Frente Farmacol.

 2021; 12: 766293. Publicado on-line em 10 de dezembro de

2021. doi:  10.3389/fphar.2021.766293 PMCID: PMC8707065 PMID: 34955836

Polissacarídeos solú veis nã o amilá ceos da bananeira ( Musa x

paradisiaca L.) Diminuem o impacto epitelial de Clostridioides difficile
Hannah L. Simpson , 1 Carol L. Roberts , 1 Louise M. Thompson , 1 , † Cameron R. Leiper , 1 Nehana
Gittens , 1 Ellie Trotter , 1 Carrie A. Duckworth , 1 , † Stamatia Papoutsopoulou , 2 , 3 , † Fabio Miyajima , 4 , 5 , † Paul
Roberts , 6 , 7 , † Niamh O'Kennedy , 8 Jonathan M. Rhodes , 1 , † e Barry J. Campbell 1 , * †

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Materiais Complementares

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Vamos para:

Abstrato

A infecção por Clostridioides difficile (CDI) é uma das principais causas de diarreia

associada a antibió ticos. A adesã o deste pató geno Gram-positivo ao epitélio intestinal é
um passo crucial na CDI, com recorrência e recidiva da doença dependente da interaçã o
epitelial de seus endó sporos. A proximidade ou adesã o de cepas hipervirulentas à
mucosa intestinal também sã o necessá rias para a liberaçã o de toxinas de C. difficile , que,
quando internalizadas, resultam em arredondamento das células epiteliais intestinais,
danos, inflamaçã o, perda da funçã o de barreira e diarréia. Interrompendo esses C.
difficileAs interaçõ es epiteliais podem, portanto, representar uma estratégia terapêutica
promissora para prevenir e tratar a ICD. A ingestã o de fibra alimentar é amplamente
reconhecida como benéfica para a saú de intestinal, e mostramos anteriormente que os
polissacarídeos nã o amilá ceos solú veis (NSP) da banana-da-terra ( Musa spp.), podem
bloquear a adesã o epitelial e a invasã o de vá rios pató genos intestinais, tais como E. coli e
Salmonellae. Aqui, avaliamos a açã o da banana NSP e uma variedade de fibras vegetais
solú veis alternativas, para açã o inibitó ria nas interaçõ es epiteliais de isolados clínicos
de C. difficile , preparações de endosporos purificados e toxinas. Descobrimos que a
banana NSP possuía a capacidade de interromper a adesã o epitelial de C. difficilecélulas
vegetativas e esporos, com atividade inibitó ria contra C. difficile encontrada dentro do
componente polissacarídeo á cido (rico em pectina), através da interaçã o com o epitélio
intestinal. Atividade semelhante foi encontrada com NSP purificada de bró colis e alho-
poró , embora pareça ser menos potente do que NSP de banana. Embora a banana NSP
nã o pudesse bloquear a interaçã o e a açã o intracelular de toxinas purificadas de C.
difficile , diminuiu significativamente o impacto epitelial de C. difficile, reduzindo a
inflamaçã o induzida por bactérias e toxinas, ativaçã o de caspase 3/7 e citotoxicidade em
linhagem de células intestinais humanas e culturas organoides intestinais de murino. A
suplementaçã o dietética com NSP solú vel de banana pode, portanto, conferir um efeito
protetor em pacientes com CDI, impedindo a adesã o de C. difficile à mucosa, ou seja, um
efeito “contrabió tico” e diminuindo seu impacto epitelial. Isso sugere que a fibra
dietética solú vel de banana pode ser um produto nutricional terapeuticamente eficaz
para uso na prevençã o ou tratamento de CDI e diarréia associada a antibió ticos.

Palavras-chave: Clostridioides difficile , esporos, toxina, intestino, epitélio, fibra

alimentar solú vel

Vamos para:

1. Introduçã o

Clostridioides difficile é um anaeró bio altamente infeccioso, Gram-positivo, formador de

esporos ( Bartlett, 2010 ) que é reconhecido como a principal causa de diarreia
associada a antibió ticos, atribuindo 15 a 25% de todos os casos ( Ananthakrishnan,
2011 ). A infecção por C. difficile (CDI) causa um espectro de doenças intestinais, com
sintomas que variam de diarreia leve a colite pseudomembranosa (PMC) grave,
perfuraçã o intestinal e megacó lon tó xico, que pode ser fatal ( Rupnik et al., 2009 ).

A adesã o de C. difficile ao epitélio intestinal representa um passo inicial e crucial na

patogênese da CDI ( Janoir, 2016 ). Para mediar este processo, C. difficile possui adesinas
que exibem atividade de ligaçã o a carboidratos (lectina). Essas adesinas de superfície
reconhecem e se ligam a carboidratos complementares na superfície das células
hospedeiras, promovendo a adesã o bacteriano-epitelial ( Sharon, 2006 ). De fato, a
proximidade ou adesã o de C. difficile à mucosa intestinal também é necessá ria para a
liberaçã o de toxinas de C. difficile ; toxinas A e B de cadeia simples (TcdA e TcdB) e a
toxina biná ria ( C. difficiletransferase; CDT). Está bem estabelecido que apó s sua
internalizaçã o nas células, via endocitose mediada por clatrina ( Papatheodorou et al.,
2010 ), C. difficile TcdA e TcdB estã o envolvidos na monoglicosilaçã o de pequenas
GTPases da família Rho (Rho, Rac1 e Cdc42), impedindo a sua interacçã o com
reguladores a jusante ( Just et al., 1995a ; Just et al., 1995b ; Sehr et al., 1998 ). Isso
resulta em sua subsequente inativaçã o, levando ao aumento do arredondamento celular,
perda de fibras de estresse de actina e ruptura das junçõ es intercelulares ( Voth e
Ballard, 2005 ).). Outros efeitos celulares de TcdA e TcdB incluem a induçã o de uma
resposta inflamató ria, mediada pela ativaçã o do fator nuclear kappa B (NF-κB) e
subsequente liberaçã o das principais citocinas pró -inflamató rias, como a interleucina 8
(IL-8) e interleucina 1 beta (IL-1β) ( Kim et al., 2006 ; Cowardin et al., 2016 ). TcdA e
TcdB também sã o conhecidos por mediar a morte celular programada através da
ativaçã o de vias apoptó ticas intrínsecas e extrínsecas e ativaçã o subsequente da
caspase-3 executora ( Gerhard et al., 2008 ). C. difficile CDT está associado a cepas
hipervirulentas, que podem aumentar a gravidade do CDI e estã o ligadas a taxas mais
altas de doenças fatais ( Bacci et al., 2011; Cowardin et al., 2016 ; Berry et al.,
2017 ; Ló pez-Cá rdenas et al., 2021 ).

A CDT faz parte da família de toxinas ADP-ribosilantes que, quando clivadas, se ligam a
um receptor de lipoproteína estimulado por lipó lise (LSR) na superfície apical das
células epiteliais intestinais ( Gerding et al., 2014 ). A pró pria toxina biná ria consiste em
dois polipeptídeos nã o ligados, componente enzimá tico CDTa e componente
transportador CDTb. CDTa é uma mono ADP-ribosil transferase que se torna
internalizada no hospedeiro, provavelmente através de um heptâ mero CDTb na
superfície da célula. O complexo internalizado entã o se transloca viaendocitose mediada
por receptor para endossomos á cidos onde CDTb, apó s uma diminuiçã o do pH
endossomal, cria um poro na membrana permitindo a translocaçã o de CDTa para o
citosol. Lá CDTa atua irreversivelmente ADP-ribosilato monomérica G-actina que leva à
inibiçã o da polimerizaçã o em F-actina, interrompendo assim o citoesqueleto de actina
resultando em arredondamento celular e morte celular ( Carman et al., 2011 ; Davies et
al., 2011 ; Cerveja et al., 2018 ). Estudos também sugeriram que a CDT pode aumentar a
adesã o bacteriana à s células-alvo através da formaçã o de saliências de microtú bulos
( Schwan et al., 2009 ; Abt et al., 2016 ). C. difficileas toxinas também exibem atividade de
lectina, ligando-se a porçõ es específicas de carboidratos na superfície da célula epitelial
para facilitar sua captaçã o via endocitose mediada por receptor. Estudos demonstraram
a ligaçã o direta de C. difficile TcdA a glicanos que expressam o dissacarídeo Galβ1-
4GlcNAc ( Tucker e Wilkins, 1991 ; Greco et al., 2006 ).

Nos ú ltimos anos, a incidência de ICD aumentou rapidamente e a doença está se

tornando associada a maiores taxas de morbidade e mortalidade ( Rupnik et al.,
2009 ; Freeman et al., 2010 ). Uma série de variantes hipervirulentas de C.
difficile também surgiram, com destaque para a cepa hipervirulenta BI/NAP1/027
( Rupnik et al., 2009 ; O'Connor et al., 2009 ), que demonstrou secretar níveis elevados
de TcdA e TcdB ( Loo et al., 2005 ; McDonald et al., 2005 ). Além disso, houve um
aumento considerá vel nas taxas de recorrência e recaída associadas ao CDI ( Kelly,
2012 ), devido à capacidade de produzir endó sporos (Burns et al., 2011 ). Esta forma
robusta e dormente de C. difficile pode sobreviver quase indefinidamente fora do
hospedeiro e persiste em superfícies clínicas por longos períodos de tempo ( Burns et al.,
2011 ). Uma vez ingeridos por um indivíduo suscetível, os esporos retornam ao
crescimento vegetativo através da germinaçã o, resultando em colonizaçã o, liberaçã o de
toxinas e subsequente doença ativa ( Burns et al., 2011 ). Também foi demonstrado que
os esporos de C. difficile sã o um veículo chave de transmissã o no CDI, interagindo com o
epitélio intestinal ( Paredes-Sabja e Sarker, 2012 ) e macró fagos da mucosa ( Paredes-
Sabja et al., 2012 ), levando à persistência dentro do trato intestinal.

Está claro que a bactéria C. difficile , a toxina e a interaçã o do esporo com o epitélio
intestinal desempenham um papel fundamental na patogênese da CDI. Interromper
essas interaçõ es bactérias-epiteliais poderia, portanto, representar uma estratégia
terapêutica promissora para prevenir e tratar CDI. Nossos pró prios estudos recentes
demonstraram que polissacarídeos nã o amilá ceos (NSP) de plantas dietéticas solú veis,
particularmente seus componentes á cidos (ricos em pectina), de bananas-da-terra
( Musa spp.), podem bloquear a adesã o epitelial de vá rios outros pató genos intestinais
(incluindo Salmonella enterica sorovar Typhimurium, Shigella sonnei e vá rios patovares
de Escherichia coli ) em linhagens de células epiteliais intestinais humanas in
vitro( Martin et al., 2004 ; Roberts et al., 2010 ; Roberts et al., 2013 ), e também bloquear
a translocaçã o bacteriana através de explantes ileais humanos ex vivo de epitélio
associado a vilosidades ou folículo (FAE) ( Roberts et al., 2010 ; Roberts et al., 2013 ). O
efeito é mediado pela interaçã o entre o NSP rico em pectina de banana e as células
epiteliais do intestino. A eficá cia foi confirmada in vivo em galinhas, onde a
suplementaçã o de uma dieta comercial com banana NSP demonstrou bloquear
a colonizaçã o de Salmonella ( Parsons et al., 2014 ; Parsons et al., 2015). O objetivo do
presente estudo foi avaliar a açã o da banana NSP em uma variedade de isolados clínicos
de C. difficile de diferentes ribotipos de PCR e status de toxina, bem como testar uma
variedade de fibras vegetais solú veis alternativas por sua açã o inibitó ria nas interaçõ es
epiteliais de C. difficile . A banana NSP também foi testada quanto à sua capacidade de
inibir a adesã o epitelial de endó sporos de C. difficile e nas interaçõ es celulares de toxinas
purificadas de C. difficile .

