CURVAS ANALÍTICAS E CALIBRAÇÃO

Vagner F Knupp
 CALIBRAÇÃO
• A calibração, em geral, é uma operação
que relaciona uma grandeza de saída com
uma grandeza de entrada, para um sistema
de medida sob determinadas condições.
• Calibração em Química Analítica é a
operação que determina a relação
funcional entre valores medidos
(intensidades y de sinais em certas
posições zj) e grandezas analíticas
caracterizando os tipos de analitos qi e
suas quantidades ou concentrações x.
 Formas de calibração

- Padrões externos
- Adição de padrão
- Padrão interno
 Formas de calibração

1º - Padrões externos
 Formas de calibração
1º - Padrões externos
É a forma mais utilizada de calibração. São
utilizadas soluções contendo concentrações
conhecidas do analito.
• Os padrões são considerados “externos” pois são
preparados e analisados separadamente das
amostras.
• Normalmente são utilizadas soluções com
concentrações crescentes do padrão do analito e
correlacionando-se a resposta instrumental com a
concentração, se obtêm uma curva de calibração.
 Formas de calibração

• A curva de calibração pode ser linear (correlação

entre resposta instrumental e concentração apresenta
função linear) ou polinomial (correlação entre resposta
instrumental e concentração apresenta função
polinomial).
• A curva linear é mais adequada pois apresenta a
mesma sensibilidade para toda a faixa de calibração.
Nas curvas não lineares, a sensibilidade é função da
concentração.
 Formas de calibração

Curva analítica Curva analítica

linear não linear
 Formas de calibração
Limitação da curva de calibração normal
• A relação entre a resposta instrumental (Spadrão) e
a concentração (Cpadrão) é determinada quando o
analito está presente na matriz da solução padrão
que pode ser diferente da matriz da amostra.
• Quando se utiliza a curva de calibração normal,
assumimos que qualquer diferença entre a matriz
dos padrões e a matriz da amostra não afeta a
inclinação da curva (sensibilidade).
• Um erro proporcional determinado é introduzido
quando as diferenças entre as duas matrizes
afetam a sensibilidade.
 Formas de calibração

Para se avaliar se as diferenças entre as inclinações das curvas

são significativas, pode se aplicar os testes estatísticos F e t.
 Formas de calibração
• Quando o efeito de matriz é esperado e a
matriz da amostra é conhecida, pode-se realizar
uma curva por ajuste de matriz (matrix
matching).
•Neste método de calibração, a matriz da
amostra é adicionada nos padrões de calibração
de modo a se compatibilizar a matriz e minimizar
os erros.
Obs: nem sempre se consegue realizar o ajuste
de matriz, pois muitas vezes é difícil obter a
matriz sem o analito.
 Formas de calibração
• O desvio padrão é calculado para inclinação
(m) e interseção (b) pelas formulas do método
dos mínimos quadrados:
Exercício
• Um processo de tratamento para efluentes
contendo Fe está sendo avaliado. A eficiência do
processo de precipitação está sendo monitorada
após a adição de diferentes quantidades do
agente precipitante. Desta forma, após cada
tratamento, uma alíquota do sobrenadante é
coletada para posterior determinação de Fe por
espectrometria de absorção atômica. Um volume
de 2,00 mL dessas amostras foi diluído para 10,0
mL e as mesmas foram analisadas contra uma
curva de calibração aquosa. Suspeitando de uma
possível interferência da matriz, o analista
resolveu realizar uma calibração por ajuste de
matriz.
Dados obtidos
C Abscn Abscaj
0 0,050 0,004

0,5 0,090 0,030

1 0,132 0,065

1,5 0,169 0,095

2 0,218 0,13

3 0,292 0,200

4 0,37 0,266
Dados obtidos
0.40
0.35 y = 0.0803x + 0.051
R2 = 0.9993
0.30
Sem ajuste
0.25
Sinal (A)

0.20
0.15 y = 0.0664x - 0.001
0.10 R2 = 0.999
0.05 Com Ajuste

0.00
-0.050.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
Conc Fe (mg/L)
As absorbâncias apresentadas abaixo foram obtidas
para o branco e para as amostras (100, 75, 50 e 25 –
gramas de precipitante utilizados).

Amostra Absorbância
Branco -0,009
T100 0,040
T75 0,093
T50 0,192
T25 0,245

Considerando que o limite estabelecido pelo CONAMA para Fe

em efluentes é 15,0 mg/L, o uso da curva aquosa poderia
conduzir a alguma tomada de decisão equivocada?
 Conc
Amostra A Sem ajuste Dil mg/L
Branco -0.009 0.52 x5 2.62


T100 0.04 1.13 x5 5.67
T75 0.093 1.79 x5 8.97
T50 0.192 3.03 x5 15.13
T25 0.245 3.69 x5 18.43

Conc
Amostra A Com ajuste Dil mg/L
Branco -0.009 -0.12 x5 -0.60
T100 0.04 0.62 x5 3.09


