
Mecanismos de amplificação genica, que explicam a amplificação do gene ERBB2
Amplificação são mutações que resultam em múltiplas cópias de genes em determinadas regiões
cromossómicas (amplicons). Os amplicons:
o São estruturas cromossómicas que contêm múltiplas cópias de sequências de DNA amplificado (0,5-
10Mb)
o O amplicon do ERBB2 pode conter outros genes que ajudam ao processo de oncogénese

Estes mecanismos estão associados com as origens de replicação do DNA, que são zonas onde o DNA começa
a replicar durante a fase S. Estes mecanismos têm a capacidade de duplicar DNA e envolvem mecanismos
de corte do DNA de cadeia dupla através da topoisomerase.
Características das origens de replicação:
o DNA consegue replicar sozinho à única zona do DNA onde isso pode acontecer
o Envolvem mecanismos de corte de cadeia dupla (topoisomerase) à DNA está enrolado, a
topoisomerase corta e desenrola o DNA e assim as zonas de replicação multiplicam

Double minute chromossomes (principal fonte de amplificação)

As origens de duplicação podem começar a fazer duplicação com sobre expressão, ou seja, temos uma
cadeia de DNA com origens de replicação, e o que acontece é que o DNA começa a multiplicar-se, mas
em vez de se multiplicar só uma vez, há um erro, o que leva a uma multiplicação múltipla. O que acontece
é que um destes pedaços é integrado com os outros naturalmente, os outros vão ficar soltos precisando
de ser colados uns aos outros.

Estes cromossomas são epissomas circulares e acêntricos (não têm centrómero) que contêm uma origem
de replicação. Ou seja, quando voltar a haver uma fase S, estes cromossomas vão-se voltar a replicar e
como são acêntricos o que acontece durante a anafase é que vão para um lado qualquer uma vez que não
dá para garantir que é equitativo. Depois podem ser integrados no DNA, não sendo necessário que isso
aconteça. Deste modo, podem:
o replicar a qualquer momento aumentando o número de cópias de genes, que podem ser
reintegrados nos cromossomas
o segregação desregulada para as células filhas na divisão celular aumentando o seu número em
algumas células
o crossing-over entre 2 deles dará origem a circulos multiméricos

Partindo do double minute chromossomes em 1942, Barbara

McClintock, descreve o mecanismo de amplificação mais
reconhecido para eucariotas, o Breakage-fusion-bridge
1. Quebra de cadeia dupla (quebra de DNA) ou perda de
telómeros
2. Fusão de extremidades de DNA livres
3. Durante a anafase os 2 centrómeros, de dois cromossomas,
são puxados para polos opostos formando uma ponte,
levando a nova quebra.

Ou seja, a determinado momento o DNA tem uma quebra de cadeia

dupla, e quando ocorre a fase S vai haver duplicação, contudo, a
celula não vai para a metáfase com pontas de DNA livres pelo que vai
haver fusão das extremidades de DNA livres. Durante a anafase os
cromossomas que deviam estar separados, estão juntos, sendo que
ao puxar vai resultar numa nova quebra, que pode ser no mesmo
sítio ou num sítio diferente.

Se for no mesmo sítio estamos a perpetuar a quebra, contudo, não existem grandes problemas. Se quebrar
num sítio diferente a célula vai ficar com esta sequencia duplicada, e isto vai fazer com que na próxima
divisão ela vai duplique novamente, havendo uma nova fusão, o que leva a outra quebra e assim
sucessivamente. Isto resulta num ciclo em que a célula não consegue parar, levando á multiplicação de
genes.