Vamos para:

2. Materiais e métodos
2.1 Culturas de células epiteliais intestinais humanas

As linhagens celulares de adenocarcinoma de có lon humano Caco-2 (ECACC

#86010202), SW620 (ECACC #87051203) e SW480 (ECACC #87092801) foram obtidas
da Coleçã o Europeia de Culturas de Células Autenticadas (Public Health Laboratory
Service; Wiltshire, Reino Unido) . As células do intestino-407 (ATCC #CCL-6) foram
obtidas da American Type Culture Collection (Padrõ es LGC: Teddington, Reino
Unido). Todas as linhas celulares foram inicialmente cultivadas em frascos de cultura de
tecidos T-75 até 80% de confluência. As células foram tripsinizadas e re-semeadas em 1
× 10 5 células/poço para placas de cultura de tecidos de 24 poços (Corning Costar, High
Wycombe, Reino Unido) para ensaios de infecçã o. Para ensaios de luminescência, as
células foram semeadas a 9 × 10 4por poço em placas de cultura de fundo branco de 96
poços (Costar). Culturas paralelas em placas de fundo transparente de 96 poços foram
usadas para avaliar a confluência por microscopia de luz. Todas as linhagens celulares
foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco completo (DMEM)
suplementado com 10% v/v de soro fetal bovino (Invitrogen; Paisley, Reino Unido), 100
U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina e 8 mM de glutamina ( Sigma Aldrich;
Poole, Reino Unido), e mantida a 37°C em uma atmosfera umidificada de 5% CO 2 /95%
ar por 24-48 h.

2.2 Culturas Organoides Intestinais Murinas

Organoides intestinais foram utilizados para avaliar a citotoxicidade epitelial em

resposta a toxinas purificadas de C. difficile , conforme ( Jones et al.,
2019 ). Camundongos (cepa C57BL/6J, com 10 semanas de idade) adquiridos de Charles
River Ltd. (Margate, Reino Unido) e foram mantidos por 2 semanas antes da colheita de
tecido em uma dieta de raçã o para roedores peletizada CRM padrã o (Special Diet
Services; Witham, Reino Unido) com á gua disponível ad libitum , em ambiente livre de
pató genos específicos na Unidade de Serviços Biomédicos (Universidade de
Liverpool). Os camundongos foram sacrificados, sob o Anexo 1 da Lei de Animais
(Procedimentos Científicos) de 1986, aumentando o CO 2níveis, seguido de luxaçã o
cervical. O intestino delgado foi dissecado e transportado em gelo em soluçã o salina
tamponada com fosfato (PBS) estéril pH 7,3, para uso no estabelecimento de culturas
organoides ao longo de 6 dias, conforme descrito anteriormente ( Jones et al., 2019 ). No
dia 7, as culturas foram passadas por ruptura mecâ nica através de uma agulha 27G,
ressuspensas em Matrigel fresco e plaqueadas novamente em placas de 24 poços. O
tratamento experimental de organoides só foi realizado apó s um mínimo de 1 passagem.

2.3 Polissacarídeos nã o-amido solú veis em plantas

Preparaçõ es de polissacarídeos nã o amilá ceos (NSP) de banana ( Musa x paradisiaca L.)
a partir de farinha de banana sem excipiente (grupo AAB de farinha de banana verde
Trobana (Chifre)); Confoco Internacional Ltda.; Ripley, Reino Unido) foram preparados
pela Provexis plc (Reading, Reino Unido) no Teagasc Food Research Center (Moorepark,
Irlanda) conforme descrito anteriormente ( Roberts et al., 2010 ; Roberts et al.,
2013). Uma série de outros NSP também foram preparados, selecionados para incluir
representantes de dicotiledô neas, monocotiledô neas commelinó ides e
monocotiledô neas nã o commelinó ides. Esta seleçã o garantiu uma grande variedade de
composiçã o NSP. As plantas selecionadas incluíram as das famílias Rosaceae—maçã ,
pêra e morango (dicotiledô neas); Ericaceae—mirtilo (dicotiledô nea); Musaceae—
banana (verde) (monocotiledô nea commelinó ide); Solanaceae—tomate e pimentã o
(dicotiledô neas); Poaceae—aveia (monocotiledô nea commelinó ide); Fabaceae — feijã o
carreteiro (dicotiledô nea); Brassicaceae—bró colis (dicotiledô nea); Apiaceae—aipo
(dicotiledô nea); e Amaryllidaceae – alho-poró (monocotiledô nea não
commelinó ide). Todos foram preparados com a mesma especificaçã o (Provexis
plc); ver Tabela Complementar S1. As concentraçõ es solú veis de NSP testadas estavam
dentro da faixa de concentraçõ es luminais efetivas no có lon distal humano que seriam
prontamente alcançá veis com suplementaçã o dietética ( Roberts et al., 2010 ). As fraçõ es
polissacarídicas neutras e á cidas de NSP solú vel de banana foram preparadas por
cromatografia de troca aniô nica Q-Sepharose, conforme ( Parsons et al., 2014 ).

2.4 Cepas de Clostridioides difficile e Condiçõ es de Crescimento

A cepa de referência de laborató rio C. difficile 1470 (ATCC #43598) foi obtida da

American Tissue Type Collection (LGC Standard; Teddington, Reino Unido). O isolado
laboratorial clínico de C. difficile 080042 (PCR ribotipo 027) utilizado em ensaios iniciais
de interaçã o de células epiteliais intestinais foi obtido do Dr. Godfrey Smith
(Departamento de Microbiologia Médica, Royal Liverpool e Broadgreen University
Hospitals NHS Trust, Reino Unido). C. difficile 1342, uma cepa negativa do locus de
patogenicidade (PaLoc), foi fornecida pelos Drs. (Universidade de Oxford, Oxford, Reino
Unido) (Stoesser et al., 2011 ). Onze isolados clínicos adicionais de C. difficile de
diferentes status de toxina e ribotipo PCR, e de vá rias localizaçõ es geográ ficas, também
foram obtidos do Royal Liverpool e Broadgreen University Hospitals NHS
Trust; Vejotabela 1. Todos os isolados foram inicialmente cultivados em laborató rio sob
condiçõ es anaeró bicas, a 37°C por 48 h, em á gar Brain Heart Infusion (BHIS)
suplementado com 0,1% p/v L-cisteína e 5 mg/ml de extrato de levedura. Antes da
infecçã o de células epiteliais intestinais cultivadas, as cepas de C. difficile foram
cultivadas em á gar anaeró bico Fastidious (Oxoid), lavadas três vezes em PBS estéril pH
7,3 e ressuspensas a uma DO 550 nm , equivalente a 1 × 10 9  UFC/ml.

TABELA 1
C. difficile cepas usadas.

C. designação de Ribótip
Toxina A Toxina B Toxina binária Isolamento geográfico
cepa difficile o
80042 + + + 027 Liverpool
98011 + + + 027 Liverpool
108536 + + + 027 Japão
98078 + + + 078 Liverpool
C. designação de Ribótip
Toxina A Toxina B Toxina binária Isolamento geográfico
cepa difficile o
98231 + + + 078 Liverpool
108526 + + − 018 Japão
108906 + + − 012 Malawi
98359 + + − 106 Liverpool
1470 − + − 017 Bélgica
108963 − + − 017 Liverpool
108519 − + − 017 Japão
108520 − + − 368 Japão
98220 − − − 010 Liverpool
1342 − − − 005 Oxford
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2.5 Isolamento e Purificaçã o de Esporos

Esporos de cinco isolados clínicos selecionados de C. difficile (98011, 108536, 108906,
98220 e 1342) foram preparados de acordo com métodos previamente descritos
( Permpoonpattana et al., 2011 ), com algumas modificaçõ es. Resumidamente, para cada
isolado, uma ú nica colô nia bacteriana foi selecionada da cultura anaeró bica de á gar BHIS
(a 37°C por 48 h) e usada para inocular 10 ml de caldo TGY (3% p/v caldo de soja
tríptica, 2% p/v glicose , 1% p/v extrato de levedura, 0,1% p/v L-cisteína) Apó s
incubaçã o durante a noite em condiçõ es está ticas, o meio de cultura TGY foi
subcultivado (1:100) em caldo Sorbitol MacConkey (SMC) (9% p/v /peptona, 0,05% p/v
de proteose-peptona, 0,1% p/v (NH4 ) 2SO4 , 0,15 % p / v/Tris, 0,1% p/v L-cisteína) e
incubado a 37°C até um OD600nm = 0,5. Alíquotas do caldo de cultura foram utilizadas para
inocular uma dú zia de placas de á gar SMC por cepa, que foram incubadas em condiçõ es
anaeró bicas, a 37°C por 10 dias. Apó s o dia 10, os esporos foram colhidos e lavados duas
vezes com á gua estéril, depois suspensos em 2 ml de PBS estéril pH 7,3 contendo 125
mM de Tris, 200 mM de EDTA, 0,3 mg/ml de proteinase K e 1% v/v de sarcosil e
incubados a 37 °C por 2 h com agitaçã o suave. Os esporos foram então centrifugados
(4.500 x gpor 20 min) e o pellet ressuspenso em á gua destilada estéril fria. Isso foi
repetido mais 10 vezes. Apó s a lavagem final, os esporos foram tratados termicamente
(60°C, por 20 min) para matar quaisquer células vegetativas residuais e, em seguida,
congelados a -20°C até o uso. Para calcular os nú meros de esporos, alíquotas foram
diluídas em série em PBS estéril e semeadas em á gar BHIS suplementado com 0,1% p/v
taurocolato de só dio para germinaçã o de esporos ( Sorg e Sonenshein, 2008 ; Burns e
Minton, 2011 ). Apó s 48 h, os títulos de esporos foram enumerados pela enumeraçã o de
unidades formadoras de colô nias de bactérias vegetativas (UFC). Para confirmar a
pureza de cada preparaçã o de esporos, uma coloraçã o de endosporo de Schaeffer e
Fulton foi rotineiramente realizada ( Schaeffer e Fulton, 1933). Os resultados indicaram
que o processo de purificaçã o produziu de forma eficaz e reprodutível títulos de esporos
de alta pureza, efetivamente livres de células vegetativas (ver Figura Suplementar
S1 ; Tabela Suplementar S2 ).

2.6 Bloqueio de fibra solú vel de Clostridioides difficile - Adesã o de células epiteliais
intestinais

Monocamadas de células Caco-2 confluentes em placas de 24 poços foram pré-tratadas

por 30 min com ou sem NSP solú vel de banana (0-20 mg/ml em DMEM sem
antibió tico). Monocamadas de células foram entã o infectadas com isolados clínicos
vegetativos de C. difficile ou preparados de esporos de C. difficile purificados (1 ×
10  7  UFC/ml), em uma multiplicidade de infecçã o (MOI) de 100, por 2 h. Cada
monocamada foi entã o lavada três vezes com PBS estéril para remover bactérias ou
esporos não aderentes, e as monocamadas foram lisadas com Triton X-100 estéril a 1%
v/v. C. difficile e C. difficile vegetativo aderente epitelialos esporos foram ambos
enumerados realizando diluiçõ es em série de lisados celulares, plaqueamento de
alíquotas de 20 µl de lisado em á gar BHIS (incluindo 0,1% p/v de taurocolato de só dio
para esporos) em triplicado. As placas foram entã o incubadas por 48 h a 37°C em
condiçõ es anaeró bicas e as UFC quantificadas.

Em experimentos separados, uma variedade de fibras vegetais dietéticas solú veis,

incluindo NSP isoladas de dicotiledô neas, como maçã , feijã o, mirtilo, bró colis, aipo, pêra,
pimentã o, morango e tomate, foram comparadas com NSP do alho-poró
monocotiledô neo nã o commelinó ide , e as monocotiledô neas commelinó ides aveia e
banana. Cada NSP foi rastreado a 5 mg/ml quanto à capacidade de bloquear interaçõ es
de C. difficile com monocamadas de células Caco-2.

Experimentos adicionais também foram realizados para determinar se a açã o da banana

NSP para bloquear a adesã o de C. difficile foi por meio de uma interaçã o com a
monocamada epitelial intestinal ou por interaçã o direta com bactérias. Para testar o
primeiro, banana NSP foi adicionada à s células Caco-2 30 min antes da infecçã o como
descrito acima, mas depois removida por três lavagens com PBS estéril (1 min cada; a
37°C). As monocamadas foram entã o fornecidas com DMEM livre de antibió tico fresco,
infectado e os níveis de C. difficile aderente à s células avaliados. Para testar a interaçã o
direta com bactérias, banana NSP foi incubada com C. difficilepor 30 min, seguido de
centrifugaçã o, ressuspensã o das bactérias em meio sem antibió tico e inoculaçã o de
monocamadas epiteliais. Para avaliar se a atividade inibitó ria do NSP solú vel da banana
para bloquear as interaçõ es C. difficile - epitélio intestinal do hospedeiro está dentro de
um componente polissacarídeo á cido (rico em pectina) ou neutro, monocamadas de
Caco-2 foram pré-tratadas por 30 min com 5 mg/ ml de fraçõ es NSP de troca aniô nica de
Q-Sepharose dessalinizadas e purificadas, conforme descrito anteriormente ( Parsons et
al., 2014 ).

