Efeitos da irradiação com diodo emissor de

luz azul na proliferação, apoptose e

diferenciação de células-tronco
mesenquimais derivadas da medula óssea

Aluno: Andreyson da Silva Araujo

Disciplina: Efeitos Biológicos da Radiação
Data: 03/07/2019
 INTRODUÇÃO
 As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células-tronco estromais
multipotentes que podem ser derivadas de uma ampla variedade de tecidos e
fluidos adultos.
 As MSCs são bem reconhecidas como tendo capacidade de autorrenovação e
diferenciação. Eles podem se diferenciar em células da linhagem mesodérmica,
como adipócitos, osteócitos e condrócitos, bem como células de outras
linhagens embrionárias.
 Devido ao seu papel endógeno na manutenção de nichos de células-tronco, as
MSCs estão envolvidas na homeostase de órgãos, na cicatrização de feridas e
no envelhecimento bem-sucedido. As MSCs estão surgindo como um agente
terapêutico extremamente promissor para a regeneração de tecidos, e têm sido
amplamente utilizadas em engenharia de tecidos e terapias baseadas em células
em vários campos da medicina.
 Estímulos biofísicos, como mudanças nos sinais ambientais extracelulares, têm
sido cada vez mais reconhecidos como estratégias promissoras para afetar a
proliferação, migração e diferenciação de CTMs.
 INTRODUÇÃ
O
 A terapia baseada em diodos emissores de luz (LED), uma terapia
biofísica não invasiva, tem sido amplamente utilizada na prática
clínica para várias doenças, incluindo artrite, osteoartrite, artrite
reumatóide, rejuvenescimento da pele e cicatrização de feridas.
 Estudos recentes já demonstraram que a irradiação com LED
vermelho tem efeitos benéficos na proliferação e diferenciação de
MSCs derivadas de medula óssea (BMSCs). Mostrou-se que a luz
LED vermelha não coerente promove a proliferação de BMSC, mas
não induziu a diferenciação osteogênica de BMSCs em meio
normal.
 Além disso, tratamentos com irradiação de LED de baixa potência
no espectro vermelho (comprimentos de onda de 620-660 nm) e no
espectro do infravermelho próximo (NIR) (comprimento de onda de
830 nm) foram relatados para promover a proliferação de BMSC.
 INTRODUÇÃO
 Em outros trabalhos os comprimentos de onda entre 400 e 500 nm, a luz
LED azul, induz a apoptose celular e reduz a proliferação celular em
melanomas, linfomas de células B, tumores de pele e fibroblastos
dérmicos da pele regulando autofagia, espécies reativas de oxigênio
(ROS) e vias de sinalização mediadas por mitocôndrias.
 Além disso, a luz azul induz a apoptose de fotorreceptores e causa
degeneração macular relacionada à idade, também conhecida como
retinite pigmentosa.
 No entanto, nenhum estudo testou os efeitos dos LEDs azuis nas
BMSCs. O presente estudo foi desenhado para investigar os efeitos da
irradiação do LED azul na proliferação, apoptose e diferenciação de
osteoblastos da BMSC, bem como os mecanismos potenciais desses
efeitos.
MATERIAIS E MÉTODOS
 BMSCs foram irradiados com uma luz LED azul a 470 nm durante 1
min, 5 min, 10 min, 30 min e 60 min ou não irradiado.

 A proliferação celular foi medida através da realização de ensaios de

contagem de células e de coloração EdU (Ethynyl-2-deoxyuridine).

 A apoptose celular foi detectada por coloração TUNEL (Terminal

deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling).

 A diferenciação osteogênica foi avaliada pela coloração de ALP

(Alkaline Phosphatase) e ARS ( Alizarin Red S). Coloração DCFH-
DA e imunocoloração γ-H2A.X foram usados ​para medir os níveis
intracelulares de produção de ROS e danos no DNA.
 RESULTADOS
Inibição do crescimento de BMSC após
irradiação LED azul