NOTA: Este fenómeno pode ser encontrado sozinho ou em conjugação com os double minute.
Amplificação génica incluem vários eventos:
o Formação de double minute chromossomes através das origens de replicação
o Encurtamento dos telómeros
o Double strand breaks que ocorrem em fragile sites (quebras de cadeia dupla que ocorrem em zonas
frágeis de DNA)
o Incorporação de sequências de múltiplos cromossomas
o Ciclos de repetições breakage-fusion-bridge

Exemplo: evento que é detetado em laboratório em que existe amplificação do gene ERBB2, mas é
preciso saber como é que se forma. Aqui preciso de distinguir duas coisas:
o Aneuploidia à Alteração do número total de cromossomas em que temos 6n a equivalerem a 6
genes de ERBB2 e por isso não há uma amplificação. Tumores podem não ter só 2n cromossomas,
pode ter 4 ou 6n cromossomas e não se tratar de uma amplificação uma vez que o DNA se
encontra completo, ou seja, todas as sequências que promovem e que inibem o gene ERBB2 estão
presentes. Por isso apesar de ter 6 genes ERBB2 tenho 6 genes de tudo (6 vezes 23 pares de
cromossomas - há equilíbrio).
• Ploidia baixa (3 a 4 cópias)
• Ploidia elevada (+ de 5 cópias) – muito pouco comum

o Polissomia à Aumento do número de 1 cromossoma, em que temos 2n a equivaler a 6 genes de

ERBB2 e por isso temos amplificação uma vez que só tenho os genes de ERBB2 a mais (há
desiquilibrio). Trata-se de um mecanismo distinto da amplificação génica, mas podem coexistir
simultaneamente

Assim, na aneuploidia não há sobre-expressão da proteína uma vez que tem os bloqueadores todos, na
polissomia temos bloqueadores para dois genes, mas não tenho bloqueadores para os outros 4 e por isso
vai estar sobre expressa

Avaliação clínica
Técnicas de determinação:
o Status da Proteína à Imuno-histoquímica (escala de 0 a 3+) os inequívocos (2+) vão para hibridação
in situ. É mandatório em todos os carcinomas primários invasivos e aconselhável em metástases
• Pergunta possível teste à doente com um tumor primário invasivo deve avaliar o status
ERBB2 (sim). Se tiver um tumor primário in situ deve avaliar o status ERBB2 (não)
o Status do gene à Hibridização in situ (2+, tumores primarios, invasivos e metástases)
• Fluorescente ou cromogénica (FISH e CISH ou SISH)
• Single probe ou dual probe (BdISH)

Se o fenómeno que provoca isto é uma amplificação genica porque se faz imuno-histoquimica?
Porque é mais barata, mais universal e porque a validação inicial tem que ser feita por IHQ, está indicado do
ponto de vista terapêutico para dar indicação terapêutica (validada) e é uma técnica que se faz na maior
parte dos laboratórios a hibridação in situ não. Quando se faz IHQ há uma aproximação a terapêutica, uma
vez que estou a detetar a proteína que o anticorpo monoclonal vai bloquear (interessa saber se está lá aquela
proteína).

A relação entre a amplificação génica e a sobre-expressão é direta, ou seja, há outros mecanismos de sobre-
expressão da proteína que não são a amplificação genica. No caso do ERBB2 não há mais nenhum mecanismo
reconhecido de sobre-expressçao que não seja a amplificação, por isso, ver a sobre-expressão ou a
amplificação é a mesma coisa.
 Pré-requisitos da Hibridação in situ
1. Molécula alvo disponível (preservada) à A disponibilidade do ácido nucleico alvo está relacionada
com a parte pré-analítica (no caso do ERBB2 é o DNA a molécula alvo)
2. Marcação específica à A sonda (sequencia de ácidos nucleicos que é complementar ao acido
nucleico que se quer detetar) deve hibridar exclusivamente com a sequência alvo
• Quando há inespecificidade não é porque uma adenina se ligou a uma citosina é porque
se pode tratar de uma sequência parcial, ou seja uma parte da sequencia coincide mas o
resto não e por isso aqui devemos lavar para retirar o que não hibridou
3. Sonda bem caracterizada à Deverão ser conhecidas todas as reações cruzadas possíveis entre a
sonda e outras moléculas alvo no tecido
4. Produto final ou marcador facilmente visualizável
• Fluoresceína ou rodamina
• Peroxidase – HRP
• Fosfatase alcalina – CIAP
• Glucose oxidase

Aplicações da hibridação in situ

o Localização subcelular de ácidos nucleicos à ver célula a célula para saber em quais está a ocorrer a
alteração
o Deteção de alterações numéricas de genes e de algumas alterações estruturais
o Células em interfase e em metáfase

Limitações
o É sensível às questões pré-analíticas (principalmente RNA – é muito lábil e por isso degrada-se com
muita facilidade, podendo desaparecer)
o Não deteta muitas alterações estruturais em interfase.

