Food Sci. Technol (Campinas) vol.34 no.1 Campinas Jan./Mar.

2014
Epub 25 de março de 2014

http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20612014005000012

Atividades antioxidantes do kombucha preparadas a

partir de três substratos diferentes e alterações no
conteúdo de probióticos durante o armazenamento
*
Caili Fu; Fen Yan; Zeli Cao; Fanying Xie; Juan Lin

Faculdade de Biociências e Biotecnologia, Fuzhou University, Fuzhou, Fuzhou,

China, e-mail: ljuan@fzu.edu.cn

ABSTRATO

Kombucha é uma bebida fermentada que promove a saúde em todo o mundo. O

presente estudo comparou as habilidades de eliminação de radicais livres e o poder
de redução total (TRP) de kombucha preparado a partir de chá verde de baixo custo
(LGTK), chá preto (BTK) e chá em pó (TPK). LGTK apresentou as maiores
habilidades de eliminação contra 2,2-difenil-1-picrilidrazilo (DPPH), anião
superóxido e radicais hidroxilo, enquanto a BTK mostrou o TRP mais alto. Mudanças
no conteúdo de probióticos em LGTK também foram investigadas durante o
armazenamento. O número de bactérias do ácido acético diminuiu moderadamente
até 10 dias de armazenamento. O número de bactérias do ácido lático (LAB)
diminuiu significativamente, e sua taxa de sobrevivência foi de apenas 0,98% no 8º
dia de armazenamento.

Palavras-chave: kombucha; atividades antioxidantes; probióticos;

armazenamento.

1. Introdução

Kombucha, uma bebida popular consumida em todo o mundo como uma bebida
medicinais que promove a saúde, é tipicamente feita pela fermentação de chá
açucarado com uma simbiose de espécies de leveduras, fungos e bactérias de ácido
acético à temperatura ambiente por cerca de 7 a 14 dias. Esta bebida é composta
por alguns probióticos, como bactérias de ácido acético e bactérias de ácido lático,
além de polifenóis de chá, açúcares, ácidos orgânicos, etanol, vitaminas solúveis
em água e uma variedade de micronutrientes produzidos durante a fermentação
(Chen & Liu, 2000; Greenwalt et al., 2000; Malbasa et al., 2008). As principais
espécies de bactérias de ácido acético encontradas em kombucha foram
identificadas como Acetobacter xylinoides, A. pasteurianus, A.xylinum, A. aceti e
Bacterium gluconicum . Enquanto as espécies de leveduras isoladas de kombucha
incluíam principalmente Brettanomyces bruxellensis, B. lambicus, B. custersii,
Kloeckera apiculata, Saccharomycodes ludwigii, Schizosaccharomyces pombe,
Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii, Candida e espécies de Pichia
(Chen & Liu, 2000; Greenwalt et al. 2000, Malbasa et al., 2008, Chu & Chen, 2006,
Malbasa et al., 2011). Estudos anteriores de nosso laboratório mostraram que o
kombucha preparado por fermentação em cultura mista com cepas puras
apresentou um sabor distinto e um curto período de fermentação (Ma et al., 2008;
Xie, 2011). Numerosos benefícios para a saúde foram atribuídos ao consumo desta
bebida, incluindo: estimula o sistema imunológico, ajuda a digestão, protege contra
câncer e doenças cardiovasculares, previne infecções microbianas; Também é
conhecida por suas propriedades hipoglicêmicas e anti-lipidêmicas, atividades de
eliminação de radicais livres, entre outras (Chen & Liu, 2000; Greenwalt et al.,
2000; Malbasa et al., 2008; Chu & Chen, 2006; Malbasa et al., 2011; Aloulou et al.,
2012; Ilicic et al., 2012; Yang et al., 2009; Greenwalt et al., 1998).