Abordagens alternativas também foram usadas para avaliar o impacto da banana NSP na
adesã o de C. difficile à s células Caco-2, incluindo coloraçã o de Giemsa acoplada à
microscopia de luz (conforme ( Roberts et al., 2013 )) e citometria de fluxo (com base no
método de Drudy e colegas ( Drudy et al., 2001 ). Resumidamente, C. difficile 080042 foi
cultivado anaerobicamente em 50 ml de caldo anaeró bio fastidioso (Lab M; Bury, Reino
Unido) sem agitaçã o por 36 h, a 37°C. As bactérias foram lavado e ressuspenso em PBS
estéril, pH 7,3. Para rotulagem de fluorocromo, 1 × 10 8bactérias/ml foram incubadas
com 1 μM de 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(e-6)-carboxifluoresceína, éster acetoximetílico
(BCECF/AM) no escuro, a 37°C por 1 h. O excesso de fluorocromo foi removido por 5
lavagens sequenciais em PBS estéril seguidas de centrifugaçã o, cada uma por 5 min. As
bactérias foram ressuspensas em PBS contendo banana NSP, ou PBS sozinho e incubadas
por 30 min no escuro, depois adicionadas a 1 × 10 6 células Caco-2 em suspensã o de
célula ú nica, a 37°C por 1 h. Apó s a incubaçã o, as células foram lavadas três vezes em
PBS (300 x g, por 20 min) para remover qualquer bactéria nã o aderente. Apó s a lavagem
final, os pellets foram ressuspensos em 1 ml de PBS e submetidos a citometria de fluxo
usando um citô metro de fluxo FACScan (Becton, Dickinson Ltd.; Wokingham, Reino
Unido). Um total de 10.000 eventos foram adquiridos, com dados analisados usando o
software Cell Quest (Becton Dickinson). A intensidade média de fluorescência (MFI)
usando a média geométrica de cada amostra foi usada para avaliar a aderência
bacteriana à s células Caco-2.

2.7 Ensaio de Ativaçã o do Canal de Cloreto de Células Epiteliais

A secreçã o de cloreto celular foi avaliada usando um ensaio colorimétrico que mede o
efluxo de iodeto celular como um substituto para monitorar a atividade do canal iô nico
de cloreto, conforme Tang e Wildey (2004) . As células Caco-2 foram semeadas em
placas de 96 poços a 2,5 × 10 4 células/poço e incubadas por 24 h a 37°C. As células
foram entã o carregadas com 100 µl de tampã o de carregamento de iodo pré-aquecido e
incubadas durante 4 h a 37°C. Apó s três lavagens com PBS estéril e incubado por 30 min
com banana NSP (2,5-10 mg/ml) ou agonistas do canal de íons cloreto, forscolina (200
μM; Sigma) ou RP107 (100 μM; Sigma) como controles positivos ( Noel e outros,
2006). Apó s a incubaçã o, as células foram lisadas com 1% (v/v) de Triton X-100 em á gua
desionizada. A concentraçã o de iodo intracelular foi determinada usando a reaçã o de
Sandell-Kolthoff modificada e as absorbâ ncias medidas em DO 410 nm ( Tang e Wildey,
2004 ). Bloqueadores de canal de cloreto, inibidor de regulador de condutâ ncia
transmembrana de fibrose cística (CFTR) Inh-172 (12,5–200 μM; Sigma) ( Linsdell,
2014 ), ou á cido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino)benzó ico (NPPB, 50–800 μM; Sigma)
( Keeling et al., 1991 ), foram avaliados por sua capacidade de bloquear a ativaçã o do
canal de cloreto celular e estavam presentes durante a etapa de carregamento de iodo de
4 h antes da incubaçã o com NSP solú vel de banana, RP107 ou forscolina.

2.8 Tratamento de células epiteliais intestinais e organoides

com toxinas Clostridioides difficile

C. difficile TcdA e TcdB purificados, isolados da cepa de referência de cepa altamente

tó xica VPI10463 , foram fornecidos pelo Dr. Clifford Shone (Public Health England;
Porton Down, Reino Unido) ( Maynard-Smith et al., 2014 ). A toxina biná ria (CDT) foi
gerada a partir da combinaçã o (1:2) do componente purificado CDTa e do componente
ativado CDTb (precursor CDTb digerido com tripsina), produzido e purificado a partir
de uma cepa de ribotipo 027, pelos Drs Panagiotis Papatheodorou e Carsten Schwan
(Institute for Experimental e Farmacologia Clínica e Toxicologia, Universidade Albert-
Ludwigs Freiburg, Alemanha) ( Schwan et al., 2009 ; Aktories et al., 2018 ).

A diluiçã o em série de cada toxina foi feita em meio de cultura estéril para atingir
concentraçõ es finais de teste entre 1–1.000 ng/ml. As células Caco-2 foram semeadas a 2
× 10 5 células/poço em placas de cultura de tecidos de 6 poços e incubadas por 24
h. Apó s três lavagens com PBS estéril, as monocamadas foram pré-tratadas por 30 min
com ou sem 10 mg/ml de NSP solú vel de banana. As células foram entã o tratadas com
toxinas por até 24 h.

Os organoides intestinais, no dia 4 de cultura, foram pré-tratados com 10 mg/ml de

banana NSP ou veículo salino, seguido de tratamento com toxinas de C. difficile (1-100
ng/ml). As imagens foram tiradas usando um microscó pio Axiovert 25 (Zeiss) e uma
lente objetiva de 20X com uma câ mera Hitachi HV-C20A antes do tratamento e 24 h apó s
o tratamento com a toxina. A circularidade organoide (como medida de citotoxicidade)
foi pontuada conforme descrito anteriormente ( Jones et al., 2019 ).

2.9 Avaliaçã o de Immunoblot da Mono-Glucosilaçã o Mediada por Toxina da

Proteína de Ligaçã o a GTP Intracelular, Rac1

Os efeitos mediados pela toxina de C. difficile foram avaliados por immunoblot usando

dois anticorpos monoclonais criados contra o substrato de toxina botulínica C3
relacionada a Ras (Rac1); clone 102 (BD Transduction Lab; Oxford, Reino Unido)
mostrou anteriormente perder afinidade para Rac1 apó s monoglicosilaçã o mediada por
toxina de C. difficile ( Gerhard et al., 2008 ) e clone 238a (Abcam; Cambridge, Reino
Unido) que reconhece isoformas Rac1 nã o glicosiladas e monoglicosiladas ( Gerhard et
al., 2008). As células foram lisadas em tampã o Tris-HCl 20 mM gelado, pH 7,4. Os lisados
de proteína de célula inteira (25 µg) foram separados usando géis de gradiente de
acrilamida 4-20% em SDS-PAGE a 150 V por 2 h, seguido de eletrotransferência para
membrana de nitrocelulose (100 V, por 1 h). As membranas de nitrocelulose foram
bloqueadas usando 1% (v/v) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS contendo 0,1%
(v/v) de Tween-20 durante a noite a 4°C, depois incubadas com anticorpo primá rio
(1:1.000) por 2 h à temperatura ambiente, seguido por três lavagens de 5 min com PBS-
0,1% (v/v) Tween 20. Os blots foram incubados com anticorpo de imunoglobulina de
coelho anti-rato de coelho conjugado com peroxidase de rá bano (HRP) (1:2.000) por 1 h
em temperatura do quarto. As membranas foram novamente lavadas três vezes com
PBS-0,1% (v/v) Tween 20 e as bandas de proteína visualizadas com SuperSignal West
Dura Extended Duration Substrate (Thermo-Fisher Scientific;

2.10 Quantificaçã o da Liberaçã o de Citocinas Inflamató rias

O meio colhido de linhagens de células humanas foi testado quanto à presença de IL-8
pró -inflamató ria usando um ensaio imunossorvente ligado a enzima em sanduíche de
fase só lida (ELISA) (Kit Human Elipair; Abcam, Cambridge, Reino Unido). Para culturas
organoides intestinais de murino, o meio foi ensaiado para a quimiocina CXCL1/KC
usando um kit ELISA Duoset de camundongo CXCL1/KC (R & D Systems, Abingdon,
Reino Unido). Para ambos os ensaios, o anticorpo de captura em tampã o carbonato-
bicarbonato 0,5 M (pH 9,6) foi revestido em placas de ELISA de 96 poços com radiaçã o γ
de alta ligaçã o (Costar) durante a noite a 4°C. Apó s três lavagens com PBS-0,1% (v/v)
Tween 20, as placas foram bloqueadas com albumina de soro bovino a 1% (p/v) por 2 h
à temperatura ambiente. Amostras de tratamento em triplicado (100 µl) de meio sem
células foram entã o incubadas durante a noite a 4°C, as placas lavadas três vezes com
12,0 µl de tampã o de lavagem, e o respectivo anticorpo de detecçã o biotinilado
adicionado por 2 h à temperatura ambiente. Subsequentemente, ExtrAvidin peroxidase
(Sigma; Poole, Reino Unido) foi adicionado a cada poço, incubado por 20 min à
temperatura ambiente. As placas foram novamente lavadas três vezes com PBS-Tween,
revelado com SigmaFastsubstrato o -fenilenodiamina (Sigma) durante 10 min e o
desenvolvimento da cor parou com 100 µL de 4 MH 2 SO 4 . Os ELISAs foram medidos
num leitor de placas Tecan Sunrise (Tecan; Reading, Reino Unido) a OD 492 nm , com um
filtro de referência ajustado a OD 750 nm . As amostras de tratamento foram quantificadas
contra curvas de calibraçã o de padrõ es de IL-8 recombinante humana (0–2000 pg/ml) e
KC de camundongo (0–1.000 pg/ml) em meio de cultura.

2.11 Avaliaçã o da Apoptose Celular

As células foram semeadas a 1 × 10 4 células/ml em placas de cultura de tecidos de 96

poços de parede branca de fundo transparente (Corning/Costar) e cultivadas durante a
noite a 37°C. Apó s o tratamento com toxinas purificadas e/ou isolados clínicos de C.
difficile , as monocamadas celulares foram testadas usando um ensaio Caspase-Glo 3/7
comercial (Promega; Southampton, Reino Unido), conforme as instruçõ es do
fabricante. A luminescência foi detectada usando o leitor de placas Infinite F200
(Tecan). As experiências foram realizadas em triplicado, com luminescência de fundo
determinada a partir de poços contendo apenas meio de cultura.

2.12 Avaliaçã o da Citotoxicidade Celular

A viabilidade das células epiteliais durante os tratamentos com NSP e em resposta à

infecçã o por C. difficile ou ao tratamento com toxina foi monitorada pela mediçã o da
adenilato quinase (normalmente encontrada em células intactas) liberada no meio de
cultura a partir de células Caco-2 usando um bioensaio ToxiLight (Lonza; Slough, Reino
Unido). A citotoxicidade organoide intestinal foi medida conforme descrito
anteriormente ( Jones et al., 2019 ).

2.13 Aná lise Estatística

Os dados sã o expressos como média ± SD, salvo indicaçã o em contrá rio. N nú meros
indicam o nú mero total de experimentos independentes realizados, onde cada
experimento foi realizado com pelo menos n = 3 réplicas para qualquer grupo de
tratamento individual, salvo indicaçã o em contrá rio. Grupos amostrais independentes
foram primeiramente avaliados quanto à normalidade (teste de Shapiro-Wilks) e
igualdade de variâ ncias (teste de Levene). As comparaçõ es de duas amostras foram
realizadas usando o teste t nã o pareado ou o teste U de Mann-Whitney não paramétrico,
conforme apropriado. Vá rios grupos de tratamento foram analisados usando aná lise de
variâ ncia paramétrica unidirecional (ANOVA) ou teste não paramétrico de Kruskal-
Wallis (Stats-Direct v3.0.171; Venda, Reino Unido). As diferenças foram consideradas
significativas quando p < 0,05.

