UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE BIOQUMICA IV TURMA F1 MARCEL DA SILVA AMORIM GOMES

RELATRIO DE BIOQUMICA

FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO

NITERI SETEMBRO DE 2013

1 METODOLOGIA

1.1 Materiais - Equipamentos, vidrarias e reagentes utilizadas:

Tabela 1 Equipamentos, Vidrarias e Reagentes utilizados no experimento. Equipamentos e Vidrarias Bquer Cubetas de vidro Vortex Tubos de Ensaio Espectrofotmetro TUNER, modelo 330 gua destilada (solvente branco) Soluo de Azul de Bromofenol neutro Soluo de Azul de Bromofenol cida Quantidade 5 3 1 6 1 24 mL 25mL 10 mL

1.2 - Procedimento Experimental No aparelho utilizado, contm 4 compartimentos para o cmodo das cubetas. Em um compartimento, colocou-se a cubeta preta, em outro compartimento colocou-se a cubeta contendo o branco (gua destilada) e em outro compartimento colocou-se a cubeta contendo a soluo de azul de bromofenol com pH cido (amarelo). Calibrou-se com o branco o espectrofotmetro, ajustando a 100% de transmitncia e 0 para absorvncia eliminando a diferena de absorvncia do branco, promovendo ento a leitura real de absorvncia da soluo. Feito a calibrao, configurou-se o aparelho em um comprimento de onda () de 410nm, ajustou-se o branco, e com o auxlio de uma alavanca fixa no aparelho, pode-se movimentar as cubetas do compartimento 02 (branco) e o compartimento 03 (soluo de azul de bromofenol com pH cido) para o feixe de luz, verificando-se a absorvncia neste comprimento. O procedimento calibrao, aferimento e coleta de dados, foram realizados para os comprimentos de onda: 410, 430, 450, 470, 490, 510, 530, 550 e 570 e 590nm. O mesmo foi feito para a soluo de azul de bromofenol com pH neutro e determinado o comprimento de onda para absorvncia mxima.

A segunda etapa da prtica foi medir as absorvncias das solues de azul de bromofenol com pH cido e pH neutro nas concentraes de , , 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 para o comprimento de onda de com absorvncia mximo. Assim colocou-se 4 ml de gua destilada em cada 6 tubos de ensaio, em uma diluio seriada no tubo 1 foi colocado 4 mL de azul de bromofenol com pH cido e agitado em vortex, no tubo 2 foi adicionado 4 mL da soluo do tubo 1 e agitado em vortex, o mesmo procedimento anterior foi repetido para os tubos 3,4 e 5. No tubo 6 aps adicionado 4 mL da soluo do tubo 5 e agitado em vortex foi retirado 4mL e descartado para seguir a diluio de 2x em relao com a anterior. O procedimento para diluio foi repetido para a soluo de Azul de Bromofenol com pH neutro. No aparelho de espectrofotometria, foi adicionado cada diluio a cubeta no compartimento 03 contendo a soluo de soluo de Azul de Bromofenol, configurouse o aparelho em um comprimento de onda () para absorvncia mximo, feito a calibrao para o branco, com o auxlio de uma alavanca fixa no aparelho, pode-se movimentar as cubetas do compartimento 02 (branco) e o compartimento 03 (Azul de Bromofenol) para o feixe de luz, verificando-se a absorvncia neste comprimento. O procedimento calibrao, aferimento e coleta de dados, foram realizados para cada diluo das solues de Azul de Bromofenol com pH neutro e cido.

2 RESULTADOS E DISCUSSO

Para determinar a curva de absorvncia, foi ligado o espectrofotmetro e colocado o contedo da soluo e gua destilada em duas cubeta que foram inseridas no interior do equipamento. As cubetas de vidro so usadas quando se trabalha na regio do visvel. Para a regio do ultravioleta, devem-se usar as cubetas de quartzo, que so transparentes radiao ultravioleta, pois o vidro absorve a mesma. A cubeta com gua destilada foi usada para calibrar/zerar o equipamento nos diferentes comprimentos de onda () a serem analisados antes da leitura de absorvncia da soluo do complexo. O branco contem todos os reagentes e solventes usados na anlise, mas nenhum analito. Com isso ele mede a resposta do mtodo analtico para impurezas e espcies interferentes, de modo a obter a resposta analtica corrigida. Verificou a absorvncia das solues de Azul de bromofenol com pH neutro e pH cido em diferentes comprimentos de onda () no espectrofotmetro, anotando os valores utilizados na tabela abaixo:
Comprimento de onda (nm) Azul de Bromofenol (pH<3,0) Absorvncia Azul de Bromofenol (pH>4,6) Absorvncia

