NORMA TCNICA

L5.406
Jun/2007
16 PGINAS

Coliformes termotolerantes: Determinao em amostras

ambientais pela tcnica de tubos multiplos com meio A1 mtodo de ensaio

Companhia Ambiental do Estado de So Paulo

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COLIFORMES TERMOTOLERANTES
DETERMINAO EM AMOSTRAS
AMBIENTAIS PELA TCNICA DE TUBOS
MLTIPLOS COM MEIO A-1
Mtodo de Ensaio
SUMRIO

L5.406
Jun/07

Pgina

Introduo...................................................................................................................................... 1
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Objetivo.......................................................................................................................................2
Normas e documentos complementares...................................................................................2
Definies....................................................................................................................................2
Aparelhagem.............................................................................................................................. 3
Meios de cultura e solues....................................................................................................... 6
Procedimentos............................................................................................................................ 8
Resultados.................................................................................................................................12
Determinao de coliformes termotolerantes em amostras slidas ou semi-slidas......... 15
Referncias............................................................................................................................... 16

Introduo
A poluio das guas por material fecal de origem humana e animal torna esse elemento um
veculo de transmisso de doenas infecciosas causadas por bactria, vrus, protozorios e
helmintos (WHO, 2004).
A deteco de microrganismos patognicos, embora necessria em algumas circunstncias, no
aplicvel para fins de monitoramento ou verificao de rotina. Por esse motivo, uma das
estratgias mais viveis para o controle de qualidade microbiolgica da gua a avaliao da
presena dos chamados microrganismos indicadores de contaminao fecal. Esses
microrganismos devem possuir uma srie de caractersticas, dentre elas, estar presentes em
grandes quantidades em fezes humanas e de animais de sangue quente, no se multiplicar em
guas naturais e ser detectveis por mtodos laboratoriais simples e rpidos.
Alguns microrganismos atendem maior parte desses requisitos, destacando-se dentre eles as
bactrias do grupo coliforme as quais so definidas como bacilos aerbicos e anaerbios
facultativos, Gram-negativos, no formadores de esporos, capazes de crescer na presena de
concentraes relativamente elevadas de sais biliares e fermentar a lactose na temperatura de
35C 37C, com formao de cido, gs e aldedo, em 24 a 48 horas (WHO, 2004; UNITED
KINGDOM, 2002).
Algumas bactrias do grupo dos coliformes, que so capazes de fermentar a lactose em
temperaturas mais elevadas, de 44C a 45C, foram por muito tempo denominadas coliformes
fecais, pois acreditava-se que sua origem era exclusivamente fecal. Dentre essas bactrias, o
gnero predominante Escherichia, mas algumas espcies de Citrobacter, Klebsiella e
Enterobacter tambm so termotolerantes. A Escherichia coli est presente em densidades
elevadas nas fezes de humanos e animais, e raramente encontrada na ausncia de poluio

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fecal, enquanto que as outras espcies de coliformes termotolerantes podem ter origem ambiental
(WHO, 2004).
Por esse motivo, o termo mais correto, aceito atualmente para esse subgrupo dos coliformes,
coliformes termotolerantes, e a E. coli considerada o indicador ideal de contaminao fecal,
mas so igualmente aceitveis para esse fim os coliformes termotolerantes (LECLERC et al.,
2000; UNITED KINGDOM, 2002; WHO, 2004).
A Resoluo CONAMA 357/2005, que dispe sobre a classificao de corpos de gua e
diretrizes ambientais para seu enquadramento, utiliza os coliformes termotolerantes como padro
de qualidade microbiolgica, e permite sua substituio pela Escherichia coli, de acordo com
critrios estabelecidos pelo rgo ambiental competente (BRASIL, 2005).
Os coliformes termotolerantes podem ser analisados quantitativamente pelas tcnicas de tubos
mltiplos e membrana filtrante, e cada uma dessas tcnicas apresenta vantagens e desvantagens,
devendo ainda ser considerados os objetivos da anlise. Com a tcnica de tubos mltiplos pode
ser utilizado o caldo lauril triptose na etapa presuntiva (incubao a 35C durante 24 a 48 horas)
e o meio EC como etapa de diferenciao para coliformes termotolerantes (incubao a 44,5C
durante 24 horas) sendo necessrias portanto, at 72 horas para a obteno dos resultados. Pode
ser tambm empregado um procedimento simplificado, que requer incubao a 44,5C durante
24 horas, com meio de cultura A-1. Este meio foi testado inicialmente com amostras de guas
estuarinas, em comparao com o procedimento convencional com o caldo lauril triptose. Os
resultados obtidos atravs desses dois mtodos foram similares (STRANDRIDGE;
DELFINO,1981).
A presente norma apresenta a determinao de coliformes termotolerantes atravs da tcnica de
tubos mltiplos com o meio A-1, segundo o procedimento descrito no Standard Methods
(APHA; AWWA; WEF, 2005).
1 Objetivo
Esta norma prescreve a tcnica dos tubos mltiplos, utilizando o meio A-1, para a determinao
do nmero mais provvel de coliformes termotolerantes em 24 horas, com aplicao em
amostras de guas brutas, marinhas, residurias, bem como amostras de resduos slidos.
2 Documentos Complementares
Os documentos relacionados a seguir contm disposies que constituem fundamento para esta
norma. As edies indicadas estavam em vigor no momento desta publicao. Como toda norma
est sujeita reviso e alteraes, aqueles que realizam procedimentos com base nesta, devem
verificar a existncia de legislao superveniente aplicvel ou de edies mais recentes das
normas citadas.
Na aplicao desta norma necessrio consultar:

CETESB (So Paulo). Guia de coleta de preservao de amostras de gua. So

Paulo,1988.

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3 Definies
Para os efeitos desta norma so adotadas as definies de 3.1 a 3.6.
3.1 Coliformes
Grupo de bactrias constitudo por bacilos Gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos,
no formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na presena de sais biliares ou
outros compostos ativos de superfcie (surfactantes), com propriedades similares de inibio de
crescimento, e que possuem a enzima -galactosidase. Fermentam a lactose com produo de
aldedo, cido e gs a 35C em 24-48 horas.
3.2 Coliformes termotolerantes
So os coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produo de cido e gs
temperatura de 44C-45C .
3.3 Bacilo
Designao dada s bactrias que apresentam forma cilndrica.
3.4 Colorao do Gram
Colorao diferencial, atravs da qual as bactrias so classificadas em Gram-positivas ou Gramnegativas, dependendo da reteno ou no do corante cristal violeta. As bactrias, nas quais o
cristal-violeta retido, apresentam colorao roxa (Gram-postivas), e aquelas nas quais o cristalvioleta removido pela ao do lcool-acetona, coram-se posteriormente pela safranina,
apresentando colorao rosa (Gram-negativas).
3.5 Esporos
Estruturas especializadas que se formam em certas bactrias Gram-positivas sob condies
inadequadas. Os esporos no apresentam atividade metablica e so muito mais resistentes aos
efeitos do calor, dessecao, congelamento, substncias deletrias e radiaes, que as prprias
clulas que os formam.
3.6 Teste de oxidase
Este teste tem por finalidade evidenciar a presena da citocromo-oxidase, uma enzima da cadeia
respiratria de certas bactrias. Esta enzima necessria para a oxidao do citocromo-c,
segundo a seguinte reao:
2 citocromo-c-reduzido + 2H+ + 1/2O2

citocromo-oxidase

2citocromo-c-oxidado + H2O

No teste de oxidase, o citocromo-c oxidado sofre reduo, ocorrendo a oxidao da tetrametil pfenilenodiamina, formando-se uma substncia de colorao azul. As bactrias do grupo
coliforme apresentam resultados negativo neste teste.

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4 Aparelhagem
4.1 Equipamentos
4.1.1 Balana
Com sensibilidade mnima de 0,1g ao serem pesados 150g. As balanas devem ser colocadas em
local adequado, protegidas de vibraes, umidade e mudanas bruscas de temperatura.
4.1.2 Banho-maria
Equipado com termostato e agitador de baixa velocidade para promover circulao da gua e
manter a temperatura uniforme (44,5C 0,2C) em todos os pontos. O termmetro utilizado
para controle do banho-maria deve ter a escala graduada em incrementos de 0,2C ou menos. O
nvel de gua no banho-maria deve ser mantido acima do nvel do meio de cultura nos tubos de
ensaio imersos para incubao.
4.1.3 Destilador de gua ou aparelho para desionizao
Deve produzir gua que obedea aos critrios de qualidade estabelecidos pela Agncia Ambiental Americana no Manual for the Certification of Laboratories Analyzing Drinking Water
(UNITED STATES, 2005).
4.1.4 Equipamentos para esterilizao
4.1.4.1 Autoclave
Deve ter capacidade suficiente para permitir a circulao do vapor ao redor do material a ser
esterilizado. Deve manter a temperatura de esterilizao de 121C durante o ciclo, o qual no
deve exceder 45 minutos para um tempo de esterilizao de 15 minutos.1
4.1.4.2 Estufa de esterilizao
Devem manter a temperatura de 170C - 180C durante o perodo de esterilizao (mnimo de
duas horas). O termmetro utilizado para controle de temperatura deve ter a escala graduada em
incrementos de 10C ou menos, com seu bulbo colocado em areia, durante o uso.
4.1.4.3 Incubadora bacteriolgica equipada com termostato para operar a 35C 0,5C
Deve manter a temperatura na faixa de 35C 0,5C. O termmetro deve ter escala graduada em
incrementos de 0,5C e estar imerso em gua.
4.1.4.4 Incubadora bacteriolgica equipada com termostato para operar a 44,5C 0,2C