Vamos para:

3. Resultados
3.1 NSP solú vel de banana-da-terra inibe a adesã o epitelial intestinal de isolados
clínicos de Clostridioides difficile , independentemente do status da toxina e do
ribotipo

Observou-se que NSP solú vel de banana-da-terra bloqueia a adesã o dose-dependente de

isolados clínicos de C. difficile à s monocamadas de células epiteliais intestinais de Caco-
2. O pico de inibiçã o da adesã o de C. difficile a células Caco-2 foi observado apó s o pré-
tratamento com banana NSP a 10 mg/ml para o ribotipo 027, isolado positivo de
toxina C. difficile 80042 (64,2 ± 4,4% de inibiçã o) foi observado em comparaçã o com
controles nã o tratados ( N = 3, n = 3, p < 0,001, teste de Kruskal-Wallis), verFigura 1A. O
NSP de banana também reduziu a adesã o de C. difficile de forma dependente da dose de
outros isolados de C. difficile , incluindo a cepa de referência ATCC C. difficile 1470 a
células Caco-2 (pico de inibiçã o observado em 10 mg/ml, 81,2 ± 2,4% em comparaçã o
com o nã o tratado controle ( N = 3, n = 3, p < 0,001);Figura 1A. Usando a dose inibitó ria
ideal de 10 mg/ml de banana NSP, níveis semelhantes de bloqueio da interaçã o de C.
difficile 80042 com células epiteliais foram observados usando duas outras linhagens de
células colô nicas SW620 (69,2 ± 3,0% de inibiçã o) e SW480 (70,6 ± 1,4% ) como foi
visto usando células Caco-2 (75,6 ± 5,1%), em comparaçã o com controles não tratados
( N = 3; p <0,001, teste U de Mann-Whitney),Figura 1B. Abordagens alternativas para
medir a adesã o bacteriana, por citometria de fluxo (Figuras 1C, D) e coloraçã o de Giemsa
acoplada à microscopia de luz (Figura 1E), também revelou reduçã o acentuada na
adesã o de C. difficile à s células Caco-2 na presença de banana NSP.

FIGURA 1
Polissacarídeos nã o amilá ceos solú veis de banana inibem a adesã o de C. difficile à s células epiteliais intestinais
de maneira dose-dependente. (A) A adesã o do isolado 80042 de C. difficile a monocamadas confluentes de
Caco-2 [Caco2] é significativamente inibida na presença de banana-da-terra (NSP). (B) Pré-tratamento com 10
mg/ml de banana NSP, bloqueou a adesã o de C. difficile 80042 a três diferentes linhagens celulares intestinais
Caco-2, SW480 e SW620. A adesã o é expressa em relaçã o a UFC/mL encontrada na ausência de fibra dietética
solú vel de banana, definida como 100% ( N = 3 experimentos, n = 3 repetiçõ es; ** p < 0,01, *** p< 0,001; teste
6
de Kruskal-Wallis ou teste de Mann Whitney U). (C) Aná lise de citometria de fluxo de 1 × 10   células Caco-2
8
em suspensã o, nã o infectadas (azul), co-incubadas com 1 × 10   BCECF/AM marcado com C difficile 80042 por
1 h, sem (verde), ou com 30 min de pré-tratamento com 10 mg/ml de banana-da-terra NSP (rosa). (D) Os
dados sã o baseados em 10.000 eventos e representativos de N = 4 experimentos separados. Efeito significativo
de NSP, avaliado pelo desvio na intensidade de fluorescência média, em comparaçã o com controles infectados
(** p < 0,01, teste de Kruskal-Wallis). (E) C. difficile corado com Giemsa80042 inocularam células Caco-2 na
ausência e presença de 10 mg/ml de banana-da-terra NSP. As setas pretas indicam bactérias aderentes.

Banana NSP (a 10 mg/ml) também reduziu significativamente a adesã o de um painel de

isolados clínicos de C. difficile diferindo em sua origem geográ fica, expressã o de toxina e
ribotipo de PCR (tabela 1) para células Caco-2, com uma reduçã o média geral para todos
os isolados testados de 73,8% (intervalo de 52,2-98,6%) em comparaçã o com as
monocamadas inoculadas nã o tratadas (Figuras 2A–D, para todos; p < 0,001; teste de
Kruskal-Wallis). Estes resultados demonstram que o efeito inibitó rio da banana NSP é
independente da expressã o da toxina C. difficile e do status do ribotipo.
FIGURA 2
NSP solú vel de banana inibe a adesã o epitelial de um painel de isolados clínicos de C. difficile diferindo na
expressão da toxina e ribotipo. As células Caco-2 [Caco2] foram submetidas a pré-tratamento com 10 mg/ml de
banana NSP por 30 min antes da inoculaçã o com C. difficile em uma multiplicidade de infecçã o (MOI) de 100. A
banana NSP inibiu significativamente a adesã o à s monocamadas de células Caco-2 , de isolados clínicos de C.
difficile positivos para (A) todas as toxinas (A, B e biná rias), (B) positivos para toxina A e toxina B, (C) apenas
Toxina B e (D) cepas nulas de toxina. Laborató rio clínico C. difficileO isolado 80042 (ribotipo 027) foi usado
como uma referência positiva para a inibiçã o de NSP de banana-da-terra da adesã o de células epiteliais de
bactérias, com adesã o a células Caco-2 expressas em relaçã o a UFC/mL encontradas em cada controle nã o
tratado (definido como 100%). Diferenças significativas do controle nã o tratado, *** p < 0,001, N = 3
experimentos, n = 3 réplicas; teste de Kruskal-Wallis).

3.2 NSP solú vel de outras fontes vegetais pode inibir a adesã o epitelial
de Clostridioides difficile , mas nã o tã o eficazmente quanto o NSP de bananeira

Para rastrear a atividade inibitó ria, as monocamadas de células Caco-2 foram

submetidas a pré-tratamento usando NSP solú vel de uma variedade de plantas
dietéticas antes da infecçã o com C. difficile 80042 (Figura 3A). A pré-incubaçã o de
células intestinais com 5 mg/ml de NSP de bró colis, alho-poró e banana resultou nos
níveis mais altos de inibiçã o da adesã o de C. difficile 80042 a células Caco-2 (>43% de
inibiçã o; p ≤ 0,01 ( N = 3, n = 3-4 para NSP de bró colis e NSP de banana; N = 1, n = 3 para
NSP de alho-poró ). Observou-se que NSP de feijã o, pimentã o ou tomate foi menos eficaz
(> 22% de inibiçã o; p <0,05) enquanto outros, como maçã , mirtilo, aipo, aveia, pêra e
morango, tiveram pouco ou nenhum efeito inibitó rio ( N = 3, n = 3-4); verFigura
3A. Estudo adicional de NSP de alho-poró e NSP de bró colis indicou um efeito inibitó rio
dependente da dose na adesã o de células epiteliais de C. difficile , com pico de inibiçã o
observado em 20 mg/ml (NSP de alho-poró , 57,5 ± 6,5%; e NSP de bró colis , 56,9 ± 7,2%
em comparaçã o com controles não tratados (100%); ambos p < 0,001). Ambas as fibras
solú veis de plantas dietéticas tiveram uma eficá cia menor do que a observada com a
banana NSP; usado como controle positivo a 10 mg/ml, onde a adesã o epitelial de C.
difficile foi reduzida em 81,8 ± 4,6% ( p < 0,001; N = 3, n = 3); VejoFiguras 3B,C.

FIGURA 3
Avaliaçã o de uma gama de polissacarídeos nã o amilá ceos (NSP) solú veis em plantas dietéticas quanto à sua
capacidade de prevenir a adesã o de C. difficile à s células epiteliais intestinais in vitro . (A) A adesã o de C.
difficile isolado 080042 a monocamadas de células Caco-2 [Caco2] confluentes é significativamente inibida na
presença de 5 mg/ml de NSP de feijã o, bró colis, alho-poró , pimentã o, banana e tomate. Aná lises adicionais
mostraram que a adesã o epitelial de C. difficile foi reduzida de uma maneira dependente da dose por, (B) alho-
porro NSP e (C)bró colis NSP, comparado ao bloqueio observado com 10 mg/ml de banana-da-terra NSP. A
adesã o foi medida em relaçã o ao UFC/mL quantificado na ausência de NSP (definido como 100%). Todos
os N = 3 experimentos, n = 3–4; com exceçã o do alho-poró NSP ( N = 1, n = 3); * p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p <
0,001; teste de Kruskal-Wallis).

3.3 NSP solú vel de banana-da-terra inibe a aderência epitelial de Clostridioides

difficile através de um efeito no epitélio intestinal
A bananeira NSP parece exercer seu efeito inibitó rio sobre a adesã o de C.
difficile via açã o no epitélio. Quando a banana NSP (10 mg/ml) foi adicionada à s
monocamadas de células Caco-2 por 30 min, depois removida por três lavagens com PBS
estéril, observou-se que os níveis de C. difficile aderente foram significativamente
reduzidos (59,2 ± 5,0%) em comparaçã o com os controles inoculados não tratados ( p <
0,01; teste de Kruskal-Wallis), embora inferior ao observado em experimentos em que a
banana NSP foi adicionada à s células por 30 min sem remoçã o antes da infecçã o (92,9 ±
2,0%, em comparaçã o com o controle não tratado; p< 0,001; teste de Kruskal-
Wallis). Em contraste, a pré-incubaçã o de banana NSP diretamente com bactérias por 30
min, seguida de remoçã o de fibra dietética solú vel de bactérias por centrifugaçã o, nã o
resultou em inibiçã o significativa da adesã o de C. difficile em comparaçã o com controles
nã o tratados (ver Figura Suplementar S2 ).
Além disso, o tratamento de células Caco-2 com 2,5-20 mg/ml de banana-da-terra NSP
também resultou em um aumento dependente da dose na atividade do canal iô nico de
cloreto celular, com pico de atividade em 20 mg/ml de banana-da-terra (aumento de 5,4
± 0,4 vezes em comparaçã o com o controle nã o tratado; p < 0,001 teste de Kruskal-
Wallis, N = 3, n ≥ 3). Este nível de ativaçã o foi semelhante ao observado com os agonistas
do canal iô nico cloreto forscolina (200 μM) e RP107 (100 μM), que aumentaram a
atividade do canal iô nico cloreto em 5,4 ± 0,5 e 8,2 ± 1,0 vezes, respectivamente, em
comparaçã o com o veículo nã o tratado controles ( p < 0,001). Outros NSPs de plantas
dietéticas (a 5 mg/ml), previamente demonstrados como tendo pouca ou nenhuma açã o
inibitó ria sobre C. difficileadesã o à s células Caco-2, exibiram menos eficá cia com NSP de
aveia e feijã o, aumentando a atividade do canal de íons cloreto em níveis muito mais
baixos (2,2 ± 0,6 e 2,0 ± 0,3 vezes, respectivamente; ambos p < 0,001), com tomate, pêra,
sino pimenta e maçã NSP realmente reduzindo a atividade do canal de íons cloreto em
comparaçã o com os controles nã o tratados (ver Figura Suplementar S3 ). A atividade do
canal de íons cloreto em células Caco-2 induzida por 10 mg/ml de banana-da-terra NSP
foi significativamente inibida pelos inibidores NPPB e Inh-172 de maneira dose-
dependente; com níveis de pico de inibiçã o vistos usando 800 µM NPPB e 200 µM Inh-
172, reduzindo o efluxo de cloreto em 94,7 ± 10,0% e 86,9 ± 8,5%, respectivamente, em
comparaçã o com os controles tratados com veículo (ambos p< 0,001). No entanto, os
ensaios de interaçã o bacteriana indicaram que, na presença de NPPB ou Inh-172, o pré-
tratamento de células Caco-2 com 10 mg/ml de NSP de banana ainda possuía capacidade
significativa para reduzir a adesã o de C. difficile 80042. A adesão de C. difficile a células
Caco-2 foi significativamente diminuída quando tratada com agonista de canal iô nico de
cloreto.
RP107, com uma reduçã o observada na adesã o de 23,7 ± 9,0% (a 100 μM), de controles
tratados com veículo (definido em 100%) ( p < 0,01; teste de Kruskal-Wallis), com esta
açã o revertida na presença de íon cloreto antagonistas de canal NPPB ou Inh-172,
aumentando a adesã o bacteriana em 7,9 ± 8,1% e 4,5 ± 4,1%, respectivamente, acima do
nível observado nos controles (100%); veja a Figura Suplementar S3 ).

3.4 O efeito inibitó rio da banana NSP na adesã o de células epiteliais intestinais
de Clostridioides difficile é mediada principalmente pela fraçã o polissacarídica á cida
(rica em pectina)

A 5 mg/ml, a fraçã o polissacarídica á cida (rica em pectina) da banana NSP, bloqueou

significativamente a adesã o do isolado de C. difficile 080042 à linha celular intestinal
Caco-2 em 52,3 ± 7,2% ( p < 0,01), e estava em menos tão eficaz quanto a fibra solú vel de
banana nã o fracionada, que reduziu a adesã o em 62,3 ± 17,1% ( p < 0,01). Por outro
lado, o pré-tratamento de células Caco-2 com 5 mg/ml de fraçã o de polissacarídeo
neutro (nã o ligado a Q-Sepharose) de banana NSP mostrou capacidade
significativamente reduzida de inibir a adesã o epitelial de C. difficile (Figura 4).

