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Apostila Bioquimica USP
Apostila Bioquimica USP
INSTITUTO DE QUMICA
BIOQUMICA QBQ220N
Biologia Noturno
Professores
Alexander Henning Ulrich
Hugo Aguirre Armelin
2006
2
NDICE
APRESENTAO................................................................................................................................5
INTRODUO E NORMAS GERAIS ..................................................................................................5
NORMAS E RECOMEDAES NO LABORATRIO........................................................................6
GUIA PARA RELATRIO DE LABORATRIO..................................................................................6
AVALIAO.........................................................................................................................................7
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA ......................................................................................................7
CALENDRIO DE MDULOS E ATIVIDADES 2006 .........................................................................8
MDULO 1: REAO CIDO-BASE, PH E SISTEMA TAMPO....................................................10
Grupos de discusso 1 ....................................................................................................................11
MDULO 2: AMINOCIDOS.............................................................................................................12
Grupo de discusso 2 ......................................................................................................................12
MDULO 3: ESTRUTURA PRIMRIA DE PROTENAS..................................................................15
Grupo de discusso 3 ......................................................................................................................16
MDULO 4: ESTRUTURA SECUNDRIA E TERCIRIA DE PROTENAS....................................17
Grupo de discusso 4 ......................................................................................................................20
MDULO 5: CINTICA E TERMODINMICA ..................................................................................21
Grupo de discusso 5 ......................................................................................................................25
MDULO 6: CINTICA ENZIMTICA...............................................................................................26
Grupo de discusso 6 ......................................................................................................................30
MDULO 7: MECANISMOS DE CATLISE ENZIMTICA..............................................................32
Grupo de discusso 7 ......................................................................................................................34
MDULO 8: ACARES: ESTRUTURA E FUNO......................................................................35
Grupo de discusso 8 ......................................................................................................................39
3
MDULO 9: GLICLISE ...................................................................................................................40
Grupo de discusso 9 ......................................................................................................................43
MDULO 10: CICLO DE KREBS......................................................................................................44
Grupo de discusso 10 ....................................................................................................................45
MDULO 11: CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA.....................................46
Grupo de discusso 11 ....................................................................................................................48
MDULO 12: GLICONEOGNESE...................................................................................................49
Grupo de discusso 12 ....................................................................................................................50
MDULO 13. CIDOS GRAXOS: ESTRUTURA, FUNO E METABOLISMO .............................51
Grupo de discusso 13 ....................................................................................................................54
MDULO 14: LPIDES, MEMBRANA & TRANSPORTE..................................................................55
Grupo de discusso 14 ....................................................................................................................58
MDULO 15: CICLO DAS PENTOSES ............................................................................................60
Grupo de discusso 15 ....................................................................................................................61
MDULO 16 E 17 FOTOSSNTESE...............................................................................................62
Grupo de discusso 16 ....................................................................................................................63
Grupo de discusso 17 ....................................................................................................................64
MDULO 18: METABOLISMO DO GLICOGNIO ...........................................................................65
Grupo de discusso 18 ....................................................................................................................67
MDULO 19: CONTROLE HORMONAL DO METABOLISMO........................................................67
Grupo de discusso 19 ....................................................................................................................71
MDULO 20: METABOLISMO DE AMINOCIDOS.........................................................................72
Grupo de discusso 20 ....................................................................................................................73
MDULO 21: CICLO DO NITROGNIO ...........................................................................................73
Grupo de discusso 21 ....................................................................................................................74
MICROPIPETADORES ......................................................................................................................76
LABORATRIO 1: FOTOMETRIA E ESPECTROFOTMETRO.....................................................78
4
I. FUNDAMENTOS....................................................................................................................78
II. OBJETIVOS............................................................................................................................80
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................80
IV. RELATRIO DE LABORATRIO 1 ......................................................................................82
LABORATRIO 2: TITULAO E CROMATOGRAFIA DE AMINOCIDOS..................................84
I. FUNDAMENTOS....................................................................................................................84
II. OBJETIVOS............................................................................................................................87
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................87
IV. RELATRIO DE LABORATRIO 2 .....................................................................................89
LABORATRIO 3: CINTICA ENZIMTICA....................................................................................90
I. FUNDAMENTOS....................................................................................................................90
II. OBJETIVOS............................................................................................................................93
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................93
IV. RELATRIO DE LABORATRIO 3 ......................................................................................96
LABORATRIO 4: PURIFICAO DE PROTENAS (SDS-PAGE E PONTO ISOELTRICO) .....97
I. FUNDAMENTOS....................................................................................................................97
II. OBJETIVOS............................................................................................................................99
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................99
IV. RELATRIO DE LABORATRIO 4 ...................................................................................101
V. APNDICE...........................................................................................................................104
LABORATRIO 5: REAO DE TRANSAMINAO...................................................................107
I. FUNDAMENTOS..................................................................................................................107
II. OBJETIVOS..........................................................................................................................109
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL....................................................................................109
IV. RELATRIO DE LABORATRIO 5 ....................................................................................110
5
APRESENTAO
PROFESSORES:
Prof. Dr. Hugo Aguirre Armelin (coordenador) Bloco 9 Inf., Sala 924
Prof. Dr. Alexander Henning Ulrich Bloco 8 Sup., Sala 858
MONITORES:
Doutorando Cleber Augusto Trujillo Bloco 8 Sup., Sala 858
Doutoranda Katia Neves Gomes Bloco 8 Sup., Sala 858
INTRODUO E NORMAS GERAIS
A disciplina de Bioqumica (QBQ220-noturno) compreende o programa de mdulos mostrado no
calendrio das pginas 8 e 9. Cada mdulo focaliza um tpico a ser desenvolvido em um dia de
aula, envolvendo 3 atividades:
a) Aula expositiva pelo professor;
b) Grupos de discusso centrados em questes objetivas;
c) Fechamento do tema pelo professor que analisar as questes discutidas em grupo.
Alm destes mdulos, desenvolvidos em sala de aula, haver tambm um conjunto de mdulos de
laboratrio, consistindo em 5 aulas prticas concentradas no ltimo ms de curso.
Os grupos de discusso sero formados por 6 alunos, organizados no primeiro dia de aula
permanecendo fixos por todo o curso.
Para as aulas de laboratrio cada grupo ser dividido em 2: A e B. Cada mdulo de laboratrio
consistir em 3 atividades:
a) Execuo da aula prtica no laboratrio;
b) Trabalho em sala de aula;
c) Relatrio que ser realizado em sala de aula.
No primeiro dia de cada modulo de laboratrio, o conjunto de subgrupos A trabalhar no laboratrio,
enquanto os subgrupos B estaro na sala de aula. No perodo seguinte inverte-se: subgrupos B no
laboratrio e subgrupos A na sala de aula. Finalmente, no ltimo perodo, os subgrupos se renem
na sala de aula para discutir, conciliar resultado e fazer um relatrio de grupo, que deve ser
entregue no mesmo dia.
6
NORMAS E RECOMEDAES NO LABORATRIO
Em cada mdulo de laboratrio, os subgrupos da turma A trabalharo no laboratrio enquanto os
subgrupos da turma B estaro na sala de aula para discutir e conciliar os resultados obtidos na aula
prtica e para fazer um relatrio de grupo, que dever ser entregue no mesmo dia. No perodo
seguinte, inverte-se: os subgrupos da turma B no laboratrio e subgrupos da turma A na sala de
aula.
Seguir rigorosamente as seguintes instrues:
- PROIBIDO COMER, BEBER E FUMAR NO LABORATRIO.
- Leia com detalhe o procedimento experimental (protocolo) e preste ateno s instrues
fornecidas antes de iniciar a experincia.
- Procure utilizar reagentes, vidraria e equipamentos disponveis com cuidado, para evitar
desperdcio e quebra.
- Mantenha sua rea de trabalho organizada. Ao terminar a experincia passe gua na vidraria
utilizada e a coloque no local indicado.
- Em caso de dvida ou acidente, pea auxlio aos monitores ou aos professores.
- Uso do avental nas aulas prticas obrigatrio!
GUIA PARA RELATRIO DE LABORATRIO
OBJETIVOS: Colocar o(s) objetivo(s) da aula prtica de forma clara e concisa.
INTRODUO: Deve conter os fundamentos bioqumicos da metodologia empregada (aspectos
tericos da aula prtica encontrados na literatura).
MATERIAIS E MTODOS: Descrever os procedimentos executados em laboratrio incluindo todos
os reagentes, materiais e equipamentos utilizados.
RESULTADOS E DISCUSSO: Colocar todos os dados obtidos (utilizar tabelas, caso julgue
necessrio). Os grficos sero aceitos em papel milimetrado ou no Excel. Comentar os
resultados comparando turma A e B, discutir possveis diferenas obtidas comparando com
dados da literatura.
CONCLUSO: Comentar quais as concluses da aula prtica. Ser claro e objetivo nas concluses.
Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou no.
BIBLIOGRAFIA: Colocar todos os livros e artigos consultados.
NO ULTRAPASSAR 5 PGINAS DE RELATRIO!
7
AVALIAO
A avaliao de desempenho ser composta dos seguintes itens:
a) Provas em grupo (PG1 a PG6), que consistiro num trabalho em grupo para
resoluo de questes objetivas por um perodo de 4 h;
b) Relatrios de laboratrio (R1 a R5);
c) Provas escritas individuais (P1, P2 e P3). A ltima prova escrita da matria ser
sobre os temas abordados em laboratrio.
O clculo da media final ser feito atravs da seguinte formula:
10
5 , 2 3 0 , 3 2 5 , 2 1 2
11
x P x P x P x
Rs PGs
MdiaFinal
+ + +
+
=
Haver uma nica prova substitutiva para substituir uma das provas individuais de avaliao.
Reposies de PG ou relatrio de laboratrio esto vetados. A presena em todas as
atividades obrigatria. Uma lista de presena ser passada em todas as aula. Alunos que
alcanarem a mdia final 5,0 e mostrarem freqncia 70% estaro aprovados. Aqueles cuja
mdia for no mnimo igual a 3,0 e apresentarem freqncia 70% podero fazer a prova de
recuperao.
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
A bibliografia recomendada envolve 2 livros textos em portugus:
TORRES, B. B. & MARZZOCCO, A. Bioqumica Bsica.
VOET, D. ; VOET, J. & PRATT, C. W. Fundamentos de Bioqumica.
Contudo, outros excelentes textos de Bioqumica, em geral em ingls, podero ser usados com igual
proveito:
VOET, D. & VOET, J. Biochemistry.
STRYER, L.; BERG, J. M. AND TYMOCZKO, J. L. Biochemistry.
LEHNINGER, A. L. Principles of Biochemistry.
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CALENDRIO DE MDULOS E ATIVIDADES 2006
DATA
MDULO/
ATIVIDADE
TTULO
JULHO 31 1 GUA; REAO CIDO-BASE, pH E SISTEMA TAMPO.
AGOSTO 3 2 AMINOCIDOS: Estrutura, Propriedades Qumicas.
4 3 PROTENAS: Estrutura Primria.
7 - PROTENAS: Estrutura 3D e Conformao.
10 4 PG-1.
11 5 INTRODUO CINTICA E TERMODINMICA QUMICA.
14 6 CINTICA ENZIMTICA.
17 7 MECANISMOS DE CATLISE ENZIMTICA.
18 - PG-2.
21 - AVALIAO 1.
24 8 AUCARES ESTRUTURA E FUNO.
25 9 GLICLISE.
28 10 ACETIL-CoA E CICLO DE KREBS
31 11 CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA
SETEMBRO 1 12 GLICONEOGNESE
4-8 - SEMANA DA PTRIA.
11 - .PG-3.
14 - AVALIAO 2
15 13 CIDOS GRAXOS:ESTRUTURA, FUNES E METABOLISMO.
18 14 LIPDEOS, MEMBRANA E TRANSPORTE.
21 - PG-4.
22 15 CICLO DAS PENTOSES.
25-29 - SEMANA TEMTICA DA BIOLOGIA.
OUTUBRO 2 16 FOTOSSNTESE 1.
5 17 FOTOSSNTESE 2.
6 - PG-5
9 18 METABOLISMO DO GLICOGNIO.
12 - FERIADO
13 - RECESSO
16 19 CONTROLE HORMONAL DO METABOLISMO.
9
19 20 METABOLISMO DE AMINOCIDOS.
20 21 CICLO DO NITROGNIO.
23 - PG-6.
26 - AVALIAO 3.
L1-A MTODOS COLORIMTRICOS E ESPECTRO DE ABSORO.
LABORATRIO* 27
B AULA.
L1-B MTODOS COLORIMTRICOS E ESPECTRO DE ABSORO.
30
R1-A RELATRIO.
NOVEMBRO 2 FERIADO
3 .RECESSO
L2-A TITULAO E SEPARAO DE AMINOCIDOS.
6
R1-B RELATRIO
L2-B TITULAO E SEPARAO DE AMINOCIDOS
9
R2-A RELATRIO.
L3-A CINTICA ENZIMTICA, INVERTASE.
10
R2-B RELATRIO.
L3-B CINTICA ENZIMTICA, INVERTASE.
13
R3-A RELATRIO.
L4-A FRACIONAMENTO DE PROTENAS.
16
R3-B RELATRIO.
L4-B FRACIONAMENTO DE PROTENAS.
17
R4-A RELATRIO.