T75 0.093 1.42 x5 7.08
T50 0.192 2.91 x5 14.53
T25 0.245 3.70 x5 18.52
 Formas de calibração

2º - Adição de padrão
 Formas de calibração
2º - Adição de padrão
•É uma forma de calibração muito utilizada quando
se tem efeito de matriz e não é possível realizar o
ajuste de matriz.
• Neste método de calibração, quantidades
conhecidas do analito são adicionadas a balões
contendo volumes fixos da amostra. Posteriormente,
o volume do balão é completado com um diluente
adequado (água, ácidos diluídos, solventes
orgânicos, etc.)
• As respostas instrumentais são obtidas para cada
uma das soluções e se obtém a relação linear entre
a quantidade de analito adicionada e a resposta
instrumental.
 Formas de calibração
2º - Adição de padrão

Exemplo do preparo
de uma curva de
calibração por
adições de padrão
 Formas de calibração
2º - Adição de padrão
• Cuidados
• Deve-se ter uma idéia da concentração do
analito na amostra para se definir a alíquota da
amostra a ser tomada e as adições do padrão
que serão realizadas.
• A faixa linear da técnica de medida deve ser
respeitada, ou seja, a soma da concentração do
analito na amostra e da adição do padrão no
último ponto deve ser menor que limite da faixa
linear.
 Formas de calibração
2º - Adição de padrão
• Cálculo
Extrapolação no
gráfico
ou
Utilizar a equação
linear e calcular x
quando y = 0
 Formas de calibração
2º - Adição de padrão
• Como a curva de calibração por adição de padrão
é construída na amostra, ela não pode ser estendida
para a análise de outras amostras. Desta forma,
para cada amostra deve-se construir uma curva de
calibração. Este fato dificulta a aplicação deste
método de calibração para análises de rotina, onde
um grande número de amostras precisa ser
analisado.
• O método de adições de padrão pode ser utilizado
para checar a validade da curva de calibração por
padrões externos (avaliação do efeito de matriz).
 Formas de calibração
2º - Adição de padrão

• O resultado é obtido da curva analítica:

Y = m X + b fazendo Y = 0 → X = -b/m

Lembre de que a construção da curva analítica

implica em diluição da amostra que deve ser
compensado.
• EXERCÍCIO

A determinação de Cu em cachaça deve ser feita por

adição de padrão, pois é difícil simular a composição
da matriz. Sabendo-se que a concentração
aproximada de cobre em uma amostra de cachaça é
8 mg/L e que a faixa linear para Cu em
espectrometria de absorção atômica com chama é 0
a 3 mg/L, faça os cálculos para o preparo da curva
por adição de padrões.
EXERCÍCIO
• Calcule a concentração de Cobre na
amostra

C abs
0 0.089

0.5 0.120

1 0.152

2 0.206
 C abs
0.25

0.2

0 0.089

Sinal (A)
0.15

0.5 0.120 0.1

y = 0.0585x + 0.0906

1 0.152 0.05 R2 = 0.9982

2 0.206 -2.5 -1.5 -0.5

0
0.5 1.5 2.5
Conc Cu (mg/L)

y = 0.0585x + 0.0906 se y = 0 logo x = -0.0906 / 0.0585 = 1.54 mg/L

 Formas de calibração

3º - Padrão Interno
 Formas de calibração
3º - Padrão Interno

• O sucesso da utilização dos métodos de calibração

com padrões internos e de adições de padrão
depende da habilidade do analista manusear
amostras e padrões reprodutivelmente e da
estabilidade do equipamento.
• Quando o procedimento não pode ser controlado
de forma que todas as amostras e padrões são
tratados igualmente, a exatidão e precisão do
método podem ser comprometidos.
 Formas de calibração
3º - Padrão Interno
• Nos casos onde o processo analítico não é
reprodutível, a padronização é possível se o sinal do
analito for referenciado ao sinal gerado por outra
espécie que foi adicionada em concentração fixa e
conhecida em todos os padrões e amostras.
• A espécie adicionada é chamada de padrão interno
e deve ser essencialmente diferente do analito.
 Formas de calibração
3º - Padrão Interno
• Desde que o analito e o padrão interno em
qualquer amostra ou padrão recebem o mesmo
tratamento e estão sujeitos as mesmas variações, a
razão dos sinais não será afetada.
• Se uma solução contem um analito de
concentração CA e um padrão interno de
concentração CPI, então o sinal devido ao analito, SA,
e ao padrão interno, SPI, são:

SA = kACA
SPI = kPICPI
 Formas de calibração
3º - Padrão Interno
Desta forma:

Onde K é a razão da sensibilidade do analito e do padrão interno.

