Protein engineering to improve the

stability of Thermomyces lanuginosus

lipase in methanol
 INTRODUÇÃO

Lipase Principais Aplicações Industriais:

Modificação de gorduras e óleos
através de hidrólise;
Alcoolólise;
Enzima lipolítica
Estereficação;
Produzida por
Acidólise;
Síntese de Biodiesel.
Animais Plantas
Microrganismos
 Fungo termofílico. A lipase deste fungo é
Thermomyces lanuginosus basofílica e termoestável, sendo utilizada
na síntese de biodiesel.

O biodiesel é produzido utilizando catalisadores alcalinos ou enzimáticos

Catalisadores alcalinos Catalisadores enzimáticos
Baratos
Condições mais
Reações a altas
suaves
temperaturas
Não produzem
Tendência a
subprodutos
produzir
subprodutos
 Grandes quantidades podem desativar a
de metanol enzima Lipozyme TL
IM.

Por isso, existem diferentes abordagens para melhorar a

estabilidade na presença de solventes orgânicos.

Protein engineering
Técnica usada para melhorar a estabilidade de uma enzima
chamada TLL na presença de metanol.
 Pequena mudança na
estrutura da enzima, Torna a TLL mais estável na
chamada de mutação ponto presença de metanol
I241E

Também é possível produzir uma versão melhorada da TLL através de um

processo chamado de evolução dirigida.

Trocam-se certos tipos de aminoácidos na enzima e formam-se

novas ligações químicas que podem ajudar a manter a estrutura
estável mesmo em contato com solventes orgânicos como o
metanol.
Objetivo do estudo
Criar enzimas que possam ser usadas de forma eficiente na
produção de biodiesel, utilizando a técnica de protein engineering.

1. Modificam-se aminoácidos na TLL para torná-la mais compatível

com a água.
2. Compara-se a TLL com outras enzimas para entender como as
mudanças podem afetar a sua estrutura.
3. Selecionaram-se mutações que poderiam aumentar a estabilidade
na presença de metanol.
MATERIAIS E MÉTODOS
ORGANISMOS E PLASMÍDEOS
Escherichia coli HST08;
E. coli BL21 (DE3);
Gene TLL de tipo selvagem;
Plasmídeo recombinante pE_TLLHis6N;
TLLHis6N.
 MUTAGÉNESE DIRIGIDA AO LOCAL
É uma técnica na qual mudanças
específicas são introduzidas no DNA
de um organismo num local
específico. É utilizada para
modificar genes de maneira
controlada, permitindo a introdução
de mutações específicas ou a
correção de sequências genéticas
indesejadas.
 MUTAGÉNESE DIRIGIDA AO LOCAL
Realizou-se conforme as diretrizes do Quik-Change™ Site-
Directed (Stratagene, La Jolla, CA, EU).
Foram utilizados os seguintes primers específicos:
As células de E.coli HST08 foram transformadas e cultivadas em
meio ágar Luria-Bertani (com 20 g/L de caldo LB em pó; Nacalai
Tesque, Kyoto, Japão), contendo 100 mg/L de sal sódico de
ampicilina.
Através de sequenciamento obteu-se a confirmação da
mutação.
 EXPRESSÃO E PREPARAÇÃO DE TLL
DUVIDAS AQUI
Cepas de E. coli BL21 (DE3) foram transformadas com plasmídeos mutantes
usando pE_TLLHis6N e estes foram inoculados em 200mL de meio líquido LB
com 100 mg/L de sal sódico de ampicilina e incubados a 37 °C e 150 rpm.
Quando a DO600 atingiu 0,6 e a cepa estava no meio do crescimento logarítmico,
0,1 mM de isopropil β-D-1-tiogalacto-piranosídeo (IPTG) foi adicionado a 25 °C e
100 rpm por 20 h. As células resultantes foram colhidas centrifugando 200 mL do
meio de cultura por 5 min a 10.000 rpm e 4 °C. As células coletadas foram
suspensas em 200 mL de água ultrapura, centrifugadas a 10.000 rpm por 5 min a
4 °C e lavadas com remoção do sobrenadante. As células foram então suspensas
em 20 mL de tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 8,5) contendo imidazol 10 mM e
NaCl 300 mM. A suspensão foi sonicada em gelo por 15 min na intensidade de 40
W, parando a cada 1,5 s, para que a temperatura da amostra não ultrapassasse
15 °C. A solução foi centrifugada a 15.000 rpm por 30 min a 4 °C e o sobrenadante
foi coletado.
EXPRESSÃO E PREPARAÇÃO DE TLL
A coluna foi equilibrada despejando tampão fosfato de sódio 50 mM
(pH 8,5) contendo imidazol 10 mM e NaCl 300 mM. O TLL foi então
aplicado numa coluna HisTrap™ HP (Global Life Sciences Solutions
USA LLC, Marlborough, EUA) seguindo o protocolo do fabricante.

