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Mudana de pH

O pH mede a concentrao do on de hidrognio. A mudana de


pH pode alterar a carga lquida das molculas, como protena ou
DNA, causando uma migrao mais demorada (ou mais rpida).
Isso porque essas molculas tm partes bsicas que aceitam ons
de hidrognio (prtons) e muitas partes cidas que podem doar
prtons. Quando um cido doa um prton, ele torna-se carregado
negativamente; quando uma base aceita um prton, pelo
contrrio, ela fica carregada positivamente. medida que a
concentrao de ons de hidrognio na soluo aumenta,
protenas e DNA tornam-se menos carregados negativamente (ou
mais carregados positivamente). O pH no qual uma molcula,
como a protena, no tem carga chamado de ponto isoeltrico.
Tampes estabilizam o pH no gel em um nvel em que o DNA ir
estar carregado negativamente e ir migrar como desejado.
Corrente
O gel de eletroforese funciona aplicando-se uma corrente eltrica
placa de gel submergida no tampo. As molculas de DNA so
carregadas negativamente, e as protenas podem ser carregadas
negativamente desnaturando-as primeiro e depois tratando-as
com dodecil sulfato de sdio (SDS). As protenas ou molculas de
DNA migram do ctodo carregado negativamente para o nodo
carregado positivamente. A gua, no entanto, um veculo
bastante pobre em corrente - s carrega corrente de modo eficaz
quando se dissolve substncias nela, j que ons carregados se
movem em um campo eltrico. A soluo tampo tem uma maior
concentrao de ons (maior fora inica), de maneira
queconsegue carregar muito mais corrente que a gua pura.
Gel de empilhamento
Tampes desempenham um papel ainda mais complexo em uma
espcie de eletroforese chamada SDS-PAGE, ou dodecil sulfato de
sdio, eletroforese em gel de poliacrilamida. Essa uma das
tcnicas mais comuns para anlise de protena. Elas so
desnaturadas portratamento no calor e depois revestidas com
dodecil sulfato de sdio, e s depois adicionadas ao gel, que
geralmente corre verticalmente. O gel tem duas regies, a de
empilhamento (na parte superior) e a de correr por baixo. O gel de
empilhamento preparado com um tampo diferente de modo
que o seu pH mais baixo do que o do gel de correr, alm disso,
ele tem uma fora inica menor. Esses dois fatores causam o
empilhamento da protena, assim ela entra toda no gel de correr
ao mesmo tempo. Esse efeito ajuda a garantir a separao das
protenas no gel de acordo com seu tamanho.
Tampo Eletroforese em gel de DNA
Os dois tampes mais comuns para eletroforese em gel de DNA
so tris-acetato EDTA e tris-borato EDTA, onde o EDTA significa
cido etilenodiaminotetractico. Ele importante porque serve
como quelante dos ons de magnsio, retirando-os da soluo.
Esses ons so cofatores essenciais para enzimas chamadas
DNAses que quebram o DNA, assim o EDTA no tampo funciona
como uma precauo extra para prevenir quaisquer problemas com
as DNAses.