As autoclaves mais modernas que possuem portas deslizantes, com abertura e fechamento automticos, ciclos programveis
de esterilizao e monitoramento contnuo de temperatura e presso, tambm podem apresentar etapas de resfriamento e
remoo do vapor como parte do ciclo; para esses equipamentos, no requerido o tempo estrito de 45 minutos para o ciclo,
desde que os registros impressos indiquem a operao do ciclo normal e o resfriamento durante a exausto e remoo do
vapor.

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Deve manter a temperatura na faixa de 44,5C 0,2C. O termmetro deve ter escala graduada
em incrementos de 0,1C e estar imerso em gua.2
4.1.5 Medidor de pH
Deve oferecer exatido mnima de 0,1 unidade de pH.
4.1.6 Refrigerador
Deve manter a temperatura na faixa de 2C a 8C. O termmetro utilizado para controle de
temperatura deve ser graduado em incrementos de 1C ou menos.
4.2 Vidraria e material plstico
4.2.1 Frasco para gua de diluio
De vidro neutro, borossilicato, ou plstico autoclavvel, com tampas que permitam boa vedao
e sejam livres de substncias txicas solveis; devem ter volume suficiente para conter 90 2ml
de gua de diluio, deixando um espao suficiente para permitir uma boa homogeneizao
quando se fizer a agitao.
4.2.2 Frasco para coleta de amostras
De vidro neutro ou plstico autoclavvel atxico, com capacidade mnima de 125mL, com boca
larga e tampa prova de vazamento.
4.2.3 Pipetas
Tipo Mohr, para 10mL, 5mL, 2mL e 1mL, com graduao de 1/10 e erro volumtrico inferior a
2,5%, com bocal para tampo de algodo. Podem ser utilizadas pipetas descartveis de plstico,
estreis, ou de vidro borossilicato.
4.2.4 Tubos de Durham
De borossilicato ou vidro neutro, de 9mm de dimetro e 45mm de comprimento.
4.2.5 Tubos de ensaio
De borossilicato ou vidro neutro, de 15 ou 16mm de dimetro x 150mm de comprimento, e de 18
mm de dimetro x 180mm de comprimento, com tampas frouxas.
4.3 Outros materiais
4.3.1 Bico de Bunsen ou similar
Devem ter funcionamento adequado, de modo a produzir combusto completa.
2

Para atender ao rgido controle de temperatura requerido nas determinaes de coliformes termotolerantes deve-se utilizar
uma incubadora que comprovadamente proporcione esse controle.

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4.3.2 Caixas ou cestas de ao inoxidvel

Para acondicionamento de materiais a serem esterilizados.
4.3.3 Estantes
De tamanho adequado para colocao dos tubos de ensaio empregados na anlise.
4.3.4 Estojo para pipetas
Usar estojo de alumnio ou ao inoxidvel de tamanho adequado, para acondicionamento das
pipetas a serem esterilizadas. Opcionalmente, as mesmas podem ser embrulhadas
individualmente em papel apropriado para a esterilizao.
4.3.5 Termmetros
Os termmetros de mercrio devem ter escala adequada ao uso e a coluna no deve apresentar
interrupes. Tambm podem ser utilizados termmetros eletrnicos digitais, desde que
apresentem faixa, sensibilidade e exatido adequadas.
5 Meios de cultura e solues
5.1 Meio A-1 (concentrao dupla)
5.1.1 Frmula
Lactose................................................................................................................................. 10,0g
Triptona................................................................................................................................40,0g
Cloreto de sdio (NaCl) ...................................................................................................... 10,0g
Salicina...................................................................................................................................1,0g
Polietilenoglicol p-isooctilfenil ter (Triton X-100).......................................................... 2,0mL
gua destilada....................................................................................................................... 1,0L
pH final aps esterilizao: 6,9 0,1
5.1.2 Preparo
Pesar o meio desidratado no dobro da quantidade especificada no frasco e acrescentar 1,0L de
gua destilada fria. Aquecer, agitando freqentemente, at a completa dissoluo, tomando
cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio.
Em tubos de ensaio de
18 x 180 mm, contendo em seu interior tubos de Durham invertidos, distribuir volumes
adequados para que o volume final, aps esterilizao, seja de 10ml. Tamponar e esterilizar em
autoclave a 121C durante 10 minutos. 3
5.1.3