O TLL aplicado foi eluído aplicando um gradiente linear de imidazol

de 10 mM a 200 mM, e aproximadamente 1.000 mL de tampão Tris-
HCl 10 mM (pH 8,0) foram usados como fluido externo e foram
dialisados a 4 °C.
ENSAIO DE ATIVIDADE DE LIPASE E AVALIAÇÃO DE
ESTABILIDADE DE TLLS EM METANOL 50% (V/V)
A atividade da lipase foi medida usando o método BALB-DTNB
de Kurooka et al., com tributirato de BAL (BALB) como substrato
e ácido 2-nitrobenzóico (DTNB) como reagente cromogênico
para o grupo SH.
A atividade da lipase foi expressa como a produção de 1 µmol de
ânion 5-tio-2-nitrobenzenoato por minuto a 30 °C. O TLL foi
dissolvido numa solução tampão Tris-HCl 5 mM (pH 8,0) com
metanol a 50% (v/v) até atingir uma concentração de cerca de
0,30 mg/mL, mantido a 40 °C e agitado. A atividade residual ao
longo do tempo foi determinada usando o método BALB-DTNB
MINIMIZAÇÃO DE ENERGIA PARA TLL COM BASE EM
CÁLCULOS DE MECÂNICA MOLECULAR
A estrutura 3D da TLL foi determinada utilizando a estrutura da lipase de
T. lanuginosus DOAM 232588 como referência. Este processo envolveu a
substituição de diferentes resíduos de aminoácidos, seguida pela
minimização de energia por meio de cálculos de mecânica molecular.
Os TLLs mutantes foram determinados a partir dos cálculos de
minimização de energia, utilizando a conformação calculada da TLL
selvagem como base. Os cálculos foram realizados utilizando o campo de
força Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics (CHARMm), e o
cálculo do algoritmo de minimização empregou a descida mais íngreme.
A etapa de minimização foi definida como 1000, e foi confirmado que o
cálculo foi concluído dentro desse número de passos.
 MEDIÇÃO DE DICROÍSMO CIRCULAR (CD)
A análise de dicroísmo circular (CD) foi conduzida por meio de um
dispersómetro de dicroísmo circular J-820. A temperatura da atividade
experimental foi mantida constante a 40 °C e medida em solução aquosa
ou metanol a 50% (v/v). Antes da medição dos espectros, o fluxo de
nitrogênio foi assegurado. Utilizou-se uma célula retangular de quartzo
com um caminho ótico de 2,0 mm, e foram obtidas dez varreduras
consecutivas para cada medição, cobrindo a faixa de comprimento de
onda de 190 nm a 300 nm. Os resultados apresentam as leituras obtidas
durante as medições.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
1. Seleção de resíduos de aminoácidos para as TLLs mutantes

2. Preparação e comparação das estruturas tridimensionais (3D) das TLLs selvagens e

mutantes

3. Estabilidade das TLLs na presença de 50% (v/v) de metanol

4. Estabilidade térmica das TLLs

 1. Seleção de resíduos de aminoácidos para as TLLs
mutantes
Percentagens de homologia com a lipase TLL das diferentes lipases que foram analisadas
neste estudo:

• lipase de T. lanuginosus DOAM 232588 79%

• lipase de R. emersonii CBS 393.64 62%

• lipase de B. spectabilis No. 5 52%

Os resíduos de aminoácidos nas posições 6, 8, 28, 29, 34, 45, 51, 116, 119, 163, 174, 178, 198,
237, 242 e 261 nas lipases mencionadas anteriormente, são selecionados como candidatos
para servirem como resíduos hidrofílicos substitutos dos resíduos hidrofóbicos.

Figura 1. Comparação dos alinhamentos de TLL, lipase de T. lanuginosus DOAM 232588 (A), R. emersonii CBS 393.64 (B) e B.
spectabilis No. 5 (C).

Na imagem os espaços rodeados a vermelho são centros ativos e as setas são onde
haverá mutações.
 2. Preparação e comparação das estruturas
tridimensionais (3D) das TLLs selvagens e
mutantes

As posições dos aminoácidos no centro ativo do TLL e os 16

resíduos de aminoácidos hidrofóbicos que foram
selecionados como candidatos para substituições foram
marcados na estrutura da TLL.