Além dos efeitos favoráveis à saúde, as mudanças nos componentes químicos e

microbianos e as bio-atividades durante a fermentação do fungo pelo chá também
foram amplamente investigadas pelos pesquisadores. Chen & Liu encontraram
mudanças em componentes principais e micróbios em kombucha preparados a
partir de nove fontes diferentes durante uma fermentação prolongada de até 60
dias (Chen & Liu, 2000). Jayabalan e seu parceiro relataram mudanças no conteúdo
de ácidos orgânicos e polifenóis de chá, pH, proteína e conteúdo microbiano em
kombucha, preparados a partir de chá verde, chá preto e fabricação de tecidos
durante a fermentação com fungo de chá (Jayabalan et al., 2007). Verificou-se que
a concentração de ácido acético atingiu o máximo no 15º dia (kombucha de chá
verde), enquanto a concentração de ácido glucurônico atingiu o máximo no 12º dia
(chá preto kombucha) de fermentação, respectivamente. Em um estudo posterior,
esses autores também analisaram as mudanças na capacidade de eliminação de
radicais livres de kombucha durante a fermentação (Jayabalan et al., 2008a). Além
disso, há um relatório interessante de que as bactérias de ácido lático obtidas a
partir de kefir podem aumentar a produtividade de bactérias em kombucha para
obter de alta eficácia a lactose de ácido d-sacárico 1, 4 (Yang et al., 2010). No
entanto, a pesquisa sobre as mudanças no conteúdo de probióticos durante o
armazenamento de kombucha é rara.

O presente estudo tem como objetivo comparar as habilidades de eliminação contra

2,2-difenil-1-picrilididazol (DPPH), aniões superóxido e radical hidroxilo, e o poder
de redução total de kombucha preparado a partir de chá verde de baixo custo
(LGTK), chá preto (BTK ) e chá em pó (TPK), além de investigar as mudanças no
conteúdo de probióticos no LGTK durante o armazenamento.

2. Materiais e métodos

2.1 Preparação de chá fermentado

Kombucha foi preparado usando chá verde de baixo custo, chá preto e chá
comprado na Damin Food (zhangzhou) Co., Ltd. (Fujian, China). Resumidamente,
3,0 g de chá preto, chá verde de baixo custo e chá em pó, respectivamente, foram
mergulhados em 400 mL de água fervente e durante 20 min. As infusões foram
então filtradas usando papel de filtro e a sacarose (5%) foi subsequentemente
dissolvida no filtrado transparente resultante. Posteriormente, 200 mL de filtrados
de chá açucarado foram vertidos em um balão Erlenmeyer de 500 mL, seguido de
esterilização a 115 ºC durante 15 min. Após o arrefecimento até à temperatura
ambiente, o frasco Erlenmeyer foi inoculado com 5% de cultura, obtido a partir da
coleção de cultura de College of Bioscience & Biotechnology, Fuzhou University, que
era composta de Saccharomyces cerevisiae Meyen ex Hansen (10 8 CFU / mL) ,
Gluconacetobacter sp . (10 8 UFC / mL e Lactobacillus plantarum (10 8 CFU / mL),
com proporção de 1: 1: 1 e relatadas como estirpes ótimas para a fermentação de
kombucha (Ma et al., 2008; Xie, 2011). O frasco Erlenmeyer foi cuidadosamente
coberto e a fermentação foi realizada a 30 ºC com agitação (100 rpm) durante 90
h. O chá fermentado foi centrifugado a 10 000 rpm durante 10 min e a atividade
antioxidante foi determinada (Marques et al., 2012; Vissotto et al., 2013; Li et al.,
2012). Todas as análises foram realizadas em duplicado.

2.2 2.2 2.2-radicais de difenil-1-picrilidrazilo (DPPH)

A capacidade de eliminação de radicais livres de 2,2-difenil-1-picrilidrazilo (DPPH)

de kombucha preparada a partir de chá verde de baixo custo (LGTK), chá preto
(BTK) e chá em pó (TPK) foi medida de acordo com o método descrito por Marques
com algumas modificações (Marques et al., 2012). Foram misturados 2 mL de
amostras de kombucha diluídas de 160 vezes com 2 mL de solução metanólica
DPPH 0,1 mmol / L. A mistura foi agitada vigorosamente e deixada em repouso no
escuro durante 20 min, após o que a absorvância foi medida a 517 nm utilizando
um espectrofotómetro.