Armazenamento

O meio preparado pode ser estocado temperatura ambiente, em local limpo e ao abrigo da luz,
3

No preparo desse meio, evitar aquecimento excessivo durante a dissoluo e a esterilizao. O tempo transcorrido entre seu
preparo e esterilizao no deve exceder duas horas.

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durante, no mximo 7 dias. Ignorar a formao de precipitado.

5.2 Meio A-1 (concentrao simples)
5.2.1 Frmula
Lactose.................................................................................................................................. 5,0 g
Triptona...............................................................................................................................20,0 g
Cloreto de sdio (NaCl)......................................................................................................... 5,0g
Salicina...................................................................................................................................0,5g
Polietilenoglicol p-isooctilfenil ter (Triton X-100)....................................................... ...1,0mL
gua destilada....................................................................................................................... 1,0L
pH final aps esterilizao: 6,9 0,1
5.2.2 Preparo
Pesar o meio desidratado na quantidade especificada no frasco e acrescentar 1,0L de gua
destilada fria. Aquecer, agitando freqentemente, at a completa dissoluo, tomando cuidado
para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Em tubos de ensaio de 16 x 150mm,
contendo em seu interior tubos de Durham invertidos, distribuir volumes adequados para que o
volume final, aps esterilizao, seja de 10mL. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121C
durante 10 minutos.3
5.2.3 Armazenamento
O meio preparado pode ser estocado temperatura ambiente, em local limpo e ao abrigo da luz,
durante, no mximo 7 dias. Ignorar a formao de precipitado.
5.3 gua de diluio
5.3.1 Frmula
Soluo Estoque A......................................................................................................... 1,25mL
Soluo-Estoque B............................................................................................................. 5,0mL
gua destilada.............................................................................................................. 1000,0mL
5.3.2 Preparo
a) Preparar a soluo-estoque A com a seguinte composio:
Dihidrogeno fosfato de potssio (KH2PO4) .........................................................................34,0g
gua destilada q.s.p......................................................................................................1000,0mL
Preparo: Dissolver dihidrogeno fosfato de potssio em 500mL de gua destilada, ajustar o pH
para 7,2 0,5 com soluo de hidrxido de sdio 1N e completar o volume para um litro com
gua destilada. Distribuir volumes adequados necessidade do laboratrio em frascos com
tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121C, durante 15 minutos. Armazenar em geladeira,
durante no mximo 2 meses. 4
4

Antes da utilizao das solues-estoque deve-se verificar se no h quaisquer evidncias de contaminao microbiana
(turbidez, presena de material em suspenso). Em caso afirmativo, essa soluo deve ser descartada.

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b) Preparar a soluo-estoque B com a seguinte composio:

Cloreto de magnsio (MgCl2.6H2O).....................................................................................81,1g
gua destilada q.s.p......................................................................................................1000,0mL
Preparo: Dissolver o cloreto de magnsio em 500mL de gua destilada e completar o volume
para 1000mL com gua destilada. Distribuir volumes adequados necessidade do laboratrio em
frascos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121C, durante 15 minutos. Armazenar
em geladeira, durante no mximo 2 meses.
c) Adicionar 1,25mL da soluo-estoque A e 5mL da soluo-estoque B a um litro de gua
destilada;
d) Distribuir, em frascos de diluio, quantidades adequadas para que o volume final, aps
esterilizao seja de 90 2ml;
e) Tamponar e esterilizar em autoclave a 121C durante 15 minutos.
5.3.3 Armazenamento
A soluo preparada poder ser estocada ao abrigo da luz e temperatura ambiente, durante, no
mximo, duas semanas.
5.4 Soluo de hidrxido de sdio 1N
5.4.1 Frmula
Hidrxido de sdio (NaOH) ................................................................................................40,0g
gua destilada q.s.p.....................................................................................................1000,0mL
5.4.2 Preparo
Pesar 40,0g de hidrxido de sdio, colocar em um balo volumtrico e completar o volume para
1000mL com gua destilada. Homogeneizar bem at a completa dissoluo do hidrxido de
sdio.
5.4.3 Armazenamento
Em frasco com tampa de rosca, temperatura ambiente durante no mximo 6 meses.
6 Execuo do ensaio
6.1 Princpio do mtodo
A determinao do nmero mais provvel de coliformes termotolerantes na amostra efetuada a
partir de aplicao da tcnica de tubos mltiplos. Esta tcnica baseada no princpio de que as
bactrias presentes em uma amostra podem ser separadas por agitao, resultando em uma
suspenso de clulas bacterianas uniformemente distribudas na amostra. A tcnica consiste na
inoculao de volumes decrescentes da amostra em meio de cultura adequado ao crescimento
dos microrganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado em uma srie de tubos. Atravs
de diluies sucessivas da amostra, so obtidos inculos, cuja semeadura fornece resultados
negativos em pelo menos um tubo da srie em que os mesmos foram inoculados e a combinao

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de resultados positivos e negativos permite a obteno de uma estimativa da densidade das

bactrias pesquisadas, atravs da aplicao de clculos de probabilidade. Para anlise de gua,
tem sido utilizado preferencialmente o fator 10 de diluio, sendo inoculados mltiplos e
submltiplos de 1ml da amostra, usando-se sries de 5 tubos para cada volume a ser inoculado.
(Figura 1).

Amostra

Volumes decimais adequados

mltiplos e sub-mltiplos de 1 ml

Meio A1

Incubao
3 h: 35 0,5C
21 2 h: 44,5 0,2C

Leitura

Produo de gs - teste positivo

Ausncia de gs - teste negativo

para coliformes termotolerantes

para coliformes termotolerantes

Figura 1 Esquema do procedimento para determinao de coliformes

termotolerantes pela tcnica de tubos mltiplos com o meio A-1.
6.2 Amostragem
Deve ser efetuada segundo as especificaes apresentadas no Guia de Coleta e Preservao de
Amostras de gua (vide item 2).
6.3 Procedimento
6.3.1 Identificar a amostra a ser analisada e definir os volumes da mesma a serem inoculados,
em funo de sua procedncia, segundo especificado a seguir: A tcnica de tubos mltiplos
requer a inoculao de mltiplos e submltiplos de 1ml da amostras, sendo cada volume
inoculado em uma srie de 5 tubos. A escolha desses volumes deve ser feita cuidadosamente
pelo analista (com base em sua experincia sobre a provvel densidade de coliformes presentes
na amostra ou em dados prvios sobre a mesma), de tal modo que pelo menos um tubo inoculado
com o menor volume selecionado fornea resultado negativo. requerida a inoculao de, no
mnimo, trs volumes, sendo aconselhvel, para amostras desconhecidas, a seleo de um maior
nmero de volumes a serem inoculados.
6.3.2 Antes de iniciar o exame, desinfetar a bancada de trabalho, usando um desinfetante que
9

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no deixe resduos.
6.3.3 Proceder identificao dos tubos, anotando, no primeiro tubo direita na primeira fileira,
o nmero da amostra, o volume a ser inoculado e a data. Nos primeiros tubos direita nas
fileiras seguintes, anotar apenas o volume a ser inoculado em cada tubo das mesmas.
6.3.4 Homogeneizar a amostra no mnimo 25 vezes, inclinando o frasco, de modo a formar um
ngulo de aproximadamente 45 entre o brao e o antebrao.
6.3.5 Com a pipeta esterilizada de 10ml e obedecendo aos cuidados de assepsia, transferir 10ml
da amostra para um frasco contendo 90 2 ml de gua de diluio, antecipadamente identificado
(Figura 2). Prepara-se, assim a primeira diluio decimal (10-1), sendo que 1ml da mesma
corresponde a 0,1ml da amostra.