Como selecionamos os doentes para a IHQ (saber se há sobreexpressão da proteína)

Marcação positiva à vai para terapêutica

o Marcação circunferencial com completa e intensa
em mais de 10% das células tumorais invasivas Marcação negativa à não vai
para a terapêutica
o Sem marcação
o Marcação incompleta
em menos de 10% das
células

Marcação inequívoca (2+)

o São estes que vão ser testados a hibridação para esclarecer
o Uma taxa superior a 20% é porque há um problema com a técnica de ihq
o Se não há equívocos também há um problema com a técnica
Como selecionamos os doentes para Hibridação
Há duas estratégias:
o Seleção de doentes para terapêutica – HIS (1 sonda ERBB2)

Vamos ver se há amplificação, ou seja, ver se

há mais que 2 ou 4 pontos por célula – ver
só a quantidade de gene.

Limitação de usar só uma sonda à Pode-se

tratar de uma aneuploidia, não sendo uma
amplificação (não há sobre expressão)

Se a média é inferior a 4 à negativo

Se a media é superior ou igual a 6 à positivo
Se media entre 4 e 6 à inequivoco

o Seleção de doentes para terapêutica – HIS (2 sonda) – mais usada

É usada uma sonda para o ERBB2 e

outra sonda para o cromossoma 17.

Vamos fazer a razão:

o Tenho 2 sinais de ERBB2 para
um sinal do cromossoma 17 à
razão certa
o Se começo a ter mais genes
ERBB2 e o número de
cromossomas 17 mantem-se
igual à rácio é superior a 2 logo
tenho uma amplificação
o Rácio inferior a 2 e a media de
sinal ERBB2 é inferior a 4 à
negativo
o Media de sinal superior a 6 à
inequívoco

Outras terapêuticas anti-ERBB2:

a) Transtuzumab liga-se à extremidade da proteína e
liga-se também o pertuzumab que é outro
anticorpo mono-clonal que impede a dimerização
dos recetores
b) Transtuzumab emtansine tem acopulado a ele uma
molécula citotóxica que quando ele é internalizado
a molécula citotóxica vai rebentar dentro da célula
(quimio terapia dirigida)
c) Mistura do Transtuzumab com o pertuzumab
(anticorpo híbrido, que impede a dimerização dos
recetores e impede todos os efeitos com o transtuzumab ao mesmo tempo)

Para além destas terapêuticas há também o Lapatinib, o fatinib e o neratinib que são inibidores de tirosina
cinase, ou seja, são pequenas moléculas que inibem especificamente a criação de resíduos de fosfotirusina
para ativar as vias consequentes.
Recetores nucleares

Quando os recetores se encontram na superfície celular (ERBB2) a molécula que o ativa é uma molécula que
não atravessa a membrana (hidrofilica) mas se o recetor estiver no citoplasma ou no núcleo (recetor
intracelular) a molécula que o ativa tem que atravessar a membrana e por isso tem que ser hidrofóbica.

Recetores intracelulares:
o Exemplos clássicos à hormonas esteroides à São sintetizadas do colesterol, como os esteroides
sexuais (estrogénio) e os corticosteroides.
o Outros exemplos à Hormonas da tiroide, vitamina D3 e ácido retinóico à São funcional e
estruturalmente diferentes das hormonas esteroides, mas agem do mesmo modo (são hidrofóbicas,
atravessam a membrana e ligam-se aos recetores dentro da célula)

Nuclear recetor superfamily

o Fatores de transcrição que contêm domínios para:
• ligação a moléculas de sinalização
• ligação ao DNA
• ativação da transcrição

Assim, a ação de ligandos ativa ou reprime a sua atividade transcritora, podendo ter efeitos distintos nas
suas moléculas alvo.

