Biotecnologia de Alimentos

UNIJUI UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RS DBQ DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA E QUMICA CURSO - QUMICA INDUSTRIAL DE ALIMENTOS
INDICE
APRESENTAO........................................................................................................................... 1 INTRODUO A TECNOLOGIA DE FERMENTAES........................................................... 2 MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL ....................................................................... 9 18
ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR.....................................
CRESCIMENTO CELULAR ........................................................................................................... 27 CLASSIFICAO DOS PROCESSOS............................................................................................ 37 EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES STARTERS........................................................... 40 SISTEMAS DE FERMENTAO.................................................................................................. 48 INTRODUO AO ESTUDO DA FERMENTAO ALCOLICA........................................... 54 SEPARAO DOS PRODUTOS DE FERMENTAO.............................................................. 66 SEPARAO DOS PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM LEVEDURAS....... 73 PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM BACTRIAS.......................................... 77 DIGESTO ANAERBICA (FERMENTAO METANOGNICA)......................................... 79 TECNOLOGIA DE PRODUO E UTILIZAO DE ENZIMAS.............................................. 89
APRESENTAO
A Biotecnologia um ramo muito amplo da Tecnologia que se ocupa da transformao ou tratamento de materiais de origem biolgica. Spinks (1980) define Biotecnologia como a utilizao de organismos vivos ou sistemas biolgicos para a produo industrial e seu uso em servios de saneamento. A tendncia atual de incluir no termo Biotecnologia, em seu aspecto mais essencial, a Microbiologia Industrial, que trata do aproveitamento dos microrganismos como agentes de degradao e sntese. Por semelhana dos conceitos fundamentais que regem o tratamento biolgico de efluentes, o cultivo de clulas animais e vegetais e a produo de certos medicamentos. Assim, tambm devido ao seu amplo significado, pode englobar tambm aspecto igualmente importante da Cincia, Tecnologia e Engenharia de Alimentos. De certa forma, os processos de fermentao representa uma elo que liga as antigas artes de elaborao de alimentos (queijo, vinho, ...), mediante o uso de uma flora microbiana natural com a moderna industria de fermentao de alimentos que utilizava cultivos puros e sofisticados equipamentos de controle do processo. A produo em larga escala de protenas de organismos unicelulares, produo de antibiticos, produo de clulas animais e vegetais e a produo compostos qumicos a partir de matrias-primas renovveis em substituio aos combustveis fsseis, so exemplos de outras reas onde os processos fermentativos podem ser utilizados. O componente curricular Biotecnologia de Alimentos pretende tem como objetivo principal estudar alguns elementos essenciais e bsicos dos processos fermentativos: introduo a microbiologia industrial, sistemas de fermentaes, desenho de fermentadores, cintica de crescimento, metabolismo microbiano, esterilizao na indstria fementativa, produo de enzimas, cultivos starters. Objetiva, tambm, abordar de forma mais detalhada alguns tipos de fermentao: alcolica, lctica, actica, metanognica.
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Introduo biotecnologia de alimentos
INTRODUO A TECNOLOGIA DE FERMENTAES O termo Fermentao deriva do latim fervere (ferver), devido ao aparecimento das bolhas devido a produo de dixido de carbono pela ao das leveduras sobre o extrato de frutas ou gros de malte;
Significado bioqumico: relata a gerao de energia pelo catabolismo de compostos orgnicos; Produo de vinho: 10.000 a.C. - provavelmente o vinagre foi descoberto na mesma poca e as bebidas alcolicas destiladas surgiram a mais de 10.000 a.C. na China; Cerveja: 5000 - 6000 a.C. - egpcios deixavam a cevada germinar em potes de barro, aps estrusavam e amassavam os gros lavando-os aps para obter a bebida, ainda, utilizavam as leveduras da cerveja produzir CO2 para o crescimento de pes; Leite e derivados lcteos: dados apontam que em 5000 a.C. se observou que o leite quando retido no estmago de terneiros jovens coagulava-se (ao enzimtica); Produtos crneos: conforme Erichsen (1983), cerca de 1500 a.C. o homem j sabia que a carne finamente triturada e misturada com sal e especiarias poderia ser preservada, esta carne era seca e enrolada (rolos) mantendo suas principais qualidades, como um flavor agradvel Este produto foi o precursor da lingia fermentada produzida atualmente. O nome salame provm da cidade de Salamis, destruda a mais de 2000 anos, situada na costa oeste da ilha Grega de Cypros. Exame microscpico do sedimento de cerveja escavado de urnas que datam de 3400 a 1440 a.C. demonstram claramente que na maioria das vezes continham leveduras, observando-se uma pureza maior nos sedimentos mais recentes. A necessidade de preservar a carne da caa e de animais domsticos abatidos durante o inverno e consumidos no vero (summer sausage), fizeram com que o homem procurasse solues para a preservao do produto. Assim, os produtos crneos fermentados tornaram-se de grande importncia no mercado alimentar permitindo preservar a carne e atribuir a ela sabor e aroma caractersticos da tecnologia usada. Antonie van Leeuwenhoek, um pioneiro no uso do microscpio, foi o primeiro a examinar em 1680 gotas de cerveja fermentada. Entretanto esta descoberta foi esquecida...... 1856-1857: Louis Pasteur, aps investigaes detalhadas sobre as leveduras da cerveja e do vinho, concluiu finalmente que leveduras vivas fermentavam o acar em etanol e CO2 quando em anaerobiose. Pateur tambm observou muitas outras fermentaes: Ex.: observou provavelmente um Penicillium que fermentava D-tartarato de amnio em uma mistura racmica de D e L-tartarato (tartarato de Na, K); Observou tambm como uns microrganismos cilndricos produziam cido butrico somente em condies anaerbias e investigou a produo de cido actico por fermentao; 1870 - Pasteur e outros pesquisadores observaram os efeitos antagonistas de um microrganismo frente a outros e previram suas aplicaes teraputicas;
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1881 - Robert Kock estudou e desenvolveu tcnicas de cultivo puro assim como outros mtodos bacteriolgicos clssicos utilizados at hoje; Dois elementos vitais deram inicio a era moderna da tecnologia de fermentaes industriais: Emprego de fungos e leveduras na modificao de alimentos e bebidas e os estudos microbiolgicos pioneiros de Pasteur e Kock. Desenvolvimento de fermentaes em superfcie ou semi-slidas surgiu com o desenvolvimento de alimentos orientais e durante as grandes navegaes; Capacidade hidroltica de determinados fungos em hidrolisar o amido e protenas na produo de molho de soja, este foi o inicio das fermentaes industriais. Cultivo de algas e fungos deu inicio ao processo industrial de obteno de protenas alimentcias microbianas (SCP - protenas de organismos unicelulares) e de inculos de microrganismos Produo de vinagre e os estudos de Pasteur sobre a produo de cidos prepararam o caminho para o desenvolvimento de fermentaes que produzissem cidos orgnicos; O desenvolvimento da metodologia de cultivos puros por Kock proporcionou o surgimento de tcnicas que permitiram estudar as aplicaes industriais de espcies microbianas individuais, iniciando-se o emprego de cultivos puros, meios esterilizados e condies asspticas nas fermentaes industriais. FERMENTAO DE ALIMENTOS Fermentao de po, queijo e cerveja bem como bebidas alcolicas desenvolveram-se para satisfazer as exigncias comerciais modernas de produo em grande escala, com qualidade elevada e constante, custos competitivos e variedade de produtos. Produo de cultivos Starters para produtos lcteos e o emprego de enzimas industriais melhoraram a eficincia dos processos, assim como a automao e controle da qualidade na produo de po e produtos lcteos. Fermentao de po em temperaturas mais elevadas e com maior quantidade de inoculo; Uso de amilases microbianas na produo de acares fermentescveis a partir de gros de amido, proporcionando acares as leveduras para que fermentem liberando CO2 (crescer a massa de po e produzir textura caracterstica). Tcnicas de Pasteurizao: permitiram a produo de cerveja em escala industrial fazendo com que industrias artesanais de cerveja, vinhos, licores passassem rapidamente a grandes complexos produzindo em grande escala. Tcnicas de controle de processo como: (Para garantir maior vida-de-prateleira aos alimentos) Controle da velocidade de inoculao; Viabilidade e condies de armazenamento das leveduras; Controle das condies de oxignio dissolvido; Controle da concentrao de Nitrognio solvel e de acares fermentescveis no lcool; Controle da temperatura do processo; Fermentao em processos contnuos;
Introduo de inovaes tecnolgicas como: Obteno de cerveja com elevadas concentraes de mosto; Emprego de cereais no malteados e enzimas microbianas Produo de cervejas com baixos nveis de carboidratos Aplicao de tcnicas genticas convencionais para melhorar a qualidade das leveduras e eliminar caractersticas indesejveis. LEVEDURAS DE PANIFICAO Sculo XVII os padeiros obtinham suas leveduras nas cervejarias locais; Devido ao seu sabor amargo e atividades de fermentao variveis, foram gradualmente sendo substitudas por leveduras procedentes de fbricas de bebidas alcolicas. 1781 obtm-se as primeiras leveduras de panificao prensadas, obtidas atravs do processo Holands e posteriormente em 1846 mediante o processo denominado Viena Ambos obtinham rendimentos baixos, 5 a 14% respectivamente referente a matria-prima e 30% de lcool. 1879-1919 - avanos substanciais nos processos fermentativos com uso de biomassa permitindo a obteno industrial de leveduras para panificao de forma independente de bebidas alcolicas; 1879 - Marquardt introduziu a aerao no processo fermentativo de cereais permitindo aumentar o rendimento e diminuindo a produo de lcool a 20%. INOVAES TECNOLGICAS: Adio gradual de acar Surge o primeiro processo de retro-alimentao Permite elevar a eficincia do processo ate prximo do mximo terico sem a formao conjunta de lcool.