Figura 2 Preparo das diluies decimais

6.3.6 Com a mesma pipeta, semear 10ml da amostra em cada um dos tubos contendo o meio
A-1 em concentrao dupla, quando este volume for requerido para o teste (Figura 3).
6.3.7 Desprezar a pipeta de 10ml e, com uma pipeta de 5ml, inocular 1 ml da amostra em cada
um dos tubos correspondentes a essa quantidade de inculo (100).
6.3.8 Homogeneizar o frasco contendo a primeira diluio (10-1) , conforme descrito no item
6.3.4, e, com uma nova pipeta estril, transferir 10ml para um frasco contendo 90 2ml de gua
de diluio, conseguindo-se assim a segunda diluio decimal (10-2), sendo que 1ml da mesma
corresponde a 0,01ml da amostra.
6.3.9 Proceder dessa maneira na seqncia de diluies desejadas (10-3 ,10 4, 10-5.....10-n).
6.3.10 Ordenar os frascos contendo as diluies, mantendo seqncia crescente das mesmas (da
menor para a maior diluio efetuada).
6.3.11 Agitar vigorosamente 25 vezes o frasco com a primeira diluio efetuada (10-1) e, com
uma pipeta estril de 5ml, inocular 1mL da diluio em cada um dos tubos de meio A-1 em
concentrao simples, correspondentes a essa diluio.
6.3.12 Proceder da mesma forma com a prxima diluio utilizando uma nova pipeta estril.

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Figura 3 Inoculao da amostra e volumes decimais

11

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6.3.13 Aps a inoculao de todos os volumes da amostra ou das diluies requeridas para o
ensaio, efetuar uma pr-incubao a 35C 0,5C de todos os tubos inoculados, durante 3 horas.
Aps esse perodo, transferir os tubos para um banho-maria ou incubadora a 44,5C 0,2C,
para a continuidade da incubao durante 21 2 horas.
6.3.14 Proceder leitura, considerando como resultado positivo para o teste, todos os tubos que
apresentarem formao de gs no tubo de Durham.
6.3.15 Com os dados obtidos, calcular o NMP de coliformes termotolerantes em 100mL da
amostra.
7 Resultados
7.1 Clculo do nmero mais provvel (NMP/100mL)
7.1.1 A densidade de coliformes termotolerantes expressa como NMP por 100mL, o qual
obtido atravs da Tabela 1, em que so dados os limites de confiana de 95% para cada valor de
NMP determinado.
7.1.2 A Tabela 1 apresenta o NMP para vrias combinaes de resultados positivos e negativos,
quando so inoculados 5 pores de 10mL, 5 pores de 1mL e 5 pores de 0,1mL da amostra.
Embora os volumes indicados se refiram mais especificamente a amostras de guas pouco
poludas, esta tabela tambm pode ser utilizada quando volumes maiores ou menores da amostra
so inoculados. Para sua utilizao, procuram-se os cdigos formados por trs algarismos
correspondentes ao nmero de tubos com resultado positivo em trs sries consecutivas
inoculadas.
7.1.3 Utilizao da Tabela 1
7.1.3.1 Quando so inoculadas apenas 3 sries de 5 tubos, sendo utilizados volumes indicados
na tabela (10mL, 1mL e 0,1mL): neste caso, o NMP obtido diretamente a partir da Tabela 1.
Para isto, procura-se o cdigo formado pelo nmero de tubos com resultados positivos obtidos
nas trs sries consecutivas inoculadas, verificando-se o NMP correspondente. Considerem-se os
exemplos que se seguem na Tabela 2, nos quais so apresentados os resultados positivos obtidos
em cada srie de 5 tubos inoculados.
7.1.3.2 Quando mais de 3 volumes decimais so inoculados: neste caso, para a composio do
cdigo, so utilizados apenas os resultados positivos correspondentes a trs sries consecutivas
inoculadas, sendo que o primeiro algarismo escolhido para compor o cdigo ser correspondente
srie de menor volume da amostra (maior diluio) em que todos os tubos apresentaram
resultados positivos, desde que tenham sido inoculadas diluies subsequentes para totalizar os
trs algarismos para o cdigo. Encontra-se o cdigo na Tabela 1, o NMP a ele correspondente, e
o valor final do NMP obtido atravs da aplicao da seguinte frmula:
10
Valor do NMP correspondente ao cdigo x
maior volume inoculado selecionado para compor o cdigo

Exemplos: Vide Tabela 3.