L5-A MECANISMOS DE CATLISE, TRANSAMINASES.
20
R4-B RELATRIO.
L5-B MECANISMOS DE CATLISE, TRANSAMINASES.
23
R5-A RELATRIO.
A AULA.
24
R7-B RELATRIO.
27 AVALIAO INDIVIDUAL DO LABORATRIO.
DEZEMBRO 7 - SUBSTITUTIVA.
18 - RECUPERAO.
* L = laboratrio; R = relatrio; A e B = turmas.
10
MDULO 1: REAO CIDO-BASE, pH E SISTEMA TAMPO
1. A molcula de gua, H
2
O, apresenta um ngulo de 104,5 graus entre as duas ligaes O-H,
dando-lhe um carter altamente polar. Alm disso, o tomo de O possui 2 pares de eltrons
livres, permitindo a formao de ligaes (ou pontes) de H entre molculas vizinhas. Esta
estrutura d gua propriedades fsicas e qumicas de enorme importncia biolgica.
2. A gua se ioniza atravs de uma reao cido-base:
H
2
O + H
2
O H
3
O
+
+ OH
-
A reao cido-base se caracteriza pela troca de prtons entre pares conjugados de cidos e
bases. A gua pode se comportar como cido e como base:
AH + H
2
O H
3
O
+
+ A
-
B + H
2
O BH + OH
-
Estas so reaes de equilbrio, s quais correspondem constantes de equilbrio definidas.
Por exemplo: K = [H
3
O
+
] [A
-
]
[AH] [H
2
O]
K mede a afinidade relativa das bases, de cada par cido-base conjugados (AH/ A
-
e H
3
O
+
/
H
2
O), por prtons. Fala-se comumente em constante de dissociao de um cido (K
a
),
significando: K
a
= K [H
2
O] = [H
+
] [A
-
], onde [H
2
O] essencialmente constante (55 M).
[AH]
3. [H
+
] a concentrao hidrogeninica e os valores de [H
+
] para a maioria das solues so
muito baixos e difceis de serem comparados. Um valor mais prtico conhecido como pH:
pH = - log [H
+
].
como 1/[H
+
] = 1/K x [A
-
]/[AH]
pode-se obter pH = - logK + log [A
-
]/[AH]
por analogia - log K = pK
e pH = pK + log [A
-
]/[AH]
Conclui-se que pK numericamente igual a pH da soluo na qual as concentraes
molares do cido e sua base conjugada so iguais (ie log [A
-
]/[AH] = 0).
A igualdade pH = pK + log [A
-
]/[AH] conhecida como Equao de Henderson-
Hasselbach.
4. cidos so classificados de acordo com sua fora relativa, ou seja, de acordo com sua
capacidade de transferir um prton para a gua. cidos com constantes de dissociao
menores do que aquela de H
3
O
+
(que, por definio, igual a 1 em solues aquosas (v se
consegue confirmar porqu!)) so s parcialmente ionizados em solues aquosas e so
conhecidos como cidos fracos (K < 1). J os cidos fortes tm constantes de dissociao
maiores que a de H
3
O
+
, sendo quase completamente ionizados em solues aquosas (K>1).
11
5. Tampes so sistemas aquosos que tendem a resistir a variaes no seu pH quando
pequenas quantidades de cido (H
+
) ou base (OH
-
) so adicionadas. Um sistema tampo
consiste de um cido fraco (o doador de prtons) e sua base conjugada (o aceptor de
prtons). comum encontarr os seguintes smbolos para representar um cido (AH ou BH
+
)
e sua base conjugada (A
-
ou B:)
6. A adio de cido forte (H
+
) ou base forte (OH
-
) a uma soluo aquosa de um cido fraco,
por exemplo, cido actico (pK
a
= 4,76), causa pequenas variaes de pH, se a soluo
estiver a um pH prximo do pK do cido. Este comportamento define um tampo cido-base.
Grupos de discusso 1
1) Defina cidos e bases no conceito de Brnsted, mostrando exemplos.
2) a) Qual o pH das solues 0,1 M dos cidos fortes HCl e HNO
3
?
b) Usar a equao Henderson-
Hasselbach para calcular o grau de dissociao dos cidos fracos i) H
2
S (K
a
=1x10
-7
) e ii) cido
actico (K
a
=2x10
-5
) em solues 0,1 M. Qual o respectivo pH dessas solues?
3) Esquematize a curva de titulao de 1 L de uma soluo de 0,1 M H
3
PO
4
com uma soluo de 10
M NaOH, colocando pH (eixo y) em funo de volume de base adicional (eixo x). Indicar os
pontos na titulao (volumes de NaOH) em que o pH equivale cada um dos pK
a
s do cido.
4) Indique como se pode preparar 1 L de um tampo a pH=7,0, capaz de manter o pH estvel com
adio de 10 mL de HCl 0,1M, dispondo-se das solues:
a) 1M H
3
PO
4
b) 1M cido actico
c) 1M NaOH
5) Desenhe a estrutura do gelo, mostrando pontes de hidrognio entre molculas de gua. O que
acontece quando o gelo derrete? Porque a gua lquida 4
o
C mais densa do que o gelo 0
o
C?
6) Desenhe a estrutura do NaCl no estado slido e tambm no estado aquoso, neste ltimo,
destaque suas interaes com gua.
12
MDULO 2: AMINOCIDOS
1. Aminocidos, bases purnicas e pirimidnicas, nucleosdeos e nucleotdeos, hexoses (como
glicose), so componentes monomricos dos principais polmeros biolgicos, ou seja,
protenas, cidos nuclicos (DNA e RNA) e polissacardeos (glicognio, amido e celulose).
Aminocidos, bases, nucleosdeos e nucleotdeos so muito solveis em gua e possuem
grupos funcionais que participam em reaes cido-base. Glicose tambm altamente
solvel em gua, mas no participa em reaes cido-base.
i. H 20 aminocidos que compem protenas (Tabela 1), todos mostrando a frmula geral:
R
+
H
3
N C
COO
-
on dipolar ou zwitterion encontrado em gua pH 7
H
2. Aminocidos podem ser agrupados em classes com base nas propriedades dos seus grupos
radicais (R), em particular sua polaridade ou tendncia de interagir com gua em pH
biolgico ( 7,0).
3. Todos os aminocidos livres comportam como cidos poliprticos. Quando um aminocido
cristalino dissolvido em gua, ele pode agir como um cido ou como uma base. O grupo
carboxlico mostra um pK em torno de 2,0, enquanto o grupo amino tem um pK entre 9,0 e
10,0. Portanto, no pH fisiolgico (pH 7,0), a maioria das molculas de todos os aminocidos
est na forma de ons dipolares (zwitterions). Chama-se pI de um aminocido o pH da
soluo na qual suas molculas possuem carga lquida nula. Na cadeia lateral (-R) os
aminocidos apresentam grupos funcionais, entre os quais existem grupos cido-base.
4. O carbono dos aminocidos, excetuando-se a glicina, assimtrico, fazendo com que
estas substncias tenham atividade ptica e, portanto, apresentem pares de ismeros
pticos.
Grupo de discusso 2
1) Quais dos aminocidos tm dois carbonos quirais e qual deles no possui isomeria ptica?
2) Mostre porque a seguinte forma no-inica de um aminocido no pode ser encontrada em
soluo aquosa.
R
H
2
N C
COOH
H
13
3) O etanol no tem carter cido em gua, enquanto fenol e cido actico se dissociam em soluo
aquosa, sendo o cido actico (pK=4,8) mais forte que o fenol (pK=10). Como se pode explicar o
comportamento destes trs compostos em gua a partir de suas estruturas moleculares?
4) Esquematize a curva de titulao da glicina com NaOH a partir de pH=1 e do cido asprtico com
HCl a partir de pH=11. Coloque o pH na ordenada e, na abscissa, a quantidade de equivalentes
de cido ou base forte.
5) a) Quais os pontos isoeltricos de: glicina (pKs=2,5 e 9,5), cido asprtico (pKs=2,5; 4,0 e 9,5),
lisina (pKs=2,5; 9,5 e 10) e histidina (pKs=2,5; 6,0 e 9,5)? b) Calcular as cargas lquidas
(aproximadas) do cido asprtico, lisina ou histidina nos seguintes pHs: pH 1, pH 8, pH 11.
6) Tentar classificar os aminocidos em termos da natureza qumica dos seus grupos radicais: a)
ionizveis ou no ionizveis, b) cidos ou bsicos, c) polares ou no polares, d) hidroflicos ou
hidrofbicos, e) alifticos ou aromticos, f) lineares ou ramificados e g) pequenos e grandes.
7) Na Tabela 1 indicar: a) O cdigo de letra nica para cada aminocido e b) os pK
R
dos
aminocidos com grupos radicais ionizveis.
14
15
MDULO 3: ESTRUTURA PRIMRIA DE PROTENAS
1. A descrio da estrutura das protenas dividida em quatro nveis de organizao: estrutura
primria, secundria, terciria e quartenria.
2. A estrutura primria se refere seqncia de aminocidos que compem a protena. Trata-
se, portanto, da estrutura de ligaes covalentes. A principal ligao covalente entre
aminocios a ligao peptdica. Os aminocidos podem formar polmeros atravs da
ligao do grupo carboxila de um aminocido com o grupo amino de outro. Esta ligao
carbono-nitrognio chamada ligao peptdica, obtida por excluso de uma molcula de
gua. Quimicamente, a formao da ligao peptdica pode ser representada pela seguinte
equao:
Esta reao, como esta escrita, jamais ocorre nos seres vivos. A unio dos aminocidos por
ligao peptdica no feita por reao direta entre eles, mas atravs de um complexo
aparato de sntese protica, que inclui ribossomos, cidos ribonuclicos, vrias protenas e
enzimas num processo chamado traduo. A equao mostra apenas o resultado liquido do
processo.
3. As propriedades da ligao peptdica impem restries ao dobramento do polmero formado.
A ligao peptdica apesar de ser representada por um nico trao de ligao, tem
caractersticas intermediarias entre uma ligao simples e uma dupla ligao, devido as
interaes entre duas formas de ressonncia.
A conseqncia desse carter parcial de dupla ligao que no h possibilidade de rotao
em torno da ligao peptdica. Assim sendo, os quatro tomos dos grupamentos que
participam da ligao peptdica ficam dispostos em um plano rgido, constituindo o que se
costuma chamar de grupo peptdico ou unidade peptdica (vide retngulos) Notar tambm
que os dois carbonos alpha (C
18
Figura 2: -hlice. Figura 3: Folha pregueada.
2. H duas estruturas secundrias principais: -hlice (Figura 2) e folha pregueada (Figura 3),
que so estruturas organizacionais regulares e repetitivas. Estas duas estruturas podem ser
caracterizadas por combinaes de angulos phi e psi (Figura 1) adotadas pela cadeia principal.
Alm de -hlice e folha , as protenas globulares mostram tambm alas de formas definidas,
mas irregulares e no repetitivas.
3. A estrutura terciria descreve o arranjo tridimensional da cadeia principal da protena, incluindo a
disposio espacial das cadeias laterais dos aminocidos. H muitas possibilidades de arranjos
tridimensionais para a estrutura terciria das protenas.
a. As propriedades bioqumicas e biolgicas de uma protena so determinadas pelo arranjo
tridimensional de sua cadeia, isto , pela sua estrutura terciria. Logo, nas condies
fisiolgicas a protena adquire uma estrutura terciria bem definida e necessria sua
funo, que conhecida como estrutura nativa. O desarranjo da estrutura terciria leva
perda de funo da protena, processo que genericamente chamado de desnaturao.
b. Em protenas pequenas da estrutura primria define a estrutura terciria nativa da protena.
Nestes casos os processos de desnaturao e renaturao da estrutura da protena so
reversveis. A estrutura nativa a conformao da protena de menor nvel de energia livre
(G) e alcanada espontaneamente (processo exergnico). O exemplo clssico desse
comportamento dado pela protena Rnase A, uma enzima que no seu estado nativo
catalisa a hidrlise de RNA. Para protenas grandes o processo de desnaturao
irreversvel e o fenmeno de alcance da conformao nativa complexo e ainda mal
entendido.
19
c. A estrutura tridimensional das protenas mantida por ligaes fracas como pontes de H,
ligaes inicas e interaes hidrofbicas. A exceo a ponte de dissulfeto (-S-S-) que,
apesar de covalente, importante na manuteno da conformao nativa de protenas.
d. Protenas possuem muitos grupos ionizveis atravs de reao cido-base, cujos pKs variam
enormemente. O pI de uma protena definido como pH da soluo na qual a carga lquida
da molcula de protena nula.
4. Existem muitas maneiras diferentes para apresentar estruturas tridimensionais de protenas.
Estrutura de mioglobinade baleia, uma protena globular tpica
Fita (azul =H) modelo space-filling
Topografia
de superfcie
20
Grupo de discusso 4
1) Distinga estrutura secundria e terciria de uma protena. D exemplos.
2) Descreva -hlice e folha pregueada. Aponte as diferenas essenciais entre estas formas de
estrutura secundria encontradas em peptdeos.
3) Discuta os dois diagramas de Ramachandran apresentados na Figura 1 e relacione-os com as
estruturas apresentadas nas Figuras 2 e 3.