Durante a Primeira Guerra Mundial a Alemanha desenvolve a produo de leveduras de panificao usando melao (todo resduo dos processos industriais da poca) como substrato, com a finalidade de produzir protena para o consumo humano - Primeiro processo moderno para produo de SCP. Durante a Segunda Guerra Mundial, tambm na Alemanha, inicia-se a produo de SCP para consumo humano e animal a partir de Candida utilis, utilizando melao procedente da produo de papel e polpa de celulose, obtendo-se os acares (substrato) a partir da hidrlise cida da madeira. USA, Sua, Taiwan e Rssia passam tambm a utilizar este processo. CIDOS ORGNICOS 1881 inicia-se a produo comercial de cidos orgnicos sendo que at hoje 50% do cido lctico utilizado a nvel industrial produzido via fermentao usando Lactobacil1us delbrueckii.
cido Ctrico extrado inicialmente a partir do suco de limo e posteriormente sintetizado a partir do glicerol. 1923 - inicia-se a produo de Citrato via fermentao industrial, atualmente estima-se uma demanda aproximada de 450.000 toneladas/ms produzidas exclusivamente por fermentao, inicialmente: Empregava-se cultivo em superfcie de Aspergilius niger como organismo produtor (citrato). Aps a 2 Guerra Mundial introduziu-se o processo de cultivo submerso. Entretanto em 1977 desenvolve-se o processo que utiliza Candida, muito mais eficiente. Outros cidos orgnicos so produzidos de forma econmica e rentvel por fermentao: Ex.: produo de Acido Glucnico e Acido Actico, este obtido pela oxidao do etanol utilizando Acetobacter aceti. Entretanto, o cido Actico em escala industrial produzido somente por via qumica. LCOOL E CETONAS Durante Primeira Guerra Mundial a Alemanha impedida de importar azeites vegetais utilizados na produo de glicerol, componente para produo de explosivos, desenvolve a primeiro processo fermentativo de produo de glicerol, produzido por leveduras a partir do etanol em presena de bissulfito de sdio; Durante a Primeira Guerra na Inglaterra desenvolvido o processo de fermentao acetonabutanol por via anaerbia, utilizando Clostridium acetobutylicum, este foi o primeiro processo em grande escala que necessitava mtodos de cultivos puros para prevenir a contaminao. Aps a Guerra a demanda deste produto diminuiu, entretanto aumentou a procura por n-butanol, produzido por fermentao at os anos 50, sendo substitudo pelo n-butanol produzido a partir do petrleo, cujo preo era mais baixo que o preo do amido e dos substratos a base de acar utilizados no processo fermentativo. 1941 - Inicia-se a implementao da indstria da fermentao alcolica nos USA, aps revogarse a proibio da produo de lcool por bioprocessos, sendo responsvel ento por 77% do lcool industrial produzido 1973 - A crise do petrleo faz surgir projetos para produo de combustveis alternativos. Surge o PROLCCOL no Brasil, projeto que em 1987 chegou a produzir 3 bilhes de gales de etanol/ano, a partir da cana-de-acar. Nos USA inicia-se o Gasohol Program que destinava-se a produzir lcool a partir do milho, adicionando cerca de 10% na gasolina. Este projeto fez surgir um nmero muito grande de plantas industriais de pequena e grande escala utilizando processos contnuos e descontnuos. AMINOCIDOS Glutamato Monosdico e a Lisina so os que se produzem em maiores quantidades, cerca de 500.000 e 80.000 toneladas/ms, respectivamente. A produo de aminocidos resultado do trabalho de pesquisa sobre os mecanismos bioqumicos que regulam a biosntese destes compostos por microrganismos, obtendo-se superprodues a partir de mutaes e do controle do processo de fermentao.
As novas tcnicas passam a: Estimular as clulas para que usem substratos alternativos; Preveno ou impedimento de reaes laterais; Induo e ativao de enzimas biosintticas; Reduo ou inibio de atividades enzimticas que poderiam degradar o produto e, finalmente facilitar a excreo do aminocido pelo microrganismo. As pesquisas que culminaram com o desenvolvimento do processo de fermentao para produo de cido glutmico foram as responsveis pelo grande avano na produo de aminocidos por fermentao. Hoje a maioria dos aminocidos comerciais so produzidos por fermentao. Assim como a de monofosfatos de inosina e a guanosina utilizados como potencializadores de sabor. BIOPOLIMEROS Goma Xantana - biopolmero mais importante atualmente em funo do volume de produo, utilizada como gelificante ou estabilizante de suspenses. Produzido por fermentao utilizando a bactria Xanthomonas campestris. Outras gomas: Alginato produzido pelo Azetobacter vinelandii; Pululano produzido pelo Aureobasidium pullulans; Escleroglucana produzido pelo Sclerotinum; Gelano produzido pela Pseudomonas elodea Gomas em geral possuem elevados pesos moleculares e altas viscosidades causando problemas nos processos de mistura, transferncia de massa e calor em fermentadores. Estes aspectos devem ser levados em conta na hora de escolher ou desenhar um aparelho de fermentao. POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) : polister termoplstico acumulado intracelularmente em alguns tipos de bactrias ( Bacillus subtilis, Pseudomonas oleovorans, Alcaligenes eutrophus, entre outras) at um nvel de 80% da massa seca celular, sua produo permite a fabricao de plsticos biodegradveis. VITAMINAS A maioria das vitaminas produzida por mtodos qumicos. Entretanto algumas vitaminas podem ser produzidas por fermentao. Ex.: vitaminas do grupo B como a tiamina, biotina, cido flico, cido pantotnico, piridoxamina, vitamina B12 e riboflavina. A sntese qumica da vitamina B12 muito complexa sendo que sua produo comercial s vivel por via fermentativa utilizando Pseudomonas. Riboflavina: sua produo por fermentao compete eficazmente com os mtodos de sntese e semi-sntese, sendo que 30% da demanda mundial produzida por fermentao.
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Recentemente uma cepa recombinante de Bacillus subtilis foi patenteada, sendo capaz de produzir 4,5g de riboflavina em 24 horas de fermentao, perodo muito inferior aos 5 dias necessrios quando se utiliza Ascomycetes.