 Utilizamos a análise espectroscópica para identificar

a emissão máxima de luz do LED azul, que, em um
comprimento de onda de 470 nm, foi de
aproximadamente 1,500 unidades de absorbância,
como mostrado na Fig.1A.
 Para examinar o efeito da irradiação de LED azul
no crescimento de BMSC, expusemos as BMSCs a
luz LED azul por 1 min, 5 min, 10 min, 30 min e 60
min e subsequentemente avaliamos a proliferação
usando ensaios de contagem de células.
 Não foram observadas diferenças óbvias entre as
Fig. 01:Os efeitos da irradiação LED azul no
células tratadas com irradiação de curta duração
crescimento BMSC. (A) Mapa de detecção da
durante 1 min e as correspondentes células de
controle não irradiadas. No entanto, o crescimento
intensidade de saída do LED azul: o pico do
celular começou a diminuir significativamente a comprimento de onda é de 470 nm. Após a
partir de tratamentos por 5 min (Fig. 1B). O irradiação com LED azul, o número de BMSC foi
encolhimento e o arredondamento óbvios das determinado usando um ensaio de contagem de
BMSCs foram observados após o tratamento com células (B). O painel mostra o número total de
irradiação LED azul por 30 min e 60 min (Fig. 1C). células após irradiação por luz LED azul. * P
<0,05; ** P <0,01. (C) Imagens representativas
tomadas ao microscópio (ampliação × 40).
 RESULTADOS
 Para identificar ainda se a irradiação de
LED azul tem um efeito tóxico na
proliferação celular, a coloração de EdU
foi empregada para determinar as
porcentagens de células proliferativas
após a irradiação por até 60 minutos.
 Em comparação com os grupos de
controle, observaram-se diminuição nas
porcentagens de células EdU para
células irradiadas com luz LED azul
durante 10 min, 30 min e 60 min (Fig.
2).
 As percentagens de células EdU foram
reduzidas de aproximadamente 30% para
19,8%, 5,8% e 2,4% respectivamente,
Fig. 02:indicando que a irradiação
Efeitos antiproliferativos da com LEDao LED azul em BMSCs. Um ensaio de coloração de etinil-
exposição
azul inibe(EdU)
2-desoxiuridina significativamente
foi realizado paraa avaliar a proliferação de BMSC exposição a irradiação com LED
azul emproliferação de BMSC
diferentes pontos temporais. (A) Coloração imunofluorescente representativa de BMSCs. DAPI
(azul), EdU (vermelho) e imagens mescladas foram mostradas. Fotos das áreas selecionadas foram tomadas
aleatoriamente sob microscopia de fluorescência. Barra de escala: 20 μm. (B) O painel mostra as
porcentagens de células positivas EdU. * P <0,05; *** P <0,001.
 Indução de apoptose na BMSC por
irradiação com LED azul

• Para investigar os efeitos da irradiação LED

azul na apoptose celular, realizamos
coloração TUNEL em BMSCs. Como
mostrado na Fig. 3, não foram observadas
diferenças óbvias entre os grupos de
controle e as células tratadas com irradiação
LED azul durante menos de 5 min.

• No entanto, as porcentagens de células

TUNEL foram significativamente maiores
após o tratamento com irradiação LED azul
por 10 min, 30 min e 60 min.

• A percentagem média de células

apoptóticas foi aumentada para um máximo
de 31%.
Fig. 03: Estes
Efeitos dados sugerem
pró-apoptóticos que a
da irradiação LED azul em BMSCs. As percentagens de BMSCs
irradiação
apoptóticas apósLED azul tem
irradiação por efeitos
luz LED sobre
azul até 60 min foram medidas por desoxinucleotidil terminal
BMSCs.
coloração por rotulagem de ponta de transferência dUTP (TUNEL). (A) Coloração imunofluorescente
representativa de DAPI (azul), TUNEL (verde) e imagens mescladas. As fotos foram tiradas aleatoriamente
usando microscopia de fluorescência. Barra de escala: 20 μm. (B) O painel mostra as porcentagens de
células positivas TUNEL. * P <0,05; ** P <0,01.
Diferenciação osteogênica de BMSC foi inibida pela irradiação com LED azul

• BMSCs, células estromais não-

hematopoiéticas, têm a capacidade de se
diferenciar em osteoblastos. Assim,
avaliamos a atividade da fosfatase alcalina
(ALP), um marcador precoce da
osteogênese, no dia 7, durante a
diferenciação osteogênica das BMMSCs.

