Produção de enzimas

industriais
Prof. Dr. Guilherme Antônio Lopes de Oliveira
 Conceitos

A vida e a energia para a vida

• A queima de açúcares é a principal
forma segundo a qual retiramos energia
do meio ambiente para vivermos

• Um saco de açúcar pode permanecer

anos na prateleira do supermercado
– A prateleira não tem enzimas!

• Nos animais, a glicose libera sua energia

química em segundos
– Reações catalíticas promovem a oxidação
da glicose ao quebrar ligações químicas
que armazenam energia
Conceitos

Participam das vias bioquímicas

• Enzimas realizam o controle preciso do metabolismo
celular;
• O metabolismo energético
é um dos principais
temas de estudo
da bioquímica;
 O que são as enzimas?
• Proteínas notáveis, altamente
especializadas;
– Alto grau de especificidade com substratos
• Poder catalítico extraordinário;
– Muito maior do que catalisadores sintéticos
• Aceleram reações químicas;
– Em condições suaves de temperatura e pH
– Atuando de forma organizada catalisam
centenas de reações que degradam as
moléculas dos nutrientes e conservam suas
energias.
Enzimas são proteínas?
 Qual a natureza das enzimas?
 O químico orgânico alemão Richard Willstätter (1872–1942) – ganhador
do Nobel pela estrutura da clorofila – conseguiu separar o componente
enzimático de um preparado biológico e não encontrou nenhuma
proteína!

 1926 (EUA) – J Summer cristaliza a urease e

conclui: enzimas são proteínas!

 Willstater criticou os resultados…

James Batcheller Sumner

1887-1955
 SIM!
Mas como funcionam?

 Kunitz e Northrop John Howard Northrop

1891-1987
 Eletroforese e centrifugação: enzimas
estão na fração protéica!
 Mesmo em quantidades proteícas
indetectáveis pelos métodos, as
enzimas continuavam tendo atividades.
Finalmente, Sanger
 1952
 Publica a primeira estrutura primária
de uma proteína: a Insulina, com 51
aminoácidos Frederick Sanger
13 August 1918
 O trabalho mostrava também que a
estrutura das proteínas poderia ser
descrita pela sua sequência de aminoácidos, do N ao C
terminal
 A sequência, entretanto, não ajudava a prever a
função da proteína;
CONCLUSÃO: HISTÓRIA DA Enzimologia
 As enzimas realizam reações catalíticas e transformam moléculas
umas nas outras;
 Os organismos biológicos são ricos em enzimas e as enzimas
funcionam também fora dos organismos biológicos →
biotecnologia!
 As enzimas são proteínas formadas por polímeros de
aminoácidos;
 A multiplicidade de função se dá pela interação tridimensional
formada (modelo chave-fechadura) por interações
não-covalentes a partir de uma série de
aminoácidos ligados covalentemente
(ligação peptídica);
 Toda enzima é proteína?!
• Não!, há alguns RNAs que
funcionam como enzimas.
• Componente químico
adicional necessário para a
função:
– Cofator: íons inorgânicos
– Coenzima: moléculas
orgânicas complexas
– Se liga muito firmemente:
grupo prostético
 Nomenclaturase das enzimases

• Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome

do substrato ou à atividade realizada
– Urease – hidrolisa a uréia
– DNA-polimerase – polimeriza DNA
– Pepsina – pepsis vem do grego (digestão)
 Reação enzimática
• Reação se dá em fases:
• Enzima aumenta a velocidade das reações;
• Os catalisadores aumentam a velocidade das
reações por que diminuem a energia de ativação;
 Aplicações das enzimas
Inibidores enzimáticos
• Inibição reversível competitiva
– Inibidor compete pela ligação ao sítio ativo

• A ligação do inibidor altera os parâmetros cinéticos, tornando a

reação mais lenta
 Aplicações das enzimas
Inibidores enzimáticos
• Inibição reversível não competitiva
– Inibidor se liga a um local diferente do sítio ativo da enzima;

• Gera alterações na configuração estrutural da enzima, impedindo a

ligação com o substrato.
 Aplicações das enzimas
Inibidores enzimáticos
• Inibição irreversível
- Neste caso o inibidor tem por função, se ligar ao sítio ativo ou a
regiões próximas, gerando alterações irreversíveis.
 Medicamentos
• Muitos são inibidores de
enzimas;
• São usados para tratar doenças;
- desde dores de cabeça até a
AIDS

• Penicilina (Alexander Fleming,

1928)
– Inibem reação de transpeptidase
 As Beta-lactamases

• Enzimas que quebram o anel

beta-lactâmico das penicilinas;

• Disseminaram-se em bactérias
submetidas à pressão seletiva
– O mau uso dos antibióticos
 Guerra contra as bactérias
• Acido clavulânico: inativa
irreversivelmente as Beta-lactamases
• Clavulin: amoxilina + ácido clavulânico

• Foram encontradas bactérias

resistentes ao ácido clavulânico...
• O desenvolvimento e descoberta de
novos antibióticos é uma indústria em
crescimento...
Produção industrial de enzimas
 Produção de Enzimas
Introdução

As células constituem-se, até hoje, o único meio para

obtenção de biocatalisadores, visto que ainda não é
possível obter novas enzimas por síntese química;

As enzimas podem ser provenientes de:

• células animais, vegetais e microrganismos.

 Produção de Enzimas Industriais
Produção de Enzimas
Ainda se produz um número importante de enzimas de
origem animal e vegetal;
Ex.: renina usada na elaboração de queijos,
proteases vegetais usadas em anti-
inflamatórios, amilases para a preparação de
mostos de cerveja.

