Tcnicas de anlise de DNA e RNA

Fundamento e aplicao das tcnicas de anlise de DNA

Extraco, purificao, quantificao e deteco de cidos nucleicos
Electroforese convencional em gel de agarose
Electroforese em gel de campo pulsado (PFGE)
Hibridao Southern, hibridao dot-blot e hibridao in situ
Sequenciao de DNA
Footprinting de DNA
Retardao em gel
Mutagnese de DNA

Extraco, purificao, quantificao e deteco de cidos nucleicos

Extraco e purificao de cidos nucleicos Utilizao de Kits comerciais
Quantificao de cidos nucleicos
Mtodo espectrofotomtrico (A concentrao de DNA medida pela absoro a 260 nm, sendo
uma absorvncia de 1,0 equivalente a 50 g/ml de DNA de cadeia dupla.)
Mtodo baseado na fluorescncia do brometo de etdio (Comparao com a fluorescncia de
amostras de DNA de concentrao conhecida.)

Deteco de cidos nucleicos

Colorao com brometo de etdio
Colorao com nitrato de prata
Mtodos de deteco no radioactivos na hibridao de cidos nucleicos
Marcao das sondas in vitro com:
Corantes fluorescentes ou fluorforos (fluorescena e rodamina)
Biotina ou digoxigenina (atravs de ligandos de afinidade avidina, estreptavidina ou
anticorpo anti-digoxigenina - acoplados a uma enzima de sinalizao que converte os
substratos em produtos corados ou quimioluminescentes)
Enzimas (fosfatase alcalina AP ou peroxidase de rbano silvestre HRP)

Mtodos de deteco radioactivos na hibridao de cidos nucleicos

Marcao das sondas in vitro com 32P
Marcao interna (Nick translation, Random primers, PCR)
Marcao terminal 5ou 3

Electroforese em gel convencional (1)

Electroforese em gel convencional (2)

A tcnica de electroforese em gel permite a separao de fragmentos de DNA de
dimenses diferentes
A matriz de gel (ovais laranja) consiste em longas cadeias de polmeros, entrelaadas. A
dimenso das cadeias interligadas, ou poros, depende da concentrao de agarose ou de
acrilamida utilizada no gel.

Os poros nos gis de agarose so maiores do que nos gis de acrilamida. Os primeiros
so utilizados para separar fragmentos grandes de DNA (500 pb a 20 kb) e os ltimos para
separar fragmentos pequenos de DNA (1 nucletido a 2 kb).

Sob a aco da corrente elctrica que passa atravs do gel os fragmentos so separados,
movendo-se para o plo positivo a uma taxa inversamente proporcional ao logaritmo da
sua dimenso, formando bandas que so visualizadas por auto-radiografia (fragmentos
radioactivos) ou pela adio de um corante fluorescente, como por exemplo o brometo de
etdio.

Os gis de agarose so horizontais, mas os de acrilamida so verticais (preparados entre

duas placas de vidro com um afastamento de alguns milmetros apenas) porque o oxignio do
ar inibe a polimerizao da acrilamida.

Electroforese em gel de campo pulsado (PFGE) (1)

A tcnica de electroforese em gel de campo pulsado PFGE utilizada para separar cromossomas
diferentes, como por exemplo de Saccharomyces cerevisiae, cujas dimenses variam entre 220 000 a
2,5 milhes de pares de nucletidos, ou molculas de DNA com 107 pares de nucletidos. O DNA
corado com brometo de etdio.

Electroforese em gel de campo pulsado (PFGE) (2)

Definio das condies: N de fases; durao dos pulsos; durao de cada fase; amperagem.
Exemplo: Fase 1; pulso 1 segundo; durao da fase 36 minutos; 180 mA
Fase 2; pulso 2 segundos; durao da fase 36 minutos; 180 mA

Hibridao Southern e hibridao Northern (1)

As tcnicas de hibridao Southern e hibridao Northern

permitem, respectivamente, a deteco de DNAs ou de RNAs
especficos por hibridao com sondas apropriadas, de DNA e
RNA.
Neste exemplo, a sonda de DNA detectada pela sua
radioactividade, mas as sondas tambm podem ser detectadas por
mtodos no radioactivos.

