Centro Universitário da FEI – Departamento de Engenharia Química

Biotecnologia I (QCP050)

Experimento 07 e 08
Fatores que afetam a atividade enzimática da
invertase (pH e temperatura)

AMANDA FANTINI PEDREIRA 11.219.064-0

ANDRÉ MARIANO L. GOMEZ 11.120.241-2
BEATRIZ DARCIE 11.120.126-5
TURMA 750

Objetivo
O objetivo desta aula é levantar experimentalmente a curva velocidade em função do pH e da
temperatura (v=f(pH) e v=f(temperatura)) da enzima invertase, para a determinação dos valores
de pH ótimo e temperatura ótima da reação de hidrólise da sacarose pela invertase. Com o
levantamento dos dados de v=f(temperatura) será possível determinar o valor da energia de
ativação desta reação enzimática no trecho crescente de atividade.

Introdução
A sacarose é um dissacarídeo que por hidrólise libera uma molécula de -D-glicose e uma de -
D-frutose. A hidrólise da sacarose pode ser feita por via ácida ou enzimática, catalisa da pela enzima -
fructofuranosil-fructohidrolase ou -fructofuranosidase (EC 3.2.1.26), mais conhecida como invertase ou
sacarase. A invertase catalisa a hidrólise do terminal não redutor de carboidratos -D-fructofuranosídicos
em -fructofuranosídeos quebrando um ligação glicosídica -1,4, e por exemplo, no caso da hidrólise da
sacarose [O- -D-glicopiranosil-(1→2) -D-frutofuranosídeo], obtém-se uma mistura equimolar de glicose
e frutose, como mostra a Figura 1.

CHOH 2 CHOH 2
HOCH 2 2
O O Invertase O O

HO HO
OH O CHOH
2 + HO
2
HO
OH

HOCH
OH

+
HOHOCHOH 2

OH OH OH OH

1 mol de sacarose 1 mol de -D-glicose 1 mol de -D-frutose

(açúcar não redutor) (açúcares redutores)

Figura 1. Hidrólise da sacarose pela ação da invertase.

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A faixa de pH ótimo para atividade da enzima está entre 4,0 e 5,0; mais especificamente em pH
4,5 – 4,6. O pH de estabilidade encontra -se entre 3,5 e 5,5. A atividade máxima é alcançada na faixa de
temperatura entre 40 e 55 C, em presença de soluções diluídas de sacarose. Em temperaturas abaixo de
40 C a invertase é bem estável, com perda de atividade mínima, inferior a 5%. Porém, para valores acima
de 40 C a queda de atividade se acentua e a 60 C, 80% da atividade é perdida irreversivelmente.

Definição de unidade de atividade enzimática

Uma unidade de atividade enzimática da invertase foi definida como sendo a quantidade de
enzima que catalisa a formação de um miligrama de açúcares redutores (mistura equimolar de
glicose e frutose) por minuto, sob condições padronizadas de pH 4,6, tempera tura de 37 C e
concentração de sacarose no meio de reação de 100 mM.

Procedimento Experimental

Soluções e Reagentes
• Reativo de DNS
• Solução de Sacarose 500 mM
• Solução de Invertase (E.C.3.2.1.26) SIGMA I4504 (1g) 5 mg/L

Preparo do tampão
• Para o Tampão Acetato de Sódio 50 mM : soluções de ácido acético 50 mM e acetato de
sódio 50 mM
• Para o tampão Fosfato de sódio 50 mM: soluções de fosfato de sódio monobásico e
dibásico 50 mM
• É feito prepviamente pela mistura das duas soluções estoque conferindo o valor do pH
desejado através do uso de um pHmetro previamente calibrado.

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EXPERIMENTO 07 - Influência do pH na Atividade Enzimática da Invertase

• Cada aluno/grupo irá pipetar 0,6 ml das seguintes soluções de tampão (ver tabela
abaixo) em tubos de 25 mL graduados.

Tubo pH ensaio Tampão

1 3,0 Acetato
2 4,0 Acetato
3 4,6 Acetato
4 5,0 Acetato
5 6,0 Fosfato
6 7,0 Fosfato
7 8,0 Fosfato
8 9,0 Fosfato

• Pipetar no mesmo tubo 0,2 ml de sacarose 500 mM, e levar ao banho termostatizado a
37 C por 5 minutos.
• Após equilíbrio térmico, ainda no banho, pipetar 0,2 ml da solução contendo a enzima
e cronometrar o tempo de reação de 10 minutos, mantendo-se os tubos no banho a
37 C.
• Após 10 minutos exatos adicionar 1,5 ml do reativo de DNS e mergulhar os tubos por
5 minutos cronometrados em banho de água fervente.
• Resfriar os tubos, completar o volume para 25 ml com água destilada;
• Proceder à leitura da absorvância em espectrofotômetro a 540 nm;
• Calcular a concentração de açúcares redutores totais formada na reação utilizando uma
curva de calibração do método do DNS.