Exemplo dos glucocorticoides

1. O recetor está ligado a um chaperone

mantendo o recetor inativo
2. Quando temos glucocorticoides estes
ligam-se ao recetor e há uma alteração
conformacional, que faz com que o 4. 3.
chaperone se desligue o que permite que
o recetor dimerize
3. Assim, o recetor consegue translucar-se
para o núcleo
4. O recetor liga-se ao DNA e iniciar a 2.
transcrição com a ajuda de um co-ativador
(histona acetil transferase) para garantir a 1.
transcrição

Em vez de ter o recetor estar na membrana, o recetor está á solta no citoplasma, vai alterar a sua
conformação quando se liga o ligando, dimeriza e é translocado para o núcleo
• Só transloca para o núcleo depois de ser ativado (no citoplasma)
• Inativado em maior quantidade no citoplasma
• Ativado em maior quantidade no núcleo
 Outro exemplo à hormona da tiroide
1. O recetor está sempre ligado ao DNA, em vez de andar
a solta no citoplasma, ligado a uma histona desacetillase
(reprime a transcrição) – faz com que haja um
enrolamento maior da cromatina
2. Quando a hormona atravessa a membrana do
citoplasma e entra dentro do núcleo liga-se ao recetor,
que provova uma alteração conformacional, que faz
com que o co-repressor se desligue e liga-se o co-fator,
que vai desenrolar o DNA e iniciar a transcrição.

É um recetor que ao mesmo tempo é um fator de

transcrição

NOTA: Os neurotransmissores são outros recetores parecidos, são moléculas hidrofilicas (como os
transmissores membranares)

Hormonas peptidicas
o Plateled-derived growth factor (PDGF – fator de crescimento derivado das plaquetas) à as
plaquetas quando rebentam libertam este fator de transcrição para proliferar fibroblastos)

o Citoquinas à Regulam o desenvolvimento e diferenciação das células sanguíneas. Controlam a

atividade linfocítica durante a resposta imune

o Membrane-anchored growth factors

Eicosanoides
Eicosanoides à São lípidos envolvidos na sinalização autócrina ou parácrina, como os:
o Prostaglandinas o Tromboxanos
o Prostaciclinas o Leucotrienos

Estimulam respostas, tais como: agregação plaquetária, inflamação e contração do músculo liso

De entre os fosfolípidos temos a fosfolipase A2, que

transformam fosfolípidos em ácido ariquidonico.

Em seguida o ácido ariquidonico pode-se transformar em

leuconutrientes ou em prostoglandinas H2, sendo que para se
transformar em prostaglandidas é atraves da COX.

A citoxigenase transforma as prostaglandinas H2 em outras

prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos, que têm duas
funções principais:
o Alivia a dor
o Promove a trombose (formação de trombos)
Os AINES (anti-inflamatórios não esteroides) (ex. AAS) inibe a COX
o < tromboxanos < agregação plaquetária e coagulação sanguínea < AVC à consequência secundária
o < prostaglandinas < inflamação e dor à objetivo principal
o < prostaglandinas < proliferação celular < cancro colon à não acontece pois não inibe a COX2
• COX1 – produção fisiológica de prostaglandinas
• COX2 – produção patológica de prostaglandinas à já se tentou criar um inibidor específico
para a COX2 mas tinha muitos efeitos secundários

Estrogénios e cancro da mama

Um tumor com uma elevada quantidade de recetores de estrogénio, quando no ciclo da mulher há um
aumento dos estrogénios o tumor vai aumentar (mais proliferação). A cada ciclo menstrual há um boost para
o seu tumor crescer.

Avaliação de recetores hormonais

Recetores de estrogénios (ER)
o Avaliado por Imuno-histoquímica
o Prevê a resposta à terapêutica endócrina
(Tamoxifeno)
o Positividade se > 1%
• 1-10% - low positive
o Mandatório em todos os carcinomas
primários invasivos e aconselhável em
metástases e recorrências
Recetores de Progesterona (PgR)
o Avaliado por Imuno-histoquímica
o Auxilia na previsão da resposta terapêutica
endócrina (Tamoxifeno)
o Positividade se > 1%
o Mandatório em todos os carcinomas
primários invasivos e aconselhável em
metástases

Partindo do colesterol, o que acontece é que, o

colesterol tem uma serie de enzimas
(representadas a verde) que vão provocando
alterações até acabar nos estrogénios

Uma das enzimas é a aromatose à transforma

a testosterona em estrogénios. É fundamental
sendo que os homens não a têm.