4) Descreva a experincia clssica de Anfinsen com a enzima ribonuclease A, indicando sua
concluso principal. Qual o papel das pontes de dissulfeto na manuteno da estrutura nativa
(terciria) da ribonuclease? Conceitue estrutura nativa e desnaturao de protenas, mostrando
o que isso tem a ver com a atividade enzimtica da ribonuclase A. Que funo termodinmica
promove espontaneamente a transio da ribonuclease de desnaturada para nativa?
5.) Duas protenas, apesar de terem diferenas quanto a alguns de seus aminocidos, so capazes
de desempenhar a mesma funo. Explique como isto possvel.
6.) Pesquisar informaes sobre a estrutura de hemoglobina. Descrever a sua estrutura terciria e
quartenria. Descrever as mudanas na estrutura quartenria que acontecem devido ligao
de oxignio.
7) O que efeito hidrofbico e qual o seu papel na manuteno da estrutura terciria das protenas?
Qual o fator preponderante no efeito hidrofbico: o entlpico ou o entrpico? Explique
qualitativamente sua resposta.
8) Mostre porque uria desorganiza a -hlice.
21
MDULO 5: CINTICA E TERMODINMICA
1. A variao de energia livre padro diretamente relacionada constante de equilbrio:
G
o
= -2.3RT log K
eq
2. A composio de um sistema de reao (uma mistura de reagentes e produtos) tende a uma
variao contnua at que o equilbrio alcanado. No equilbrio, as taxas de reao para um
lado e para outro so exatamente iguais. As concentraes de reagentes e produtos no
equilbrio definem a constante de equilbrio. Na reao:
A + B C + D , a constante de equilbrio dada por:
K
eq
= [C][D] / [A][B]
3. Quando um sistema no est em equilbrio, ele tende ao equilbrio, e a magnitude desta
tendncia pode ser medida como a variao de energia livre da reao, G. A energia livre de
Gibbs (G), uma propriedade termodinmica, definida pela equao: G = H TS, onde H, T e S
so respectivamente entalpia, temperatura absoluta e entropia, todas tambm propriedades
termodinmicas.
4. Numa transio de estado a temperatura (T) e presso constantes (condies comuns s
reaes bioqumicas) a variao de G (G) : G = H - TS.
Se se trata de uma reao bioqumica, H o calor de reao. Quando H positivo a reao
endotrmica, se H for negativo a reao exotrmica. Nestas condies, a espontaneidade da
reao definida pelo valor de G: se G negativo, a reao espontnea, sendo
denominada exergnica. Se, ao contrrio, G for positivo, a reao no ocorre
espontaneamente e denominada endergnica. Portanto, a reao ocorre no sentido em que a
energia livre total diminui.
4. No equilbrio, G = 0. Logo, possvel demonstrar a validade das seguintes igualdades:
G = G + 2,3 RT logB/A B/A = K G = - 2,3 RT logK
5. Em condies padro, 25C (298K), com concentraes de reagentes e produtos iguais a 1M,
pH = 0, a variao de energia livre considerada padro, ou G. Entretanto, a maioria das
reaes bioqumicas ocorrem em pH 7,0, para as quais utiliza-se G.
6. A Figura 4 mostra esquematicamente como varia G com o desenvolvimento da reao, indicado
no eixo das abcissas como coordenada de reao
22
Figura 4. Variao de energia livre (G) no decorrer de uma reao genrica.
Para que a reao ocorra, necessariamente tem-se G
final
< G
inicial
, isto , G negativo. Um ponto
importante a ser destacado que o valor de G permite prever se a reao pode ocorrer, mas
no a velocidade com que a reao atinge o equilbrio. A velocidade de reao depende da
energia livre do Estado de Transio que maior que do que o dos reagentes no Estado Inicial,
isto , G* positivo. Quanto maior o valor de G*, menor ser a velocidade de reao.
7. Na reao genrica A B a velocidade (v) proporcional a [A], isto , v
1
=k
1
[A]. A velocidade da
reao inversa ser, consequentemente, v
-1
=k
-1
[B]. k
1
e k
-1
so constantes de velocidade e
reaes como AB e BA so ditas de primeira ordem, porque as suas respectivas
velocidades dependem de concentrao molar de um nico reagente elevado potncia 1. As
constantes de velocidade k
1
e k
-1
so diferentes da constante de equilbrio da reao, K=[B]/[A].
No estado de equilbrio, por definio, v
1
=v
-1
e, portanto, formalmente, K=k
1
/k
-1
. As reaes
representadas pelas equaes seguintes: 2AB e A+BC so de segunda ordem, cujas
velocidades so, respectivamente, v=k
A
[A]
2
e v=k
AB
[A][B]. Notar que a ordem da reao no
coincide necessariamente com a estequiometria da equao qumica.
8. As quinases formam uma classe muito importante e abundante de enzimas, que se caracterizam
por catalisar a transferncia de um grupo fosfato de alta energia para uma outra substncia
receptora.
9. So chamados compostos de alta energia substncias orgnicas com o grupo fosfato em
ligaes anidrido ou fosfoenol, cuja hidrlise libera fostato inorgnico (Pi) com um G
0
negativo
e em valor absoluto superior a 8kcal/mol. Outros compostos fosforilados com o fosfato em
ligaes ester ou tioester tambm mostram um G
0
de hidrlise negativo, mas de valor absoluto
Energia
Livre
(G)
Coordenada de Reao
Estado Inicial (S)
Estado Final (P)
Estado de Transio
G'
G*
23
da ordem de 3kcal/mol. Estas classes de compostos esto ilustradas na Tabela 2. O principal
composto fosforilado da clula o ATP; cuja frmula estrutural est na Figura 5. O ATP possui
fosfato em ligaes anidrido e ester, aos quais correspondem G
0
de hidrlise de,
respectivamente, -8kcal/mol e -3,5kcal/mol. Todas estas reaes so, portanto, muito
voltadas para os produtos de hidrlise, sendo praticamente irreversveis. No entanto,
nenhuma destas reaes ocorre na clula a velocidade significante se no houver catlise
por uma enzima especfica, da classe das fosfatases.
Figura 5. Frmula estrutural do ATP.
C
C
C C
C
H
H
H
H
H
H
N
N
N
N
HO OH
NH
2
O
-
O- P - O- P - O- P - O- CH
2
O O O
O
-
O
-
O
-
Ad e n i n a
Ri b o s e
AMP
ADP
AT P
ATP = Adenosina 5-trifosfato
Na clula: [ATP] + [ADP] + [AMP] = Constante
FIGURA 2
C
C
C C
C
H
H
H
H
H
H
N
N
N
N
HO OH
NH
2
O
-
O- P - O- P - O- P - O- CH
2
O O O
O
-
O
-
O
-
Ad e n i n a
Ri b o s e
AMP
ADP
AT P
ATP = Adenosina 5-trifosfato
Na clula: [ATP] + [ADP] + [AMP] = Constante
FIGURA 2
24
Tabela 2. Compostos fosforilados.
R
C
CH
2
Fosfoenol
+
H
2
O
O P
R
C
CH
3
O
+
P
i
G
o
' =- 13.000 cal/mol
Anidrido fosfrico
cetona cido
R
C O P
O
+
H
2
O
R
C
O + P
i
cido
O
cido
G
o
' =- 8.000 cal/mol
O P R
+
H
2
O
+
P
i
cido
G
o
' =- 3.000 cal/mol
ster fosfrico
O
R
H
lcool
R S CoA
O
C
Tioster
+
H
2
O
+
cido
G
o
' =- 3.000 cal/mol
OH R
O
C
HS-CoA
tiolcool
ATP ADP
ADP
AMP
+
H
2
O
+
P
i
cido
G
o
' =- 8.000 cal/mol
cido
AMP +
H
2
O
+
P
i
cido
G
o
' =- 8.000 cal/mol
cido
A OH +
H
2
O
+ P
i
cido
G
o
' =- 3.500 cal/mol
lcool
Adenosina trifosfato
Adenosina difosfato
Adenosina monofosfato
(Adenosina)
P
i
=fosfato inorgnico =HPO
4
2-
= PO
3
2-
P
Na clula:
[ATP] + [ADP] + [AMP] =
constante
(pH=7,4)
H
10. No metabolismo muito importante a transferncia de fosfatos de um composto fosforilado de
alta energia para outro. Uma das reaes chave deste tipo :
fosfoenolpiruvato + ADP ATP + piruvato
G
0
=-5kcal/mol
Como esta reao no ocorre sem catlise, seu controle pela clula feito atravs de uma
enzima quinase especfica.
25
11. Alm das quinases que catalisam a transferncia de grupo fosfato do ATP para metablitos,
existem as quinases que tem como substratos protenas, genericamente referidas como
quinases de protena ou, simplesmente, protena-quinases.
H alguns milhares de protena-quinases diferentes em um organismo, que catalisam a
transferncia de fosfato de ATP para o grupo OH da cadeia lateral de resduos especficos de
serina e treonina formando um ster de fosfato. As reaes deste tipo so genericamente
chamadas de fosforilaes e so modificaes covalentes que causam mudana de
conformao das protenas, alterando sua atividade biolgica. Por exemplo, um grande nmero
de enzimas so fosforiladas para sofrer uma transio do estado inativo ao ativo ou vice-versa.
Mais raramente as protenas so fosforiladas no grupo enlico de resduos de tirosina.
Grupo de discusso 5
1) Defina reaes exotrmicas e endotrmicas. Qual a relao entre estes conceitos e a funo
termodinmica entalpia?
2) Defina reaes exergnicas e endergnicas. Qual a relao destes conceitos com G
0
.
3) G
0
caracterstico de cada reao (desde que a temperatura seja constante) e no varia
com as concentraes de reagentes e produtos no equilbrio. G, por outro lado, no
caracterstico da reao, podendo assumir qualquer valor em funo das concentraes iniciais
de reagentes e produtos (quociente Q na expresso de G). Mostre por que estas afirmaes
so verdadeiras discutindo a expresso que relaciona G
0
e G.
4) Na reao genrica AB K
eq
=10
3
. Qual o valor de G
0
? No ponto de equilbrio as
concentraes molares de A e B podem variar? Como varia G com as concentraes molares
iniciais de A e B?
5) Ainda para a reao AB (questo 4) proponha uma condio na qual a reao inversa seja
espontnea. Mostre que a sua proposta possvel calculando o respectivo G. Esta questo
possui mltiplas respostas ou apenas uma resposta nica?
6) Para a reao AB (questo 4), se a constante de velocidade de primeira ordem, k
1
for igual a
10, qual deve ser o valor da constante k
-1
para a reao inversa? Para um mesmo K, constante
de equilbrio, pode haver mltiplos valores de k
1
e k
-1
? Qual a interpretao termodinmica para
a sua resposta?
26
7) Considerando a equao G
0
= -2,3 RT log K, sendo: R = 1,98 x 10
-3
kcal/mol K; T = 298K e
2,3 RT = 1,36 kcal/mol. Calcule os valores de G
0
quando K varia de 10
5
a 10
-5
. Faa uma
tabela.
8) Porque a hidrlise de ATP necessita catlise enzimtica, sendo este um composto rico em
energia? Utilize-se do grfico esquemtico de variao de G (energia livre) em funo de
coordenada de reao para responder a esta questo, definindo estado de transio e energia
de ativao.
MDULO 6: CINTICA ENZIMTICA
1. Enzimas so catalisadores biolgicos cuja natureza qumica proteica. A natureza proteica das
enzimas lhes proporciona alto grau de especificidade.
2. A grande maioria das reaes biolgicas no ocorre, ou ocorrem a velocidades baixssimas nas
condies fisiolgicas de pH e temperatura. Logo, as reaes biolgicas, em geral, necessitam
de catlise para ocorrer, isto , necessitam de enzimas. Para cada reao h uma enzima
especfica.
3. Na reao genrica A B a direo espontnea da reao dada pela variao de energia
livre, .G
0
, conforme esquematizado no grfico da Figura 5.
Figura 6. Variao de energia livre (G) na reao genrica A B.
Energia
Livre (G)
Coordenada de Reao
Estado Inicial
(S)
Estado Final
(P)
Estado de transio da
reao no catalisada
G
0
G
1
0#
G
0#
-1
Estado de transio da
reao catalisada
G
0#
-1cat
G
0#
1cat
*
*
27
G
0
uma constante que se relaciona com a constante de equilbrio da reao pela expresso -
G
0
=2.3 RTlogK. Por outro lado, as velocidades das reaes AB e BA ou, respectivamente,
as constantes de velocidade k
1
e k
-1
no dependem do G
0
da reao, mas dos, respectivos,
G
1
0
e G
-1
0,
que por sua vez s dependem da energia livre (G) do estado de transio
(energias de ativao). A enzima (catalisador) no muda o G
0
da reao, pois
catalisadores no interferem com os estados inicial e final das reaes, mas mudam o
caminho da reao e, por conseqncia diminuem a energia do Estado de Transio.
4. Uria uma substncia muito estvel em gua, mas que pode ser rapidamente decompostas
por hidrlise se a reao for catalisada pela enzima urease:
H
2
N
UREASE
C=O + H
2
O CO
2
+ 2 NH
3
H
2
N
Trata-se de reao de primeira ordem, onde v=k
1
[uria], apesar da equao estequiomtrica
indicar a existncia de 2 reagentes. Esta reao pode ser acompanhada em tubo de ensaio no
laboratrio. As Tabelas 3 e 4 mostram resultados obtidos na prtica.
Tabela 3. Cintica da enzima urease.