ANTIBITICOS Pasteur identificou efeitos antagonistas de alguns microrganismos frente a outros e julgou que poderiam ter efeito teraputico. 1928 - Alexander Fleming observou que Penicillium notatum, contaminante dos cultivos de Staphylococcus aureos, matava as bactrias, identificando o ingrediente ativo, a Penicilina, podia inibir outras bactrias. Aps a penicilina ter sido isolada na sua forma ativa, em 1940 nos USA, Florey e Chain demonstraram sua destacada atividade antibacteriana desenvolvendo-se ento um processo fermentativo comercial para sua produo. Este fato marcou o incio da indstria de antibiticos. Seguiu-se ento a descoberta de Estreptomicina a partir de espcies de Streptomyces Cefalosporinas a partir de Cephalosporium acremonium Com o desenvolvimento a partir de 1940 de tcnicas de gentica microbiana que implicaram em tcnicas de mutao e seleo de microrganismos, permitiu aumentar muito o rendimento da produo de penicilina de poucas mg/L para at 20g/L de cultivo. Iniciam-se tambm, nesta poca, os estudos sobre a produo de metablitos secundrios, pequenas molculas como os antibiticos que no tm papel importante no crescimento e manuteno das clulas. TRANSFORMAES DE ESTERIDES O uso de microrganismo, o domnio das tcnicas microbiolgicas e fermentativas permitiu fazer transformaes enzimticas altamente seletivas e especificas, representando um grande avano na produo de frmacos, como os hormnios esterides. 1940 - descobriu-se que a cortisona, esteride secretado pela glndula adrenal, aliviava a dor de pacientes com artrite reumtica, o que fez desenvolver-se um processo de sntese qumica para sua produo que requeria 37 etapas, a um custo de 200 U$/g; 1952 - cientistas descobrem que uma cepa de Rhizopus arrhizus hidroxilava a progesterona, produzindo 11-hidroxiprogesterona, permitindo que o custo da sntese de cortisona casse para 11 etapas e o custo reduzisse para U$ 16/g. 1980 - Introduziram-se modificaes no processo e os custos foram diminuindo gradativamente de forma que hoje estes custos esto prximos de U$ 0,46/g. Tcnicas semelhantes de biotransformao microbiana permitiram a sntese de outros esterides como a aldosterona, prednisona e prednisolona, assim como de outros frmacos importantes na medicina.
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ETAPAS DO PROCESSO FERMENTATIVO 1) Formulao do meio de cultura a ser usado no processo; 2) Esterilizao do meio de cultura, fermentadores e equipamentos auxiliares; 3) Produo de uma cultura pura e ativa em suficiente quantidade para inocular no fermentador; 4) Crescimento dos organismos no fermentador sob condies timas para a formao do produto 5) Extrao do produto e sua purificao; 6) Disposio dos efluentes produzidos no processo. REAS DE APLICAO DA FERMENTACO INDUSTRIAL A) ALIMENTOS v Massas fermentadas (po, panetone); v Carnes fermentadas (salame, lingia); v Bebidas fermentadas (cerveja, vinho ...); v Bebidas destiladas (conhaque, aguardente ...); v Leite fermentado (iogurte, queijo ...); v Enzimas (proteases, amilases, glicose oxidase ...); v Condimentos (vinagre, glutamato...) v Aminocidos (lisina, cido glutmico); v Polissacardeos (dextrano) B) PRODUTOS AGROINDUSTRIAIS v lcool (industrial e carburante); v Antibiticos de uso veterinrio; v Biogs; v Hormnios de crescimento vegetal. C) MEDICAMENTOS v Antibiticos; v Vacinas; v Vitaminas; v Hormnios de consumo humano (insulina); v Aminocidos. D) CIDOS ORGNICOS E SOLVENTES v cido ctrico; v cido actico; v Etanol; v Propanol; v Butanol; v cido lctico.
Microbiologia industrial
INTER-RELAES ENTRE MICRORGANISMOS E ENZIMAS As relaes existentes entre microrganismos e as enzimas neles contidos so muito importantes quando se deseja explorar as enzimas que levam a determinadas reaes qumicas especificas. As enzimas podem ser isoladas e assim a biotecnologia enzimtica pode convenientemente ser manipulada em bio-reatores apropriados. Por outro lado as clulas microbianas quando encontram-se imobilizadas em um suporte slido, atuam como catalizadores que levam a reaes qumicas concretas, da mesma maneira que as enzimas isoladas, o que denota menos trabalho preparativo. Desta maneira uma grande parte da tecnologia de fermentaes se refere ao cultivo de microrganismos em grande escala. A seleo e aplicao dos princpios da engenharia gentica aplicada a microrganismos apropriados permitem manipular o contedo enzimtico destes em determinadas condies. Tambm o crescimento de microrganismos em um substrato apropriado provocar a induo da enzima necessria para a degradao desse substrato de crescimento dentro da clula. Ex.: o cultivo de levedura sobre maltose induzir a biossntese da enzima maltase, (uma glucosidase) que degrada maltose a glicose, que necessria para a produo de energia qumica em forma de ATP dentro da levedura. MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL Introduo Os produtos comercialmente importantes das fermentaes industriais so de 4 categorias: clulas microbianas, molculas grandes como enzimas e polissacardeos, produtos bsicos e metablitos secundrios que no so necessrios para o crescimento celular. A produo comercial dos produtos de fermentao tem utilizado principalmente diversas espcies de bactrias, leveduras e fungos, ainda que os avanos recentes no desenvolvimento de tcnicas de cultivos tm permitido utilizar clulas mais complexas nos processos de fermentao. Microrganismos Industriais Na natureza existem duas classes principais de clulas, ambas utilizadas nos processo de fermentao industrial: procariontes - clulas bacterianas; eucariontes -leveduras, fungos, clulas animais e vegetais. Os microrganismos tambm se diferenciam em funo de suas exigncias de oxignio, podendo dividir-se em estritamente aerbias, como os Streptomyces e a maioria dos fungos filamentosos, que podem desenvolver-se unicamente em presena de O2 e os estritamente anaerbios, como os Clostridios, que unicamente podem crescer na ausncia de O2 e os microorganismos facultativos, entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em situao de aerobiose e anaerobiose. As bactrias utilizadas nos processos fermentativos so principalmente quimiorganotrficos, isto , podem obter sua energia e seu carbono por oxidao dos compostos orgnicos. As bactrias podem dividir-se em Gram positiva e Gram negativa, em funo de suas resposta a colorao de Gram. A reproduo se d por diviso assexuada. Os esporos so produzidos usualmente em resposta