Assim tenho duas alternativas:

o Bloquear o recetor à bloqueio o recetor
o estrogénio não se liga e por isso o
tumor não cresce
o Bloquear a enzima aromatose à para
impedir que haja a formação de
estrogénios e por isso o tumor não
cresce

Tumores ER+ sensíveis a níveis de estrogénios

o As mulheres têm ciclos de ativação da progesterona e dos estrogénios e estes ciclos vão levar a que
um tumor que tenha recetores de estrogénio possam vir a crescer com mais ou menor velocidade
o A toma de contraceção oral tem maiores números de hormonas à mulher com cancro da mama
deve logo parar de os tomar
o Como a quantidade de estrogénios é superior há um risco aumentado para cancro da mama (toma
sem pausas durante mais de 5 anos)
 Inibidores do recetor
Tamoxifeno à bloqueia em apenas uma
zona da proteína
o antagonista dos recetores de
estrogénios em tecido mamário
bloqueando AF2 (agonista no
endométrio)
o liga-se competitivamente aos
recetores de estrogénio inibindo o
seu efeito em tecido mamário

Fulvestrant à bloqueia em duas zonas da

proteína (inibe e degrada os recetores)
o antagonista dos recetores de
estrogénio bloqueando AF1 e AF2
o promove também a sua
degradação

Inibidores de estrogénio
Inibidores da aromatase (transforma testosterona em estrogénio)
o inibição da aromatase à pode acumular testosterona e não vai ter
estrogénios (sem menstruação – castração química)
o Há dois tipos de inibidores:
• Inibidores esteróides com inibição irreversível (Exemestano)
• Inibidores não esteróides com inibição por competição
reversível (Anastrazole e Letrozole)

Diferença dos inibidores do recetor e os inibidores de estrogénio à ver se é pre menopausica ao diagnostico
ou se é pos menopausica ao diagnostico
o Mulher pós menopausica à inibição dos estrogénios
o Mulher pré menopausica à inibição do recetor, inibição de estrogénios ou supressão ovárica
Todas as doentes ER+ respondem a tamoxifeno? Não
O que se sabe é que as mulheres que são estrogénios
positivas e que são sujeitas a terapia endócrina, só uma
parte é que respondem, porque o seu tumor está
regulado pelos estrogénios. A parte que não responde
é porque nos só vemos se eles lá estão (podem estar
sobre-espressos mas não fazerem o tumor crescer)

ER+ que não respondem

o Resistência à terapêutica à tumor com os recetores de estrogénios desregulados (apesar de ter o
recetor o tumor não está dependente deste recetor)

ER- que respondem

o Outros mecanismos de ação do tamoxifeno desconhecidos
o Questões técnicas (fase pré-analítica, limite da técnica)
EGFR e ALK e carcinoma do pulmão

Cancro do pulmão está associado a 3 fatores de risco: fumar tabaco, fumar passivamente e a história familiar

Em portugal este rastreio não se faz uma vez que a TC embora

com o potencial de ser uma técnica de rastreio efetiva não
provou até ao presente que a sua utilização reduzisse a taxa de
mortalidade, ou seja, até pode detetar mais, mas não reduz a
taxa de mortalidade. Como um plano de rastreio implica a
redução da taxa de mortalidade e isso não se verifica neste caso
então não é rastreio

Deste modo, no atual estado da arte não se aconselha o rastreio

do cancro do pulmão por TC como prática clínica corrente.”

Diagnostico de carcinoma pulmonar – tipo histológico

A terapêutica de carcinoma de pequenas células em primeira e segunda linha é a quimioterapia e em terceira

linha a radioterapia. A terapêutica de carcinoma de não pequenas células é muito maior. primeiro tínhamos
quimioterapia, a partir do ano 2000 entramos na terapia dirigida (EGFR).