Tubo n
o
Tempo (minuto) NH
3
(moles)
1 0 0
2 2 0.084
3 4 0.168
4 6 0.252
5 8 0.336
6 10 0.420
Concentrao da uria: 5 mM; Concentrao da urease: 0,1 g/mL;
Volume de reao: 1 mL; Temperatura: 30
o
C.
Os dados da Tabela 3 mostram que a velocidade da reao constante ao longo do tempo
estudado. J os dados da Tabela 4 mostram variaes relativamente complexas da velocidade
de reao em funo da concentrao da uria para um perodo de 10 minutos de reao.
28
Os dados da Tabela 4 permitem medir experimentalmente duas constantes importantes das
reaes enzimticas V
max
(velocidade mxima) e K
m
(constante de Michaelis) atravs da
equao v = V
max
[S] / (K
m
+ [S]).
Tabela 4. Cintica da enzima urease.
Tubo n Uria (mM) Urease (g) NH
3
(moles)
1 2,5 0,1 0,21
2 5,0 0,1 0,42
3 10 0,1 0,59
4 15 0,1 0,67
5 25 0,1 0,73
6 50 0,1 0,78
7 100 0,1 0,79
8 200 0,1 0,78
9 200 - 0,00
Os significados de V
max
e K
m
so definidos no modelo de cintica enzimtica proposto por
Michaelis e Menten no incio do sculo passado onde ES um complexo enzima substrato
formado antes de converso do substrato em produtos.
A derivao da equao Michaelis Menten:
v = V
max
[S] / (K
m
+ [S]) = k
cat
[E
t
][S] / (K
m
+ [S])
apresentada na prxima pgina.
E + S ES E + P
k
cat
k
1
k
-1
29
Frao de E
tot
na forma de ES =
[S]/(K
diss
+[S])
Velocidade
naquela [S]
Velocidade mxima
Concentrao
do substrato
K
diss
aparente do
Complexo enzima-substrato
30
5. Substncias que reduzem a atividade de uma enzima so chamadas inibidores. Em termos
gerais, inibidores podem atuar em vrias maneiras. Aqui vamos focalizar em inibidores que
ligam reversivelmente com a enzima com constantes de dissociao K
I
. Estes tipos de
inibidores podem atuar em duas maneiras diferentes: a) Eles podem competir com o substrato
para o mesmo stio de ligao na superfcie da enzima livre. Neste caso so chamados
inibidores competitivos ou b) Eles podem ligar em outro stio na enzima livre (E) e/ou no
complexo enzima-substrato (ES). Estes inibidores so chamados inibidores mistos/no-
competitivos se podem ligar a E e ES e so chamados acompetitivos se ligam somente ao
complexo ES.
6. A presena de um inibidor competitivo se manifesta em uma mudana no valor do K
m
:
K
m obs
= K
m
(1+[I]/K
I
) = K
m
onde = (1+[I]/K
I
)
7. A presena de um inibidor misto/no-competitivo se manifesta em uma mudana nos valores do
K
m
e no valor do V
max
:
K
m obs
= K
m
(1+[I]/K
I
)/(1+[I]/K
I
) = K
m
/
V
max obs
= V
max
/
8. A presena de um inibidor acompetitivo se manifesta em uma mudana nos valores do K
m
e no
valor do V
max
:
K
m obs
= K
m
/ (1+[I]/K
I
) = K
m
/
V
max
obs
= V
max
/
Grupo de discusso 6
1) As velocidades de uma reao enzimtica foram determinadas para diversas concentraes de
substrato, conforme a tabela abaixo:
[S] (M) V (mol/L.min)
5 22
10 39
20 65
50 102
100 120
200 135
Os grficos de, respectivamente, V em funo de [S] e 1/V em funo de 1/[S] podem servir para
determinar K
m
e V
max
? Como?
31
2) Numa reao enzimtica, o valor de V
max
, mas no o de K
m
diretamente proporcional
concentrao da enzima? Justifique.
3) A velocidade inicial de uma reao enzimtica em funo da concentrao do substrato S, na
ausncia e na presena dos inibidores A e B segue os dados da tabela abaixo:
VELOCIDADE (MOL/L X MIN)
[S] (M)
SEM I Com Inibidor A Com Inibidor B
1,25 1,72 0,98 1,01
1,67 2,04 1,17 1,26
2,5 2,63 1,47 1,72
5,0 3,33 1,96 2,56
10,0 4,17 2,38 3,49
a) Qual a classe dos inibidores A e B?
b) Determine V
max
e K
m
na ausncia e presena dos inibidores.
4) Utilizando-se dos valores de K
m
e V
max
determinados nas questes 1 e 3, esquematize num
mesmo grfico, para as duas reaes, V em funo da concentrao de substrato, expressa em
mltiplos de K
m
. No eixo dos Y ajuste arbitrariamente as escalas para cada reao fazendo
coincidir os pontos de V = V
max
. Como so as curvas para duas reaes? Justifique o resultado.
5) O que so enzimas alostricas? Defina utilizando-se de grficos esquemticos de V em funo de
[S], compare uma enzima michaeliana (da questo 4) com uma enzima alostrica positiva e com
uma enzima alostrica negativa.
32
MDULO 7: MECANISMOS DE CATLISE ENZIMTICA
1. Catlise acido/base catlise por transferncia de protons. A catlise cida um
processo no qual a transferncia parcial de prtons de um cido para o estado de transio
diminui a energia livre do estado de transio de uma reao. A reao pode ser tambm
estimulada por uma catlise bsica se a taxa de reao aumentar com a abstrao de um
prton por uma base. Algumas reaes podem ser sujeitas simultaneamente a ambos os
processos, caracterizando uma catlise cido-base. Em reaes catalisadas por enzimas os
cidos e bases catalisadores so grupos especficos ionizveis da enzima localizados no seu
stio ativo/stio cataltico. A mutarrotao da glicose (Figura 6) e a catlise da ribonuclease
pancretica bovina A (RNase A) (Figura 7) so exemplos de catlise cido-base.
Figura 6. Mutarrotao da glicose.
33
Figura 7. Catlise da ribonuclease pancretica bovina A (RNase A).
34
2. Catlise covalente envolve a acelerao da taxa de reao atravs da formao transiente
de uma ligao covalente substrato-catalisador. A descarboxilao do acetoacetato um
exemplo deste processo:
No primeiro estgio desta reao, a amina faz um ataque nucleoflico ao grupo carbonila do
acetoacetato formando uma base de Schiff (ligao imina).
O tomo de nitrognio protonado do intermedirio covalente atua como um receptor de eltrons
reduzindo assim o carter de alta energia do enolato. A catalise covalente possui estgios
nucleoflicos e eletroflicos. A catlise covalente pode ser dividida conceitualmente em trs
estgios:
1) A reao nucleoflica entre o catalisador e o substrato formando uma ligao
covalente.
2) A perda de eltrons do centro da reao pelo catalisador agora eletroflico.
3) A eliminao do catalisador que uma reao essencial para retornar ao estgio 1.
Grupo de discusso 7
1) Examine a reao de hidrlise de RNA catalisada pela RNase A para verificar que se trata de um
mecanismo de catlise cido-base.
OH
-
35
2) Faa o grfico da velocidade de uma reao enzimtica em funo do pH para uma enzima
estvel entre pHs 3 e 12, considerando que o substrato no possui grupos ionizveis e a
atividade enzimtica exige no centro ativo uma carboxila (pK
a
= 5) desprotonada e um grupo
amino (pK
a
= 9) protonado.
3) Definir catlise eletrosttica. Procure um exemplo de uma enzima que utiliza esta estratgia.
4) Descrever o mecanismo empregado pelas serina proteases (tripsina, quimiotripsina, elastase, etc)
para hidrolisar ligaes peptdicas. Descrever todas as etapas da reao. Quais tipos de catlise
so empregados em cada uma das etapas?
MDULO 8: ACARES: ESTRUTURA E FUNO
1. Os carboidratos so compostos que apresentam a frmula emprica (CH
2
O)
n
(n> ou = 3),
sendo funcionalmente poliidroxialdedos ou poliidroxicetonas. Os carboidratos mais simples
so os monossacardeos, que se apresentam na formas de aldoses ou cetoses, conforme o
grupo funcional carbonlico que possuem, isto , respectivamente, aldedo ou cetona. H
duas trioses: o gliceraldedo, uma aldotriose, e a diidroxiacetona, uma cetotriose (Figura 8).
O gliceraldedo apresenta um carbono (C2) assimtrico, dando origem a dois ismeros
opticos, as formas D e L (Figura 9). J a diidroxiacetona no possui C assimtrico e, por isso,
no mostra esse tipo de isomeria. Os outros monossacardeos podem ser derivados pelo
crescimento da cadeia destas duas trioses. A Figura 10 mostra a famlia D derivada do D-
gliceraldeido, cujas frmulas estruturais planares obedecem as regras de Fisher.
Figura 8. Gliceraldedo e diidroxiacetona. Figura 9: Carbono quiral ou
carbono assimtrico.
36
Figura 10. Famlia D derivada do D-gliceraldedo.
Figura 11. Ciclizao da D-glicose.
37
O aumento da cadeia do monossacardeo leva ao aparecimento de novos Cs assimtricos e,
portanto mais ismeros estruturais, tambm chamados estereoismeros. O nmero de
ismeros dado pela expresso 2
n
onde n o nmero de carbonos assimtricos. Por
exemplo, em aldoexoses h 4 Cs assimtricos, logo o nmero de ismeros 2
4
=16, sendo 8
da forma D e 8 da forma L. Mas, as estruturas lineares como representadas na Figura 10
tanto para pentoses como para hexoses so poucos estveis em soluo, formando
estruturas cclicas segundo a reao mostrada na Figura 11. Esta uma reao bem
conhecida da qumica orgnica, pela qual um lcool (OH) faz uma adio nucleoflica a
carbonila de um aldedo, formando um composto de condensao da conhecido como
semiacetal. No caso do exemplo da Figura 11 a hexose a D-glicose e, como a figura
mostra, a ciclizao leva ao aparecimento de uma outra isomeria estrutural devido s duas
posies possveis do OH do C1 em relao ao plano do anel, gerando os ismeros e .
importante enfatizar que o OH do C1 no quimicamente equivalente aos demais OHs que
so alcolicos, sendo por isso chamado de OH glicosdico. A existncia do OH glicosdico
permite que todos os monossardeos sejam oxidados em condies brandas pelo reagente
de Fehling, uma reao de oxido-reao na qual os OHs alcolicos no participam.
Figura 12. Nomenclatura para estereoismeros.
38
2. Conforme exemplificado na Figura 12 h uma nomenclatura especificamente designada para
distinguir pares de estereoismeros. Enantimeros possuem estruturas isomricas que so
uma imagem especular da outra, por exemplo, cada membro da famlia D de hexoses
mostrada na Figura 10 tem um, e, somente um, enantimero na famlia L. So epmeros
pares de estereoismeros que diferem apenas pela configurao de um C assimtrico. So
anmeros os dois ismeros resultantes da posio do OH glicosdico do C1 na estrutura
cclica da hexose. E, finalmente, so denominados diastereoismeros pares de ismeros que
no caem em nenhuma das categorias anteriores.
3. Ligao glicosdica: os monossacardeos podem se apresentar na forma de oligo ou
polissacardeos, onde os monmeros so ligados atravs de ligaes glicosdicas.
Oligossacardeos so formados por um pequeno nmero de monossacardeos, resultantes
da condensao de um OH glicosdico com um OH alcolico, como exemplificado abaixo
pela dimerizao de duas molculas de -glicose por ligao 1-4, originando o dissacardeo
maltose:
Caso a ligao glicosdica envolva a condensao dos dois OHs glicosdicos como o caso
da trealose, uma 1-1-diglicose, o dissacardeo no pode ser oxidado pelo reagente de
Fehling (dissacardeo no redutor). J a maltose, que possue um OH glicosdico livre um
dissacardeo redutor, sendo oxidado pelo reagente de Fehling.
4. Polissacardeos so polmeros constitudos de centenas ou milhares de resduos de
monossacardeos, geralmente glicose, formando cadeias lineares, como a celulose (1-4-
poliglicose), ou cadeias ramificadas, como o glicognio e o amido.
O glicognio altamente ramificado, as suas cadeias lineares so formadas por ligaes 1-
4-glicosdicas e suas ramificaes decorrem de ligaes 1-6-glicosdicas (Figura 13). O
glicognio apresenta uma nica extremidade redutora livre (C1 no resduo final na ltima
molcula de glicose da cadeia) e inmeras extremidades no redutoras. A partir das
extremidades no redutoras h acrscimo ou retirada de resduos do polmero. Portanto, as
molculas de glicognio no tm tamanhos definidos.
39
Figura 13. Glicognio Poli (1-4) (1-6) glicose.
Grupo de discusso 8
1) Desenhe o conjunto dos ismeros de D-aldoses de 6 C, atravs das frmulas de projeo de
Fisher. Quantos epmeros possue uma hexoaldose. Identifique todos os epmeros de D-glicose.
Existem pares enantiomricos na famlia D de monossacardeos. Explique.
2) Descreva o fenmeno da mutarrotao de D-glicose, incluindo as reaes qumicas pertinentes
com as respectivas frmulas estruturais dos reagentes. O que este fenmeno tem a ver com os
conceitos de C anomrico e anmeros.
