RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - NOITE

MICROBIOLOGIA

Prof.ª MARCELA PELLEGRINI

“ANÁLISE DE QUALIDADE DA ÁGUA”

Brian Kaique Macedo Rodrigues RA: 00111892

Maria Laura Bellano Miranda RA: 00114439

Yasmin Fernandes Mendes RA: 00107807

Renan Torres Manfrinati RA:00111519

Nicholas Soares Tucunduva RA: 00100460

Mateus Ferreira Machado. RA: 00111270

1°/2023
 INTRODUÇÃO

Para que pudesse haver o melhor entendimento dos assuntos referentes a

métodos laboratoriais relacionados a microbiologia, a professora providenciou
aos estudantes aulas práticas no laboratório multidisciplinar localizado no Apoio
2 da UNISO. A microbiologia é uma disciplina que estuda todos os seres
microscópicos presentes no ecossistema, sejam eles fungos, bactérias ou vírus,
então para que os conhecimentos sejam mais aprofundados, a aula prática se
mostra essencial. Nas aulas práticas aqui explicadas, foi possível compreender
diversos processos relacionados ao manuseio de equipamentos laboratoriais
diversos, compreender termos e práticas que evidenciam a necessidade do
conhecer e aprender.

A detecção e quantificação de todos os micro-organismos patogênicos

potencialmente presentes na água é trabalhosa, demanda tempo, os custos são
elevados e nem sempre se obtêm resultados positivos ou que confirmem a
presença dos microrganismos. O objetivo do exame microbiológico da água é
fornecer informações a respeito da sua potabilidade, ou seja, ausência de risco
de ingestão de micro-organismos causadores de doenças, geralmente
provenientes da contaminação pelas fezes humanas e outros animais de sangue
quente. Vale ressaltar que os micro-organismos presentes nas águas naturais
são, em sua maioria, inofensivos à saúde humana. Porém, na contaminação por
esgoto sanitário estão presentes microrganismos que poderão ser prejudiciais à
saúde humana. Os microrganismos patogênicos incluem vírus, bactérias,
protozoários e helmintos. A água potável não deve conter microrganismos
patogênicos e deve estar livre de bactérias indicadoras de contaminação fecal.
Como indicadores de contaminação fecal, são eleitas como bactérias de
referência as do grupo coliforme. O principal representante desse grupo de
bactérias chama-se Escherichia coli e o motivo desta bactéria ser a
representante são as seguintes:

• São bactérias que são comuns nas fezes de animais de sangue quente;
• São mais resistentes a produtos desinfetantes e agentes tensoativos;
• Sua concentração na água indica o grau de contaminação fecal;
• São facilmente detectáveis por métodos simples e baratos.
 O Ministério da saúde da estabelece que seja verificada, na água para
consumo humano para garantir sua potabilidade, a ausência de coliformes totais
e Escherichia coli e determinada a contagem de bactérias heterotróficas.

A técnica de número mais provável (NMP) é um método utilizado na

microbiologia para estimar a concentração de microrganismos em uma amostra.
Baseado na diluição seriada da amostra, o NMP utiliza a contagem de tubos
positivos para determinar o número mais provável de microrganismos presentes.
Essa abordagem estatística fornece uma estimativa confiável da carga
microbiana, sendo especialmente útil quando os microrganismos não podem ser
facilmente contados individualmente. O NMP é aplicado em diversos campos,
como análises de qualidade de alimentos, água e produtos farmacêuticos,
permitindo a avaliação da segurança e controle microbiológico de diferentes
produtos e processos.

OBJETIVOS

Com objetivo de tornar o conhecimento teórico adquirido na sala de aula

empírico, as aulas práticas servem tanto para que o conhecimento seja
absorvido de uma forma mais interessante ao aluno, tanto para que os métodos
sejam efetuados pela experiência própria, já que ler instruções de como fazer
algo é muito diferente do que efetuá-las. Os objetivos dessas aulas são os
seguintes:

• Aprender de forma prática como funciona os métodos de análise de

qualidade da água;
• Aprender como interpretar os dados coletados;
• Aprender como se portar em um laboratório e evitar contaminação
cruzada por ações de descuido com os equipamentos.
 METODOLOGIA

Prática 1 – Preparação dos Tubos Múltiplos (19/04/2023)

No dia 19 de abril de 2023, fomos ao Apoio 2 para iniciar os métodos de

análise, foi necessário coletar água de algum ambiente em que poderia existir
alguma contaminação. Nosso grupo coletou água do mar da praia de Peruíbe –
SP, e a utilizou para verificar se havia contaminação por coliformes fecais
utilizando a técnica de múltiplos tubos. Com a coleta, foi possível iniciar os
procedimentos que iriam evidenciar a presença e quantidade aproximada de
coliformes.