as condies adversas do meio, porque so mais resistentes ao calor e aos compostos txicos que as clulas vegetativas e posteriormente germinam em condies apropriadas. As bactrias so desprovidas de clorofila, mas podem possuir outros pigmentos fotossintticos Os fungos (bolores) tambm so quimiorganotrficos e os mais importantes utilizados nas fermentaes se classificam principalmente em dois grupos: os Zigomycotina, asseptados dos gneros Mucor e Rhizophus e os Deuteromycotina, septados dos gneros Thicotherma, Aspergillus, Penicillium Fusarium e Aureobasidium. Os fungos so desprovidos de clorofila ou outros pigmentos fotossintticos. Sua reproduo pode ser assexuada (esporulao) ou sexuada. As leveduras so fungos geralmente unicelulares e que se reproduzem de forma assexuada (por gemao ou diviso binria) ou sexuada. A levedura mais utilizada nos processos fementativos industriais a Saccharomyces cerevisiae, principalmente para produo de lcool e nas panificaes. Esta levedura no degrada a lactose, por isso para produzir lcool e biomassa a partir de soro de leite utilizada Kluyveromyces lactis, que possuem as enzimas necessrias para degradar lactose. Outras leveduras importantes so: Candida utilis e Endomycopsis fibuliger Os vrus no tm estrutura celular alguma, possui o material gentico (DNA ou RNA) contido por uma camada de protena. No possuem atividade metablica e, portanto, no sintetizam protoplasma nem crescem. Em conseqncia disto sua multiplicao no pode ser feita por um processo de diviso, como nos microrganismos celulares. Novos vrus so produzidos pelas clulas nas quais penetram, de acordo com as informaes contidas no seu cido nuclico. So agentes submicroscpicos que infecta as plantas, animais e bactrias. Os vrus bacterianos (bacterifagos) infectam os processos de fermentao de cepas microbianas e causa srios problemas, particularmente nos cultivos starter utilizados no processamento de alimentos. Clulas animais e clulas vegetais tambm podem ser utilizadas nos processos fermentativos industriais, principalmente para a produo de antibiticos e hormnios vegetais. Necessitam de um meio muito nutritivo e so sensveis a flutuaes de fatores externos como temperatura, pH, O2 e CO2 dissolvidos. FONTES NUTRICIONAIS PARA OS MICRORGANISMOS Basicamente as necessidades nutricionais dos microorganismos so as mesmas de todos os seres vivos, que para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes de energia e fonte de material plstico. Nos seres superiores encontra-se apenas dois tipos nutritivos: a) os vegetais so fotossintticos (obtm energia da luz solar) e autotrficos, se nutrem exclusivamente de substncias inorgnicas; b) os animais so quimiotrficos, pois obtm energia as custas de reaes qumicas e heterotrficos, por exigirem fontes orgnicas de carbono. Entre os microrganismos h uma grande variedade de tipos intermedirios. FONTES DE ENERGIA a) Algumas bactrias realizam fotossntese, porm no produzem oxignio. Podem utilizar fontes inorgnicas (liotrficas) ou compostos orgnicos (organotrficas) como doadores de eltrons. b) Os fungos, leveduras e a grande maioria das bactrias so quimiossintticas, obtendo energia as
custas de reaes qumicas, nas quais substratos adequados so oxidados com desprendimento de energia. Estes substratos podem ser inorgnicos (litotrficos) ou orgnicos (organotrficos). No primeiro grupo encontramos apenas bactrias, como por exemplo, Thiobacillus, capazes de oxidar enxofre, produzindo cido sulfrico, podem ser utilizados na lixiviao de metais, como cobre e urnio. A grande maioria das bactrias e a totalidade de fungos, leveduras e, tambm, os protozorios so quimiorganotrficos. FONTES DE MATERIAL PLSTICO MATRIASPRIMAS COMO FONTE DE CARBONO Para os autotrficos a nica fonte de carbono necessria o CO2 . Para os heterotrficos, h necessidade de suprir o meio com outras fontes de carbono, naturais ou sintticas: Celulose, Amido, Sacarose, Lactose, Glicose (alto custo), leos, Metanol, Etanol; Melao de cana-de-acar Composio varivel (rico em aminocidos, vitaminas, minerais, vrios acares); corrigir deficincias (N, P, S); Extrato de Malte cevada malteada; 90-95% de CHO; rico em aminocidos. MATRIASPRIMAS COMO FONTE DE NITROGNIO Quanto s necessidades de nitrognio h trs categorias principais de microrganismos: Alguns microrganismos, especialmente bactrias, retiram o nitrognio diretamente da atmosfera e o converte em nitrognio orgnico. Muitos fungos e quase totalidade das bactrias utilizam compostos inorgnicos de nitrognio, como amnio e nitratos. Algumas bactrias exigem fontes orgnicas de nitrognio. De um modo geral, adicionar aminocidos ou hidrolisados de protenas favorece o crescimento da maioria dos heterotrficos. o Sais de Amnio, Sais (nitratos); Uria o Lquido da macerao do milho ( 4% N); o Extrato de levedura e Peptonas (laboratrio) o Ar atmosfrico ONS INORGNICOS ESSENCIAIS Alm de nitrognio, os microrganismos exigem uma srie de outros elementos, sob a forma de compostos inorgnicos, alguns em quantidade bem maiores que outros. o Macronutrientes P, S, K, Mg, Ca, Fe o Micronutrientes Cu, Zn, Co, B, ... FATORES DE CRESCIMENTO So os compostos orgnicos indispensveis a um determinado microorganismo, que ele no consegue sintetizar. Tais fatores devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa crescer, como por exemplo vitaminas (especialmente do complexo B), aminocidos, nucleotdios, cidos graxos, entre outros. Aspecto importante dessa exigncia resulta do fato que, quando um microrganismo exige um determinado fator, seu crescimento ser limitado pela quantidade desse fator presente no meio.
Dentro de certos limites, o crescimento ser proporcional ao teor do composto limitante. Isso permite a elaborao de um mtodo de dosagem de certos compostos, baseados na medida do crescimento microbiano. Essa a base da dosagem microbiana de uma srie de substncias, principalmente aminocidos e vitaminas. AGUA A gua no constitui um nutriente, mas absolutamente indispensvel para o crescimento dos microrganismos. Seu papel mltiplo. Os microrganismos se nutrem pela passagem de substncias em soluo atravs da membrana citoplasmtica. Exerce funo na regulao da presso osmtica e regulao trmica. A maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecao, a no ser quando esta precedida pelo congelamento brusco (liofilizao) OXIGNIO ATMOSFRICO Como a gua o oxignio no um nutriente e funciona apenas como receptor de hidrognio nos processos de respirao aerbica. Os microrganismos se comportam diferentemente em presena de O2 livre: Aerbios exigem oxignio livre; alguns, porm, em pequenas quantidades no tolerando as presses normais de O2 atmosfrico; Anaerbios no toleram a presena de O2 livre; Facultativos crescem na presena ou ausncia de O2 . Entre as bactrias encontra-se os trs tipos de comportamento. Os fungos (bolores) so estritamente aerbios, enquanto as leveduras so aerbias ou facultativas. CLASSIFICAO DOS MOSTOS SINTTICO: composio conhecida quantitativamente e qualitativamente usado em pesquisas quando se quer controlar exatamente o curso de uma fermentao. O objetivo saber a rota de fermentao, saber quanto e quando e quais os substratos que esto sendo utilizados pelos Microorganismos. Tem um alto custo. COMPLEXO: composio no bem definida, esto enquadrados os meios naturais tais como: caldo de cana, melao, suco de uva, extrato de leveduras, enquadram-se todos os mostos naturais. CARACTERISTICAS DO MOSTO Requerimentos bsicos: 1) Proporcionar o mximo rendimento de produto ou biomassa por grama de substrato usado; 2) Produzir a mxima concentrao de biomassa ou produto; 3) Permitir o mximo rendimento na formao do produto; 4) Produzir o mnimo de subprodutos indesejveis; 5) Ser de uma qualidade permanente e estar disponvel durante o ano todo 6) No sofrer degradao durante a esterilizao 7) No dever causar problemas em outras etapas do processo fermentativo particularmente: aerao, agitao, extrao, purificao e tratamentos dos efluentes.