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

410 430 450 470 490 510 530 550 570 590

0,27 0,417 0,384 0,281 0,170 0,081 0,042 0,035 0,047 0,053

0,003 0,002 0,001 0,009 0,020 0,036 0,070 0,111 0,179 0,262

Tabela. 2 Absorvncia versus comprimento de onda

De acordo com os resultados da tabela acima, foi montado dois grficos em papel milimetrado anexados ao relatrio, correlacionando comprimento de onda e absorvncia das solues de Azul de bromofenol com pH neutro e pH cido. A tabela 2 mostra que o comprimento de onda de mxima absoro para a soluo de Azul de bromofenol com pH pH cido encontra-se a 430 nm, e que esta a regio do espectro onde ocorre uma menor variao da absortividade da soluo, quando se aplica uma variao pequena do comprimento de onda. Com isso obteve-se que a faixa onde se encontra o comprimento de onda que apresentar uma curva de calibrao de maior sensibilidade est a 430 nm. Para a soluo de Azul de Bromofenol com pH pH neutro o comprimento de onda de mxima absoro encontra-se a 590 nm, regio do espectro onde ocorre uma menor variao da absortividade da soluo, quando se aplica uma variao pequena do comprimento de onda. A soluo padro Azul de Bromofenol foi preparada em um concentrao de 1mg/100mL. A partir da concentrao da soluo padro obteve-se as concentraes contida nas solues diludas serialmente. Verificou a absorvncia das solues de Azul de bromofenol com pH neutro e pH cido para o comprimento de onda () de mxima absorvncia no espectrofotmetro, anotando os valores utilizados na tabela abaixo:
Concentrao de Azul de Bromofenol (mg/100mL) Azul de Bromofenol (pH<3,0) ( Azul de Bromofenol (pH>4,6) ( =

= 430)

590)

Absorvncia

Absorvncia

1 2 3 4 5 6 7

1,00 0,50 0,25 0,125 0,0625 0,03125 0,015625

0,417 0,238 0,091 0,028 0,009 0,008 0,024

0,262 0,123 0,057 0,027 0,006 0,003 0,008

Por meio da lei de Beer-Lambert: A = BC, onde A absorbncia, a absortividade molar em unidades de L mol-1 cm-1, B o comprimento do caminho da amostra e C a concentrao do elemento que absorve, na soluo, expressado em mol L-1.

Analisando-se a lei de Beer, percebe-se que quanto maior o valor de , maior ser a taxa de absoro observada e mais sensvel o mtodo espectrofotomtrico, a absortividade molar no comprimento de onda selecionado.

Figura. 1 Estrutura do Azul de Bromofenol

O azul de bromofenol apresenta duas substncias capazes de absorver luz (dois cromforos). Os cromforos so estruturas moleculares que o azul de bromofenol assume em pH abaixo de 3 e pH acima de 4,6.

Figura. 2 Estruturas do Azul de Bromofenol para pH cido e neutro

O azul de bromofenol sofre mudana estrutural pela ionizao de sua molcula do azul de bromofenol. O azul de bromofenol possui 3 estruturas, uma estrutura em pH abaixo de 3 (estrutura A) e a estrutura em pH acima de 4,6 (estrutura B). As 3 estruturas do azul de bromofenol so ilustradas na figura 1 mais abaixo. Em pH abaixo de 3 ou acima de 4,6 essas diferentes conformaes moleculares podem ter seus eltrons excitados pela luz visvel, em determinado comprimento de onda, ocorrendo a excitao ocorre a emisso da luz que no pde ser absorvida pelos eltrons em sua transio eletrnica, sendo ela transmitida. O comprimento de onda, da luz que absorvida pelos eltrons do cromforo, dita a cor complementar que ser transmitida, sendo essa a cor visualizada. Assim o azul de bromofenol sofre um desvio qumico da Lei de Lambert-Beer quando em pH cido ou neutro ele um analito se dissocia ou reage com o solvente para formar um produto que tem um espectro de absoro diferente.

3 BIBLIOGRAFIA 1. SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos da Qumica Analtica. 8 Ed. Thomson, 2006. P. 678-754 2. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princpios de Anlise Instrumental. 5 Ed. Bookman, 2002. P. 276-280