As enzimas de origem vegetal são produzidas em grande

parte como subprodutos da atividade agrícola;
Ex.: papaína, extraída do latéx do
papaya, bromelina, obtida do talo
do abacaxi.
 Produção de Enzimas

Produção de enzimas de origem animal

• Tecidos animais são secos e triturados - submetidos a

desintegração por moinhos ou homogeneizadores;

• Extraídas com água ou soluções tampões adequadas;

• Resíduos removidos por filtração (uso de terra

diatomácea) ou centrifugação;
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas de origem animal

Pancreatina
• apresenta atividade amilolítica, proteolítica e lipolítica;
• Pâncreas de porco;
• Antigamente: realçar sabor de queijos;
• Atualmente: Auxiliar digestivo;

Pâncreas frescos ou congelados são triturados com tecido duodenal

Tripsina presente no duodeno inicia a ativação das enzimas

Massa é seca em secadores a vácuo, e desengordurada através de extração com

éter de petróleo

Flocos são secos em secadores a vácuo, para remoção do solvente, e moídos,

obtendo-se um pó fino e peneirado
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas de origem animal

Renina
• Usada na elaboração de queijos

Extração do estômago de bezerro alimentado somente com leite

Lavagem e corte em tiras do estômago

Extração do coalho com uma solução de cloreto de sódio (12-

20%) Filtra-se e purifica-se a solução por precipitação salina

Acidificação
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas de origem animal
Pepsina
• Origem: Mucosa do
estômago de porco
• Auxiliar digestivo

Mucosa é fatiada e misturada com ácido clorídrico ou fosfórico (pH 2,0)

por 16 h a temperatura ambiente

Eleva-se a temperatura para 40-45 °C por 1 h (pepsinogênio é convertido

em pepsina)

Tecido não digerido é filtrado e seco (secador a vácuo) a 40 °C.

Pepsina de alta pureza é obtida através da concentração a vácuo do

filtrado, resfriamento a 5-8 °C e adição de etanol para atingir a
concentração de 60%
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas de origem animal

Catalase
• Obtida a partir de
fígado e sangue de boi
ou porco
• Pode atuar como
peroxidase, degradando
álcoois, nitritos e fenóis
Fígados são macerados e submetidos a agitação em solução aquosa de 25%
com acetona a 25 °C

Concentração da acetona é aumentada a 35%, a massa obtida é filtrada e os

sólidos descartados

Mais acetona é adicionada (50%), precipitando a catalase, recuperada através de

filtração ou centrifugação

Precipitado pode ser seco ou ainda extraído em solução aquosa agitada por 1 h,
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas de origem vegetal

Papaína
• Enzima proteolítica

• Origem: látex do fruto verde do mamão

• Clarificação da cerveja, amaciamento de carne, auxiliar digestivo

• Extraída como suco prensado deste componente e

posteriormente purificada

• A adição de água e cloreto de sódio perfazem um preparado

chamado de papaína bruta
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas de origem vegetal
Bromelina
• Enzima proteolítica

• Origem: caule e fruto do abacaxi;

• Clarificação da cerveja, amaciamento de carne, auxiliar

digestivo;

• Obtida do suco do caule do abacaxi após moagem,

prensagem, filtração e precipitação;
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas de origem vegetal

Maltase
• Proteases, lipases e hemicelulases, oxiredutases e amilases
(alfa-amilases: no grão durante a germinação; beta-amilase
presente no grão antes da germinação);

• Origem: malte de cevada, trigo, arroz...

• Após germinação é feita secagem: paralisação da atividade

biológica do grão e reduzir teor de umidade;
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas microbianas

Engenharia de Bioprocessos: propagação de células microbianas

Aplicação comercial: bactérias, fungos filamentosos e leveduras;

•Produção de enzimas extracelulares industriais: Bacillus e Aspergillus (80- 85%
do mercado de enzimas extracelulares);
DNA, mRNA, tRNA e rRNA participam juntos
da síntese de enzimas (proteínas)
Ribossoma
Aminoacil-tRNA
Cadeia polipeptídica (enzima)
tRNA

mRNA

DNA mRNA
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas microbianas
Síntese e excreção de proteína extracelulares
•Enzima pronta: pode difundir-se livremente
através da parede celular e, no caso de
fungos e batérias Gram positivas, chega ao
meio externo.
•Algumas enzimas permanecem associadas a
estruturas da membrana ou da parede
celular.
•Nas bactérias Gram negativas a secreção
de enzimas é mais complexa, devido a
presença de uma membrana externa.
Única enzima relevante produzida
por uma bactéria Gram negativa é a (a) Bactérias Gram
positivas; (b) Bactérias
pululanase de Klebsiella pulmoniae. Gram negativas; (c) Fungos
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas microbianas

Escolha do microrganismo

• Produtor da enzima de interesse em

grande quantidade;

• Estável;

• Não-patogênico;

• Fácil manipulação.
 Produção de Enzimas
Produção de enzimas microbianas

Produção de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados

•Atualmente: Todas as enzimas produzidas comercialmente provém de

microrganismos que são um produto de programas de melhoramento
genético;

•Técnica: Clonagem genética, clonagem molecular ou DNA

recombinante.

•A partir da obtenção de um fragmento de DNA que codifique a

síntese de uma determinada enzima e da introdução deste
fragmento em uma célula hospedeira onde o código genético vai
se reproduzir e se expressar