Hibridao Southern e hibridao Northern (2)

Estas tcnicas envolvem as seguintes etapas:
(A) Misturas de molculas de RNA de cadeia simples (Hibridao Northern) ou de molculas
de DNA de cadeia dupla obtidas por digesto com enzimas de restrio (Hibridao Southern)
so separadas por electroforese com base na dimenso.
(B) As molculas de RNA ou os fragmentos de DNA desnaturados por exposio do DNA a
condies alcalinas desnaturantes, so transferidos para membranas de nitrocelulose ou de
nylon.
(C) A membrana, contendo os cidos nucleicos ligados, cuidadosamente removida do gel.
(D) A membrana depois colocada num saco de plstico selado ou numa garrafa de hibridao,
juntamente com a soluo de hibridao (uma soluo salina tamponada) e a sonda de DNA ou
de RNA, radioactivamente marcada e na forma de cadeia simples, por um perodo de tempo
prolongado em condies que favorecem a hibridao.
(E) A membrana em seguida removida do saco ou da garrafa de hibridao e lavada
vigorosamente, de modo que apenas as molculas de sonda que hibridaram com o RNA ou o
DNA imobilizado na membrana permanecem ligadas. Aps auto-radiografia, o DNA ou o
RNA que hibridou com a sonda marcada visualizado como uma banda.

Hibridao dot-blot

Estratgias de sequenciao shotgun do genoma humano

A sequenciao shotgun significa que o DNA genmico original aleatoriamente clivado em pequenos fragmentos.

Digesto parcial
Clonagem em vectores BAC

Sonicao e reparao das

extremidades dos fragmentos

Clonagem
Vector M13 ou
Fagemdio

Estratgia da empresa pblica

Estratgia da empresa privada

Celera

Sequenciao de insertos grandes

Pesquisa de regies codificantes numa sequncia de DNA (1)

Pesquisa de regies codificantes numa sequncia de DNA (2)

(A) Qualquer regio da sequncia de DNA, em princpio, codifica seis sequncias diferentes de
aminocidos, porque as trs grelhas diferentes de leitura so utilizadas para interpretar a sequncia
de nucletidos em cada cadeia.
A sequncia de nucletidos sempre lida na direco 53 da cadeia e codifica um
polipptido a partir da extremidade amnica (N) para a extremidade carboxlica (C).
Na leitura de uma sequncia nucleotdica aleatria numa grelha particular encontrado, em
mdia, um sinal de paragem da sntese proteica em 21 aminocidos (um em 63 nucletidos).
Na sequncia de 48 pb, os codes stop esto representados a verde, e apenas a grelha de leitura
2 no tem codo stop.
(B) Pesquisa na sequncia de DNA de 1700 pb de uma possvel sequncia codificante de uma
protena. A informao est apresentada como em (A), com cada codo stop representado a verde.
Todas as regies entre possveis codes de iniciao e terminao da sntese proteica esto
representadas como barras vermelhas. Apenas a grelha de leitura 1 codifica realmente uma protena,
de 475 aminocidos.

Aplicaes da sequenciao de genomas

Tcnica de footprinting de DNA (1)

Esta tcnica permite detectar interaces DNA-protena

Figure 8-54. 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.