12

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Tabela 1 ndice de NMP e limites de confiana de 95%, quando so inoculadas pores de

10mL, 1mL e 0,1mL da amostra
Combinao de
NMP/100ml positivos

0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-1-1
0-2-0
0-2-1
0-3-0
1-0-0
1-0-1
1-0-2
1-1-0
1-1-1
1-1-2
1-2-0
1-2-1
1-3-0
1-3-1
1-4-0
2-0-0
2-0-1
2-0-2
2-1-0
2-1-1
2-1-2
2-2-0
2-2-1
2-2-2
2-3-0
2-3-1
2-4-0
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-4-0
3-4-1
3-5-0
4-0-0
4-0-1
4-0-2

< 1,8
1,8
1,8
3,6
3,7
5,5
5,6
2,0
4,0
6,0
4,0
6,1
8,1
6,1
8,2
8,3
10
10
4,5
6,8
9,1
6,8
9,2
12
9,3
12
14
12
14
15
7,8
11
13
11
14
17
14
17
20
17
21
24
21
24
25
13
17
21

Limites de Confiana 95%

Inferior

Superior

0,090
0,090
0,70
0,70
1,8
1,8
0,10
0,70
1,8
0,71
1,8
3,4
1,8
3,4
3,4
3,5
3,5
0,79
1,8
3,4
1,8
3,4
4,1
3,4
4,1
5,9
4,1
5,9
5,9
2,1
3,5
5,6
3,5
5,6
6,0
5,7
6,8
6,8
6,8
6,8
9,8
6,8
9,8
9,8
4,1
5,9
6,8

6,8
6,8
6,9
10
10
15
15
10
10
15
12
15
22
15
22
22
22
22
15
15
22
17
22
26
22
26
36
26
36
36
22
23
35
26
36
36
36
40
40
40
40
70
40
70
70
35
36
40

Combinao de
NMP/100mL positivos

4-0-3
4-1-0
4-1-1
4-1-2
4-1-3
4-2-0
4-2-1
4-2-2
4-2-3
4-3-0
4-3-1
4-3-2
4-4-0
4-4-1
4-4-2
4-5-0
4-5-1
5-0-0
5-0-1
5-0-2
5-0-3
5-1-0
5-1-1
5-1-2
5-1-3
5-2-0
5-2-1
5-2-2
5-2-3
5-2-4
5-3-0
5-3-1
5-3-2
5-3-3
5-3-4
5-4-0
5-4-1
5-4-2
5-4-3
5-4-4
5-4-5
5-5-0
5-5-1
5-5-2
5-5-3
5-5-4
5-5-5
-

13

25
17
21
26
31
22
26
32
38
27
33
39
34
40
47
41
48
23
31
43
58
33
46
63
84
49
70
94
120
150
79
110
140
170
210
130
170
220
280
350
430
240
350
540
920
1600
> 1600
-

Limites de Confiana 95%

Inferior

Superior

9,8
6,0
6,8
9,8
10
6,8
9,8
10
14
9,9
10
14
14
14
15
14
15
6,8
10
14
22
10
14
22
34
15
22
34
36
58
22
34
52
70
70
36
58
70
100
100
150
70
100
150
220
400
700
-

70
40
42
70
70
50
70
70
100
70
70
100
100
100
120
100
120
70
70
100
150
100
120
150
220
150
170
230
250
400
220
250
400
400
400
400
400
440
710
710
1100
710
1100
1700
2600
4600
-

CETESB / L5.406 / jun/07

Tabela 2 Exemplos de NMP de resultados positivos obtidos em cada srie de 5 tubos

inoculados
Exemplos

Nmero de tubos com resultados

Cdigo
positivos em cada srie de 5 tubos
(combinao
de resultados
inoculados com:
positivos e negativos)
10mL

1mL

0,1mL

5
4
5
0

2
2
5
0

0
0
1
1

1
2
3
4

NMP/100mL

520
420
551
001

49
22
350
1,8

Tabela 3 Exemplos onde so inoculados mais de trs volumes

Volumes
decimais
Exemplos Inoculados
(mL)

Nmero de tubos com resultados positivos

em cada srie de 5 tubos inoculados com:

10
mL

100
mL

10-1 10-2 10-3

mL mL mL

10-4 10-5
mL mL

Cdigo
NMP
Clculo do NMP/100mL
selecionado correspondente ao
NMP
cdigo

10-6
mL

531

110

110 x

10
1

1,1 x 103

521

70

70 x

10
0,1

7,0 x 103

10 a 10-5

520

49

49 x

10
0,001

4,9 x 105

10 a 10-6

500

23

23 x

10
0,001

2,3 x 105

10 - 10-2

10 a 10-4

Observao: nmeros grifados correspondem ao nmero de tubos positivos selecionados para compor o cdigo.