FIGURA 4
A atividade inibitó ria do NSP solú vel da banana para bloquear a interaçã o C. difficile - epitélio intestinal do
hospedeiro está dentro de um componente polissacarídeo á cido (rico em pectina). A 5 mg/ml, a fraçã o
polissacarídica á cida purificada com Q-Sepharose de banana NSP bloqueou significativamente a adesã o de C.
difficile à s monocamadas de células Caco-2 [Caco2] confluentes, enquanto a fraçã o neutra nã o teve efeito
significativo em comparaçã o com o controle nã o tratado ( N = 3 experiências, n = 3 réplicas, ** p < 0,01, teste
de Kruskal-Wallis).

3.5 NSP solú vel de banana-da-terra inibe a aderência epitelial de esporos

de Clostridioides difficile

NSP solú vel de banana, a 10 mg/ml, reduziu significativamente a adesã o de todas as

cinco preparaçõ es de esporos isolados de C. difficile à s células Caco-2, com inibiçã o
variando de 27,9 ± 5,4% a 33,8 ± 6,9% (todos p ≤ 0,05, Kruskal -Teste de
Wallis); Vejomesa 2. O bloqueio de esporos foi menor do que o observado com a bactéria
vegetativa C. difficile correspondente , da qual os esporos foram purificados, no mesmo
MOI 100, onde a pré-incubaçã o com 10 mg/ml de banana NSP resultou em inibiçã o
variando de 78,9 ± 3,1% para 97,9 ± 1,5% (para todos, p < 0,001). Vale ressaltar que os
esporos de C. difficile (de todos os isolados) apresentaram adesã o marcadamente maior
à s células Caco-2 (85 ± 7,3% versus 4,0 ± 0,6% de adesã o do inó culo original de esporos
e células vegetativas (1 × 10 7  UFC/ ml), respectivamente; N = 5 isolados).

MESA 2
NSP solú vel de banana inibe a adesã o epitelial de esporos de C. difficile e células vegetativas.

C. cepa % de redução na adesão de esporos com % de redução na adesão de C. difficile com

difficile banana NSP a banana NSP a
98011 30,3 ± 5,2* 93,4 ± 1,9***
108536 33,8 ± 6,9* 92,6 ± 4,3***
108526 27,9 ± 5,4** 86,7 ± 2,0***
98220 29,9 ± 8,9** 78,9 ± 3,1***
1342 32,8 ± 14,9** 97,9 ± 1,5***
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a
 Reduçã o na adesã o de esporos isolados de C. difficile purificados e células vegetativas a células Caco-2
expressas como uma porcentagem de controles nã o tratados, definida como 100%. As células Caco-2 foram
pré-tratadas com 10 mg/ml de polissacarídeos sem amido (NSP) de banana-da-terra por 30 min antes da
inoculaçã o (1 × 10 7  UFC/ml; multiplicidade de infecçã o, MOI 100). Diferenças significativas dos controles nã o
tratados, * p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001 (dados expressos como média ± SEM para N = 2-4
experimentos, n = 3 réplicas; teste de Kruskal-Wallis).

3.5 NSP solú vel da banana reduz a inflamaçã o e a citotoxicidade induzidas por
toxina A/B por Clostridioides difficile , mas nã o bloqueia a monoglicosilaçã o Rac1
mediada por toxina nas células epiteliais intestinais
3.5.1 Bloqueio de NSP de banana -da -terra da inflamaçã o induzida por toxina A/B de Clostridioides difficile

 As toxinas A (TcdA) e B (TcdB) de C. difficile provocaram aumentos dependentes da dose

na liberaçã o da citocina pró -inflamató ria IL-8 de células Caco-2, que foram observadas
como significativamente bloqueadas por 30 min de pré-tratamento com 10 mg/ml de
banana-da-terra NSP. A resposta induzida pelo pico observada com 100 ng/ml de TcdA
(445,1 ± 30,9 pg/ml de IL-8 liberada) foi reduzida em 10 mg/ml de NSP de banana para
270,9 ± 21,1 pg/ml ( p < 0,001; N = 2, n = 3; Kruskal-Wallis). Tratamento de células Caco-
2 com C. difficile 98011 (TcdA + , TcdB + e CDT +) em MOI 100 por 4 h, a liberaçã o de IL-8
aumentou de níveis basais de 206,7 ± 7,8 pg/ml para 915,5 ± 20,6 pg/ml, e na presença
de 10 mg/ml de banana NSP, C. difficile mediada por IL-8 a liberaçã o foi diminuída para
683,6 ± 63,7 pg/ml ( p < 0,05); VejoFigura 5A. Da mesma forma, a liberaçã o de 100
ng/ml de IL-8 induzida por TcdB também foi bloqueada por NSP de banana de 228,2 ±
18,5 pg/ml a 96,0 ± 3,3 pg/ml (ambos p < 0,001; N = 2, n = 3; teste de Kruskal-Wallis). É
importante notar que a resposta de IL-8 observada 4 h apó s a infecçã o com o C.
difficile 108519 (expressando apenas TcdB) foi menor (em apenas 366,5 ± 31,0 pg/ml)
do que a observada com C. difficile 98011 expressando todas as três toxinas ( p <
0,001). O pré-tratamento com 10 mg/ml de NSP de banana também diminuiu a
libertaçã o de IL-8 mediada por C. difficile 108519 (TcdB + apenas) a partir de células
Caco-2 (diminuiçã o de 2,8 vezes; p < 0,001);Figura 5B. Notou-se também que
monocamadas de células Caco-2 que foram submetidas a pré-tratamento com 10 mg/ml
de banana-da-terra NSP, mas nã o receberam tratamento subsequente com toxinas de C.
difficile nem bactérias, mostraram diminuiçõ es acentuadas nos níveis basais secretados
de IL-8;Figuras 5A,B.

FIGURA 5
A NSP solú vel da banana reduz a bactéria C. difficile e a toxina A e a inflamaçã o mediada pela toxina B,
apoptose celular e citotoxicidade nas células epiteliais intestinais. Monocamadas de células Caco-2 foram
tratadas com toxinas C. difficile A (TcdA) ou toxina B (TcdB), a 1-100 ng/ml por 24 h, na ausência (barras
pretas) ou na presença de 10 mg/ml de banana-da-terra NSP (barras brancas). Em paralelo, as células Caco-2
foram infectadas com o isolado 98011 de TcdA+/TcdB+/CDT + C. difficile ou o TcdB + C. difficileisolar 108519,
em uma multiplicidade de infecçã o (MOI) de 100 por 4 h, novamente na ausência ou presença de banana
NSP. O meio colhido das células foi analisado quanto à liberaçã o de IL-8 (por ELISA) e marcador de
citotoxicidade adenilato quinase (por bioensaio Toxilight). A morte celular apoptó tica foi medida usando o
ensaio Caspase Glo 3/7. Na presença de banana NSP, liberaçã o de IL-8 mediada por TcdA e TcdB (A,B) ,
ativaçã o de caspase 3/7 (C,D) e (E,F) citotoxicidade (liberaçã o de adenilato quinase intracelular) foram todos
significativamente reduzido ( N = 2, n = 3; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; teste de Kruskal-Wallis).

3.5.2 Bloqueio de NSP de banana -da-terra de Clostridioides difficile e citotoxicidade induzida por toxina

 A bactéria C. difficile e a apoptose mediada por toxina (ativaçã o de caspase-3/7)

também foi monitorada na ausência e presença de NSP de banana-da-terra. As toxinas de
C. difficile induziram a ativaçã o da caspase-3 celular de maneira dose-dependente, com
pico de resposta observado em 100 ng/ml para TcdA e TcdB (verFiguras 5C,D). De
acordo com a liberaçã o de IL-8 induzida pela toxina, a ativaçã o da caspase-3/7 foi maior
nas células Caco-2 que foram tratadas com TcdA. O pré-tratamento de células com 10
mg/ml de banana NSP resultou em uma diminuiçã o significativa na ativaçã o de caspase-
3/7 mediada por toxina (por exemplo, 100 ng/ml de TcdA, 63,8 ± 1,6% de reduçã o e 100
ng/ml de TcdB, 58,2 ± 10,4 % de reduçã o na ativaçã o da caspase3/7 (ambos p < 0,05)
Apó s 4 h de infecçã o das células Caco-2 com C. difficile 98011 (expressando todas as
toxinas), houve um aumento de 13,1 ± 3,3 vezes na ativaçã o da caspase-3/7 em em
comparaçã o com os controles nã o tratados. Na presença de 10 mg/ml de banana-da-
terra NSP, houve uma reduçã o significativa em C. difficileativaçã o de caspase-3/7
mediada por 98011 (reduçã o de 84,1 ± 7,0% em comparaçã o com a observada na
ausência de NSP de banana, p < 0,001; N = 2, n = 3; teste de Kruskal-Wallis); VejoFigura
5C. A atividade da caspase-3/7 celular também foi aumentada (10,1 ± 1,6 vezes) apó s a
infecçã o com C. difficile 108519 (apenas expressando TcdB), embora em um nível mais
baixo do que o observado com C. difficile 98011 (Figura 5D). Novamente, a pré-
incubaçã o com 10 mg/ml de banana NSP resultou em uma reduçã o acentuada (87,6 ±
1,4%) na ativaçã o de caspase 3/7 induzida por bactérias ( p < 0,001). Como foi visto com
a resposta de IL-8, houve uma pequena, mas notá vel, diminuiçã o na ativaçã o de caspase
3/7 em células pré-tratadas com banana NSP sozinha.

Como visto com outros efeitos mediados por toxinas, as toxinas de C. difficile TcdA e
TcdB evocaram um aumento dependente da dose na liberaçã o de adenilato quinase de
células Caco-2, com as respostas de pico observadas em 100 ng/ml para ambas as
toxinas (Figuras 5E,F). Novamente, a liberaçã o de adenilato quinase foi
significativamente maior em células tratadas com TcdA (aumento de 8,2 ± 0,9 vezes) em
comparaçã o com TcdB (aumento de 1,8 ± 0,2 vezes); p < 0,001; N = 2, n = 3. A pré-
incubaçã o com 10 mg/ml de banana NSP diminuiu significativamente a liberaçã o de
adenilato quinase em 1, 10 e 100 ng/ml de células tratadas com TcdA e TcdB (todas as
doses, p ≤ 0,01). Como exemplo, o pré-tratamento com banana NSP em células tratadas
com 100 ng/ml de TcdA e TcdB leva a uma diminuiçã o significativa na liberaçã o de
adenilato quinase em 63,3 ± 4,1% e 35,7 ± 9,2%, respectivamente (ambos p < 0,001;
verFiguras 5E,F). Apó s 4 h de infecçã o de células Caco-2 com C. difficile 98011, um
aumento de 8,9 ± 0,3 vezes foi observado na liberaçã o de adenilato quinase em
comparaçã o com controles não tratados, que foi significativamente diminuído em
células pré-incubadas com 10 mg/ml de banana-da-terra NSP (reduçã o de 47,3 ±
1,03%; p < 0,001;Figura 5E). Enquanto a liberaçã o de adenilato quinase aumentou 2,1 ±
0,3 vezes em células infectadas com C. difficile 108519 (expressando apenas TcdB), a
resposta foi menor do que a observada com C. difficile 98011 (expressando todas as
toxinas), com pré-incubaçã o de Caco- 2 células com 10 mg/ml de NSP de banana,
resultando em reduçã o significativa da liberaçã o de adenilato quinase celular (56,2 ±
1,9%) em comparaçã o com a observada na ausência de NSP de banana ( p < 0,001;Figura
5F). Em alguns experimentos, os níveis basais de liberaçã o de adenilato quinase
pareciam ser mais baixos em células Caco-2 que receberam apenas NSP de banana.