Tcnica de footprinting de DNA (2)

(A) A tcnica de footprinting de DNA requer uma molcula de DNA previamente marcada numa
das extremidades.
A protena representada na figura tem uma ligao forte com sete nucletidos da sequncia de
DNA especfica, protegendo esses nucletidos do agente de clivagem, a enzima DNase I.
Na reaco paralela de clivagem com DNase I realizada sem a protena de ligao a DNA,
visualizado no gel de acrilamida desnaturante o conjunto completo de bandas (no est
representado).
Os resultados so analisados, em paralelo, com as quatro reaces de sequenciao pelo
mtodo de Sanger do fragmento em estudo, o que permite determinar a sequncia de DNA
reconhecida pela protena. A identificao dos nucletidos envolvidos na interaco com a
proteina obtida por mutagnese in vitro.
(B) O footprint foi realizado para determinar o local de ligao de uma protena humana que
estimula a transcrio de genes eucariticos especficos. Estes resultados indicaram que o local de
ligao se situa a cerca de 60 nucletidos a montante do local de incio da transcrio.

Retardao em gel (1)

Esta tcnica permite detectar interaces DNA-protena

Retardao em gel (2)

Este mtodo permite determinar, aps sequenciao, a sequncia de DNA reconhecida por
uma protena reguladora de um gene. A identificao dos nucletidos envolvidos na
interaco com a protena obtida por mutagnese in vitro.
A protena relevante purificada e misturada com milhes de diferentes fragmentos curtos de
DNA, cada um com uma sequncia diferente de nucletidos. Um conjunto destes fragmentos pode
ser produzido programando um sintetizador de DNA, aparelho que sintetiza quimicamente DNA
com a sequncia pretendida. Por exemplo, h 411, ou aproximadamente 42 milhes de sequncias
possveis para um fragmento de DNA de 11 nucletidos.
Os fragmentos de DNA de cadeia dupla que se ligam fortemente protena reguladora do gene
so depois separados dos fragmentos de DNA que no se ligam por retardao em gel.
Aps separao dos complexos protena-DNA do DNA livre, os fragmentos de DNA so
removidos da protena, e so realizados vrios ciclos adicionais do mesmo processo de seleco. As
sequncias de nucletidos dos fragmentos de DNA que permanecem atravs de mltiplos ciclos de
seleco so determinadas, e uma sequncia consenso de DNA reconhecida pela protena pode ser
obtida.

Retardao em gel (3)

Esta tcnica tem diferentes designaes: Electroforetic mobility shift assay (EMSA); Gelshift; Gel
retardation; Bandshift assay.
Figure 7-29. 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.

Retardao em gel (4)

O fundamento da tcnica de retardao em gel est esquematizado em (A).
Neste exemplo, o extracto proteico de uma linha celular produtora de anticorpo misturado com o
fragmento de DNA radioactivo contendo cerca de 160 nucletidos da sequncia de DNA reguladora
do gene que codifica a cadeia leve do anticorpo produzido pela linha celular.
O efeito das protenas do extracto na mobilidade do fragmento de DNA analisado por
electroforese em gel de poliacrilamida, seguida de auto-radiografia, comparando com a mobilidade do
fragmento de DNA sem adio do extracto.
Os fragmentos de DNA livres migram rapidamente para o fundo do gel, enquanto os
fragmentos ligados a protenas so retardados; as seis bandas retardadas sugerem que o extracto
contm seis protenas diferentes de ligao a sequncias especficas de DNA (C1 a C6), que se ligam
a este fragmento. (Para simplificar, os fragmentos de DNA com mais de uma protena ligada foram
omitidos da figura).
Em (B), o extracto foi fraccionado por uma tcnica padro de cromatografia (em cima), e cada
fraco foi misturada com o fragmento de DNA radioactivo, aplicada num poo do gel de
poliacrilamida e analisada como em (A).

Purificao de protenas de ligao a DNA por cromatografia de afinidade (1)

Figure 7-30. 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.