Mutações Epidermal Growth Factor Receptor

o Este recetor pode estar amplificado também nos tumores, mas não explica a maioria dos casos
porque é que os tumores dependem do EGFR
o Esta sobre expresso em mais de 60% dos carc. não de pequenas células do pulmão e mais de 50%
dos glioblastomas. Como consequências da sua sobre-expressao temos a:
• Ativação da proliferação
• Evasão da apoptose

ERBB2 tambem pode estar amplificado em carcinoma de pequenas células e também temos o C-MET
Qualquer um dos 3 genes (EGFR, ERBB2, C-MET) amplificados, ativam a via das map cinases, da PI3K AKT e
MTOR.

As mutações que se conhecem são ativadoras do domínio cinase de tirosina. Estas mutações são importantes
porque dão indicação terapêutica a inibidores de cinase de tirosina (Gefitinib/Erlotinib), sendo que estão
muito bem estabelecidas em carcinoma do pulmão. O que acontece é que há mutação entre 10 a 15% do
domínio tirosina cinase no carcinoma de pequenas células.
Assim, sempre que há hipótese vou testar a mutação do domínico tirosina cinase para ver se a mutação
existe ou não, se a mutação existir é porque o tumor está a depender da mutação para crescer e por isso
tenho que a inibir.

Terapêutica anti-EGFR
Na célula normal, quando o fator de crescimento se liga há ativação imediata das vias de tradução de
sinal. Quando a célula está mutada este fator está constantemente ligado.
Inibidores de 1ª geração à vai haver uma
molécula pequena que vai encaixar no
domínio tirosina cinase da porção interna do
recetor (centro ativo) que vai impedi-lo de
se ligar ao ATP, o que consequentemente
inibe o efeito da mutação.

Contudo a célula desenvolveu uma forma de

resistir a terapêutica com uma nova
mutação (T790M) à mutação de resistência
a terapêutica.

Esta mutação altera o centro ativo e os

inibidores deixam de funcionar. Assim,
foram desenvolvidos inibidores de 3ª
geração, que vão conseguir bloquear e
impedir novamente os efeitos da mutação.

Carcinoma de pequenas células em estadio avançado, se é positivo para a mutação de EGFR posso dar
Gefitinib, Erlotinib ou Afatinib, que são inibidores de cinase – são muito semelhantes do ponto de vita
molecular que bloqueiam as mutações. Para além disto, pode haver translocação do ALK, que dá direito a
outras duas terapêuticas Crizotinib ou Ceritinib.

Quando olhamos para o gene EGFR vamos sequenciar os exões 18

a 21 e nestes exões vou procurar mutações de sensibilidade a droga
pelo que posso dar Gefitinib ou Erlotinib. Quando o tumor tem
alguma das mutações de resistência não posso dar Gefitinib, nem
Erlotinib, temos que dar inibidores de 3 geração
o Pergunta à quais os exões que tenho que sequenciar para
dar indicação terapêutica em cancro do pulmão – 18 a 21 (4
exões) do gene EGFR

Quando há uma mutação de sensibilidade o doente

pode tomar Gefitinib, Erlotinib ou Afatinib, depois
posso ir ver o estado de T790M, que é a mutação de
resistência a terapêutica.
• negativo vou ver outros mecanismos de
resistência
• positivo significa que primeiro não era, foi dada
terapêutica e o tumor ganhou uma nova mutação, que
ofereceu resistência a terapêutica e por isso passo a
usar Osimertinib, que é um medicamento de 3ª
geração.
NOTA: Mutação que não está descrita. As mutações devem ser aceites como patogénicas, se tem medicação
patogénica e se tem uma frequência igual ou superior a 1%

Ativação do ALK
A ALK é uma proteína que se funde com outras, induzindo a transcrição e expressão proteica. O ALK está
presente em 2-5% dos NSCLC, sendo que normalmente há inversão do braço pequeno do cromossoma 2 [inv
(2)(p21p23)]. Faz a fusão entre:
o exões 1-13 do echinoderm microtubule-associated protein-like 4 (EML4)
o exões 20-29 do gene ALK

NOTA: a translocação do ALK ocorre em diversas patologias. Com o EML4 é típica de carcinoma de não
pequenas celulas