7.1.3.3 Casos especiais

a) Se menos que trs das diluies inoculadas apresentam resultados positivos, para a
composio do cdigo so selecionados os trs maiores volumes da amostra que incluem as
sries com resultados positivos (ver Exemplo1da Tabela 4);
b) Se diluies maiores que as escolhidas para compor o cdigo apresentarem tubos com
resultados positivos, o nmero correspondente a esses tubos adicionado ao nmero de tubos
positivos da diluio mais alta escolhido para compor o cdigo (ver Exemplo2 da Tabela 4);
c) Embora no deva haver nenhum resultado negativo nos volumes superiores a aqueles
selecionados para a formao do cdigo, se isto ocorrer, o cdigo dever ser formado
considerando-se o maior volume da amostra com resultados positivos nos cinco tubos,
seguido do nmero de tubos positivos correspondentes aos dois volumes decimais seguintes
(ver Exemplo3 da Tabela 4);

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CETESB / L5.406 / jun/07

Tabela 4 Exemplos onde so inoculados mais de trs volumes

Exemplos Volumes
decimais
Inoculado
s (mL)

Nmero de tubos com resultados positivos

em cada srie de 5 tubos inoculados com:

10
mL

100 10-1 10-2 10-3

mL mL mL mL

10-4
mL

Cdigo
selecionado

NMP
correspondente ao Clculo do NMP NMP 100mL
cdigo

10-5 10-6
mL mL

10
1

100 - 10-4

510

33

33 x

100 - 10-4

542

220

220x

10
1

10-1 - 10-4

540

130

130x

10
1

10 a 10-6

500

23

23 x

10
0,001

33

2,2 x 104

1,3 x 103

2,3 x 105

Observao: nmeros grifados correspondem ao nmero de tubos positivos selecionados para compor o cdigo.

7.2 Expresso dos resultados

Os resultados so expressos como NMP/100 ml de coliformes termotolerantes.
8 Determinao de coliformes termotolerantes em amostras slidas ou semi-slidas
8.1 Pesar 30g da amostra em um recipiente estril ou diretamente no copo estril de um
homogeneizador (blender).
8.2 Adicionar 270mL de gua de diluio estril.
8.3 Homogeneizar durante 1 a 2 minutos em velocidade baixa;
8.4 Inocular 10mL do homogeneizado em tubos contendo meio A1 concentrao dupla (diluio
100), e preparar as demais diluies decimais necessrias, que sero inoculadas em volumes de
1mL em tubos contendo meio A1 concentrao simples, e iro corresponder s diluies
10-1, 10-2, etc.5
8.5 Calcular o NMP conforme descrito para amostras de gua, a partir dos tubos positivos e
negativos, e multiplicando o resultado final por 10, devido diluio inicial da amostra de
resduo slido.
8.6 Expresso dos resultados
Os resultados so expressos em NMP/100g de coliformes termotolerantes.6
5
6

Esse procedimento deve ser realizado o mais rapidamente possvel para evitar a sedimentao do material homogenizado.
Quando so analisados lodos de esgoto (biosslidos), o nmero mais provvel deve ser expresso em NMP por 100g de peso seco

15

CETESB / L5.406 / jun/07

9 Referncias
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group. In: _____. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21st
ed. Washington DC: APHA, 2005. Section 9221.
ANDREWS, W.H.; PRESNELL, M.W. Rapid recovery of Escherichia coli from estuarine water.
Appl. Microbiol., v. 23, p. 521-523, 1972.
BORDNER, R.; WINTER, J. (Ed.). Microbiological methods for monitoring the
environment: water and wastes. Washington, DC: EPA, 1978. 338 p. (EPA/600/8-78-017).
BRASIL. Ministrio do Meio Ambiente. CONAMA. Resoluo n 357, de 17 maro de 2005.
Dispe sobre a classificao dos corpos de gua e diretrizes ambientais para o seu
enquadramento, bem como estabelece as condies e padres de lanamento de efluentes, e d
outras providncias. Dirio Oficial da Unio: Repblica Federativa do Brasil, Poder Executivo,
Braslia, DF, 18 mar. 2005. Seo 1.
Disponvel em:
<http://www.cetesb.sp.gov.br/licenciamentoo/legislacao/federal/resolucoes/2005_Res_CONAM
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CETESB (So Paulo). M1.001: lavagem, preparo e esterilizao de materiais em laboratrios de
microbiologia. So Paulo, 1986.
_____. L5.216: controle de qualidade de meios de cultura. So Paulo, 1987.
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LECLERC, H. et al. Advances in the bacteriology of the coliform group: their suitability as
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STANDRIDGE, J.H.; DELFINO, J.J. A-1 Medium: alternative technique for fecal coliform
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16