3) Compare os dissacardeos maltose e sacarose, identificando a ligao glicosdica em cada caso.
Por que maltose redutora e sacarose no .
4) Analise a estrutura do glicognio. Procure destacar as vantagens e desvantagens da funo
deste polmero como composto de reserva energtica.
5) Verifique as principais caractersticas dos polissacardeos estruturais, comparando celulose,
quitina e glicosaminoglicanos (estes tambm chamados mucopolissacardeos).
6) A poro de natureza sacardica de algumas glicoprotenas pode servir como stio de
reconhecimento celular. Para desempenhar esta funo, os oligossacardeos ou glicoprotenas
devem ter a capacidade de formar um grande nmero de diferentes estruturas. Qual dos dois
40
pode produzir uma maior variedade de estruturas: oligopeptdeos compostos de cinco resduos
de diferentes aminocidos ou oligossacardeos compostos de cinco resduos de diferentes
monossacardeos? Explique.
7) Frutose, o principal acar do mel, comumente usada como adoante de alimento. Este acar
na forma -D-piranose provavelmente a substncia mais doce conhecida. A forma -D-
furanose muito menos doce.
a) Quais so as estruturas da -D-frutopiranose e -D-frutofuranose?
b) A doura do mel diminui ao deix-lo em repouso e ao mesmo tempo aumentando a temperatura.
Explique.
8) Interconverso das formas de D-galactose. Uma soluo recm-preparada da forma de D-
galactose (1g/ml em um tubo polarimtrico de 1 dm) mostra uma rotao ptica de + 150,7
o
.
Quando deixada em repouso por um longo perodo de tempo a rotao decresce gradualmente
at atingir um valor de equilbrio igual a + 80,2
o
. Em contraste, uma soluo recm-preparada
(1g/ml) da forma mostra rotao tica de apenas +52,8
o
. Quando esta soluo deixada em
repouso por vrias horas a rotao aumenta at o valor de equilbrio igual a +80,2
o
, valor
idntico quele observado para a -D-galactose.
a) Escreva as frmulas de projeo de Haworth das formas e da D-galactose. Qual
caracterstica distingue as duas formas?
b) Por que a rotao de uma soluo recm-preparada da forma decresce gradualmente com o
tempo? Explique por que solues das formas e (de concentraes iguais) atingem o mesmo
valor de rotao ptica no equilbrio?
c) Calcule a composio percentual das duas formas de galactose no equilbrio.
MDULO 9: GLICLISE
1. A gliclise a principal via catablica da glicose compreendendo as 10 reaes enzimaticamente
catalisadas que so mostradas na figura abaixo e cuja estequiometria total pode ser observada
na equao qumica seguinte:
Glicose + 2 NAD
+
+ 2 ADP + 2 P
i
2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H
2
O + 2 H
+
A gliclise, como todas as vias catablicas, exergnica e a equao acima corresponde a
G
o
= -43,4 kJ/mol. Mas o dado da variao de energia livre mais interessante em termos de
G, cujo valor exato depende de cada clula especfica, por exemplo, em msculo cardaco
estima-se que seja igual a 74,0 kJ/mol.
41
2. A finalidade da gliclise obteno de energia, como a equao estequiomtrica indica, cada
molcula de glicose degradada a duas de piruvato e parte da energia livre liberada nesta
degradao retida nos produtos na forma de 2 NADH e 2 ATP.
3. A reao que permite a obteno de NADH a nica de oxido-reduo da gliclise, pela qual
gliceraldedo-3-P oxidado a glicerato-1,3-bisP, atravs da ao oxidante de NAD
+
catalisada
pela enzima gliceraldedo desidrogenase. A manuteno da capacidade oxidante da gliclise
exige que NADH seja re-oxidada a NAD
+
, uma alternativa para isso apresentada na figura,
atravs da reao pela qual NADH reduz piruvato a lactato, recuperando NAD
+
. Esta alternativa
ocorre no msculo esqueltico com baixos nveis de O
2.
4. J ATP produzido em duas reaes distintas pelas quais um radical fosforil transferido de,
respectivamente, glicerato-1,3-P e P-enolpiruvato para ADP, em transferncias catalisadas por
glicerato-1,3-P-quinase e P-enolpiruvato-quinase. Esta maneira de fosforilao de ADP
conhecida como fosforilao a nvel do substrato, para distingui-la da fosforilao oxidativa da
mitocndria que ser vista mais adiante.
5. Na gliclise, h 3 reaes de fosforilao irreversveis catalisadas, respectivamente, pela
hexoquinase, fosfofrutoquinase e piruvato-quinase, que funcionam como marca-passos da via,
cuja regulao se d por um elaborado sistema de controle alostrico das enzimas.
6. Diversas outras hexoses, como frutose, galactose e manose, tambm so metabolisadas pela via
glicoltica.
7. A gliclise em condies anaerbicas tem energtica e funes variadas, conforme o organismo.
Cabe fazer dois destaques importantes.
8. Em vertebrados, encontram-se msculos esquelticos muito pobres em mitocndria, que so
especializados para produzir ATP a partir de gliclise anaerbica, cuja energtica obedece a
seguinte reao geral: Glicose 2Lactato + 2H
+
; G
o
= -196kJ/mol. Mas, parte dessa energia
livre liberada que seria dissipada (61kJ/mol) retida na forma de 2ATP produzidos por mol de
glicose degradada. Deve-se ainda enfatizar que o lactato no descartado, pois vai ser
aproveitado no fgado, aonde reoxidado a piruvato, alternativa metablica importante a ser
examinada mais frente.
9. Leveduras mostram um exemplo de gliclise anaerbica na forma da fermentao alcolica,
segundo a reao geral: Glicose 2Etanol + CO
2
; G
o
= -235kJ/mol. Aqui tambm parte da
energia livre, +61kJ/mol, mantida com a produo de 2ATP. A parte final da fermentao
alcolica compreende duas reaes: a primeira envolve a descarboxilao de piruvato e
liberao de acetaldedo, catalisada pela enzima piruvato-carboxilase, que no existe em
animais. Na segunda reao a desidrogenase alcolica catalisa a reduo do acetaldedo por
NADH.
42
O
OH
OH
OH
HO
ATP
ADP
O
OH
OH
OH
HO
ATP
ADP
O
P - O- CH
2
CH
2
O- P
OH
HO
H
2
C- O- P
C=O
H
2
C- OH
HC=O
HC- OH
H
2
C- O- P
HOCH
2
P - OCH
2
O=C- O- P
HC- OH
H
2
C- O- P
NAD
+
NADH
P
i
O=C- O
-
HC- OH
H
2
C- O- P
COO
-
HC- O- P
H
2
C- OH
H
2
O
COO
-
C- O- P
CH
2
ATP
ADP
COO
-
C=O
CH
3
COO
-
HC- OH
CH
3
NAD
+
NADH
O
P - O- CH
2
CH
2
OH
OH
HO
HO
ATP
ADP
NAD
+
NADH
P
i
ATP
ADP
Gl i cose
Gl i cose 6- f osf at o
Fr ut ose 6- f osf at o
ATP
ADP
Fr ut ose 1, 6 bi sf osf at o
Di i dr oxi acet ona
f osf at o
Gl i cer al de do
3- f osf at o
1, 3 Bi sf osf ogl i cer at o
3- Fosf ogl i cer at o
2- Fosf ogl i cer at o
Fosf oenol pi r uvat o
Pi r uvat o Lact at o
GLICLISE
HO
NAD
+
NADH
ADP
ATP
ADP
ATP
43
Grupo de discusso 9
1) Classifique as reaes da gliclise, destacando as que so de xido-reduo.
2) Equacione a reao de oxidao de gliceraldedo-3-fosfato, destacando o oxidante e o redutor.
3) Na reao do item 2) parte da energia utilizada para produzir ATP. Mostre como isso possvel,
equacionando as etapas relevantes da reao. Defina fosforilao ao nvel do substrato.
4) Equacione a reao lquida da transformao de glicose em piruvato. Como regenerada a
capacidade oxidante do sistema NAD
+
/NADH necessria atividade glicoltica nos glbulos
vermelhos humanos (que no tm mitocndria) e na cultura de levedo sem O
2
(fermentao).
5) Examine uma tabela com as 10 reaes da via glicoltica que contenha, respectivamente, o G
0
e o G das reaes. Quais so as reaes irreversveis da gliclise?
6) Porque os valores de G
0
e de G da mesma reao podem ser diferentes? Para decidir se a via
glicoltica numa determinada clula reversvel ou irreversvel, que valor mais relevante, G
0
ou G?
7) Uma pessoa incapaz de executar exerccios fsicos intensos e prolongados teve suas enzimas
analisadas. Todas as enzimas da via glicoltica estavam em concentrao normal, com excesso
da fosfoglicerato mutase muscular.
a) Como ser afetada a produo de energia metablica em uma clula que apresenta baixos nveis
desta enzima?
b) Como ser afetada a produo de Lactato na ausncia desta enzima? [Referncia: Di Mauro, S.;
Miranda, A.F.; Kahn, S.e Gitlin, K. - Human muscle phosphoglycerate mutase deficiency Science
1981, vol. 212, 1277-1279.
8) Calcular a porcentagem de energia armazenada pela clula ao degradar glicose pela via
glicoltica. Sabe-se que:
Glicose 2 lactato G
o
' = - 47.000 cal/mol
44
MDULO 10: CICLO DE KREBS
1. Em condies aerbicas, o destino do piruvato produzido na gliclise sofrer uma
descarboxilao oxidativa catalisada pela piruvato desidrogenase, que um complexo
multienzimtico existente no interior da mitocndria de eucariotos. Portanto, o piruvato precisa
entrar na mitocndria para ser degradado por essa via. A reao geral a seguinte:
Piruvato + CoA + NAD
+
Acetil-CoA + NADH + CO
2
2. O acetilCoA resultante da metabolizao do piruvato totalmente oxidado no ciclo do cido
ctrico, tambm chamado ciclo de Krebs, conforme a seguinte reao geral:
Acetil-CoA + 3 NAD
+
+ FAD + GDP + P
i
+ 2 H
2
O 2 CO
2
+ 3 NADH + FADH
2
+ GTP + CoA + 2 H
+
O ciclo de Krebs, esquematizado na figura, compreende 8 reaes, envolvendo 8 enzimas e 8
cidos carboxlicos, di e tri-cidos, todos dispersos na matriz da mitocondria. Portanto,
comeando no piruvato e passando pelo acetilCoA, ocorre oxidao completa desses metabolitos
liberando 3CO
2
sem participao de O
2
molecular. Os agentes oxidantes em todas as reaes
so NAD
+
ou FAD e as formas reduzidas destas co-enzimas (NADH + FADH
2
), resultantes do
processo, s so reoxidadas na cadeia respiratria, uma via especializada que se localiza na
membrana mitocondrial interna e ser considerada mais adiante.
3. O ciclo de Krebs, conforme sua reao geral indica, essencialmente catablico, pois promove
a oxidao do radical acetil a 2CO
2
e retm parte da energia livre desta reao na forma de
coenzimas reduzidos que, posteriormente, serviro produo de ATP atravs da fosforilao
oxidativa. Para cumprir esta funo basta que os 8 intermedirios do ciclo ocorram em
concentraes catalticas. Mas, o ciclo possui outra funo, alm da catablica, diversos de seus
intermedirios alimentam as vias de sntese de aminocidos, lipdeos e glicose, isto , o ciclo
tem tambm funo anablica e, portanto, deve ser classificado como anfiblico. Para que o
ciclo desempenhe concomitantemente ambas as funes, catablica e anablica, as
concentraes dos intermedirios so mantidas e controladas atravs de um complexo sistema
de reaes auxiliares, conhecidas como reaes anaplerticas. Um exemplo de reao
anaplertica a carboxilao de piruvato para obter oxalacetato, catalisada pela enzima piruvato
carboxilase.
4. A transformao de piruvato em acetil-CoA, uma reao para a qual convergem diversas vias
catablicas e anablicas, alm da gliclise. Por esse motivo a piruvato desidrogenase est
sujeita a um controle altamente elaborado, compreendendo dois nveis de regulao: a) controle
alostrico atravs da inibio pelo produto, exercido por NADH e acetil-CoA; b) modificao
covalente reversvel da subunidade E
1
da enzima, por fosforilao/desfosforilao.
5. As enzimas citrato sintase, isocitrato desidrogenase e -cetoglutarato desidrogenase so as
reguladoras do fluxo metablico atravs do ciclo de Krebs e esto sujeitas a controle alostrico,
envolvendo NADH como inibidor e Ca
+
e ADP como ativadores.
45
Citrato
cis-Aconitato
Isocitrato
Oxalosuccinato
a-Cetoglutarato
Succinil-CoA
Succinato
Fumarato
L-Malato
Oxaloacetato
Acetil-CoA
Piruvato
CoASH +NAD+
CO2 +NADH
H2O
CoASH
H2O
H2O
NAD+
NADH +H+
CO2
NAD+
NADH
+H+
CoASH CO2
GDP +Pi
GTP
FAD
FADH2
H2O
NAD+
NADH +H+
Ciclo de Krebs
Grupo de discusso 10
1) Escrever a reao de formao de acetil-CoA a partir de piruvato e indicar:
a) as 5 coenzimas necessrias
b) as vitaminas envolvidas
c) a sua localizao celular
2) Como a equao qumica, estequiometricamente equilibrada, que representa a oxidao de
acetil-CoA no ciclo de Krebs? Como se pode medir o rendimento do ciclo de Krebs em termos
de coenzimas reduzidos (poder redutor) e ATP (ligaes de fosfato de alta energia).