Na bancada, a professora nos providenciou diversos tubos de ensaio com

soluções necessárias para a realização do experimento:

• Em três tubos havia 10 ml de caldo Lauril Duplo com um Tubo de

Durham em cada;
• Em doze tubos havia 9 ml de caldo Lauril simples, com um Tubo de
Durham cada;
• Em três tubos havia 9 ml de solução salina;

O Caldo Lauril Sulfato Triptose é um meio de enriquecimento seletivo

usado para a detecção e contagem de Escherichia coli e coliformes totais em
alimentos e água. O tubo de Durham é utilizado para capturar o gás produzido
em uma fermentação. Os diversos tubos de ensaio indicam níveis de diluição
que se mostrarão positivos, ou não, conforme a diluição da água coletada é feita.

De início, foi adicionado 10 ml da

água coletada em cada um dos três
tubos de caldo Lauril Duplo, usando o
bico de Bunsen para evitar
contaminação cruzada e utilizando a
pipeta graduada e o pipetador de 10
ml estéreis, para medição e injeção
adequada da amostra nos tubos de
(Fig. 1) ensaio. Foi também adicionado 1ml
da amostra diretamente em três tubos com 9 ml de Lauril Simples,
caracterizando o nível -1 de diluição da análise (Fig. 1).

A solução salina foi utilizada para diluir

a amostra e criar níveis de diluições
cada vez menos concentrados, o
objetivo dessa diluição é quantificar a
presença das bactérias conforme o
método de análise, o que será mais
bem explicado nos resultados. Na
primeira diluição com solução salina
(Fig. 2)
foi adicionado 1 ml da amostra em 9
ml de solução salina, depois foi
adicionado 1 ml dessa primeira diluição
em três tubos com Lauril Simples,
fazendo com que a quantidade da
amostra no tubo de Lauril Simples
fosse de 0,1 ml, criando o nível de
diluição -2 (Fig. 2).

Para criar a segunda diluição, foi

(Fig. 3)
adicionado 1 ml da primeira diluição,
que continha 1 ml da amostra, em 9 ml
de solução salina, fazendo com que a
concentração da amostra de água
fosse de 0,01 ml. Foi adicionado 1 ml
da segunda diluição em três tubos com
Caldo Lauril Simples, criando o nível
de diluição -3 (Fig.3).

(Fig. 4) O processo de diluição continua

adicionando 1 ml da segunda diluição em 9 ml de solução salina, criando a
terceira diluição. É adicionado 1 ml da terceira diluição a outros três tubos com
Lauril Simples, criando o nível de diluição -4 que continha 0,001 ml da amostra
(Fig.4). Após a preparação dos três tubos com lauril duplo e doze tubos com lauril
simples diluídos com a amostra de água, coletada na praia de Peruíbe – SP, em
diferentes níveis de concentrações, todos foram levados a estufa à 35 graus
Celsius onde ficaram até o dia 26 de abril, porém, 48 horas seria o suficiente
para a observação dos resultados. As diluições feitas com a solução salina não
eram necessárias para as conclusões e resultados e por isso foram descartadas.

Prática 2 – Teste para Coliformes Termotolerantes (26/04/2023)

Nesta prática, os procedimentos foram os seguintes:

• Tomar todos os tubos do Teste Presuntivo que deram positivos (Formação

de gás) da prática 1;
• Transferir, com alça de platina flambada e fria, uma porção para os tubos
de ensaio contento o meio e misturar;
• Incubar 44,5°C;
• Se no final de 24 horas ou menos houver a formação de gás, está
indicado a presença de coliformes de origem fecal;
• Calcular o N.M.P consultando a tabela.

Os microrganismos lactose-positivos consomem lactose, com produção

de gás. Os sais biliares inibem o crescimento de bactérias Gram positivas ou
de espécies microbianas não adaptadas a microbiota intestinal. Após a
injeção dos tubos positivos nos tubos com caldo EC, estes foram colocados
na estufa á 45°C onde permaneceram até a próxima aula prática.

Prática 3 – Teste em ágar EMB para presença de Escherichia coli

Após a verificação dos resultados dos tubos com Caldo EC, a professora pediu
que utilizassemos um dos tubos positivos para semear o líquido em um meio de
cultura chamado Ágar EMB, para verificar se havia a presença de Escherichia
coli, ou outras bactérias fermentadoras de lactose e gram negativas. Assim, com
uma alça de plástico embebida no caldo EC positivo, foi feita a semeadura de
uma placa de petri contendo o ágar EMB, que é seletivo para bactérias gram
negativas e fermentadoras de lactose. Neste meio, a bactéria Escherichia coli,
quando presente, apresenta colonias com aspecto verde metalizado, sendo de
fácil identificação. Outras bactérias fermentadoras de lactose e gram negativas
apresentam colonias com uma mancha escura no centro. Após os
procedimentos, a placa foi colocada na estufa.
 RESULTADOS

Prática 1 – Verificação dos Resultados dos Tubos Múltiplos (26/04/2023)

Para verificar os tubos de ensaio e conferir se ele estava positivo para a presença
de bactérias coliformes o método era simples: Se o líquido estivesse turvo e o
tubo de Durham com presença de gás, ele era positivo para coliformes, sendo
necessário que ambos os parâmetros estejam presentes para que o tubo seja
considerado positivo na análise. Para efeito de comparação, a Foto 1 mostra os
tubos antes de ser feita a injeção das diluições da amostra, com um líquido
amarelado e translúcido e com o tubo de Durham no fundo, sem a presença de
gás. Já a Foto 2 mostra um exemplo de tubo positivo, com o líquido turvo
esbranquiçado e com o tubo de Durham com presença de gás, invertido e
flutuando no líquido.