Quando o ALK está translocado é um inibidor seletivo de tirosina cinases ALK e MET, sendo sensível ao
Crizotinib (pequena molécula que vai bloquear especificamente esta alteração)

Como se testa o ALK

o ASCO à Fazemos o ALK por IHQ, se for positivo fazemos hibridação in situ
o ESMO à só IHQ é suficiente

Ensaio FISH ALK break-apart (hibridação in situ – alteração estrutural)

Temos o gene ALK, o que vai acontecer é que, há uma inversão no cromossoma o
que junta o gene EML4 com o ALK. As sondas que têm uma estratégia break-apart
têm duas sondas com duas cores diferentes. Quando há uma inversão os genes as
sondas separam-se e vamos ver duas cores. Quando estão normais vemos só uma
cor.

A. Fusion-signal
Há uma sonda no gene A e uma sonda no gene B, isto
significa que sem translocação, há dois sinais verdes e
dois vermelhos, quando há alteração fica amarelo (fusão
de sinais). Assim, a fusion-signal diz com que gene houve
fusão (fundir provoca alteração).
Para saber se houve fusão da ALK com 2 genes diferentes,
tenho que testar um de cada vez.

B. Split-signal
Sabe-se que o gene quebra num sítio, deste modo, é
colocada uma sonda antes e outra depois da zona de
quebra. Sem translocação há dois sinais amarelos,
quando há quebra deste gene passam a estar presentes
sinais verdes e vermelhos.
Deste modo, não sei com quem o gene se vai fundir mas
sei que quebrou naquele sitio (quebrar provoca
alteração), sendo utilizado só para saber se há alteração
no ALK.

Exemplo à ALK transloca em leucemias à usar a split, uma vez que há vários genes que levam a leucemias
Perfil mutacional de doentes com carcinoma do pulmão
o Mutação no EGFR
• Mais provável em adeno vs. Outros NSCLC
• Mais provável em mulheres vs. homens

o Translocação do ALK-EML4
• Mais provável adeno vs. Outros LC

o Mutação no EGFR e translocação do ALK-EML4

• Menos provável em fumadores vs. não fumadores à pessoas que não fumam tem mais
opções terapêuticas
• EGFR: OR = 6.29, 95% CI: 5.23, 7.57
• ALK: OR = 4.09, 95% CI: 2.69, 6.21

Seleção de pacientes
Quem pode fazer o teste para ALK ou EGFR?
o Adenocarcinoma do pulmão (ou com componente de ADC)
o Não pavimentoso ou NSCLC (não pequenas células)
o Qualquer NSC (pavimentoso) com critérios clínicos de mutação (p.ex. idade jovem, sem exposição
ao tabaco), se não cumprir com estes critérios não tem indicação de fazer teste para EGFR e ALK

Condições técnicas, posso usar:

o Cell blocks
o Esfregaços de punçoes aspirativas
o Tecidos impreganados em parafina

Tem que ter pelo menos 20 % de células tumorais, EGFR não pode ser usada em IHQ (não da indicação
terapêutica), apenas pode ser usada a sua mutação. O ALK pode ser isado em IHQ e em Hibridação in situ.
RAS e BRAF

A mutação pontual de genes da família RAS é a anomalia isolada mais comum dos oncogenes dominantes
nos tumores humanos. Cerca de 25% de todos os tumores possuem uma versão mutada do gene. As
mutações envolvem os exões 2, 3 e 4, sendo que todas as mutações descobertas reduzem a sua atividade
GTP-ase.