Tratamento de organoides intestinais 3-D derivados de células-tronco de camundongos

C57BL/6J com toxinas purificadas de C. difficile , tanto TcdA quanto TcdB, aumento do
arredondamento organoide dependente da dose (citotoxicidade) ao longo de 24 h. As
alteraçõ es morfoló gicas induzidas por 100 ng/ml de TcdA (pontuaçã o de circularidade,
0,64 ± 0,05 [média ± DP]) e TcdB (0,71 ± 0,09) foram semelhantes à s observadas apó s o
tratamento com 100 ng/ml de TNFα (0,71 ± 0,08); em comparaçã o com controles não
tratados (0,38 ± 0,03); N = 4; p < 0,01 ANOVA unidirecional, consulte a Figura
Suplementar S4. O pré-tratamento de organoides com 10 mg/ml de banana-da-terra
NSP 30 min antes da adiçã o da toxina reduziu o nível de citotoxicidade induzida por
todas as doses de TcdA e TcdB. A 100 ng/ml, a circularidade mediada por TcdA (0,69 ±
0,12) foi reduzida para 0,50 ± 0,13, e a circularidade induzida por TcdB foi reduzida de
0,72 ± 0,10 para 0,54 ± 0,12]; N = 4; ambos p < 0,01 (verFigura 6). Os níveis de
quimiocina CXCL1/KC liberados de forma dependente da dose para o meio a partir de
organoides tratados com toxina também foram reduzidos pelo pré-tratamento de
culturas com 10 mg/ml de banana-da-terra NSP. CXCL1/KC liberado de organoides
tratados com 100 ng/ml de TcdA ou TcdB (409,4 ± 31,7 pg/ml ou 532,9 ± 28,1 pg/ml
liberado para a mídia em 24 h) foram reduzidos com banana NSP em 67,7 ± 4,3 pg/ml e
65,8 ± 4,8 pg/ml respectivamente; ambos p < 0,01 ANOVA de uma via.

FIGURA 6
NSP solú vel de banana inibe a citotoxicidade induzida pela toxina C. difficile em organoides derivados de
células-tronco da cripta intestinal. As culturas organoides intestinais foram pré-tratadas por 30 min com 10
mg/ml de banana-da-terra NSP antes do tratamento com 10 e 100 ng/ml de toxinas de C. difficile , (A) TcdA
ou (B) TcdB. A banana NSP reduziu significativamente a citotoxicidade induzida por TcdA e TcdB (conforme
avaliado pela pontuaçã o de arredondamento/circularidade) em comparaçã o com os controles pré-tratados
com veículo (PBS estéril, pH 7,3). O arredondamento organoide foi quantificado conforme descrito
anteriormente ( Parsons et al., 2015 ), com valores de circularidade possíveis entre 0 e 1, e onde uma
pontuaçã o de 1 indica um círculo perfeito. Dados expressos como média ± DP ( N= 4). Diferenças significativas
##  ### 
de resposta induzida por toxina para controles nã o tratados,  p < 0,01,  p < 0,001 e banana NSP versus
controles pré-tratados com veículo; ** p < 0,01; One-way ANOVA, com teste post-hoc de Dunnett.

3.5.3 Banana NSP Não Bloqueia Clostridioides difficile Glucosilaçã o Intracelular Induzida por Toxina A e Toxina B
de Rac1
Tratamento de células Caco-2 com 10 ng/ml de TcdA níveis celulares elevados de Rac1
monoglicosilado (como indicado por uma perda de ligaçã o do clone de anticorpo 102 a
Rac1) 10 h apó s o tratamento com a toxina, com pico de monoglicosilaçã o de Rac1
observado em 24 h em comparaçã o com células de controle tratadas com veículo; N =
3, n = 3; p < 0,01 (ver Figura Suplementar S5 ). O tratamento de células com 10 ng/ml de
TcdB também revelou níveis celulares elevados de Rac1 mono-glicosilado, mas isso foi
significativo apenas 48 h apó s o tratamento com a toxina; N = 3, n = 3; p < 0,01
(ver Figura Suplementar S5). Notavelmente, nem a monoglicosilaçã o mediada por TcdA
nem por TcdB de Rac1 intracelular foi observada como bloqueada em células Caco-2
pré-tratadas com 10 mg/ml de NSP de banana (verFigura 7).
FIGURA 7
As toxinas A e B de C. difficile mediam o aumento da glicosilaçã o de Rac1 nas células epiteliais intestinais, que
nã o é afetada pelo pré-tratamento com NSP solú vel de banana. A aná lise de imunotransferência mostra um
aumento na glicosilaçã o de Rac1 apó s o tratamento com 10 ng/ml (A) de toxina A (TcdA) por 24 h e (B) toxina
B (TcdB) por 48 h, que nã o é afetada pelo pré-tratamento de Caco-2 células com 10 mg/ml de banana-da-terra
solú vel NSP (P). As bandas de proteína foram analisadas por densitometria de imagem de
quimioluminescência. Os níveis de Rac1 monoglicosilados (avaliados com o anticorpo 102) foram
normalizados para Rac1 total (avaliado com o anticorpo 238a), com blots representativos mostrados para N =
3 experimentos, n= 3 repetiçõ es. Diferenças significativas dos controles nã o tratados com toxina, * p < 0,05,
** p < 0,01 e *** p < 0,001; Teste de Kruskal-Wallis.

3.6 Pré-tratamento com banana NSP reduz os efeitos patogênicos da toxina biná ria
de Clostridioides difficile em células epiteliais intestinais

O tratamento de colonó citos SW480 com toxina biná ria de C. difficile (CDT) aumentou a
citotoxicidade dependente da dose, conforme medido pela atividade de caspase 3/7
aumentada, com pico de resposta observado em 10 ng/ml CDT (283.890 ± 125.878 RFU)
em comparaçã o com controles não tratados, 109.333 ± 35.941 ( p < 0,05 teste de
Kruskal-Wallis; N = 2, n = 3). O pré-tratamento com banana NSP inibiu a citotoxicidade
dependente da dose induzida por CDT, com pico de reduçã o nos colonó citos SW480
tratados com toxina ocorrendo a 100 ng/ml de CDT (259.914 ± 67.103 RFU) que foi
reduzido em >70% para 73.060 ± 53.767 ( N = 2, n = 3; p < 0,001); VejoFigura 8A. Da
mesma forma, o tratamento com CDT também efetuou um aumento dependente da dose
na liberaçã o de IL-8 pró -inflamató ria de células SW480, com pico de resposta observado
em 100 ng/ml de CDT (1041,92 ± 84,11 pg/ml/24 h) em comparaçã o com controles não
tratados , 27,33 ± 10,81 pg/ml/24 h ( p < 0,001). Novamente, foi visto que o pré-
tratamento com banana NSP inibiu as açõ es dependentes da dose de CDT, com pico de
liberaçã o de IL-8 em colonó citos SW480 tratados com toxina ocorrendo a 100 ng/ml de
CDT reduzido em aproximadamente 50%, para 540,67 ± 41,21 pg/ml ( p <
0,001); VejoFigura 8B.

FIGURA 8
NSP solú vel de banana contra as açõ es patogênicas da toxina biná ria de C. difficile (CDT) em colonó citos
humanos. O tratamento da linhagem de células colô nicas SW480 com toxina biná ria de C. difficile (CDT, 1-100
ng/ml por 24 h) resultou em induçã o dependente da dose de (A) apoptose e (B) inflamaçã o, que foi
significativamente atenuada com banana-da-terra Pré-tratamento com NSP (a 10 mg/ml por 30 min). A
apoptose foi avaliada pelo ensaio de caspase 3/7 Glo (RFU, unidades de emissã o de fluorescência relativa), e a
citocina pró -inflamató ria IL-8 secretada para o meio de cultura foi avaliada por ELISA. Dados expressos como
## p
média ± DP. Diferenças significativas de células tratadas com toxina de controles nã o tratados; #p < 0,05,   <
### 
0,01,  p < 0,001 e entre NSP de banana e células pré-tratadas com veículo, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p <
0,001; teste de Kruskal-Wallis; N = 2 experiências, n = 3 réplicas.

A CDT também foi observada para induzir a liberaçã o de IL-8 inflamató ria das células do
Intestino-407, em concentraçõ es de teste de 10 e 100 ng/ml ao longo de 24 h (ambos p <
0,001 ANOVA de uma via; N = 2, n = 3). A pré-incubaçã o de células do Intestino-407 com
10 mg/ml de banana-da-terra NSP, reduziu a quantidade de IL-8 liberada para o meio
em 10 e 100 ng/ml de CDT (ambos p < 0,01; N = 2, n = 3 Kruskal -teste de
Wallis). Banana NSP também foi eficaz na reduçã o da citotoxicidade do Intestino-407
induzida por CDT ( p < 0,05). Nenhuma atividade inibitó ria foi observada com pré-
tratamento usando 10 mg/ml de NSP de aveia; veja a Figura Suplementar S6 ).

Vamos para:

4. Discussã o

A fibra dietética é amplamente reconhecida como benéfica para a saú de intestinal. Uma

alta ingestã o de fibra dietética aumenta o volume e a viscosidade fecal, resultando em
menor tempo de trâ nsito através do có lon ( Lattimer e Haub, 2010 ). Além disso, sua
fermentaçã o pela microbiota intestinal residente produz á cidos graxos de cadeia curta
(AGCCs), como o butirato, que atuam como fonte de energia para o epitélio intestinal
( Kumar et al., 2020 ) e possuem propriedades anticancerígenas ( Chapkin et al. .,
2020 ). A fibra também atraiu considerá vel atençã o devido ao seu papel no efeito
prebió tico, onde pode promover seletivamente o crescimento de bactérias benéficas
residentes, por meio da geraçã o de butirato para apoiar a saú de intestinal ( Simpson e
Campbell, 2015 ;Kumar et al., 2020 ). Aqui, sugerimos ainda um papel alternativo da
fibra alimentar solú vel como um “contrabió tico”, ou seja, contrariando a açã o dos
micró bios ( Flanagan et al., 2011 ; Kumar et al., 2020 ).

Nestes estudos, fornecemos evidências adicionais que suportam o efeito inibitó rio da
banana NSP contra a adesã o de pató genos diarreicos, especificamente em relaçã o a C.
difficile . Em outros experimentos de validaçã o, a banana NSP inibiu consistentemente a
aderência epitelial de uma série de isolados de C. difficile clinicamente relevantes. Como
esses isolados variaram de acordo com seu ribotipo e status de toxina, nossos resultados
sugeriram que a atividade inibitó ria da banana NSP é provavelmente independente
desses dois fatores. Demonstramos que, embora uma variedade de fibras solú veis em
plantas iniba significativamente a adesã o epitelial de C. difficile, a banana NSP exibe um
efeito inibitó rio particularmente forte. Isso é consistente com seu bloqueio superior de
adesã o e invasã o por uma série de outros pató genos, incluindo vá rias espécies de E.
coli e Salmonella . Outras evidências que apoiam o efeito protetor da banana contra a
doença diarreica incluem ensaios controlados randomizados nos quais o suco de banana
verde cozida mostrou ser eficaz em uma variedade de doenças diarreicas ( Rabani et al.,
2001 ; Rabbani et al., 2004 ; Alvarez-Acosta et al., 2009 ).

Aqui, também fornecemos mais informaçõ es sobre o mecanismo da açã o inibitó ria de
polissacarídeos nã o amilá ceos solú veis em banana. Apresentamos dados indicando que
a fibra dietética solú vel de banana provavelmente exerce seu efeito inibitó rio contra C.
difficile através de uma interaçã o com o epitélio intestinal, em vez de interaçã o com
adesinas bacterianas. Isso é semelhante ao mecanismo que relatamos anteriormente
para o bloqueio de NSP de banana de Salmonella spp. adesã o e invasã o nas células
epiteliais intestinais ( Parsons et al., 2014 ). Usando experimentos de câ mara também
mostraram que o pré-tratamento do íleo terminal humano com banana NSP gerou um
aumento na corrente de curto-circuito transmucosa (I sc), indicativo de efluxo de íons
cloreto eletrogênico e transporte de á gua associado ( Parsons et al., 2014 ). A secreçã o
epitelial de fluido já é reconhecida como uma forma de imunidade inata, pensada para
servir como um método nã o específico de limpeza de bactérias e suas toxinas da mucosa
intestinal ( Keely et al., 2011 ). Portanto, é plausível que a banana NSP possa agir dessa
maneira para reduzir C. difficileadesã o epitelial. Descobrimos que a banana NSP
aumentou o efluxo de íons cloreto das monocamadas de células Caco-2 de maneira
dependente da dose. Devido a quantidades limitadas disponíveis de outras fontes de
NSP de plantas dietéticas, só pudemos testar sua capacidade de induzir a atividade do
canal iô nico de cloreto de células epiteliais em uma dose de 5 mg/ml. Em comparaçã o
com a banana NSP neste nível, que mostrou aproximadamente 70% de inibiçã o da
adesã o bacteriana e aumento de 4 vezes na atividade do canal de íons cloreto, outras
fontes de NSP de plantas dietéticas, que mostraram nã o exibir um efeito inibitó rio na
adesã o bacteriana, tiveram um efeito mais fraco ou nada disso, atividade. No entanto,
enquanto mostramos que a atividade elevada do canal iô nico de cloreto das células
epiteliais induzida pela banana NSP pode ser significativamente suprimida na presença
de antagonistas do canal iô nico de cloreto, sob essas mesmas condiçõ es,C. difficile -
adesã o de células epiteliais. Serã o necessá rias mais informaçõ es sobre a açã o da banana
NSP nos principais transportadores de íons cloreto no intestino e no có lon, juntamente
com ensaios de adesã o bacteriana in vitro .