2.3 Actividade de eliminação de radicais hidroxilo

Resumidamente, 1 mL de solução de 0,75 mmol / L 1, 10-fenantrolina, 2 mL de

solução salina de tampão de fosfato (0,15 mol / L, pH = 7,49) e 1 mL de soluções
de amostra de kombucha com diferentes dobras diluídas (20 dobras para LGTK,
Foram adicionadas 5 dobras para BTK e 10 dobras para TPK, respectivamente) nos
tubos de ensaio. Uma alíquota de 1 mL de solução de FeSO4 a 0,75 mmol / L foi
então pipetada para dentro da mistura. A reacção foi iniciada pela adição de 1,0 mL
de solução de H2O2 a 0,01%. Após incubação a 37 ºC em banho-maria durante 60
min, a absorvância da mistura de reação foi medida a 536 nm contra o adesivo
branco (Vissotto et al., 2013).

2.4 Superóxido radical-eliminando a atividade

A atividade de eliminação do radical superóxido foi medida a 25 ºC como descrito

anteriormente (Li et al., 2012). Uma alíquota de 24 μL de solução de pirogalol de
25 mmol / L foi adicionada a um tubo contendo 100 μL de amostras de kombucha e
4,50 mL de tampão Tris-HCl-EDTA (0,05 M, pH 8,20). A densidade óptica (OD) foi
medida a 325 nm por 30 minutos cada 30s contra uma peça em branco usando um
espectrofotômetro.

2.5 Potência total redutora

O poder de redução total foi medido de acordo com o método descrito por Yen &
Chen (1995). Resumidamente, misturaram-se 2,0 mL da solução de amostra com
diferentes dobras diluídas (100 dobras para LGTK, 10 vezes para BTK e 100 vezes
para TPK) com 2,0 mL de tampão de fosfato (0,2 M, pH 6,60) e 2,0 mL de 1% K 3
Fe (CN) 6 . A mistura foi incubada a 50 ºC durante 20 minutos, após o que foram
adicionados 2,0 mL de ácido tricloroacético a 10% (TCA) à mistura e centrifugados
a 4000 rpm durante 10 min; 2 mL de sobrenadante foi então misturado com água
destilada (2,0 mL) e FeCl3 (0,4 mL, 0,1%) e a absorvância foi medida a 700 nm.

2.6 Método de contagem de placas

Para enumerar os probióticos, o Kombucha diluído (200 uL) preparado a partir de

chá verde de baixo custo (LGTK) foi espalhado na superfície das placas contendo o
microorganismo apropriado (Ma et al., 2008; Xie, 2011; Amoa-Awua et al., 2007;
Vasek et al., 2013). Todas as análises foram realizadas em duplicado. As placas
foram posteriormente incubadas a 30 ºC por 36-48 h. As colônias que cresceram
foram contadas. As leveduras foram enumeradas em Agar de extrato de levedura
contendo 100 mg L -1 de oxitetraciclina, extracto de levedura de 10 g L -1 (Sangon
Biotech (Xangai), Ltd, Xangai, China), 10 g L -1 peptona, 20 g L -1 de glicose, e 20 g
de L -1 agar (Sangon Biotech (Shanghai), Ltd, Xangai, China) em 100 mL de água
destilada. As bactérias do ácido acético foram enumeradas num meio contendo 200
U mL -1 de nistatina, 10 g L -1 de extracto de levedura (Sangon Biotech (Shanghai),
Ltd, Xangai, China), 10 g L -1 de glucose, 3% de etanol absoluto, 20 g L -1 CaCO 3 e
20 g L -1 agar (Sangon Biotech (Shanghai), Ltd, Xangai, China) em 100 mL de água
destilada. As bactérias do ácido lático foram enumeradas em meio MRS contendo
200 U mL -1 de nistatina, 10 g L -1 de extrato de carne (Sangon Biotech (Shanghai),
Ltd, Xangai, China), 5 g L -1 de extracto de levedura (Sangon Biotech (Shanghai) ,
Ltd, Xangai, China), 10 g L -1 peptona, 20 g L -1 glicose, 5 g L -1 NaOAc, 2 g L -1
hidrogenocitrato de amónio, 0,1% Tween-80, 2 g L -1 MgSO4 · 7H 2 O, 0,05 g L -1
MnSO 4 4H 2 O e 2 g L -1 K 2 HPO 4 e 20 g L -1 agar (Sangon Biotech (Shanghai),
Ltd, Xangai, China) em 100 mL destilado agua.