3) Identifique os tipos de reaes que ocorrem no ciclo de Krebs, mostrando as respectivas
equaes qumicas.
46
4) Equacione a descarboxilao oxidativa de -cetoglutarato a succinato, respeitando a
estequiometria da reao. Mostre as etapas que compem esta reao com as respectivas
enzimas e coenzimas.
5) Quais so as enzimas do ciclo de Krebs sujeitas a regulao? Explique como cada uma delas
regulada.
6) Explique porque piruvato estequiometricamente convertido a CO
2
na respirao de fatias de
msculo mantidas em soluo fisiolgica, enquanto oxalacetato e citrato tem efeito cataltico
neste mesmo processo. Mostre porque a respirao pode ser sustentada pelo consumo
estequiomtrico de citrato, mas no de acetato, quando o ciclo de Krebs inibido por malonato.
7) Dispondo das enzimas necessrias, a adio de que compostos far aumentar a concentrao de
oxaloacetato em um sistema in vitro que contm mitocndrias: acetil-CoA, piruvato, glutamato,
citrato ou cidos graxos?
8) Uma suspenso de mitocndrias, suplementada com acetil-CoA marcada com C
14
, produz CO
2
marcado apenas quando suprida de oxignio. Em condies anaerbias, a adio de azul de
metileno restaura a produo de CO
2
marcado, observando-se tambm a descolorao do
corante (azul de metileno reduzido incolor). Explique estes dados.
MDULO 11: CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA
1. Fosforilao oxidativa o processo bioqumico pelo qual a oxidao de NADH e FADH
2 ,
produzidos na gliclise e ciclo de Krebs, ocorre acoplada produo de ATP, a partir de ADP +
Pi. Este processo se d na cadeia respiratria ou cadeia de transporte de eltrons, que
compreende um conjunto ordenado de enzimas e transportadores de eltrons inseridos na
membrana interna da mitocndria.
2. A cadeia respiratria contem 4 complexos, I,II, III e IV, ordenados por ordem crescente de
potencial redox, indo do potencial padro de NAD
+
/NADH (E
0
= -0,315V) ao do O
2
/H
2
O (E
0
=
+0,815V). Os eltrons so transferidos do complexo I ou II para o complexo III pela coenzima
Q (ou ubiquinona), e do complexo III para o complexo IV pelo citocromo C para chegar ao O
2
.
NADH e FADH
2 ,
cedem eltrons, respectivamente, aos complexo I e II. A transferncia
exergnica de eltrons do nvel redox de NADH para o de O
2
(E
0
= 1,130V) envolve uma
diferena de energia livre liberada (G
0
= -218kJ/mol) que em parte retida pelo transporte de H
+
47
do lado interno para o externo da membrana, criando o gradiente eletroqumico de prtons que
permitir empurrar o processo endergnico de fosforilao de ADP por Pi para gerar ATP,
atravs da bomba de prtons que constitui a ATP sintase (tambm conhecida com F
1
F
0
-
ATPase).
Complexo I
Complexo III
Complexo IV
Espao
Intermembranar
Matrix
Mitocondrial
NADH + H+
2 H+
NAD+
Q
4 H+
Cit C
2 H+
1/2 O2 + 2H+
H2O
Complexo II
FADH2
3. A ATP sintase distinta e fisicamente separada da cadeia de transporte de eltrons. A
transferncia de 2e de NADH at O
2
envolve um G
0
= -218kJ/mol, que gera um incremento no
gradiente de prtons suficiente para mover a ATP sintase, permitindo a produo de 3 moles de
ATP (G
0
= +30,5kJ/mol). Nestas condies, a ATP sintase trabalha com uma eficincia
termodinmica igual a 42%. , no entanto, necessrio destacar que quando os 2e saem do nvel
redox de FADH
2 ,
formam-se apenas 2ATP. Naturalmente, para uma melhor medida da real
eficincia termodinmica da fosforilao oxidativa seria preciso estimar o G da transferncia de
eltrons em vez do G
0
.
4. A grande quantidade de energia livre que seria dissipada na oxidao completa da glicose a CO
2
e H
2
O [C
6
H
12
O
6
+ 6 O
2
6 CO
2
+ 6 H
2
O; G
0
= -2823 kJ/mol] aproveitada para produo de
ATP, graas quase exclusivamente ao processo de fosforilao oxidativa, rendendo 38ATP por
mol de glicose (incluindo neste total 2ATP da gliclise e 2 do ciclo de Krebs).
5. Vrios mecanismos da cadeia de transporte de eltrons e de seu acoplamento sntese de ATP
foram elucidados atravs da utilizao de inibidores e desacopladores, entre os quais esto:
rotenona, amital, antimicina A, cianeto e DNP.
Rotenona e amital inibem a reduo dos complexo I e III por NADH.
Antimicina A inibe o transporte de eltrons no complexo II.
Cianeto inibe o transporte no complexo IV.
DNP desacoplador, pois promove o vazamento de H
+
,levando dissipao do gradiente
de prtons e contnuo transporte de eltrons, desacoplado da sntese de ATP.
48
6. A sntese de ATP a partir de ADP e P
i
na mitocndria, que catalisada pela ATP sintase,
dirigida pelo processo de transporte de eltrons. Mas como a ATP sintase fisicamente separada
das protenas do transporte de eltrons, a energia livre liberada no transporte de eltrons deve
ser conservada em uma forma que possa ser utilizada pela ATP sintase. A energia livre do
transporte de eltrons conservada pelo bombeamento de H
+
da matriz mitocondrial para o
espao intermembranar, criando um gradiente de H
+
. A volta dos prtons ao interior da
mitocndria termodinamicamente favorvel. A membrana interna da mitocndria impermevel
a prtons em toda sua extenso, exceto na ATP sintase; e ento por este canal que os prtons
atravessam a membrana, de volta matriz mitocondrial. A variao de energia livre associada ao
transporte de um prton atravs da membrana interna da mitocndria pode ser determinada
atravs de medidas da diferena de pH e do potencial de membrana estabelecidos em
mitocndrias consumindo oxignio.
Grupo de discusso 11
1) Definir potencial de xido-reduo (E), potencial de xido-reduo padro (E
o
) e potencial de
xido-reduo padro bioqumico (E
o
).
2) Entre os transportadores universais de eltrons da cadeia respiratria esto NAD
+
e os
nucleotdeos de flavina (FAD e FMN), quais so as diferenas entre estes transportadores de
eltrons quanto a potencial redox e forma de interao com as enzimas com as quais atuam?
3) Classifique os seguintes inibidores quanto a seus mecanismos de ao na cadeia respiratria: a)
rotenona; b) antimicina A; c) oligomicina e d) DNP (2,4-dinitrofenol).
4) Descreva o mecanismo de ao do DNP (2,4-dinitrofenol), mostrando porque o mecanismo de
ao deste inibidor uma demonstrao experimental importante da hiptese quimiosmtica da
fosforilao oxidativa.
5) Porque F
1
e F
o
so ambos necessrios para a sntese de ATP?
6) Em mitocndrias isoladas, o transporte de eltrons no ocorre na ausncia de ADP e Pi, mesmo
que haja abundncia de succinato para fornecer eltrons. Como se explica que mitocndrias
nessas condies passam a transportar eltrons e consumir oxignio se forem tratadas com
DNP?
49
7) A relao entre energia livre padro de uma reao e o potencial redox :
G
o
= -nFE
0
o
(
m
o
l
/
m
i
n
.
l
)
Concentrao de Substrato (M)
Figura 2 Velocidade de reao em funo da concentrao de substrato para uma enzima michaeliana.
Nesta curva pode-se facilmente identificar o efeito de saturao do substrato. Nestas
circunstncias, o sistema tende a adquirir velocidade de reao mxima (V
mx
), grandeza que
funo da concentrao inicial da enzima livre (E). Podemos tambm definir uma concentrao de
substrato na qual se obtm metade de V
mx
. Esse valor de [S] numericamente igual ao K
m
,
parmetro que dentro de certos limites mede a afinidade da enzima pelo substrato.
O mtodo mais preciso para determinao grfica dessas grandezas num experimento de
Cintica Enzimtica atravs do grfico de duplo-recproco ou de Lineweaver-Burk. Para tanto se
deve plotar 1/V em funo de 1/[S].
A enzima escolhida para este estudo a invertase de levedura que catalisa a hidrlise da
sacarose para produzir glicose e frutose:
C
12
H
22
O
11
+ H
2
O C
6
H
12
O
6
+ C
6
H
12
O
6
Sacarose Glicose Frutose
A determinao da velocidade da reao (ou da atividade enzimtica) pode ser feita atravs
da dosagem dos acares redutores formados (frutose e glicose). A dosagem baseia-se na reao
entre o cido 3,5-dinitro-saliclico (DNS) e os acares redutores. Estes monossacardeos reduzem
o DNS fornecendo um produto de cor caracterstica, cuja formao pode ser acompanhada a 540
nm.
Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (mols) de acares redutores formada, por
um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente (mols) de
sacarose hidrolisada. Nestas experincias as velocidades da reao sero expressas em mols de
sacarose hidrolisada por minuto.
Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com a maior exatido
possvel. Para isso, o grupo dever organizar-se de maneira a no permitir que a reao se inicie
em tempos diferentes nos vrios tubos. Para tal, importante manter os tubos em gelo durante a
adio dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecem nos protocolos,
93
com a enzima sendo adicionada por ltimo. Leva-se ento os tubos, todos juntos, ao banho a 37C
para reagir. Transcorrido o tempo determinado, os tubos devem voltar, todos juntos e
simultaneamente, para o gelo. Neste ponto a reao pra.
A atividade enzimtica medida em unidade (U), sendo que 1 U a quantidade de enzima
necessria para a formao de 1 mol de produto por minuto.
II. OBJETIVOS
Estudar as influncias das concentraes de enzima e substrato nas velocidades de uma
reao enzimtica, examinar as curvas obtidas experimentalmente, calcular os parmetros
cinticos e discutir seus valores e importncia.
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Construo da curva padro
Adicionar a seis tubos (180 X 20 mm) com volumes crescentes de soluo padro redutora
(glicose 6 mM + frutose 6 mM), conforme indicado na tabela 1. Complete o volume em cada tubo
para 2,0 mL com tampo. Adicionar em seguida 2 mL do reagente DNS. As quantidades esto
indicadas na tabela 1.
Tabela 1 Curva padro da soluo redutora.
tubos
soluo padro
redutora (mL)
soluo
tampo (mL)
reagente
DNS (mL)
absorbncia
(540 nm)
sacarose
hidrolisada(mols)
branco - 2,0 2,0 0,000 0,00
1 0,2 1,8 2,0
2 0,4 1,6 2,0
3 0,6 1,4 2,0
4 0,8 1,2 2,0
5 1,0 1,0 2,0
Anotar aqui a concentrao da soluo padro: ________
Aps a adio do DNS (cido 3,5-dinitro-saliclico), colocar os tubos em banho-maria fervente por 10
min. Aps este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada. Agitar com
inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540 nm contra o branco.
Construir o grfico absorbncia versus concentrao de sacarose hidrolisada. Este grfico
ser a curva padro.
94
2. Efeito da concentrao da enzima
Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes conforme tabela 2.
Manter todos os tubos no gelo.
Tabela 2 Estudo da concentrao de enzima x velocidade de reao.
tubos
sacarose
5% em
tampo
(mL)
tampo
pH 4,77
(mL)
soluo
enzima
(mL)
Concentrao
enzima (M)
Abs. 540
nm
sacarose
hidrolisada por
min. (mol/min)
branco 1,0 1,0 - 0,00 0,000 0,00
1 1,0 0,9 0,1
2 1,0 0,7 0,3
3 1,0 0,5 0,5
4 1,0 0,3 0,7
5 1,0 0,1 0,9
6 1,0 - 1,0
Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e coloc-los
imediatamente (e simultaneamente) em banho-maria a 37C por 5 min. Transcorrido este tempo, os
tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reao para.
Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na presena de DNS, devido alcalinidade do
reagente, a enzima para de funcionar.
Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Findo este tempo, esfriar em
gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar com inverso da posio
na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540 nm.
Fazer o grfico colocando a concentrao da enzima (M) nas abscissas e a velocidade de
hidrlise expressa em mols de sacarose hidrolisada por minuto nas ordenadas. Durante a aula de
laboratrio ser fornecido o valor da concentrao da enzima na soluo estoque.
95
3. Efeito da concentrao de substrato
Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes segundo a tabela 3.
Manter todos os tubos no gelo.
Tabela 3 Estudo da concentrao de substrato x velocidade de reao.
tubos
sacarose
5% em
tampo
(mL)
tampo
pH 4,77
(mL)
soluo
enzima
(mL)
concentrao
sacarose (M)
Abs. 540
nm
sacarose
hidrolisada por
min. (mol/min)
branco 1,0 1,0 - 0,000 0,00
1 0,05 1,45 0,5
2 0,1 1,4 0,5
3 0,3 1,2 0,5
4 0,5 1,0 0,5
5 0,7 0,8 0,5
6 1,0 0,5 0,5
Proceder exatamente como no caso do estudo da concentrao da enzima (item anterior).
Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e coloc-los
imediatamente (e simultaneamente) em banho-maria a 37C por 5 min. Transcorrido este tempo, os
tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reao para.
Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na presena de DNS, devido alcalinidade do
reagente, a enzima (valor elevado de pH) pra de funcionar.
Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Findo este tempo, esfriar em
gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar com inverso da posio
na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540nm.
Fazer um grfico da velocidade versus concentrao inicial do substrato. Estimar os valores
de V
mx
e K
m
.
Fazer o grfico de Lineweaver-Burk e calcular os valores de V
mx
e K
m
.
Comparar o valor de K
m
com o encontrado na literatura cientfica.
96
IV. RELATRIO DE LABORATRIO 3
Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, as seguintes questes
devem estar respondidas no relatrio.
1. Qual o substrato utilizado nesta prtica? Qual a reao catalisada pela enzima a partir deste
substrato? Qual(is) o(s) produto(s) da reao catalisada pela enzima a partir deste substrato?
2. Foi utilizado algum tubo controle? Qual a funo de um tubo controle? D exemplos.
3. Por que os tubos devem ser mantidos em banho de gelo? E porque os tubos devem ser
transferidos ao mesmo tempo para o banho a 30C?
4. Por que a leitura da absorbncia feita a 540 nm?
5. Discutir as curvas obtidas para o efeito da concentrao da enzima e do substrato e elaborar um
protocolo para estudar o efeito do pH sobre a atividade.
6. No item 2 do protocolo dito que, devido alcalinidade do reagente DNS, sua adio faz a
reao parar (enzima perde atividade). Justifique essa afirmao.
7. Como se pode dosar uma enzima? Em que a dosagem de uma enzima difere da dosagem de
uma substncia qualquer? Como determinar a atividade enzimtica (U) de uma enzima?
8. Sabe-se que para [E] = x, tem-se V
mx
= 1 U, o que ocorrer com V
mx
se [E] = 2x? Qual ser o
valor de K
m
?
9. Definir K
i
. O que o valor de K
i
indica? Como se determina o Ki graficamente? Descreva um
experimento simples que ajude a definir se uma substncia um inibidor competitivo ou no-
competitivo.
10. O que atividade especfica de uma enzima? Como se calcula a atividade especfica?
11. Uma soluo da enzima hexoquinase (atuante na via glicoltica), de caractersticas michaelianas,
possui um valor de K
m
igual a 0,15 mM para a glicose e 1,5 mM para a frutose. A velocidade mxima
da reao (V
mx
) neste sistema a mesma para os dois substratos e igual a 50 mmols
substrato.(min.L)
-1
. Plote os dois casos num mesmo grfico de velocidade reao em funo da
concentrao de substrato. Faa tambm o grfico de duplo recproco de Lineweaver-Burk contendo
os dois substratos. Comente as diferenas observadas entre os dois substratos nas duas curvas.
12. Uma soluo comercial de xantina oxidase (enzima que participa do metabolismo de purinas)
possui, em seu rtulo, as seguintes informaes:
Dosagem de protena: 2,4 mg/mL
Atividade enzimtica : 150 U/mg protena
De acordo com o protocolo do ensaio enzimtico, so necessrios 10 mL de uma soluo de xantina
oxidase com atividade de 0,2 U/mL. Assim sendo, pergunta-se:
a.) Como preparar esta soluo?
b.) Se a minha concentrao de substrato (xantina) for 0,6 mM, quantos mols de xantina devem
restar em soluo aps 10 min?
97
LABORATRIO 4: PURIFICAO DE PROTENAS SDS-PAGE E PONTO ISOELTRICO (pI)
I. FUNDAMENTOS
Mtodos de Purificao de Protenas
possvel purificar e isolar protenas utilizando-se princpios fsico-qumicos, que levam em
conta as propriedades caractersticas dessas biomolculas. Uma dessas caractersticas est
baseada na solubilidade das diferentes cadeias laterais dos aminocidos, que dependem da
concentrao de sais dissolvidos no solvente (fora inica da soluo), da polaridade do solvente
(constante dieltrica desse solvente), do pH do meio (ponto isoeltrico da protena) e da
temperatura.
Em uma soluo aquosa de baixa fora inica, a solubilidade de uma protena, em geral,
aumenta com a concentrao salina. Esse fenmeno conhecido como salting in. Em solues
com alta fora inica, entretanto, a solubilidade de uma protena em geral decresce, fenmeno que
resulta da competio entre os ons salinos adicionados e o soluto (protena), diminuindo a
capacidade de solvatao do solvente aquoso. Esse fenmeno conhecido como salting out,
constituindo uma das tcnicas mais utilizadas para a purificao de protenas. Sulfato de Amnio
[(NH4)
2
SO
4
] o sal mais utilizado para salting out, uma vez que sua solubilidade alta (3,9 M a
0C), permitindo gerar solues aquosas de alta fora inica.
Protenas em geral possuem uma grande variedade de aminocidos com grupamentos
ionizveis com diferentes pKs. A um pH caracterstico para cada protena, as cargas positivas da
molcula so balanceadas pelas cargas negativas, conferindo protena carga total zero. Neste pH,
denominado ponto isoeltrico (pI), a molcula torna-se imvel em presena de um campo eltrico.
Como pode ser visto na figura 1, a solubilidade da lactoglobulina pode variar com a concentrao
salina (NaCl). No entanto, em qualquer caso, ao se ajustar o pH para valores prximos ao pI da
protena, ocorre uma solubilizao mnima e a maior frao de protenas ficar insolvel.
Em muitas situaes, pode-se utilizar os conceitos de salting out e de precipitao no pI
para purificar uma protena especfica.
98
Figura 1 Solubilidade da lactoglobulina em funo do pH em diferentes concentraes de NaCl.
Eletroforese e Separao de Protenas Totais (SDS-PAGE)
A separao de macromolculas (protenas, DNA e RNA) pode ser feita aplicando-se um
campo eltrico numa matriz slida, como um gel ou papel, que contem a mistura de interesse. Esse
mtodo, amplamente utilizado, denomina-se eletroforese e baseia-se na migrao das molculas
em relao a um campo eltrico, devido sua carga.
Normalmente se utiliza um gel, devido a supresso das correntes de conveno produzidas
por pequenos gradientes de temperatura e tambm porque o gel funciona como uma peneira
molecular, permitindo a separao das macromolculas por peso molecular.
O gel de eletroforese constitudo de um polmero de acrilamida cuja estrutura est
demonstrada na Figura 2. Esta polimerizao ocorre na presena de radicais livres, os quais so
gerados por persulfato de amnio e estabilizados por TEMED (N,N,N,N-tetrametilenenodiamino). A
polimerizao tambm depende da presena de um agente, o NNmetileno-bis-acrilamida, que
facilita a ligao das cadeiras entre si, formando um gel cuja porosidade determinada pelo
comprimento das cadeias e pelo grau de interligao entre estas.
Solubilidade
mg/mL
pH
99
Figura 2 Esquerda: ao de peneiramento de um gel poroso de acrilamida. Direita: formao de um gel de
poliacrilamida. O tamanho do poro pode ser controlado pelo ajuste da concentrao do monmero ativado
(acrilamida, em azul) e do interligante (bis-acrilamida, em vermelho).
A separao de protenas ocorre em condies desnaturantes. A mistura de protenas e
dissolvida em tampo de amostra. Este tampo de amostra contm SDS (dodecil sulfato de sdio),
que um detergente aninico que acaba rompendo as ligaes no covalentes existentes na
protena nativa resultando na sua desnaturao. Neste tampo tambm temos -mercaptoetanol
que reduz as pontes de dissulfeto existentes na protena.
II. OBJETIVOS
1) Precipitar as protenas totais de uma soluo de leite em p, utilizando os conceitos de
precipitao no pI.
2) Utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) para separar as protenas
de diferentes amostras e estimar sua concentrao.
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Precipitao no pI
Preparar uma srie de tubos de ensaio de acordo com a tabela 1
100
Tabela 1 Preparao dos tubos em diferentes pHs.
Tubo 1 2 3 4 5
cido Actico 0,1 mM 1,0 mL
cido Actico 1,0 mM 1,0 mL
cido Actico 50 mM 1,0 mL
cido Actico 1,0 M 1,0 mL
cido Actico 2,0 M 1,0 mL
PH 6,7 5,7 4,7 3,7 2,7
Turvao (sim / no)
Adicionar, a cada um dos tubos, uma alquota (5,0 mL) de soluo de leite em p desnatado
(5%, previamente centrifugado).
Agitar os tubos e aguardar 5 minutos
Separar alquotas de 1,0 mL, distribuir em tubos plsticos pequenos e centrifugar (5000 rpm,
5 minutos, temperatura ambiente). Descartar a fase sobrenadante e ressuspender o precipitado em
NaOH 0,1M (1,0 mL) (Observao: utilizar o mesmo procedimento mesmo para os tubos que
aparentemente no apresentam precipitado)
Aps a dissoluo total do precipitado, separar uma alquota da soluo obtida (10,0 L)
para SDS-PAGE.
2. Eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE)
Para este experimento, sero utilizadas como amostras:
alquotas de protenas purificadas anteriormente, a partir de uma soluo de leite em p (5%)
(amostras 1 a 5)
a soluo contendo o extrato bruto de protenas totais de leite em p (5,0 L) para
comparao (amostra 6)
Soro bovino diludo a 10% (10,0 L) para comparao (amostra 7)
Albumina bovina a 4,0 mg/mL (5,0 L) (padro de peso molecular: 66,0 KDa)
Montar o aparato para eletroforese conforme figura 3 (o gel de eletroforese ser preparado
previamente de acordo com o apndice 1), adicionar na cuba o tampo de corrida at cobrir os
poos do gel para eletroforese.
101
Adicionar tampo de amostra (10 L) a cada uma das amostras, e aquecer (2 minutos,
100C) para desnaturar as protenas. Resfriar (gelo) e aplicar 15 L nos poos do gel para
eletroforese seguindo a ordem da tabela 2.
Tabela 2 Adio das amostras ao SDS-PAGE
poo n 1 2 3 4 5 6 7 8
Amostra padro amostra 1 amostra 2 amostra 3 amostra 4 amostra 5 amostra 6 amostra 7
Aplicar a tenso nos eletrodos do aparato de eletroforese (150 V) e aguardar (30 minutos)
at que o corante marcador (Azul de Bromofenol) se aproxime da base do gel
Interromper a eletroforese e mergulhar o gel em uma soluo de colorao: Coomassie Blue R
(0,25g) em metanol : cido actico : gua (45% : 10% : 45%). Aguardar (5-10 minutos)
Substituir a soluo de colorao pela soluo de descolorao: metanol : cido actico :
gua (45% : 10%: 45%) (15 minutos)
Verificar as protenas coradas, e estimar por comparao, a purificao da amostra.
IV. RELATRIO DE LABORATRIO 4
Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, as seguintes questes
devem estar respondidas no relatrio:
1. No primeiro experimento, em que condies a maior precipitao de protenas ocorreu? A que
pH corresponde?
2. possvel estimar o peso molecular da protena majoritria precipitada a partir da soluo de
leite em p? Compare com a frao total de leite em p utilizada para fazer a eletroforese. Houve
eficincia na separao dessa protena?
3. A tabela abaixo mostra valores de pI para diferentes protenas, com seus respectivos valores de
peso molecular (em kDa). Observe a banda de protena purificada corada no gel de poliacrilamida e
a posio relativa ao padro de albumina bovina adicionado.
102
Protena pI Peso Molecular (kDa)
Casena 4,7 20,0-23,0
Insulina 5,4 6,0
Colgeno 6,6 130,0
Hemoglobina 7,1 64,5
Citocromo c 10,6 13,0
Histona 10,8 12,0 a 20,0
De acordo com os valores de pI e de peso molecular, qual seria a protena purificada da soluo
de leite em p?
4. Se houvesse contaminao da soluo de leite em p com albumina bovina, esse mtodo de
purificao seria eficiente? Como a albumina bovina poderia ser detectada? E se houvesse
contaminao do leite em p com hemoglobina, esse mtodo de purificao seria eficiente?
Consulte os dados de pI e justifique sua resposta.
5. O que eletroforese? Qual a funo do gel de empilhamento? E do gel de separao (ou de
resoluo)? Observe os diferentes pHs das solues B e C (vide Apndice) utilizadas para fazer os
gis de resoluo e de empilhamento, respectivamente. Por que o gel de empilhamento e o gel de
resoluo possuem pHs diferentes? Porque h SDS no gel?
6. Conforme a figura abaixo, uma mistura de trs protenas cujos valores de pI so 4,0; 7,0 e 11,0 foi
submetida a eletroforese. Usando-se tampes de valores de pH = 4,0; 7,0 e 11,0 esquematizar as
posies relativas das trs protenas em cada tampo. Protenas de mesma carga correriam a
mesma distncia numa eletroforese? Existe alguma possibilidade de se separar protenas diferentes
s que de cargas iguais?
Equipamento para eletroforese em papel.
103
7. A mobilidade eletrofortica em pH = 8,6 de uma protena normal e de anlogas anormais (que
tem um aminocido mutado) est representada abaixo. Identifique a que posio corresponde cada
uma das protenas e diga o porqu.