Observação: Deve-se fazer sempre um ensaio em Branco para a calibração do espectrofotômetro.

EXPERIMENTO 08 - Influência da Temperatura na Atividade Enzimática da Invertase

• Cada aluno/grupo irá pipetar em tubos de ensaio 0,6 ml do tampão acetato de sódio 50
mM pH 4,6

Temperatura de
Tubo
ensaio
1 30

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2 37
3 45
4 50
5 55
6 60
7 70
8 80

• Pipetar no mesmo tubo 0,2 ml de sacarose 500 mM, e levar ao banho termostatizado por 5
minutos.
• Após equilíbrio térmico, ainda no banho, pipetar 0,2 ml da solução contendo a enzima e
cronometrar o tempo de reação de 10 minutos, mantendo-se os tubos no banho
• Após 10 minutos exatos adicionar 1,5 ml do reativo de DNS e mergulhar os tubos por
5 minutos cronometrados em banho de água fervente.
• Resfriar os tubos, completar o volume para 25 ml com água destilada;
• Proceder à leitura da absorvância em espectrofotômetro a 540 nm;
• Calcular a concentração de açúcares redutores totais formada na reação utilizando uma
curva de calibração do método do DNS.

Observação: Deve-se fazer sempre um ensaio em Branco para a calibração do

espectrofotômetro.

_____________________________________________________________________ NO
RELATÓRIO:

Cálculo da Velocidade de Reação ou Atividade Enzimática

Calcula-se a velocidade de reação (v) após a determinação da concentração de açúcares
redutores formada durante a reação, através da curva de calibração do método do DNS e utiliza-
se a equação:

𝑣= 𝑉 𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎[𝐴𝑅] 𝐹
×𝑡 mlU ou mgml. minAR

Onde: [AR]F= quantidade de açúcares redutores totais (mg/mL) formados durante a hidrólise da
sacarose, Vamostra = volume de amostra utilizado (mL) e t = tempo de reação (minuto). Para o
procedimento padrão apresentado neste experimento a equação fica reduzida como abaixo.

[AR]F
v=
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Para a determinação da concentração de açúcares redutores os alunos devem utilizar uma

curva de calibração feita previamente, no ensaio de determinação de açúcares redutores pelo
método do DNS.

No relatório:

A partir dos dados obtidos do laboratório foi construída essa tabela

Tubos Absorvância [AR] v pH T (°C) lnv 1/T

1 0,17 0,308 0,154 3 30 -1,870 0,033
2 0,274 0,439 0,219 4 37 -1,517 0,027
3 0,353 0,538 0,269 4,6 45 -1,314 0,022
4 0,353 0,538 0,269 5 50 -1,314 0,020
5 0,462 0,674 0,337 6 55 -1,088 0,018
6 0,082 0,198 0,099 7 60 -2,312 0,017
7 0,046 0,153 0,077 8 70 -2,570 0,014
8 0,012 0,110 0,055 9 80 -2,897 0,013

Após isso, foi construído os seguintes gráficos:

Velocidade x Temperatura
0,4
0,35
0,3
Velocidade

0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Temperatura

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Velocidade x pH
0,4
0,35
Velocidade 0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 2 4 6 8 10
pH

A temperatura ideal para esse experimento é de 55 °C e o pH ideal de 7, o valor da

temperatura está de acordo com a esperada, entretanto o Ph está fora do esperado, portanto pode-
se concluir que há a possibilidade de algum erro cometido pelo grupo que foi constatado apenas
durante os cálculos. Da mesma forma pode se deduzir que antes da temperatura de 55 °C, as
amostras tendem a seguir um padrão, não havendo assim uma variação significativa na
determinação de açucares redutores, observando também o pH das amostras, que são
extremamente próximos nas três primeiras amostras.
A reação de atividade enzimática tem seu maior ponto na quinta amostra, mostrando que quanto
maior a temperatura e pH menor é seu resultado perante a atividade

• Comparar o valor experimental obtido com o valor teórico esperado.

Também foi feito um gráfico de Arrhenius utilizando os valores de velocidade em função da

temperatura dos pontos que não sofreram com a desnaturação da enzima, que é o seguinte:

LnK X 1/T
0,000
-0,2000,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035
-0,400
-0,600 y = -47,188x - 0,2807
-0,800 R² = 0,9634
ln K

-1,000
-1,200
-1,400
-1,600
-1,800
-2,000
1/T

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O Ea/R calculada foi de 47,188 obtendo assim uma energia de ativação de 5,68 J/mol,
sendo abaixa do esperado que seria entre 7,32 até 7,85 J/mol, podendo ser um erro cometido em
qualquer etapa do processo.

Esse erro pode ser explicado por uma quantidade errada de sacarose para mais ou para menos
adicionado no experimento, da mesma forma que pode ter se ocorrido com as amostras do
experimento 8.