Para se facilitar a aplicação do padrão interno, plota-se a curva de

calibração relacionando-se a razão sinal do analito (SA)/sinal do
padrão interno (SPI) X a concentração do analito (CA)

Para se obter a concentração do analito na amostra, basta utilizar

a razão sinal do analito na amostra/sinal do padrão interno e jogar
na equação da curva de calibração.
 Formas de calibração
3º - Padrão Interno
Características desejáveis:
• Ter comportamento semelhante ao do analito
de interesse, de forma a estar sujeito as mesmas
interferências e flutuações que o analito.
• Ser detectado simultaneamente ao analito
(técnicas multielementares) e ter sinal distinto
do sinal do analito.
• Idealmente não estar presente na amostra
(adiciona-se uma quantidade conhecida e
constante) em todas as soluções (brancos,
padrões, amostras).
EXERCÍCIO
• Na determinação de anfetaminas em urina por HPLC, a efedrina
foi utilizada como padrão interno. Os dois compostos apresentam
tempos de retenção distintos. Os resultados obtidos para a curva
de calibração, branco e amostra são apresentados abaixo:

Amostra Conc. Analito Área Conc. PI Área

(mg/L) (mg/L)
Branco 0 216 1,0 50289
Padrão 1 0,05 4529 1,0 48370
Padrão 2 0,10 11312 1,0 52360
Padrão 3 0,25 18659 1,0 42390
Padrão 4 0,50 43269 1,0 46350
Padrão 5 1,0 98562 1,0 53240
Branco - 515 1,0 47235
amostra
Amostra - 63917 1,0 56759

Calcule a concentração de anfetamina na amostra.

 EXERCÍCIO
Sem uso do padrão interno

120000

100000

80000
Sinal (Área)

60000 =((Sinal Am – Sinal Br) –b)/a

40000 y = 97206x - 1357.4 =((63917 - 515)+1357.4) / 97206
R2 = 0.9922
20000
= 0.67 mg/L
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
-20000
Conc Analito (mg/L)
 EXERCÍCIO
Com uso do padrão interno

Amostra Conc. Área Conc. PI Área Razão

Analito (mg/L) San/SPI
(mg/L)
Branco 0 216 1 50289 0.004
Padrão 1 0.05 4529 1 48370 0.094
Padrão 2 0.1 11312 1 52360 0.216
Padrão 3 0.25 18659 1 42390 0.440
Padrão 4 0.5 43269 1 46350 0.934
Padrão 5 1 98562 1 53240 1.851
Branco - 515 1 47235
amostra 0.011
Amostra - 63917 1 56759 1.126
 EXERCÍCIO
Com uso do padrão interno

2.000
1.800
1.600
1.400
Sinal (Área)

1.200
1.000 =((Sinal Am – Sinal Br) –b)/a
0.800 y = 1.8438x + 0.0059
0.600 R2 = 0.9994 =((1.126-0.011)-0.0059)/1.8438
0.400 = 0.60 mg/L
0.200
0.000
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Conc Analito (mg/L)
Correção do branco
 Correção do branco
Existem pelo menos quatro diferentes formas que
são utilizadas:

a) Ignorar completamente a correção

b) Utilizar o intercepto da curva de calibração como
branco de calibração
c) Utilizar um branco analítico para correção
d) Utilizar ambos (branco da calibração e branco de
reagente)
 Correção do branco
Considere os seguintes dados, que foram obtidos na
determinação de Pb:
Amostras
Curva de calibração

0 0,014 Amostra Massa Diluição Sinal

0,5 0,169 1 0,2 10 0,362

2 0,3 10 0,523
1 0,345
3 0,4 10 0,687
2 0,687
4 1,236
Branco 0,020
6 1,896
 Correção do branco

Pb y = 0.3104x + 0.026
R2 = 0.9988
2

1.5
Sinal (A)

0.5

0
0 2 4 6 8
Conc (mg/L)
 Correção do branco
a) Ignorar completamente a correção (apenas com inclinação)

Amostras
Curva de calibração
conc
0 0,014 Amostra Massa Diluição Sinal mg/L
0,5 0,169 1 0,2 10 0,362 1.17
1 0,345 2 0,3 10 0,523 1.68

2 0,687 3 0,4 10 0,687 2.21

4 1,236
6 1,896 Branco 0,020

Equação 1: y = 0,3104 x
 Correção do branco
b) Utilizar o intercepto da curva de calibração como branco
de calibração

Curva de calibração Amostras

0 0,014 conc
Amostra Massa Diluição Sinal mg/L
0,5 0,169 1 0,2 10 0,362 1.08
1 0,345 2 0,3 10 0,523 1.60
2 0,687 3 0,4 10 0,687 2.13

4 1,236
6 1,896 Branco 0,020

Equação 1: y = 0,3104 x + 0,0260

 Correção do branco
c) Utilizar uma branco analítico para correção (sem intercepto da curva)

Curva de calibração Amostras

0 0,014 conc
Amostra Massa Diluição Sinal mg/L
0,5 0,169 1 0,2 10 0,362 1.10
1 0,345 2 0,3 10 0,523 1.62
2 0,687 3 0,4 10 0,687 2.15

4 1,236
6 1,896 Branco 0,020

Equação 1: y = 0,3104 x
• Fim...