Gene mutado:
o KRAS à Carcinomas, principalmente colon e pâncreas
o HRAS à Tumores da bexiga
o NRAS à Tumores hematopoiéticos
o São muito pouco mutados em carcinomas do colo uterino e da mama

O RAS está associado à via MAP quinase, sendo que a sua ativação promove a progressão do ciclo celular
o GAP à Ligam-se a RAS ativo
aumentando a sua atividade
GTPase mais de 1000 vezes,
levando-a ao estado inativo. As
proteínas RAS mutantes ligam-
se a GAP, mas não conseguem
aumentar a sua atividade
GTPase. Assim o que acontece é
que as proteínas mutantes
ficam presas na sua forma ativa,
o que promove a progressão no
ciclo celular

As suas mutações na RAS dão indicação terapêutica anti-EGFR em CCR

o KRAS, NRAS e BRAF (não é a RAS sozinha que da origem a sua atividade aumentada cancerígena, é
sim o facto de a RAS estar mutada)
o Tudo o que vem antes não interessa se esta ligado ou desligado porque ela esta sempre ativa

As mutações mais frequentes são nos exões 2, 3 e 4, que ativam constitutivamente a proteína
o Exão 2 (codões 12 e 13)
o Exão 3 (codões 59 e 61)
o Exão 4 (codões 117 e 146)

Carcinoma Coloretal (CCR)

O tratamento de CCR metastático é feito com quimioterapia (FOLFOX/FOLFIRI) e com anticorpos anti-EGFR
(Cetuximab ou Panitumumab). Tem uma eficácia de 10-20% nos pacientes, contudo alguns deles 3-12 meses
depois passam a ter resistência secundária

EGFR E CCR
o Alterações de EGFR o Sobre expressão proteica
o Mutações somáticas o SNPs
o Amplificação génica
o Epiregulina e ampiregulina
O cetuximab, que é um anticorpo monoclonal vai se ligar ao
EGFR, ca fora, e bloqueia-o. Como as células do tumor tem
muito EGFR, como o tumor está dependente dele vai diminuir.
Tumores wild time (não tem mutação) a terapêutica funciona

Se tenho mutação do RAS, esta sempre ativo, o anticorpo vai

bloquear o EGFR mas não vai fazer nada no tumor.
Quando há muitação do ras tenho uma mutação de resistência
a terapêutica. Tumores que tem mutação a terapêutica não
funciona porque o ras esta sempre ativo

KRAS mutações ativadoras

o Preditor negativo de resposta a terapêutica (se esta mutado a terapêutica não funciona)
o 93% especificidade
o 47% sensibilidade Exão 2 (codões 12 e 13)
o 35-45% de não respondentes são KRAS mut Exão 3 (codões 59 e 61)
Exão 4 (codões 117 e 146)
NRAS mutações ativadoras
o Preditor negative de resposta
São mutuamente excluvidas, se muta
BRAF mutações ativadoras uma não muta nenhuma das outras
o Preditor negative de resposta
o 14% dos não respondents são BRAF mut (V600)

PI3K mutações ativadoras – não usada na clinica

o Associado a resistência
o Variadas mutações com resultados diferentes
o Pode coexistir com perda de PTEN

PTEN inativação – não usada na clinica

o Preditor negative de resposta

Em quarquer adenocarcinoma metastático tenho que determinar se tenho alterações do ras para dar
terapêutica anti-EGFR

BRAF
Também é usado no Melanoma metastático

São conhecidas mais de 50 mutações diferentes (Aumentam 1,5 a 700x a atividade da Proteína)
A mais comum é no exão 15 a V600E (T1799A)

Mais de 80% de todas as mutBRAF em tumores

Uma mutação ras e um anticorpo braf vai funcionar porque bloqueia depois da mutação
Ou bloqueio especificamente a alteração ou depois da mutação
KIT e GIST

Tumores de estroma gastro-intestinal

São tumores muito agressivos e que tem alterações no gene KIT

KIT (CD117) é um Recetor cinase de tirosina tipo III, tal como:

o PDGFRA
o PDGFRB
o Macrophage CSF1R
o FLT3

Está sobre expresso em 95% dos GIST

Está mutado em 70-80% dos GIST

Basicamente é uma proteína transmembranar com atividade tirosina cinase e que leva ao aumento quando
esta inativo, quan esta ligado a um ligando (ativo) mas a mutação é independente do ligando e ativa a via na
mesma.

Vai aivas a via das map cinases e a via da pi3kakt

As mutações estão presentes em diversos exões à São preditivas de resposta a terapêutica a mesilato de
imatinib

Mutações importantes:
o KIT à Exões 9, 11, 13 e 17
o PDGFRA à Exões 12 e 18