2.7 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± DP. A significância das diferenças foi
determinada usando o teste de múltiplas áreas do Duncan, e o software informático
utilizado para este estudo foi o Statistical Product and Service Solutions (SPSS),
versão 17.0, da International Business Machines Corporation.

3 Resultados e discussão

A fim de demonstrar a atividade antioxidante do kombucha preparada a partir de

chá verde de baixo custo (LGTK), chá preto (BTK) e chá em pó (TPK), ensaios de
eliminação contra 2,2-difenil-1-picrilidrazilo (DPPH), superóxido anião e radicais
hidroxilo foram utilizados para avaliar mudanças de habilidades de eliminação de
radicais livres e o poder de redução total. Todas as análises foram realizadas em
duplicado depois que os chás açucarados foram fermentados durante 90 h seguido
de centrifugação a 10 000 rpm durante 10 min. LGTK teve a maior capacidade de
eliminação contra DPPH, aniões superóxido e radical hidroxilo, enquanto a BTK
apresentou a maior potência redutora. Os valores de atividade de eliminação de
radicais livres encontrados são mostrados na Figura 1 .

As habilidades de eliminação de radicais hidroxilo e DPPH foram em ordem

decrescente: LGTK> TPK> BTK. A taxa de eliminação DPPH da LGTK atingiu
95,30%. O TPK apresentou a menor taxa de eliminação de aniões superóxido
(3,8%), enquanto a BTK apresentou a menor taxa de eliminação de DPPH, com o
valor de 38,7%. Em consonância com os nossos resultados, Chu e Chen
descobriram que as atividades de eliminação radical de DPPH de oito BTK variaram
de 30% a 50% ao investigar os efeitos de origem e tempo de fermentação nas
atividades antioxidantes de BTK (Chu & Chen, 2006). A taxa de eliminação de DPPH
de BTK aumentou para cerca de 70% após fermentação durante 15 dias (Chu &
Chen, 2006). Entre as amostras de kombucha preparadas a partir de chá verde,
chá preto e fabricação de tecidos analisados, o chá verde Kombucha apresentou
maior capacidade de eliminação de DPPH (88%) no 18º dia de fermentação
(Jayabalan et al., 2008b). O efeito do tempo de fermentação em propriedades
sensoriais e bioativas deve ser levado em consideração ao preparar o kombucha.
Além disso, as atividades de eliminação de radicais livres, o poder de redução total
de LGTK, BTK e TPK foram determinados de acordo com o método descrito por Yen
& Chen (1995). O BTK apresentou o maior poder de redução total, como
evidenciado por uma absorvência de 0,613 a 700 nm, seguido de LGTK e TPK
(absorvência a 700 nm: 0,304 e 0,1111, respectivamente). Em um estudo sobre a
preservação do efeito de chá kombucha, Jayabalan et al. descobriram que o
tratamento térmico a 60, 65 e 68 ºC durante 1 min levou a uma diminuição dos
polifenóis do chá e propriedades de eliminação de radicais livres durante o
armazenamento. Foi assim sugerido que o tratamento térmico não era um método
adequado para a preservação de kombucha (Jayabalan et al., 2008a).