SUBSTRATOS UTILIZADOS NA FERMENTAO ALCOLICA a) Aucaradas: neste grupo temos as diretamente fermentescveis (contm monossacardeos: Ex.: glicose, frutose, suco de uva, ma, pra, etc.). Principal substrato um monossacardeo (glicose) e este metabolizado diretamente at piruvato. As matrias-primas indiretamente fermentescveis so aquelas que contm dissacardeos, predominando a maltose e sacarose. Ex.: caldo de cana-de-acar e melao. A composio do melao de cana-de-acar varia em funo de fatores como: qualidade da matria-prima (variedade, idade, sanidade, maturao, queimada ou no, etc); mtodos de extrao do acar (moagem, clarificao, cozimento, etc); condies tcnicas das regies aucareiras; condies e tempo de armazenamento. b) Amilceas: contm em sua composio polissacardeos (amido) utilizada para produo de vodka, rum, whisky (tem que sofrer sacarificao). PREPARO DA MATRIA-PRIMA a) Melao: deve sofrer uma preparao prvia (de 82 Brix 18 -20 Brix) CRUZ DE COBENGE: regra das misturas, utilizada para calcular os volumes para diluio do melao. B M - b = Quantidade de melao em peso d = volume litros) M b B - M = Quantidade de gua em peso d = volume (litros) B = Brix do melao b = Brix da gua (zero) M = Brix desejado (18 20) d = densidade Ex.: melao: 80 Brix gua; 0 Brix M = 20 Brix dmelao = 1,6284 dgua = 1,0000 80 20 0
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20 0 = 20 Kg melao = 12,31 Litros 1,6284 80 20 = 60 kg de gua = 60 litros 1,0000

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No tanque de diluio controla-se: pH: entre 4,5 5,5 Nutrientes: Sulfato de amnio (1 g/L); fosfato (1 g/L) sulfato de Mg (0,1 g/L) {ativador enzimtico} b) Caldo de cana-de-acar: no necessita diluio pois a cana sofre adio de gua por asperso na moenda para extrao do acar, neste ponto o brix deve ficar entre 18-20 D = Brix do caldo x Volume do caldo - volume do caldo = Voluma de H2 O a ser adicionada Brix desejado Ex.: Brix do caldo = 20 Volume = 50.000 L Brix desejado = 16 D = 20 x 50.000 50.000 = 12.500 L de H2 O a ser adicionada para ter 16 Brix 16 Aps fazer a diluio corrige-se o pH para 4,5 - 5,5 usando cido sulfrico, ctrico ou ainda suco de limo (caseiro) e colocam-se os nutrientes. DETERMINAO DE SLIDOS SOLVEIS TOTAIS POR REFRATOMETRIA 1) Preparo do mosto: a) Determinao de slidos solveis por refratometria - Para cada grau acima de 20 C subtrai-se 0,06 por grau; - Para cada grau abaixo de 20 C soma-se 0,06 por grau: Ex.: 20 Brix a 25C 20 Brix a 15C 5 x 0,06 = 0,3 5 x 0,06 = 0,3 20 Brix 0,3 = 19,7 Brix 20 Brix + 0,3 = 20,3 Brix
Um mosto inicialmente com 76 Brix preparar 300 ml de mosto com 16% de SST. 100 g melao -------- 76 g SST X g --------------------- 16 g SST X = 21,05 g/100mL Para 300 mL = 63,15 g de mosto + 236,85 g de gua RELACO ENTRE DIFERENTES GRAUS DE MEDIDA. 1 Brix corresponde a 0,54 Baum 1 Baum corresponde a 1,8 Brix 1 Brix corresponde a 0,85 Babo BRIX = % de slidos solveis existentes em uma soluo de sacarose quimicamente pura.
Fermentadores
ELEMENTOS DE UM FERMENTDOR (BIOREATOR) O corao de qualquer processo fermentativo sem dvida o fermentador. Uma definio funcional para um fermentador seria dizer que consiste em um recipiente em que se mantm um ambiente favorvel para que se desenvolva um determinado processo biolgico. A palavra fermentador nos faz visualizar um recipiente de grande tamanho de ao inoxidvel brilhante e com uma instrumentao muito sofisticada. Ainda que muitos fermentadores industriais so assim, outros importantes processos biolgicos industriais, desenvolvidos em grande escala, so conduzidos em equipamentos muito menos sofisticados. Em alguns processos um fermentador pode consistir em um simples recipiente aberto, embora para processos cujas condies so muito sensveis ser necessrio um sistema fechado e muito bem controlado capaz de manter um ambiente favorvel. MEIO AMBIENTE As condies ambientais existentes dentro de um fermentador podem considerar-se sob trs aspectos diferentes: condies biolgicas, qumicas e fsicas. MEIO BIOLGICO Unicamente os microrganismos que contribuem para o processo em questo encontram-se presentes, enquanto que os no produtivos, destrutivos ou no desejveis estejam excludos do processo. Do ponto de vista de produo importante tambm que os microrganismos desejados estejam presentes em quantidades suficientes para que o processo se desenvolva a um ritmo rentvel. Um sistema que contenha somente o microrganismo desejado diz-se um sistema assptico. A assepsia consegue-se, primeiro, esterilizando o meio, eliminando todos os organismos vivos, diz-se ento esterilizado, segundo introduzindo o microrganismo desejado. O ato de introduzir o microrganismo desejado denomina-se inoculao. MEIO QUMICO Implica na composio do meio de crescimento microbiano, que dever conter as concentraes adequadas de substratos ou nutrientes microbiolgicos, assim como dos precursores sintticos, livres de substncias inibidoras e mantidas a um pH adequado. MEIO FSICO Refere-se fundamentalmente a temperatura do sistema cujo controle muito importante quando se projeta um fermentador. Este parmetro e a necessidade de manter a uniformidade das condies ao longo da fermentao, exigem um bom sistema de agitao, o que pode provocar por sua vez a ruptura dos organismos e de seus agregados. Quando se mantm um ambiente favorvel os parmetros ambientais no tm que necessariamente permanecerem constantes ao longo do tempo.
Fermentadores
Fermentao por batelada - caractersticas: v Diferentes fases de crescimento; v Diferentes condies timas; v Fermentao parece estar programada de acordo com a disponibilidade de nutrientes; v pH e temperatura oscilam ao longo do tempo, para que apaream de acordo com estas trocas as sucessivas fases de crescimento PRINCIPAIS TIPOS DE FERMENTADORES Os fermentadores classificam-se em dois grandes grupos:
v Fermentadores de cultivo disperso: neste sistema os microrganismos esto imersos no meio
de cultivo e seguem os movimentos dos nutrientes lquidos. O fermentador mais simples consiste em um tanque aberto no qual o microrganismo se dispersa no meio lquido. Estes fermentadores forma utilizados de gerao em gerao com muito xito na indstria cervejeira j que ao formar-se na fase anaerbica da fermentao, uma capa de espuma que contm CO2 e leveduras, impedindo que o ar penetre no interior do tanque. Para controlar a temperatura durante a fermentao se pode colocar tubos refrigerantes. So muito utilizados no tratamento biolgico de guas residuais em fluxo lento, onde a superfcie do lquido permite que se dissolva o O2 do ar e libere o CO2 . Estes efeitos podem ser acelerados com a agitao do lquido que aumenta a transferncia de gases e mantm a homogeneidade. Nos sistemas anaerbios os prprios gases da fermentao podem proporcionar a agitao, atravs do desenho do fermentador (cnico/cerveja) ou por meio mecnico (bombas de recirculao).
v Fermentadores de cultivo imobilizado: nos sistemas imobilizados o microrganismo se
desenvolve sob forma de uma lmina ou capa disposta sobre uma superfcie que est em contato com o meio nutritivo. Em laboratrios se utiliza o cultivo em superfcie (placas). Inicialmente a produo de penicilina era feira em garrafas que eram introduzidas em uma incubadora. Atualmente se utilizada o cultivo em superfcie na fermentao do cido ctrico (Aspergillus niger), que se cultiva em uma superfcie com um meio adequado contendo melao em bandejas de pouca profundidade, colocadas em estantes temperatura constante e com circulao de ar freqente. Tambm e pode desenvolver pelculas microbianas sobre uma superfcie de meio slida adequada. Este meio pode ser de leito fixo, em pedras, plstico particulado, lminas de plstico onduladas, atravs dos quais se faz passar o meio lquido sobre a capa de microbiana da superfcie.
v Na prtica, porm, ocorre que nos sistemas de cultivo disperso tambm aparece uma capa sobre
a superfcie do recipiente, e no cultivo imobilizado existe um certo numero de microrganismos dispersos no meio de cultivo.