Em nossos estudos in vitro apresentados aqui, apenas NSP solú vel de uma dicotiledô nea
- bró colis - e do alho-poró monocotiledô neo nã o commelinó ide mostraram efeitos
inibitó rios contra interaçõ es epiteliais de C. difficile compará veis ao NSP de banana (uma
monocotiledô nea commelinó ide). NSP das outras oito dicotiledô neas testadas e da aveia
monocotiledô nea commelinó ide foram principalmente ineficazes, ou mostraram baixa
eficá cia na melhor das hipó teses. Que os efeitos inibitó rios desejados possam ser obtidos
utilizando NSP de dicotiledô neas, monocotiledô neas commelinó ides e nã o
commelinó ides, sugere que a eficá cia nã o está relacionada ao tipo de parede celular. As
dicotiledô neas e as monocotiledô neas não commelinó ides têm paredes celulares do tipo
I, formadas a partir de uma rede reticulada, mas relativamente aberta, de celulose e
xiloglucanos, com quantidades menores de arabinoxilanos, glucomananos e
galactoglucomananos ligados.Vogel, 2008 ; Pattathil et al., 2015 ). Uma matriz à base de
pectina envolve a rede celulose-xiloglucana, contribuindo com até um terço do peso seco
da parede celular. As pectinas podem ser subdivididas em três grupos
distintos; homogalacturonan e ramnogalacturonans, RGI e RGII ( Fry, 2004 ; Atmodjo et
al., 2013 ). Esses polímeros sã o ligados covalentemente, com os ramnogalacturonanos
tipicamente contendo uma alta proporçã o de açú cares neutros, como arabinose,
ramnose e galactose ( Fry, 2011 ). As monocotiledô neas commelinó ides têm paredes
celulares do tipo II; Estes sã o compostos de uma rede compacta de
glucuronoarabinoxilanos, glucanos de ligaçã o mista, como β-glucanos, e uma quantidade
relativamente maior de celulose, em comparaçã o com as paredes do tipo I.Cui e Wang,
2009 ). As paredes celulares do tipo II sã o relativamente pobres em pectina,
especialmente nas Poaceae, mas sabe-se que as pectinas ocorrem em maiores
quantidades em bananas e plá tanos. Assim, é evidente que as preparaçõ es inibitó rias de
NSP descobertas em nosso trabalho, derivadas de diferentes tipos de parede celular,
podem ter composiçõ es de polissacarídeos muito diferentes. A partir dos dados
discutidos, é difícil descobrir se a inibiçã o das interaçõ es C. difficile -epitelial por banana,
brócolis e alho-poró NSP tem uma causa comum, ou se os efeitos observados são devidos a
interações polissacarídicas completamente diferentes.

No entanto, em trabalhos adicionais apresentados aqui, a atividade inibitó ria da banana

NSP contra a interaçã o C. difficile -epitelial é devido à fraçã o á cida (ou rica em pectina)
dentro desta fibra dietética solú vel em particular, enquanto pouca ou nenhuma inibiçã o
ocorreu com a fraçã o neutra (a maior proporçã o do total NSP). Esses resultados também
suportam o bloqueio observado de Salmonella Typhimurium à s células epiteliais
intestinais com a fraçã o á cida da banana NSP ( Parsons et al., 2014). O componente de
pectina da banana NSP é conhecido por conter quantidades significativas de
homogalacturonan e quantidades muito menores de RG-I; nossos estudos anteriores
mostraram que a atividade inibitó ria associada à fraçã o á cida da banana NSP está ligada
ao componente homogalacturonan (nenhum RG-I/RG-II foi detectado na fraçã o ativa)
( Parsons et al., 2014 ). Isso é interessante, porque a pectina solú vel em á gua do bró colis
é composta de pectina nã o ramificada e altamente esterificada (homogalacturonan) ao
lado de polímeros pécticos menos abundantes com cadeias laterais menos esterificadas
( Christiaens et al., 2011).), e a pectina de alho-poró consiste em grande parte de
homogalacturonano metil-esterificado relativamente alto com quantidades menores de
RG-I decorado com cadeias laterais ricas em galactose ( Ognyanov et al., 2020 ). Em
contraste, as pectinas das dicotiledô neas que nã o mostraram atividade inibitó ria
significativa contra interaçõ es epiteliais de C. difficile - morango, mirtilo, tomate, aipo,
feijã o, pêra e maçã - foram relatadas como contendo subtipos RG-I e II em proporçõ es
significativas, com menos homogalacturonan nã o ramificado ( Lefever et al., 2004 ; Wu
et al., 2020 ; Hotchkiss et al., 2021); e aveia NSP contém quase nenhuma pectina. É
possível que o teor de homogalacturonan de banana, bró colis e alho-poró NSP possa ser
uma semelhança subjacente à atividade inibitó ria mostrada, embora na atual ausência
de dados sobre bró colis e alho-poró NSP esta seja claramente uma hipó tese
especulativa. Em trabalhos futuros, será interessante examinar se a proporçã o de
homogalacturonan em polissacarídeos pécticos tem relaçã o direta com o potencial
inibitó rio de NSP. Atualmente existe um forte foco no RG-I como fonte de
polissacarídeos dietéticos benéficos à saú de ( Wu et al., 2020 ), mas os polissacarídeos
pécticos estã o entre os mais complexos na parede celular da planta e nossos dados in
vitro mostram que outras possibilidades nã o deve ser esquecido.

Outros fatores dietéticos ricos em oligossacarídeos complexos, como o leite humano,

também estã o bem estabelecidos como sendo capazes de prevenir interaçõ es bactéria-
epitélio hospedeiro ( Asadpoor et al., 2020 ), inibindo a adesã o de bactérias
como Campylobacter jejuni e Salmonella enterica ( Asadpoor et al., 2020). al., 2020 ), E.
coli difusamente aderente (DAEC) ( Nascimento de Araú jo e Giugliano, 2000 ) e E.
coli enteroagregativa (EAEC) ( Nascimento de Araú jo e Giugliano, 2000 ). Mais
especificamente, os oligossacarídeos pécticos também demonstraram inibir a aderência
epitelial intestinal de C. jejuni in vitro( Ganan et al., 2010 ). Além disso, a pectina do
ginseng demonstrou possuir atividade antiadesiva contra outros pató genos intestinais,
como Helicobacter pylori , e alguma capacidade de inibir a hemaglutinaçã o por bactérias,
incluindo a causada por Staphylococcus aureus e Propionibacterium acnes ( Lee et al.,
2006a ) . . Um extrato polissacarídeo á cido do chá verde ( Camellia sinensis ) também
demonstrou possuir atividade inibitó ria, bloqueando a adesã o de H. pylori, bem como
de S. aureus e P. acnes ( Lee et al., 2006b ).

É uma suposiçã o razoá vel que a fibra solú vel ingerida da banana deve passar intacta
pelo intestino delgado humano. Dada uma passagem típica de aproximadamente 1 L de
líquido por dia para o ceco, uma ingestã o diá ria de 10 g de fibra solú vel deve, portanto,
resultar em uma concentraçã o de 10 mg/ml, conforme testado aqui, no ceco, mas é
prová vel que ser fermentado muito rapidamente ( Roberts et al., 2010 ). De acordo com
isso, é notá vel que o grande estudo de coorte EPIC mostrou um efeito protetor da fibra
alimentar contra o câ ncer de có lon proximal, mas não distal ( Murphy et al., 2012) e o
estudo de coorte Nurses' Health mostraram um efeito protetor da fibra de frutas contra
a doença de Crohn, que geralmente afeta o íleo e o ceco, mas não contra a colite
ulcerativa, que geralmente afeta o có lon distal e o reto ( Ananthakrishnan et al.,
2013 ) . É plausível, no entanto, que a taxa de fermentaçã o da fibra de banana possa ser
consideravelmente diminuída durante a doença diarreica, permitindo assim um efeito
protetor no có lon distal.

Embora exista controvérsia sobre se as cepas epidêmicas de C. difficile realmente têm

taxas de esporulaçã o significativamente altas ( Akerlund et al., 2008 ; Burns et al.,
2010 ; Merrigan et al., 2010 ), estudos sugerem que os esporos de C. difficile podem em
fato persistem no trato intestinal devido à sua capacidade de interagir e aderir ao
epitélio intestinal ( Paredes-Sabja e Sarker, 2012 ). Em nossos estudos, observamos que
85% dos esporos de C. difficile aderiram à s células Caco-2 intestinais humanas, em
comparaçã o com apenas 4% de C. difficilecélulas vegetativas. Nossos resultados estã o de
acordo com os de estudos anteriores, que também mostraram que os esporos de C.
difficile sã o muito mais adesivos para monocamadas de células Caco-2 ( Dingle et al.,
2010 ; Paredes-Sabja e Sarker, 2012 ) e fornecem mais evidências para sugerir que a
aderência de esporos pode ser explorada por C. difficile como um meio de persistência
no hospedeiro. Vale ressaltar que o procedimento de purificaçã o para obtençã o de
esporos de C. difficile inclui tratamento com proteinase K, removendo proteínas da
camada externa de exosporium ( Escobar-Cortés et al., 2013 ). Isso não só aumenta a
aderência de C. difficileesporos, tanto para superfícies inertes quanto para células
epiteliais intestinais em cultura, incluindo Caco-2, mas também aumenta a eficiência de
formaçã o de colô nias ( Escobar-Cortés et al., 2013 ). Especula-se que o exosporium atue
fisicamente para retardar o escape de uma nova célula vegetativa de um esporo
germinado, de modo a permitir o tempo correto de crescimento e colonizaçã o do
epitélio intestinal ( Escobar-Cortés et al., 2013 ). O baixo nível de interaçã o de células
vegetativas com monocamadas de células intestinais em cultura, em comparaçã o com o
observado para esporos, também pode refletir que C. difficile , embora capaz de
germinar em um ambiente aeró bio, nã o pode crescer e se dividir na presença dos níveis
de oxigênio visto para cultura de monocamada de linha celular (Sorg e Sonenshein,
2010 ), embora em nossos ensaios de infecçã o, a exposiçã o tenha sido relativamente
curta, mais de 2 h. Modelos recentes de tecidos intestinais humanos 3D de
bioengenharia que recapitulam as condiçõ es mais baixas de O 2 produzidas no lú men
desses tecidos ( Shaban et al., 2018 ) podem apoiar melhor estudos de longo prazo de
células vegetativas de C. difficile e interaçõ es esporo-epitélio sob condiçõ es
anaeró bicas. Talvez mais importante, nossos resultados demonstram que NSP solú vel de
banana inibe significativamente a adesã o epitelial de esporos de C. difficile . Persistência
de C. difficileesporos no có lon de pacientes com CDI nã o apenas complicam as opçõ es de
tratamento, mas também aumentam as taxas de recorrência associadas à doença
( Castro-Có rdova et al., 2021 ) e aumentam o potencial de transmissã o de C. difficile a
outros pacientes, mesmo apó s a resoluçã o da diarreia ( Crobach et al., 2018 ). De fato,
25-85% de todas as recorrências de CDI sã o atribuídas à cepa de C. difficile que causou a
infecçã o inicial ( Oka et al., 2012 ). Nossos resultados sã o, portanto, muito promissores
em relaçã o ao potencial terapêutico da fibra alimentar solú vel da banana e sugerem que
seu uso como suplemento dietético também pode ajudar a manter a remissã o da CDI
recorrente.