Para testar as alterações microbiológicas no kombucha de chá verde de baixo custo

(LGTK) durante o armazenamento, as amostras do LGTK foram colocadas na
geladeira a 4 ºC. O conteúdo de fermento, bactérias do ácido acético (AAB),
bactérias do ácido lático (LAB) e bactérias totais (TB) foram determinados a cada 2
dias usando o método de contagem de placas (Ma et al., 2008; Xie, 2011; Amoa-
Awua et al., 2007; Vasek et al., 2013). O meio de bactéria equivoluminal substituiu
o kombucha na amostra de controle. Após 90 horas de fermentação, o número de
fermento, AAB, LAB e TB no chá de chá verde de baixo custo produzido foi de 1,45
× 10 7 , 1,0 × 10 7 , 2,8 × 10 5 e 2,49 × 10 7 CFU / mL , respectivamente. As
alterações microbianas durante o período de armazenamento de 14 dias são
mostradas na Figura 2 . No geral, o número de AAB diminuiu moderadamente de
9,3 × 10 6 CFU / mL no primeiro dia para 3,4 × 10 6 CFU / mL no 14º dia. A
quantidade de fermento diminuiu ligeiramente nos primeiros dias, seguida de uma
diminuição rápida após 10 dias de armazenamento. A taxa de sobrevivência de
levedura e AAB no 10º dia foi de 73,97% e 54,09%, respectivamente. Em
contraste, a quantidade de LAB diminuiu significativamente após 2 dias de
armazenamento. O número de LAB foi de 2,7 × 10 3 CFU / mL no 8º dia,
correspondendo a uma taxa de sobrevivência de 0,98%. Em um estudo sobre a
viabilidade de dois LABs em iogurte armazenado a 5 ºC a valores de pH mais baixos
(3,5), a diminuição na contagem celular de L. acidophilus foi de 2,5 pedidos de log
após 1 semana, o que é significativamente maior que o de valores de pH mais
elevados (pH 4,5, 5,5 e 6,5) (Vinderola et al., 2000). O baixo valor de pH (3.15) do
LGTK pode ser devido à diminuição rápida do LAB em kombucha. Além disso, foi
relatado que o fermento aumentou a viabilidade de L. rhamnosus a 30 ºC, mas não
a 12 ºC (Suharja et al., 2012). A baixa temperatura (4 ºC) utilizada no presente
estudo pode ter reduzido o efeito de melhoria de viabilidade da levedura contra
LAB.
4. Conclusões

O presente estudo comparou as habilidades de eliminação contra 2,2-difenil-1-

picrilidrazilo (DPPH), aniões superóxido e radical hidroxilo, bem como o poder de
redução total de kombucha preparado a partir de chá verde de baixo custo (LGTK),
chá preto (BTK) e chá em pó (TPK). As habilidades de eliminação de radicais
hidroxilo e DPPH foram em ordem decrescente: LGTK> TPK> BTK. A produção de
kombucha antioxidante por uma fermentação rápida de chá verde de baixo custo
pode ser ideal e econômica. Ao armazenar Kombucha de chá verde de baixo custo
(LGTK) sob refrigeração a 4 ºC, o número de bactérias do ácido acético diminuiu
moderadamente, enquanto o número de bactérias do ácido lático diminuiu
significativamente durante o armazenamento de 14 dias. Um estudo sobre o
aumento das bactérias do ácido lático no LGTK durante o armazenamento está
sendo realizado para produzir LGTK como um produto multifuncional.

Reconhecimentos

Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação de Ciências Naturais da

Província de Fujian, China (Grant No. 2011J01218), a Fundação de Pesquisa para o
Projeto Orientado a Objetivos da Universidade Fuzhou (No. XRC1164) ea Fundação
de Ciências Naturais da Província de Fujian , China (Grant No. 2012J05056). Os
autores agradecem a Priscila Duarte pela amável ajuda a melhorar a apresentação
do artigo.

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Recebido 18 de novembro de 2013

Aceito 26 de dezembro de 2013 (006227)

* Autor correspondente