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Fermentadores
Qualquer processo fermentativo divide-se em uma etapa puramente fermentativa e outra de recuperao do(s) produto(s), conforme o esquema abaixo: Armazena,mento de Matrias-primas Inculo Volume: 1 a 2 litros
gua do Processo
Ar Estril
Vapor
Energia
Inculo Preparado 1:10
Preparao de Meios
Esterilizador
Fermentador de produo Refrigerao
Tanque de Semeadura (p-de-cuba)
- gua - ar - vapor
Separao de clulas Com ou sem ruptura celular
Utilizao de Subprodutos
Etapas de Recuperao do Produto
Tratamento de Efluentes
PRODUTO
Formulao
Envasamento e Armazenamento
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Esterilizao na indstria fermentativa
ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR

Introduo A esterilizao implica a destruio, inativao ou remoo de toda forma de vida microbiana. Isso quer dizer que a esterilizao provoca nos microrganismos uma perda irreversivel da capacidade de reproduo no ambiente considerado. No implica, entretanto, a inativao total das enzimas celulares, toxinas, etc. Antes de entrarmos na discusso dos mtodos, conveniente fazermos algumas consideraes em torno dos mecanismos de esterilizao e das caractersticas das populaes microbianas. O mecanismo letal varia conforme o processo de esterilizao empregado. O efeito final, entretanto, o mesmo. Deve ocorrer a destruio e/ou inativao da(s) enzimaas) envolvida(s) em processos vitais para o microrganismo. Teoricamente, basta que o agente esterilizante bloqueie uma reao enzimtica essencial ou destrua uma molcula vital. Na prtica, entretanto, agentes com ao to especifica no encontram aplicao como esterilizantes, por vrios motivos: A heterogeneidade da populao microbiana; a possibilidade da existncia de microrganismos com capacidade de utilizar outras rotas metablicas para vencer o bloqueio estabelecido; a dificuldade do agente em atingir um alvo muito especfico; etc., podem ser mencionados como fatores que justificam a utilizao de agentes capazes de atingir o microrganismo de um modo mais grosseiro e inespecfico. Principalmente no caso da esterilizao de equipamentos industriais, procura-se utilizar processos capazes de danificar generalizadamente a clula, em vez de se procurar um ponto especfico de sua estrutura metablica. Outra considerao importante, no caso da esterilizao de equipamentos, a cessao do efeito esterilizante no final do processo de esterilizao. Em outras palavras, o agente ou condio esterilizante deve atuar eficientemente durante o processo de esterilizao. Terminada a esterilizao, no deve haver ao residual. No caso de fermentao industrial, por exemplo, uma possvel ao residual pode ser to ou mais prejudicial que a presena de certos contaminantes. Essas consideraes ajudam a apontar os processos fsicos como os mtodos de escolha na esterilizao de equipamentos. MTODOS DE ESTERILIZAO Fsicos Qumicos Calor: Lquidos, Gases e vapores - Seco: Flambagem ; ar quente Esterilizantes gasosos: xido de etileno (mais - mido: vapor fluente, vapor sob presso; eficiente que os demais; utilizado em cmaras tindalizao. de esterilizao) Radiao: Formaldedo mais comum - Ultravioleta -propiolactona- carcinogncia - Ionizantes (RX e ) cido peractico Filtrao : Membranas
A escolha do mtodo depende das caractersticas dos produtos a serem esterilizado e do custo do processo. Quando se usa agentes qumicos: tempo de contato Quando se usa calor: tempo e a temperatura de contato OBS.: O vapor direto acarreta um aumento no volume do mosto MECANISMOS DE ESTERILIZACO Se bem que os mtodos usuais de esterilizao tenham uma ao generalizada sobre a clula, o mecanismo pelo qual isso conseguido varia conforme o agente empregado. No caso do calor, sabe-se, desde os tempos de Koch, que o mecanismo de destruio dos microrganismos pelo calor seco no o mesmo que ocorre quando se utiliza vapor. Exceto em casos em que haja uma destruio fsica do microrganismo, como o caso da flambagem do equipamento a ser esterilizado, o mecanismo de esterilizao no est bem elucidado. Em alguns casos, a ruptura da parede celular e a vacuolizao da clula so aparentes e poderiam ser interpretadas como oriundas da atuao de foras osmticas. A adsoro de corantes pelas clulas, a incapacidade de reproduo e, no caso de microrganismos mveis e a perda da motilidade, so caractersticas que auxiliam na constatao da perda de viabilidade de clulas individuais. Enquanto que a inativao pelo calor seco , essencialmente, um processo oxidativo, o uso de vapor causa uma coagulao das protenas celulares com prejuzo para a organizao estrutural do microrganismo, afetando a sua competncia fisiolgica. TABELA 1 - Efeito da temperatura sobre o tempo necessrio para destruir esporos bacterianos de fermentao simples em meio com concentrao inicial de 1,6 x 105 esporos/mL TEMPERATURA (C) 100 105 110 115 120 125 130 135 TEMPO (minutos) 1200 600 190 7 19 7 3 1
Tempo de esterilizao corresponde ao tempo em que o material foi submetido aquela temperatura especfica e no ao tempo total do processo, que deve incluir o tempo de aquecimento e resfriamento. DESNATURAO DE PROTENAS Alm das estruturas primria, secundria e terciria, as molculas de protena podem ser constitudas por mais de uma cadeia de polipeptdios. A conformao estrutural da molcula protica
estabilizada por ligaes covalentes e no-covalentes. Essas ligaes reduzem a flexibilidade das cadeias polipeptdicas, garantindo sua disposio de uma forma ordenada, compacta e, conseqentemente, de baixa entropia, em vez de uma associao ao acaso. Entre as ligaes covalentes, o tipo de ocorrncia mais geral a ligao dissulfeto As ligaes no-covalentes podem ser pontes de hidrognio, ligaes hidrofbicas e inicas. As ligaes hidrofbicas so as que mais contribuem para a estabilizao da estrutura protica, pois de um modo geral, 40% dos resduos de aminocidos de uma protena possuem ramificaes no-polares. Uma alterao estrutural da molcula de protena , normalmente, acompanhada de uma perda de atividade biolgica, pois a ao de enzimas pode ser explicada por uma perturbao conformacional especifica induzida pelo substrato no centro ativo da enzima. Considerando-se que as clulas de microrganismos podem conter, normalmente, de 40 a 60% de seu peso seco em protenas, e considerando-se, ainda, as funes metablicas e/ou estruturais desempenhadas por essas protenas na clula microbiana, pode-se perceber, com facilidade, o efeito que agentes ou condies capazes de desorganizar estruturalmente as protenas podero exercer sobre a clula. ALTERAO DNA Se, de um lado, agentes que atuam sobre as protenas so capazes de comprometer diretamente a competncia fisiolgica, agentes capazes de causar alteraes no material gentico do microrganismo podem provocar o aparecimento de mutaes letais. Donde a possibilidade de se utilizarem, na esterilizao, substncias ou condies que apresentem maior afinidade pelo cido desoxirribonuclico (DNA). - Agentes qumicos como propionolactona, cido nitroso, etc., agem sobre o material gentico das clulas, causando alteraes que tero conseqncias sobre as caractersticas fisiolgicas do microrganismo. - Radiaes Fazendo-se incidir uma radiao sobre microrganismos, os componentes celulares podero absorver energia radiante. O efeito letal das radiaes uma demonstrao da presena, na clula viva, de molculas capazes de absorvera energia radiante. Protenas e cidos nuclicos, constituintes essenciais da matria viva possuem estruturas que absorvem principalmente luz ultravioleta. As alteraes fotoqumicas que ocorrem, em virtude da absoro de luz ultravioleta, so muito prejudiciais s clulas. POPULAO MICROBIANA Ao tratar de esterilizao, temos de levar em conta, tambm, as caractersticas dos microrganismos contaminantes do equipamento a esterilizar. No caso de existirem no equipamento apenas formas vegetativas de microrganismos, e se o meio em que se encontram for um meio que no as abrigue e proteja da ao do agente esterilizante, e mais ainda, se pudermos estar certos de que o agente esterilizante ser capaz de atuar sobre as clulas microbianas em condies favorveis e por tempo suficiente, ento o problema de esterilizao ser relativamente simples.