(Foto 1) Tubos negativos (Foto 2) Tubo

Com base nesses parâmetros, no dia 26 foi possível ver o resultado dos tubos,
sendo possível quantificar pelo sistema NMP os coliformes presentes na água
coletada. Os resultados da nossa análise foram os seguintes (Fig. 5):

• Todos os 3 caldos Lauril Duplo deram positivos;

• Todos os 3 caldos Lauril Simples com diluição nível -1 deram positivo;
• Todos os 3 caldos Lauril Simples com diluição nível -2 deram positivo;
• Apenas um dos caldos Lauril Simples com diluição -3 deu positivo;
• Nenhum dos caldos Lauril Simples com diluição nível -4 deu positivo.
 (Tabela 1)

Com os resultados obtidos, bastava

interpretar-los e associa-los a tabela que
(Fig. 5) continha o relação que estabelecia o
Número Mais Provável de bactérias presentes na amostra. Para determinar o
NMP, verifica-se a combinação formada pelo números de tubos positivos nas
diluições com 0,1 ml, 0,01 ml e 0,001 ml da amostra, ou seja, verifica-se o
número de positivos nos níveis de diluição -2, -3 e -4. Com base nos resultados,
a combinação alcançada em nossa análise foi 3-1-0. Na tabela fornecida pela
professora (Tabela 1) o Número Mais Provável foi 43, mas de acordo com
explicações da professora, cada nível anterior positivo que não foi utilizado na
análise deve ser considerado colocando um zero no final do NPM para chegar
ao número mais preciso. Portando, considerando o nível -1, o Número Mais
Provável da nossa análise foi de aproximadamtne 430 coliformes por ml da
amostra coletada.
 Prática 2 – Teste para Coliformes Termotolerantes

Neste teste possível é notar se as bactérias presentes nos meios eram ou não
termotolerantes, e de acordo com o resultado foi possível notar que as
bactérias eram termotolerantes e tiveram o mesmo resultado que foi obtido na
Prática 1, sendo o mesmo NMP, mas ainda não era possível saber se havia a
presença de Escherichia coli, pois no teste com caldo EC, a indicação desta
bactéria em caso de positivo é provável mas não é tão seletiva, já que outras
enterobactérias como Klebisiella, Enterobacter e Citrobacter também dão
positivo neste teste. Por isso a prática 3 se tornou necessária.

Prática 3 – Teste em ágar EMB para presença de Escherichia coli

Com o resultado da semeadura do caldo EC positivo no ágar EMB, foi possível

notar que na amostra de água que coletamos na praia de Peruíbe – SP não
continha a bactéria Escherichia coli como uma das contaminantes, já que a
carcterística notavel que diferencia a E. coli (a presença da cor verde metálico
nas colonias) não estava presente. Porém, outras colonias cresceram no meio,
podendo ser qualquer enterobractéria. Segundo a professora, a mais provável
seria a bactéria Klebisiella, muito comum e considerada também um coliforme.
 Referências
ANÁLISE de coliformes por múltiplos tubos. In: FONTES, Luiz. Análise de
coliformes por múltiplos tubos. [S. l.], 3 nov. 2013. Disponível em:
https://bancadapronta.wordpress.com/2013/09/03/analises-de-coliformes-
por-tubos-
multiplos/#:~:text=A%20t%C3%A9cnica%20de%20tubos%20m%C3%BAltiplo
s,uma%20presuntiva%20e%20outra%20confirmativa. Acesso: 07/06/2023
BAM Appendix 2: Most Probable Number from Serial Dilutions. In: BLODGETT,
Robert. BAM Appendix 2: Most Probable Number from Serial Dilutions.
Fda.gov, 10 set. 2020. Disponível em: https://www.fda.gov/food/laboratory-
methods-food/bam-appendix-2-most-probable-number-serial-dilutions#tab1.
Acesso em: 7 jun. 2023.
BATALHA, B.H.L., PARLATORE, A. C. Controle da qualidade da água para o
consumo humano; bases conceituais e operacionais. 1ª ed. São Paulo: Cetesb,
1977.
BRASIL. Fundação Nacional de Saúde. Manual técnico de análise de água para
consumo humano. Brasília: Funasa, 1999.
MANUAL Prático de Análise de água. Fundação Nacional de Saúde (Funasa):
Assessoria de Comunicação e Educação em Saúde, 2004. Disponível em:
https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_analise_agua_2ed.pdf.
Acesso em: 7 jun. 2023.