ProS substituio de glutamato por valina
ProJ substituio de glicina por aspartato
ProN substituio de lisina por glutamato
ProC substituio de glutamato por lisina
A B Normal C D
(-) (+)
8. Uma protena com 40 kDa e outra com 90 kDa foram utilizadas como padro num gel de
poliacrilamida com SDS. A motilidade relativa foi de 0,92 e 0,54 respectivamente. Qual seria a
massa aparente de uma protena neste gel, com motilidade de 0,72.
9. Apesar de uma cromatografia em coluna de gel filtrao e uma eletroforese gel de poliacrilamida
usarem princpios fsicos semelhantes, porque ao separamos uma protena de 40 kDa e outra de 15
kDa a de maior peso a primeira a ser eluda da cromatografia e a de menor peso a que mais se
move na eletroforese do gel. Em que situaes voc usaria a cromatografia? E a eletroforese?
104
V. APNDICE
Preparao do gel de acrilamida / SDS
Inicialmente montam-se as placas de vidro com os espaadores posicionados. Vedar o
espao entre as placas com agarose (1% aquecida em ebulio). Aguardar resfriamento.
PRECAUES: Acrilamida neurotxica quando no polimerizada. Utilize sempre luvas
descartveis para manipular solues contendo acrilamida. Evite inalar TEMED (mesmo diludo,
pode ser txico) e butanol.
Preparar a soluo para o gel de resoluo (de corrida):
gua destilada (3,7 mL)
soluo A (1,8 mL)
soluo B (1,9 mL)
APS (Persulfato de Amnio) (0,12 mL) (soluo a 10%)
TEMED (0,45 mL) (diludo 40 vezes)
OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.
Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo (aplicando-a no espao entre as placas de
vidro com uma pipeta. Sero necessrios aproximadamente 4,0 mL de soluo. Aguardar a
polimerizao do gel (5 minutos). Ser necessrio deixar aproximadamente 1,0 cm de espao para
aplicar o gel de empilhamento
OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez
para aplicar a soluo no aparato de eletroforese.
Preparar a soluo para o gel de empilhamento:
gua destilada (1,66 mL)
Soluo A (0,3 mL)
Soluo C (0,75 mL)
APS (Persulfato de Amnio) (0,05 mL) (soluo a 10%)
TEMED (0,24 mL) (diludo 40 vezes)
OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.
Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo, aplicando-a sobre o gel de resoluo (deve
preencher um espao de cerca de 1 cm de altura). Colocar um pente plstico para formar os poos
onde as amostras sero aplicadas (de acordo com a demonstrao). Sero necessrios
aproximadamente 1,60 mL de soluo. Aguardar a polimerizao do gel (15 minutos)
105
OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez
para aplicar a soluo no aparato de eletroforese.
Solues utilizadas
Soluo A: Acrilamida e bis-acrilamida
45 g acrilamida
1,2 g bis-acrilamida
gua destilada (at 100 mL)
Soluo B: Tris-HCl pH 8,8
18,17 g Tris (em 50 mL de gua destilada)
Ajustar o pH para 8,8 (com HCl)
Adicionar SDS (4,0 mL, soluo a 10%)
Completar o volume com gua destilada (at 100 mL)
Soluo C: Tris-HCl pH 6,8
6,06 g Tris (em 50 mL de gua destilada)
Ajustar o pH para 6,8 (com HCl)
Completar o volume com gua destilada (at 100 mL)
Tampo de corrida:
3,0 g de Tris, 14,4 g de Glicina e 10, 0mL de SDS (10%)
Ajustar o volume de gua destilada para 1000 mL
Tampo de amostra:
SDS 10% (5,0 mL), 2-mercaptoetanol (0,5 mL), Glicerol (2,0 mL), EDTA 0,1M (0,1 mL), Azul
de Bromofenol 1% (1,0 mL), Soluo C (2,5 mL) e gua destilada (at 20,0 mL).
106
Figura 3 Esquema do aparato para eletroforese.
107
LABORATRIO 5: REAO DE TRANSAMINAO
I. FUNDAMENTOS
Enzimas transaminases ou aminotransferases so importantes no metabolismo de
aminocidos, pois transferem o grupo NH3
+
de um aminocido para um cetocido. Foram
identificadas mais de 50 tipos de transaminases, presentes em todos os tipos de clulas e sendo
encontradas tanto no citossol como em mitocndrias de clulas eucariticas. O grupo NH
3
+
de
todos os aminocidos (com exceo de Lys, Arg e Thr) podem ser removidos por transaminases em
diferentes organismos. As transaminases possuem especificidade diferenciada: relativamente
especfica para o cetocido aceptor do grupo NH
3
+
e, numa menor intensidade, para o
aminocido doador. A coenzima PLP (piridoxal-fosfato) essencial para as transaminaes e vrias
outras enzimas envolvidas no catabolismo de aminocidos (figura 1). PLP derivada da vitamina
B6, hidrossolvel, o piridoxal. A figura 2 mostra como os processos catablicos dos diversos
aminocidos colaboram com o eficiente funcionamento do ciclo de Krebs pelo fornecimento de
intermedirios desse ciclo.
O cido glutmico (Glu), produzido em diversas transaminaes, pode tanto sofrer
desaminao oxidativa, produzindo o - cetoglutarato e o on NH4+, que ser utilizado no ciclo da
uria, como doar o grupo NH
3
+
para a biossntese de outros aminocidos. O Glu o principal
doador de grupos NH
3
+
nesta funo. A figura 3 ilustra esses processos metablicos.
108
Figura 1 - Reao de transaminao, mostrando a dependncia pela coenzima PLP no processo de
transferncia dos grupos amino entre aminocidos e cetocidos.
Figura 2 - Os processos catablicos dos diversos aminocidos colaboram com o eficiente
funcionamento do ciclo de Krebs pelo fornecimento de intermedirios desse ciclo.
C
NH
3
+
COO- R
H
C
COO-
R
O
AMINOCIDO
-CETOCIDO
N
H
+
CH
2
O
C
H
HO
H
3
C
P
O
N
H
+
CH
2
O
CH
2
HO
H
3
C
P
NH3
Piridoxal-fosfato Piridoxamino-fosfato
-OOC CH
2
CH
2
C
NH
3
+
COO-
H
GLUTAMATO
C
COO-
O
-OOC CH
2
CH
2
-CETOGLUTARATO
109
Figura 3 Formao de -cetoglutarato e uria a partir de glutamato.
II. OBJETIVOS
Estudar as reaes de transaminases e identificar os produtos e reagentes atravs da
cromatografia em papel.
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Preparao do homogeneizado de fgado
Essa etapa ser realizada previamente. Fgados de camundongos (5 a 7 animais) ou de galinha
foram extrados e lavados com PBS (tampo fosfato: 0,05M, pH 7,4), picados e macerados para
homogeneizao com PBS (at 10,0 mL de volume final). O homogeneizado foi centrifugado (800 g,
15 minutos) para eliminar clulas remanescentes, ncleos e debris celulares. O sobrenadante foi
aliquotado para utilizao em sala de aula, mantido em gelo e em seguida mantido congelado (-
20C) at sua utilizao.
2) Preparao da mistura reacional
O sistema completo da reao composto por um aminocido, um cetocido, o preparado
enzimtico, arsenito de sdio e o tampo. O arsenito de sdio empregado com a finalidade de
evitar a oxidao dos cetocidos pelo sistema enzimtico.
Montar a seguinte reao:
0,3 mL de soluo de cetoglutarato 0,2M pH 7,4
0,3 mL de soluo de Alanina a 0,2M pH 7,4
0,3 mL de preparao enzimtica
0,5 mL de tampo fosfato 0,05M pH7,4
0,4 mL de soluo de arsenito de sdio 0,2M
110
E tambm um controle negativo (branco) contendo todos os componentes exceto a
preparao enzimtica, que substituda por tampo:
0,3 mL de soluo de cetoglutarato 0,2M pH 7,4
0,3 mL de soluo de Alanina a 0,2M pH 7,4
0,8 mL de tampo fosfato 0,05M pH7,4
0,4 mL de soluo de arsenito de sdio 0,2M
Incubar os dois tubos (reao e controle negativo) a 37C por 30 minutos. Em seguida,
inativar a reao em banho-maria fervente por 3 minutos. Centrifugar a 5000 rpm, 10 minutos
(centrfuga Eppendorf). Decantar o sobrenadante transferindo para um segundo tubo Eppendorf e
fazer a cromatografia com os padres adequados.
3. Cromatografia
Em um papel de filtro Whatman nmero 1 (10 cm X 20 cm) traar com um lpis uma linha
horizontal de 2,5 cm de altura a partir da origem (ponto de contato do papel com a soluo na cuba
de cromatografia). Marcar 7 pontos com 2,5 cm de distncia entre si.
Aplicar, com um capilar de vidro fino, sobre os pontos marcados, uma pequena alquota dos
padres de alanina, glutamato, piruvato, e -cetoglutarato, a mistura de reao, o branco (controle
negativo) e 2,4-dinitrofenil-hidrazina. Sobre os pontos onde foram aplicados os padres e as
amostras, adicionar 3 uL de 2,4-dinitrofenil-hidrazina.
O solvente utilizado para a cromatografia ser uma mistura de butanol/etanol/NH
4
OH 0,5 M
na proporo 70:20:30 (v/v).
Aps o solvente alcanar 1 cm do final do papel, secar o papel a 80C em estufa e marcar os
produtos coloridos formados. Revelar os aminocidos do cromatograma com a soluo de
ninhidrina, secando em seguida o papel. Marcar a posio das manchas que aparecerem.
IV. RELATRIO DE LABORATRIO 5
O relatrio deve conter os resultados do procedimento experimental, com possveis
explicaes de erro experimental como tambm as seguintes questes resolvidas:
1. Explique, resumidamente, como a escolha do tipo de eluente (solvente de corrida) e do papel
pode afetar a eficincia da separao de componentes pela tcnica de cromatografia em papel.
2. Procure nos livros a reao que ocorre entre a ninhidrina e os aminocidos e tambm qual a
reao de transaminao que ocorreu em seu experimento.
3. Dopamina uma amina biognica usada como neurotransmissor no crebro.
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a) Explique a reao geral que leva a formao de aminas biognicas a partir de aminocidos.
b) De qual aminocido a dopamina pode ser sintetizada? Explique.
c) Explique a sntese do aminocido que origina a dopamina.
d) Crie uma hiptese de um defeito gentico que torne este aminocido em aminocido essencial.
e) Imagine um possvel tratamento para a deficincia de dopamina na doena de Parkinson (note
que a dopamina por si s no pode ser usada, pois no passa pela barreira hematoenceflica e
deste modo no pode chegar ao crebro).
4. Glutamato o principal neurotransmissor excitatrio no crebro.
a) Explique como glutamato age como neurotransmissor (transmitindo um sinal qumico que se
torna eltrico).
b) Explique como glutamato pode ser removido da fenda sinptica, mencionando o tipo de
transporte (ativo ou passivo).
c) A phoneutriatoxina 3-4 do veneno da aranha Phoneutria niger inibe o transporte de glutamato
da fenda sinptica para o citoplasma do neurnio pre-sinptico. Explique quais so os efeitos da
inibio do transporte de glutamato sobre a neurotransmisso. Sugira um tratamento.
d) Mencione as reaes que inativam o glutamato.
e) Qual neurotransmissor inibitrio que sintetizado a partir do glutamato? Explique a reao.
5. Fenilcetonria (PKU) uma doena gentica do metabolismo de aminocidos. Uma criana de
dois anos de idade foi levada ao hospital. Sua me indicou que ela vomitava freqentemente,
especialmente aps as refeies. O peso da criana e o seu desenvolvimento fsico eram abaixo do
normal. Seus cabelos, embora escuros, continham pores de cabelos brancos. Uma amostra de
urina tratada com cloreto frrico (FeCl
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) apresentou uma cor verde caracterstica da presena do
cido fenilpirvico. A anlise quantitativa de amostras de urina apresentou os resultados mostrados
na tabela abaixo.
Substncia Paciente (mmol/L) Normal (mmol/L)
Fenilalanina 7,0 0,01
Fenilpiruvato 4,8 0
Fenilactato 10,3 0
a) Sugira que enzima possa estar deficiente. Proponha um tratamento para esta condio.
b) Por que a fenilalanina aparece na urina em grandes quantidades?
c) Qual a fonte do fenilpiruvato e do fenilactato?
d) Por que o cabelo da paciente apresentou pores brancas?
6. Intoxicao de amnia resultante da deficincia de arginina da dieta (Morris e Roger, Science
199, 431, 1978).
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Gatos, depois de jejum por uma noite, receberam uma nica refeio de uma dieta de aminocidos
completa sem arginina. Dentro de duas horas, os nveis de amnia sanguneos aumentaram de
nvel normal de 18 mg/l para 140 mg/l e os gatos apresentaram sintomas clnicos de intoxicao
pela amnia. Um gato morreu 4,5 horas depois de ingerir apenas 8 g da dieta. Um grupo controle
alimentado com a dieta completa de aminocidos ou com uma dieta de aminocidos ou com uma
dieta de aminocidos onde arginina foi substituda pela ornitina no apresentou nenhum sintoma
clnico anormal.
a) Qual era o papel do jejum neste experimento?
b) O que induziu o aumento dos nveis de amnia? Por que a ausncia de arginina levou
intoxicao por amnia? A arginina um aminocido essencial para gatos?
c) Por que a ornitina pode substituir a arginina?