Como C. difficile e suas toxinas interagem com o epitélio intestinal e possuem atividade
de lectina, hipotetizamos que era altamente provável que NSP solú vel de banana
também pudesse inibir a açã o de C. difficile TcdA, TcdB e CDT no epitélio
intestinal. Estudos anteriores de monitoramento da monoglicosilaçã o de Rho-GTPases
focaram em Rac1 devido ao fato de sua inativaçã o ter sido considerada o principal
mecanismo responsá vel pelos efeitos citopá ticos das toxinas TcdA e TcdB de C. difficile
( Popoff e Geny, 2011 ). A monoglicosilaçã o Rac1 mediada por TcdA e TcdB foi
previamente investigada em colonó citos HT29 ( Gerhard et al., 2008) através do
monitoramento do nível de Rac1 celular usando o anticorpo anti-Rac1 102, que
prejudicou o reconhecimento de Rac1 apó s sua monoglicosilaçã o, na posiçã o 35 da
treonina, dando uma aparente diminuiçã o nos níveis de Rac1. Em nossos estudos,
descobrimos que o tratamento de células Caco-2 com 10 ng/ml de C difficile TcdA ou
TcdB resultou em aumento da monoglicosilaçã o de Rac1 celular, conforme medido por
uma diminuiçã o na ligaçã o do anticorpo anti-Rac1 102. Observamos que a atividade
mediada por TcdA e TcdB intracelular não foi afetada pelo pré-tratamento com NSP
solú vel de banana. Outros estudos forneceram evidências de pequenas moléculas de
fontes naturais com atividade contra C. difficile ( Tam et al., 2015 ; Pal e Seleem, 2020),
incluindo alguns baseados em derivados de chá e flavonó ides que podem reduzir
diretamente o dano celular induzido pela toxina C. difficile glucosilante provavelmente
através do bloqueio da atividade da glicosiltransferase e hidrolase ( Tam et al., 2015 ),
destacando a importante necessidade de talvez considerar a combinaçã o não- terapias
baseadas em antibió ticos para tratamento e prevençã o profilá tica de CDI.

Outros efeitos mediados pela toxina de C. difficile incluem a induçã o da resposta pró -
inflamató ria ( Kim et al., 2006 ; Zemljic et al., 2010 ), bem como a ativaçã o da apoptose
( Gerhard et al., 2008). Em nossos estudos, o tratamento de células Caco-2 com TcdA ou
TcdB aumentou a liberaçã o de IL-8 celular (ou KC, de organoides de camundongo) e a
ativaçã o de caspase-3 de maneira dose-dependente. Curiosamente, a resposta celular à
toxina foi ligeiramente maior nas células Caco-2 que foram tratadas com TcdA. De fato,
tem havido um grande debate sobre a importâ ncia individual de TcdA e TcdB durante o
curso da infecçã o clínica, e existem muitos estudos conflitantes. Embora nossos
resultados estejam de acordo com estudos que sugerem que o TcdA apresenta maior
potência e citotoxicidade in vitro ( Poutanen e Simor, 2004 ; Kuehne et al., 2010 ), outros
destacam que o TcdB é a toxina mais potente ( Shen, 2012 ). Na Vivoexperimentos com
animais também criaram debate sobre a importâ ncia de TcdA e TcdB; enquanto que
mutantes isogênicos TcdA + , TcdB − usados em um estudo de Keuhne e colaboradores
foram capazes de induzir um efeito patogênico in vivo ( Kuehne et al., 2010 ), em um
estudo de Lyras et al. , observou-se que as cepas mutantes equivalentes eram
avirulentas ( Lyras et al., 2009 ). As cepas TcdA − , TcdB + C. difficile sã o rotineiramente
isoladas de pacientes com CDI e sã o capazes de causar doença extensa ( Voth e Ballard,
2005 ), enquanto muito poucas cepas TcdA + , TcdB − foram relatadas (Kuehne et al.,
2010 ). Isso sugere que tanto o TcdA quanto o TcdB provavelmente desempenham um
papel importante na patogênese da CDI. Nossos resultados demonstram que enquanto a
infecçã o de células Caco-2 com uma cepa TcdA − , TcdB + C. difficile monta uma resposta
celular considerá vel, a resposta é muito maior quando as células sã o tratadas com uma
cepa TcdA + , TcdB + C. difficile , sugerindo que eles poderiam de fato trabalhar juntos em
sinergia para produzir um efeito aditivo. Para CDT, mostramos em nossos estudos, que
esta toxina biná ria foi muito potente na induçã o da liberaçã o pró -inflamató ria de IL-8 de
colonó citos SW480 humanos e células Intestina-407.

Curiosamente, nossos resultados indicam que a banana NSP reduz a resposta celular
evocada de IL-8 e a ativaçã o da caspase-3 em células tratadas com TcdA, TcdB ou CDT
purificado, bem como aquelas infectadas com toxina positiva e toxina negativa C.
difficileDeformaçã o. As respostas basais também foram observadas em linhagens
celulares pré-tratadas com banana NSP, sugerindo que a fibra dietética solú vel, e
particularmente seus componentes á cidos, podem ter um efeito protetor geral contra a
induçã o de uma resposta pró -inflamató ria, dano celular e apoptose. Como a banana NSP
parece nã o ter efeito direto na monoglicosilaçã o de Rac1 mediada por toxina, mas tem
um efeito mais geral contra a induçã o celular da resposta pró -inflamató ria e apoptose,
esses estudos indicam coletivamente que a banana NSP não inibe a atividade
intracelular específica de toxinas de C. difficile em células epiteliais intestinais. A
proximidade do C. difficile ao epitélio do hospedeiro é quase certamente necessá ria para
a liberaçã o da toxina.Sears e Kaper, 1996 ) e a prevençã o dessas interaçõ es deve,
portanto, ser de benefício terapêutico. Com a NSP da banana impedindo a adesã o e a
aposiçã o pró xima de C. difficile ao epitélio intestinal, especulamos que as toxinas
provavelmente nã o seriam liberadas em grande extensã o, para serem internalizadas
pelas células hospedeiras.

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5. Conclusã o

Em resumo, os polissacarídeos não amilá ceos solú veis em banana possuem a capacidade
de interromper as interaçõ es epiteliais de células vegetativas e esporos de C.
difficile . Isso sugere que a suplementaçã o dietética com fibra solú vel de banana pode
conferir um efeito protetor em pacientes com CDI ao prevenir a adesã o bacteriana à
mucosa, ou seja, um efeito “contrabió tico”. Mais especificamente, a banana NSP bloqueia
a adesã o de C. difficile , com atividade inibitó ria contra C. difficile encontrada no
componente polissacarídeo á cido (rico em pectina), por meio da interaçã o com o epitélio
intestinal. Mais estudos sã o necessá rios para confirmar as açõ es inibitó rias mediadas
por epitélio da banana NSP em outros modelos in vitro e relevantes in vivomodelos
( Best et al., 2012 ; Hutton et al., 2014 ; Pruss e Sonnenburg, 2021 ).

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Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Godfrey Smith (Medical Microbiology Royal Liverpool & Broadgreen
University Hospitals NHS Trust, Reino Unido) e Dr. Gillian Douce (Instituto de Infecçã o,
Imunidade e Inflamaçã o, Universidade de Glasgow, Reino Unido) por isolados adicionais
de C. difficile .  Nossos agradecimentos a Dave Berry, por seu suporte técnico no Henry
Wellcome Laboratories of Molecular & Cellular Gastroenterology, e pelo suporte técnico
da Unidade de Serviços Biomédicos (Universidade de Liverpool, Reino Unido). Também
somos gratos aos Drs Peter Laing, David O'Brien, Patrick Druggan e Helen Martin, todos
ex-funcioná rios da Provexis plc, pelo apoio adicional em pesquisa e desenvolvimento,
acesso a instalaçõ es laboratoriais, patrocínio e discussã o intelectual sobre os estudos.

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Declaraçã o de disponibilidade de dados

As contribuiçõ es originais apresentadas no estudo estã o incluídas no artigo/ Material
Suplementar , maiores dú vidas podem ser direcionadas ao autor correspondente.
Vamos para:

Declaraçã o de ética

Os estudos envolvendo animais foram revisados e aprovados pelo Home Office do Reino
Unido sob o nú mero PPL: PP5019347. Os camundongos foram sacrificados, de acordo
com o Anexo 1 da Lei de Animais (Procedimentos Científicos) de 1986, para obter tecido
para culturas de células primá rias in vitro .

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Contribuiçõ es do autor

BC, JR e NO'K; concepçã o, desenho e financiamento obtido. NO'K; fornecimento de

materiais. CL, CR, ET, HS, LT, NG, NO'K e PR; aquisiçã o de dados. BC, CD, CL, CR, ET, FM,
HS, LT, NG, NO'K, PR, SP e JR; Aná lise e interpretaçã o de dados. BC, CR, HS e SP; aná lise
estatística. BC, HS, NO'K e SP; redigiu o manuscrito. Todos os coautores leram, revisaram
criticamente o manuscrito quanto ao conteú do intelectual importante e concordaram
com a versã o publicada do manuscrito.

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Financiamento

HS foi apoiado por uma bolsa de estudos CASE Industrial do Conselho de Pesquisa em
Biotecnologia e Ciências Bioló gicas (BBSRC) para BC e JR (BB/I016783/1) investigando
o papel da fibra vegetal dietética solú vel na manutençã o da saú de intestinal e prevençã o
de doenças diarreicas. A CR foi apoiada por um prêmio da Universidade de Liverpool
Reach Out Growth Fund (ROGF-N0306). Apoio de pesquisa adicional foi fornecido a BC e
JR pela Fundaçã o Bo e Vera Ax:son Johnsson para Nature Medicine Ltd. O financiamento
para publicaçã o em Acesso Aberto foi disponibilizado para a Universidade de Liverpool
por meio de uma doaçã o em bloco do UKRI (UK Research Councils). Os financiadores
nã o tiveram nenhum papel no desenho do estudo; na coleta, aná lise ou interpretaçã o
dos dados; na redaçã o do manuscrito, nem na decisã o de publicar os resultados.

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Conflito de interesses

NO'K é um presente e CR um passado, funcioná rio da Provexis Plc. BC, HS e JR

receberam apoio financeiro adicional do parceiro de biotecnologia Provexis Plc como
parte da bolsa de estudos BBSRC Industrial CASE (BB/I016783/1). JR está listado como
inventor em patentes detidas pela Provexis Plc, em um contrato de licença com a
Universidade de Liverpool, para uso de oligossacarídeos complexos na prevençã o ou
tratamento de doença inflamató ria intestinal (US8945639B2) e para uso de fibras
solú veis em antibió ticos associados diarreia (US20120165289A1).

Os demais autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de qualquer

relaçã o comercial ou financeira que pudesse ser interpretada como potencial conflito de
interesses.

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Nota do editor
Todas as reivindicaçõ es expressas neste artigo sã o exclusivas dos autores e nã o
representam necessariamente as de suas organizaçõ es afiliadas, ou as do editor, dos
editores e dos revisores. Qualquer produto que possa ser avaliado neste artigo, ou
reclamaçã o que possa ser feita por seu fabricante, nã o é garantido ou endossado pelo
editor.

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Material suplementar

O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online

em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2021.766293/
full#supplementary-material

Figura Suplementar S1
Visualizaçã o de esporos de C. difficile purificados.

Figura Suplementar S2
A bananeira solú vel NSP atua no epitélio para inibir a interaçã o do pató geno diarreico C.
difficile.

Figura Complementar S3
A NSP da banana induz a atividade do canal iô nico de cloreto celular nas células
intestinais de uma maneira dependente da dose, mas a inibiçã o do efluxo de cloreto não
inibe o bloqueio da adesã o celular epitelial de C. difficile induzido pela NSP da banana.

Figura Complementar S4
O tratamento de organoides intestinais murinos com toxinas C. difficile A (TcdA) e B
(TcdB) induz o arredondamento celular.

Figura Suplementar S5
As toxinas A (TcdA) e B (TcdB) de C. difficile mediam a monoglicosilação de Rac1
intracelular em células epiteliais intestinais.

Figura Suplementar S6
A NSP de banana-da-terra solú vel reduz a inflamaçã o mediada por toxina biná ria de
C. difficile e a citotoxicidade em células do Intestino-407.

Tabela Complementar S1
Dados de composiçã o de polissacarídeos nã o amilá ceos (NSP) solú veis derivados de
fontes alimentares.

Tabela Complementar S2
 Características de esporulaçã o de isolados clínicos de C. difficile.

Clique aqui para arquivo de dados adicional. (289K, pdf)

Clique aqui para arquivo de dados adicional. (23K, DOCX)

Clique aqui para arquivo de dados adicional. (225K, pdf)

Clique aqui para arquivo de dados adicional. (295K, pdf)

Clique aqui para arquivo de dados adicional. (216K, pdf)

Clique aqui para arquivo de dados adicional. (331K, pdf)

Clique aqui para arquivo de dados adicional. (16K, DOCX)

Clique aqui para arquivo de dados adicional. (215K, pdf)

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