Embora houvesse uma homologia de 79% entre as

estruturas 1TIB e TLL, as diferenças estruturais globais
eram pequenas.

Figura 2. Estruturas 3D de 1TIB (roxo) e TLL (verde). Os

aminoácidos mutados são bola e bastão. Os
aminoácidos azuis são o centro ativo.
Tabela1- Energia livre de TLL_WT e TLLs mutantes, e
ligações de hidrogênio e pontes salinas recém-formadas
no local da mutação.
Foram feitos cálculos de minimização de energia
para a TLL_WT utilizando métodos de mecânica
molecular.
Foram comparadas as energias livres entre a
TLL_WT e as TLLs mutantes. Observou-se
diminuições na energia livre em 11 das TLLs
mutantes.
Além disso, o número de ligações de hidrogênio
(ou pontes salinas) aumentou perto dos locais de
mutação, indicando mudanças na interação
molecular.
 3. Estabilidade das TLLs na presença de 50% (v/v) de
metanol
Tabela 2- Atividade específica e meia-vida dos TLLs.
Medição da atividade específica em
50% (v/v) de metanol:
A atividade específica das TLLs selvagem
(TLL_WT) e mutantes em água ou em
50% de metanol foi medida usando o
método BALB-DTNB.
Tabela 2- Atividade específica e meia-vida dos TLLs.

Medição da atividade residual (ou atividade

remanescente, duvida em como se diz ) na
presença de metanol: A atividade residual das
soluções de enzima TLL_WT e mutantes em
50% de metanol foi medida ao longo do tempo.
Algumas mutações mostraram pouca mudança
na atividade após 0,5 horas, enquanto outras
tiveram uma diminuição significativa.

Figura 3- Avaliação da estabilidade

estrutural de TLL_WT e TLL_A28S, (a)
Ligações de hidrogênio em TLL_WT e
TLL_A28S. As linhas verdes tracejadas
representam as ligações de hidrogênio. Os
resíduos de aminoácidos são desenhados
em bolas e colados com átomos de
carbono em cinza, átomos de hidrogênio
em branco, átomos de oxigênio em
vermelho e átomos de nitrogênio em azul.
Análise do espectro de CD de TLL_WT e TLL_A28S: O espectro de CD de TLL_A28S foi medido em
solução aquosa e na presença de 50% de metanol, antes e depois de 2 horas de incubação a 40°C.
Mudanças nos espectros de CD de TLL_WT e TLL_A28S foram semelhantes após 2 horas de
incubação em solução aquosa. No entanto, na presença de metanol, o espectro de CD de TLL_WT
mudou significativamente, enquanto o de TLL_A28S permaneceu estável, indicando que a estrutura
geral da enzima TLL_A28S foi estabilizada e mostrou-se altamente estável em metanol.

Figura 4- (b) Espectro CD de TLL_WT e TLL_A28S em solução aquosa (sem metanol). (c) Espectro CD de TLL_WT e TLL_A28S em 50% (v/v)
de metanol.
 4. Estabilidade térmica das TLLs
Procedimento: Doze diferentes TLLs (TLL_WT e várias
mutantes) foram incubadas por 10 minutos em várias
temperaturas e, em seguida, foi medida a sua atividade
residual.

Resultados: A TLL_WT apresentou a maior atividade

residual a 50°C, sugerindo uma boa estabilidade térmica.
As mutações em algumas TLLs, como V119T, F174Y e
L198N, aumentaram ainda mais a estabilidade térmica a
40°C.

Conclusões: As mutações F174Y e L198N foram

identificadas como contribuintes para a melhoria tanto da
estabilidade em metanol quanto da estabilidade térmica a
40°C. Além disso, a estabilidade térmica da TLL_V119T
aumentou, mas sua estabilidade em metanol foi menor do
que a da TLL_WT. Isso sugere que a estabilidade térmica
de uma enzima não coincide necessariamente com a sua
estabilidade em solventes orgânicos.
Figura 5- Atividade remanescente de cada TLL quando incubado em
diversas temperaturas.
 CONCLUSÃO
Com este trabalho pretendia-se criar uma enzima mutante mais eficiente.

Foi possível obter a mutante TLL_A28S que apresenta estabilidade estrutural

na presença de metanol e mantém níveis satisfatórios de atividade.
Além de se avaliar a estabilidade estrutural também foi confirmada a
estabilização da estrutura secundária da enzima, medindo o espectro de CD.

Assim, estes resultados podem contribuir para a síntese

eficiente de biodiesel.
BIBLIOGRAFIA