FIGURA 1 - Esterilizao de um meio de cultura em autoclave a 121 C por 20 minutos. O tempo total de esterilizao 100 minutos. ESTERILIZAO POR AGENTES FSICOS CALOR SECO calor seco mata os microrganismos por oxidao dos componentes celulares. O ar seco no um bom condutor de calor e sua ao no to enrgica quanto a do vapor. Por esse motivo necessrio uma temperatura e tempo maiores de esterilizao. o emprego do calor seco ou ar quente, recomendado quando o contato direto ou completo do vapor sobre presso com o material indesejvel ou improvvel, que o caso de vidraria, leos, ps e substncias similares. A esterilizao pelo calor seco consiste em submeter o equipamento a ser esterilizado a uma temperatura tal que, durante o perodo de aquecimento, haja inativao dos microrganismos presentes. A maior resistncia demonstrada por microrganismos ao calor seco parece depender de um endurecimento da camada mais externa da clula por meio de coagulao das protemas, dificultando a penetrao do calor no interior da clula propriamente dita e ulterior coagulao das protenas plasmticas. Devido muito menor capacidade de penetrao do calor seco, necessrio aquecer o equipamento a ser esterilizado a temperaturas mais altas por tempo mais prolongado, o que torna esse mtodo inadequado quando materiais como papel, algodo, plsticos, etc., esto presentes. Populaes homogneas de esporos apresentam uma relao linear de inativao com relao ao tempo de exposio a 125 C. A no-linearidade que ocorre com populaes naturais, pode ser atribuda a uma heterogeneidade da populao. As relaes no-lineares obtidas com populaes naturais podem ser reproduzidas por misturas adequadas de esporos com resistncias trmicas diferentes, isolados daquelas mesmas populaes. Alis, essa heterogeneidade das populaes
naturais pode ser devida no s presena de esporos de espcies diferentes como tambm a diferentes graus de resistncia trmica entre esporos de uma mesma espcie. A temperatura empregada tem sido 125 C e comum cotar-se a resistncia trmica de um microrganismo em relao ao D125 . A desorganizao molecular que ocorre nas clulas, devido exposio a temperaturas elevadas, pode se dar dos seguintes modos: a) ativao direta das molculas pela energia trmica, com alterao conformacional por quebra de ligaes intramoleculares e interveno subseqente de outras molculas; b) reao de molculas complexas com oxignio, gua ou vapor de gua (no caso de esterilizao pelo calor mido). A exigncia bsica da esterilizao pelo calor seco que todo o material seja sujeito temperatura esterilizante. As nicas causas possveis de fracasso na esterilizao so o controle defeituoso da temperatura; a no penetrao do calor; e a presena de microrganismos com resistncia trmica superior esperada. CALOR MIDO calor mido mata os microrganismos por desnaturao protica, ou seja: pela coagulao das protenas e enzimas celulares, e tambm a fuso dos lipdeos da membrana celular; quanto maior a temperatura menor o tempo necessrio; Para destruir esporos temos que submeter este vapor de gua a uma presso positiva para alcanarmos as temperaturas de trabalho; Sempre que possvel usa-se vapor para a esterilizao, pelo seu alto contedo de calor por unidade de peso ou de volume; porque cede facilmente calor a uma temperatura constante e controlvel; por ser de fcil produo e distribuio; e porque, mesmo sendo de aquecimento rpido, a velocidade de aquecimento e a temperatura final do equipamento podem ser controladas. TABELA 2 - Relao entre a presso de vapor de gua em diferentes presses Presso de vapor da gua (atm) 0 0,34 0,68 1,00 1,36 Temperatura 100,0 109,0 115,0 121,0 126,5
Obs.: - Para assegurar a temperatura pela presso de trabalho precisamos ter certeza de que todo o ar foi expulso, primeiro porque o ar no bom condutor de calor, logo o calor no penetra no material a ser esterilizado. Segundo a temperatura do ar aquecido a uma presso inferior a temperatura do vapor aquecido a mesma presso. Causas da inativao trmica de bactrias pelo calor mido Os mecanismos propostos para explicar a influncia letal do calor mido sobre as bactrias so: (a) coagulao de protenas; (b) inativao de enzimas; (c) desorganizao dos lipdeos celulares; (d) desorganizao do aparelho gentico; (e) ruptura do RNA.
A morte das clulas expostas ao calor exponencial. A base bioqumica desse fenmeno difcil de ser explicada em termos de acontecimentos especficos na clula. O calor mido age sobre vrios componentes celulares e, na clula, pode-se observar uma srie de efeitos. Inativao trmica dos esporos Os esporos so dotados de uma camada interna de mucopeptdeo recoberta por uma capa protica rica em cistena. As seguintes teorias tentam explicar a termorresistncia dos esporos: impermeabilidade do esporo; enzimas em formas inativas estabilizadas; desidratao do material protico, com estabilizao conseqente da maior interaproximao dos radicais hidrofbicos e imobilizao inica. A inativao dos esporos em presena de vapor de gua deve-se atividade da gua e no propriamente ao calor latente do vapor. Esse fato mostra que os altos coeficientes de temperatura, caractersticos da i ativao trmica de esporos. s podem ser devidos a processos de coagulao de n protenas ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS POR RADIAES UV E IONIZANTES Os princpios bsicos da utilizao da radiao UV so a reduo de microrganismos presentes no ar e a destruio de clulas depositadas na superfcie do equipamento e expostas radiao. A radiao UV tem sido empregada como agente auxiliar para diminuir os nveis de contaminao. A ao de radiaes ionizantes (raios gama) sobre os microrganismos se manifesta como um uma inibio do poder de multiplicao dos mesmos. ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS POR AGENTES QUMICOS Apresenta a vantagem de ser feita a temperatura inferior a 50C. Os fatores que influenciam na eficincia da esterilizao so: tempo de contato, temperatura, pH, matria orgnica, estabilidade ao oxignio umidade, etc. detergentes, lquidos (cidos e lcalis, glutaraldedo, formaldedo, iodfors, cido peractico) Gases e vapores (oznio, brometo de metila, formaldedo, -propionolactona, xido de etileno, cido peractico) ESTERILIZAO DO MEIO DE CULTURA De acordo com um conceito bem amplo, a esterilizao de um meio a operao que tem por finalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macro ou microscpicas, saprfita ou no, existentes no meio considerado. O grau de esterilizao dos meios de fermentao varia conforme o processo a que se destina. Algumas vezes totalmente dispensvel (fermentao lctica de hortalias e polvilho; tratamento biolgicos de resduos); realizada de forma incipiente (fermentao alcolica; produo de leveduras para panificao; fermentao actica do vinagre); realizada com alto grau de exigncia (produo de antibiticos, enzimas, vitaminas, acetona, butanol). Em ensaios laboratoriais sempre necessrio (devido ao uso de culturas puras) Em plantas industriais o calor mido a principal forma de se efetuar a esterilizao. Pode
ser feita nos prprios recipientes destinados a fermentao (processo descontnuo) ou em separado (processo contnuo)
ESTERILIZAO EM BATELADA:
Vrios meios de cultura so esterilizados no fermentador a 121 C (para destruir esporos), o tempo calculado em funo dos constituintes do mosto(pH, material em suspenso, etc) e do tamanho do fermentador. Esterilizar s vlvulas e eletrodos e outros equipamentos que entram em contato direto com o fermentador Mtodo indireto - injetar vapor no fermentador atravs de camisa ou da serpentina; Mtodo direto - injetar vapor direto na soluo nutriente, assim o vapor deve estar livre de aditivos qumicos OBS.: O vapor gerado pela indstria normalmente contm substncias potencialmente txicas aos microrganismos, derivadas de anticorrosivos utilizados no processo de gerao de vapor. Com injeo direta de vapor no meio de cultura o volume deste aumentar, pois uma parte do vapor se condensa aumentando o volume do lquido dentro do fermentados. Vantagem a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simultaneamente, evitando perigos de contaminaes; Desvantagem a) Manuteno de temperaturas altas por perodos longos, favorecendo possveis alteraes no meio; b) Consumo elevado de vapor e gua de resfriamento; c) Problemas de corroso pelo contato do equipamento com o meio aquecido. d) Elevado tempo ocioso do equipamento; e) interaes qumicas com nutrientes
ESTERILIZAO CONTINUA As principais desvantagens apresentas podem ser evitadas pela esterilizao contnua; melhor controle de temperatura; temperaturas mais elevadas diminui o tempo da operao; Fornece meio esterilizados para fermentadores de vrios tamanhos Etapa preliminar obrigatria nos processos fermentativos contnuos, tambm tem valor nos processos em batelada, pois diminui o tempo de esterilizao e a rea fsica necessria para o processo, devido a relao exponencial entre taxa de morte e temperatura tomando bem menor o tempo necessrio para a destruio de todos os microrganismos quando temperaturas maiores so utilizadas; Na esterilizao em batelada so necessrios 30 a 60 minutos a 121 C, a esterilizao contnua normalmente realizada em 30 a 120 segundos a 140 C; Meio de cultura torna-se diludo pois a condensao do vapor aumenta o volume do lquido, para resolver este problema o meio aquecido bombeado atravs de uma vlvula de expanso e o condensado removido por uma bomba de vcuo at que o meio de cultura fique com a mesma concentrao de antes da esterilizao.
