FERNANDA AIKO YUYAMA RODRIGUES

JOÃO EDUARDO DANIEL MARCELINO

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DE METABOLISMO

CELULAR:
INIBIÇÃO DA GLICÓLISE PELO FLUORETO

Londrina
2023
1 RESUMO

A Saccharomyces cerevisiae é uma levedura que realiza

fermentação alcóolica e oxidação de glicose pela glicólise, que é uma das vias
metabólicas centrais, no qual a glicose é convertida em duas moléculas de piruvato.
O fluoreto é um mineral natural, e uma forma iônica do flúor, utilizado,
principalmente, em cuidados bucais. O cultivo da Saccharomyces cerevisiae em
meio de cultura com fluoreto, resulta na inibição da via de glicólise, por meio da
inibição da enzima enolase, que é a nona enzima dentro da via. O objetivo do
trabalho é avaliar o consumo de glicose, pela levedura, nesse meio de cultura rico
em fluoreto. O que foi constatado ao final do experimento é que o flúor realmente
impede que a levedura consiga realizar a glicólise de forma adequada.
2 INTRODUÇÃO

O flúor é um gás amarelo-pálido e no estado líquido tem cor

amarelo-canário. Hoje em dia, não só o flúor mas também muitos dos seus
compostos têm grande importância para a nossa sociedade. Os compostos de flúor
são abundantes na natureza e amplamente distribuídos na biosfera. Rochas, solo,
água, ar, plantas e todos os animais contêm fluoreto em concentrações variadas. Os
fluoretos são liberados no ambiente por fontes naturais como emissões vulcânicas e
ressuspensão da poeira de diferentes origens de solos que contenham fluoretos e
por atividades antropogênicas como queima de carvão, produção de fertilizantes a
partir de rochas fosfáticas e processos industriais.
A levedura Saccharomyces cerevisiae têm sido utilizada por
milhares de anos pela humanidade em processos de produção de alimentos e
bebidas devido à sua capacidade fermentativa vigorosa, o que a torna um micro-
organismo de grande importância econômica e cultural. (TEIXEIRA). A glicose é o
carboidrato de principal fonte de energia da levedura Saccharomyces cerevisiae.
Embora as células de levedura possam utilizar uma ampla gama de fontes de
carbono, a presença de glicose suprime as atividades moleculares envolvidas no
uso de fontes alternativas de carbono, além de reprimir a respiração, reação
denominada Efeito Crabtree.
A glicólise, também conhecida como via de Ebden-Meyerhof, é a
primeira via metabólica da molécula de glicose e outras hexoses. Todos os seres
vivos (a exceção dos vírus) realizam, invariavelmente, a glicólise seja em condições
de aerobiose ou de anaerobiose, com as enzimas glicolíticas presentes no
citoplasma. A glicólise é um processo anaeróbico onde se observa a formação de
um produto final estável (lactato), no citoplasma celular. em condições de aerobiose,
o metabolismo da glicose prossegue com as demais vias produtoras de energia.
3 OBJETIVO

Verificar a inibição da glicólise por meio da adição de fluoreto

através do consumo de glicose por Saccharomyces cerevisiae.
4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 CULTIVO DE SACCAROMYCES CEREVISAE E INIBIÇÃO DA GLICÓLISE

Para o experimento, foram utilizados como materiais: fermento

biológico (Saccaromyces cerevisae), meio de cultivo (glicose 2%, extrato de
levedura 1% m/v), glicose 1 mg/mL, NaF 6% (m/v).
Foi dissolvido 1g de fermento em 10 mL de água destilada em um
tubo de vidro e agitado por 2 minutos para homogeneização. Em seguida foram
identificados 3 tubos Falcon, conforme a Tabela 1. A suspensão celular foi colocada
por último, ao mesmo tempo em ambos os tubos.

Tabela 1: Quantidades de cada reagente em cada tubo preparado.

Após a inoculação, os tubos foram incubados em banho-maria a

37ºC por 20 minutos e depois centrifugados a 4 000 rpm por 5 minutos. O
sobrenadante foi então transferido para tubos de vidro identificados e posteriormente
congelar.

4.2 DETERMINAÇÃO DA GLICOSE CONSUMIDA

Nesta segunda parte, foi feita a medição do pH e diluição das

amostras em 1:25. Após isso, foi preparada uma série de tubos com concentrações
de 0 a 1 mg/mL de glicose, o volume foi completado com água destilada e em
seguida, adicionado o DNS. Os volumes adicionados em cada tubo estão expostos
na Quadro 1. Os tubos foram aquecidos em banho-maria fervente por 5 minutos.
Após isso, foram resfriados, adicionou-se 3,5 mL de água destilada e foi efeituada a
leitura em 540 nm em espectrofotômetro, zerado com o branco.

Quadro 1: Volume de cada reagente adicionado.

5 RESULTADOS

O método DNS utilizado para a determinação da glicose restante na amostra

se baseia no estabelecimento de uma relação quantitativa entre a concentração de
açúcares redutores e a absorbância a 540 nm, uma vez que o DNS muda de cor na
presença dessas moléculas e de aquecimento (Figura 1). O estabelecimento dessa
relação numérica se dá pela construção da curva de calibração (Figura 2), no qual
foi utilizada um padrão de concentração conhecida.
Figura 1: Reação colorimétrica do DNS.

Figura 2: Curva de calibração realizada com padrão de Glicose.

A partir da equação da reta obtida com a curva de calibração, foi possível o

cálculo da concentração de glicose em cada amostra, obtendo-se os valores da
Tabela 2, considerando a diluição de 50x das amostras.
Tabela 2: Valores de absorbância, concentração de glicose e pH de cada amostra.
 A amostra que se destaca nos resultados é a F-, a única a qual a
concentração de glicose foi nula e houve uma diminuição considerável do pH.
6 CONCLUSÃO

Analisando-se os dados, percebe-se que a amostra na qual houve

adição de fluoreto (F+) teve resultados muito próximos à amostra na qual não houve
inoculação da levedura (F0), indicando que não houve fermentação, uma vez que a
glicose não foi consumida e o pH manteve-se próximo a 7. Já na amostra sem
adição de fluoreto (F-), o consumo total da glicose e diminuição do pH indica a
atividade fermentativa da levedura. Dessa forma, pode-se concluir que o fluoreto foi
eficiente na inibição da glicólise de Saccharomyces cerevisiae.
 REFERÊNCIAS

CETESB. Flúor e fluoretos. Outubro de 2014. Divisão de Toxicologia Humana e

Saúde ambiental.
SILVA, Otávio Bravim da. Engenharia genética de Saccharomyces cerevisiae para
aumento de síntese de ácidos graxos visando produção de biossurfactante.
Universidade de Brasília. Departamento de Biologia Celular.
TEIXEIRA, Juliana de Freitas. A levedura Saccharomyces cerevisiae: caracterização
do gênero, domesticação e importância na composição de vinhos. Belo Horizonte,
2015.
UNESP. GOULART, Flávia de Cristina. Glicose e glicólise. Ciências fisiológicas.
Universidade Estadual Paulista. Campus de Marília.