Purificao de protenas de ligao a DNA por cromatografia de afinidade (2)

Na etapa 1, as protenas de ligao a DNA so separadas das restantes protenas celulares numa coluna
com diferentes sequncias de DNA.
A fraca afinidade por DNA no especfico resulta de atraces inicas, sendo as protenas removidas
por uma soluo com uma concentrao moderada de sal.
Na etapa 2, a coluna contm apenas uma sequncia particular de DNA, e as protenas retidas devido a
interaces no especficas so eludas por solues de concentrao moderada de sal, deixando na
coluna as protenas (em geral uma) fortemente ligadas sequncia de DNA. Estas protenas so eludas
da coluna por solues contendo uma concentrao muito elevada de sal.
Um mtodo alternativo de purificao de uma protena de ligao a DNA consiste na triagem de
uma biblioteca de cDNA com uma sonda de DNA que contm o local de ligao protena.

Mutagnese stio-especfica com primer mutagnico

Apesar da falta de complementaridade dos nucletidos internos, o emparelhamento do primer

mutagnico possvel, sendo a segunda cadeia sintetizada pela polimerase de DNA, e as suas
extremidades ligadas pela ligase de DNA.
Os homodplices so identificados por hibridao molecular, utilizando o primer mutagnico como sonda
oligonucleotdica alelo-especfica, ou por PCR alelo-especfico.

Mutagnese stio-dirigida por PCR

Deve ser utilizada uma
polimerase termoestvel
com
capacidade
de
reviso de provas para
minimizar eventuais erros.

O DNA molde, isolado

de estirpes dam+,
metilado e susceptvel
digesto com DpnI, uma
endonuclease especfica
de DNA metilado e
hemimetilado.

Fundamento e aplicao das tcnicas de anlise de RNA

Hibridao Northern
Mapeamento de extremidades 5 e 3 do mRNA com nuclease S1
Mapeamento de extremidades 5 do mRNA por extenso do primer
Microarrays de DNA

Hibridao Northern
A hibridao Northern permite:

Detectar a presena de mRNA

especfico

Estimar a dimenso do mRNA,

relativamente a RNAs marcadores

Estimar a quantidade relativa do

mRNA (por comparao do sinal
de hibridao com o de outros
genes que so expressos em nveis
conhecidos).

Para alm da hibridao Northern, as tcnicas de RT-PCR e

hibridao in situ permitem analisar em que tecidos ou
condies experimentais os genes se expressam.

Detectar a presena de transcritos

diferentes de um gene especfico
(splicing alternativo, promotores
alternativos).

Mapeamento de extremidades 5 do mRNA

Tcnica de proteco da nuclease S1

Tcnica de extenso do primer

A extremidade 5 do mRNA corresponde ao local de incio da transcrio.

Anlise da expresso gnica com microarrays de DNA (1)

Perfect match
Mismatch

Cada spot contm 106-109 cpias da mesma

sequncia de cDNA de vrias centenas de
pares de bases.

Cada gene est representado por 20 pares de

oligonucletidos (PM e MM) diferentes de
cadeia simples com 20-25 nt.

Anlise da expresso gnica com microarrays de DNA (2)

cDNA marcado

Transcritase reversa
cDNA

cDNA marcado

Avidina conjugada
com um fluorforo

Nvel de expresso
X - elevado em 1
Y elevado em 2

Z idntico em 1 e 2

Anlise da expresso gnica com microarrays de DNA (3)

Os oligos MM contm uma nica base mismatch e servem para controlar a hibridao inespecfica.
O controlo positivo o gene da actina, gene expresso constitutivamente.
O controlo negativo includo nos microarrays de cDNA serve para normalizar o background ou
hibridao no especfica.
Para determinar o sinal de um gene particular, os sinais dos 20 oligos PM so somados e os sinais
dos 20 oligos MM so subtrados do total.
Em (C) um dos nucletidos est conjugado com um fluorforo.
X representa genes hipotticos presentes em nveis elevados na amostra 1; Y nveis elevados na
amostra 2; Z nveis idnticos nas amostras 1 e 2.
Para este tipo de anlise da expresso baseada na hibridao multiplex muitas empresas
comercializam (A), mas (B) comercializado como GeneChips apenas pela Companhia de
Biotecnologia US Affymetrix Inc..