• Baixa atividade de ALP foi observada em

grupos com LED azul irradiado em
comparação com o grupo controle não
irradiado (Fig. 4A).
• A coloração com Alizarina Red S (ARS)
revelou que os depósitos de cálcio no 7º dia
de diferenciação osteogênica da BMSC
foram significativamente reduzidos após
tratamento com irradiação com LED azul
(Fig. 4B).
Fig. 04: Efeitos inibitórios da irradiação LED azul na
diferenciação osteogênica da BMSC. A coloração de
ALP foi usada para detectar a atividade de ALP, e a
coloração de ARS foi usada para detectar a formação de
nódulos de cálcio. BMSCs foram irradiados por luz
LED azul a uma densidade de potência de 20 mW/cm²
por 10 min todos os dias durante a diferenciação
osteogênica. Imagens celulares representativas de (A)
coloração de ALP e (B) coloração de ARS mostram o
estado de diferenciação osteogênica no 7º dia para
BMSCs irradiadas com luz LED azul e não irradiadas.
 Aumento dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ROS)
em BMSCs após irradiação com LED azul

• Para avaliar ainda mais os efeitos da

irradiação de LED azul na produção de ROS,
foi realizada a coloração DCF-DA em
BMSCs tratadas com LEDs azuis e não
tratadas. Como mostrado na Fig. 5A,
descobrimos que o tratamento com LED azul
induziu a produção de ROS nuclear em
BMSCs após a irradiação por pelo menos 10
min.
• Após irradiação a longo prazo por 30 min e
60 min, a produção elevada de ERO foi
observada tanto no núcleo quanto no
citoplasma.
• Após a irradiação durante 10 min, 30 min e
60 min, as percentagens de células ROS
aumentaram significativamente em 33,0%,
42,4% e 53,4%, respectivamente (Fig. 5B).
Fig.
• 05: Efeitos
Estes da luz indicam
resultados LED azulquena ageração de espécies reativas de oxigênio (ROS) em BMSCs. A sonda
irradiação
fluorescente
LED azulsensível a peróxido
resulta DCFH-DA foi usada para medir os níveis intracelulares de ROS em BMSCs
em um aumento
após asignificativo
irradiação com LED azul.
na geração (A) Coloração
intracelular imunofluorescente representativa de BMSCs. DAPI (azul),
de ROS
ROS (verde) e imagens mescladas foram exibidas. Fotos foram tiradas aleatoriamente. Barra de escala: 20 μm.
por BMSCs.
(B) O painel mostra as percentagens de células positivas para ROS. ** P <0,01.
Irradiação LED azul leva a danos no DNA em BMSCs

• Investigamos se a irradiação de LED

azul causa danos ao DNA em BMSCs
usando imunomarcação γ-H2A.X. As
percentagens de células positivas para
γ-H2A.X aumentaram
significativamente em células tratadas
com irradiação com LED azul durante 5
min, 10 min, 30 min e 60 min (Fig. 6).
• Após a irradiação por 60 min,
observamos um aumento acentuado no
DNA danificado em 23,4% das BMSCs.
• Juntos, esses resultados indicam que a
irradiação LED azul resulta em aumento
do dano ao DNA em BMSCs.

Fig. 06: Efeitos da luz LED azul no dano do DNA em BMSCs. A imunoexpressão γ-H2A.X seguida de
microscopia confocal foi usada para determinar o estado de dano ao DNA em BMSCs irradiadas por luz
LED azul. (A) Coloração imunofluorescente representativa de BMSCs. Imagens DAPI (azul), γ-H2A.X
(vermelho) e mescladas foram mostradas. Fotos foram tiradas aleatoriamente. Barra de escala: 20 μm. (B) O
painel mostra as porcentagens de células positivas para γ-H2A.X. Setas indicam coloração específica de γ-
H2A.X em BMSCs. * P <0,05; ** P <0,01.
CONCLUSÃO
 Nosso estudo demonstrou que a luz LED azul inibiu a
proliferação celular, inibiu a diferenciação osteogênica e
induziu apoptose em BMSCs, que estão associados com o
aumento da produção de ROS e danos no DNA.

 Essas descobertas podem fornecer informações importantes

para a aplicação de LEDs em futuras terapias baseadas na
BMSC.