Pode se feita pela injeo direta de vapor ou por meio de trocadores de calor. Em certos casos a pasteurizao j p suficiente para eliminar grande parte do flora microbiana. uma operao rpida utilizando temperaturas prximas de 100 C seguida de resfriamento. Em meio cidos equivale a uma esterilizao Para pequenas quantidade de meio pode-se lanar mo da tindalizao.
FIGURA 2 - Esquema de esterilizao contnua do meio de cultura em trocadores de calor
DESTRUIO DE NUTRIENTES A esterilizao do meio pelo calor acarreta alteraes na sua composio qumica. A experincia mostra que, quanto mais elevada for a temperatura de esterilizao de um dado meio, menor ser a destruio de nutrientes e, conseqentemente, melhores sero os resultados da fermentao posterior. Esta menor destruio de nutrientes uma conseqncia de fato observada experimentalmente de ser a energia de ativao de destruio trmica dos microrganismos maior do que a de destruio trmica dos nutrientes. Essa afirmativa de importncia prtica, tanto na esterilizao de meios de fermentao como na esterilizao de alimentos. ESTERILIZAO DO AR As fermentaes aerbias, com o microrganismo em suspenso, constituem os processos fermentativos de maior importncia industrial atualmente. Em tais fermentaes a quantidade de ar introduzida no sistema grande e perfeitamente aceitvel, que haja grande preocupao quanto a esterilizao do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais cuidados devem ser tomados principalmente nas horas iniciais da fermentao. - A maior parte dos processos fermentativos conduzido com agitao vigorosa, e o ar fornecido ao fermentador deve ser estril. - O nmero de partculas e microrganismos depende da localizao da indstria, do movimento do ar e do tratamento prvio que o ar foi submetido.
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MTODOS PARA ESTERILIZAO DO AR Calor seco - normalmente antieconmica ou de difcil realizao; Radiaes Apenas as radiaes UV poderiam ter aplicao prtica, porm pouco usada devido ao grande tempo de exposio. Pode ser usada em pequenas instalaes (laboratrios, pesquisa). Atua mais como desinfetante. Filtrao sem dvida o processo mais importante por ser o de maior aplicao na industria. Filtros feitos de l de vidro, acetato de celulose, etc Os filtros pode ser de dois tipos principais: Filtros que apresentam poros - reteno mecnica dos microrganismos (cartuchos de membranas de steres de celulose, nylon); Filtros de camadas de material fibroso (l-de-vidro, ) - Atua na combinao de vrios efeitos fsicos: inrcia, bloqueio, difuso, separao por gravidade e atrao eletrosttica.
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Metabolismo e cintica de crescimento microbiano
CRESCIMENTO CELULAR O crescimento dos microrganismos uma parte integral de quase todos os processos de fermentao. Sabe-se que as bactrias se reproduzem por diviso binria, produzindo duas clulas de mesmo tamanho, entretanto a reproduo de muitas leveduras se d por gemao;os mofos crescem por extenso das hifas e a morfologia de seu miclio pode variar em funo do meio ambiente. quando um fungo cresce na superfcie de um meio slido produz uma rede miceliana , cuja natureza reflete a natureza do meio. Nos cultivos submersos, as clulas fngicas podem crescer unidas a partculas de nutrientes suspensas na forma de miclio filamentoso difuso ou como massa densa. A morfologia e crescimento influem na velocidade de crescimento e na formao de produtos Quando um microrganismo inoculado em um meio de volume e composio conhecidos, o cultivo passa por uma srie de fases, como se pode observar na figura 1. Depois da inoculao, existe uma fase de latncia, em que o microrganismo se adapta as condies do meio. Aps um certo perodo de tempo em que a velocidade de crescimento das clulas aumenta gradualmente, as clulas crescem a uma velocidade constante mxima ; esta fase se denomina exponencial ou logartmica. medida que o crescimento continua, os nutrientes se vo esgotando e os produtos vo sendo excretados pelo organismo, a velocidade de crescimento diminui e finalmente o crescimento cessa, devido freqentemente ao esgotamento de um nutriente ou pelo acumulo de algum produto txico; esta fase se denomina estacionria.
FIGURA 3 Crescimento de um microorganismo em um cultivo desontnuo
FATORES QUE INFLUEM NA VELOCIDADE DE CRESCIMENTO A velocidade de crescimento varia com o tipo de clula microbiana e tambm em funo das condies fsico-qumicas do meio ambiente. Em geral, o tempo para que se duplique a biomassa aumenta com a complexidade do microrganismo, de forma que os tempos de duplicao mdio para as clulas animais e vegetal so substancialmente maiores que os de mofos e leveduras, que por sua vez so maiores que das bactrias.
O crescimento celular varia com a temperatura. A maioria dos microrganismos cresce entre 25 e 35 C. Dentro deste espao o crescimento aumenta com o aumento da temperatura at um valor mximo, acima do qual a velocidade cai rapidamente devido ao incremento da taxa de morte microbiana. O pH influi no crescimento da mesma forma que na atividade enzimtica. A maioria dos microrganismos cresce em uma escala de pH variando de 3 a 4. A velocidade de crescimento da clula microbiana d epende da atividade de gua (Aw) e da umidade relativa. As bactrias necessitam uma Aw 0,95 enquanto os mofos podem crescer em valores de atividade de gua menores, de at 0,7 como mnimas. Como em qualquer reao qumica, a velocidade de crescimento depende da concentrao de nutrientes qumicos, e pode ser descrita pela equao de Monod. Os valores tpicos de Ks para as diversas fontes de carbono esto compreendidos entre 1 e 10 mg/dm3 . As clulas podem crescer a velocidades prxima as max quando a fonte de carbono limitante maior que 10 Ks ou 10 a 100 mg/dm3 . As concentraes de carboidratos elevadas podem inibir o crescimento devido ao efeito osmtico que tem uma influencia maior sobre as bactrias do que sobre os mofos Foi comprovado que a quantidade de massa celular total, formada durante o crescimento celular, freqentemente proporcional a quantidade de substrato utilizado. Biomassa produzida (g) x/s = -----------------------------Substrato consumido (g)
x/s =coeficiente de rendimento de biomassa
METABOLISMO MICROBIANO
O crescimento microbiano depende da capacidade da clula para utilizar os nutrientes de meio ambiente e sintetizar os compostos macromoleculares das estruturas celulares e tambm os principais compostos de baixo peso molecular, necessrio para a atividade celular. O metabolismo intermedirio inclui as reaes que transformam os compostos de carbono e nitrognio que entram na clula em novo material celular ou em produtos que so excretados. A sntese desses compostos necessita energia e a maioria das clulas utilizada nas fermentaes, so heterotrficas e obtm sua energia a partir da quebra de compostos orgnicos. Nos processos respiratrios ou aerbios, os microrganismos so capazes de oxidar completamente alguns dos substratos a CO2 e H2 O, obtendo o mximo de energia para a converso dos substratos remanescentes em nova massa celular. No metabolismo fermentativo ou anaerbio, as clulas so menos eficazes para converter os substratos orgnicos em material celular e usualmente excretam intermedirios degradados parcialmente. O crescimento de urna cultura microbiana pode ser dividido em fases ou estgios. Aps a inoculao de uma cultura em um meio nutriente existe um perodo durante o qual o crescimento parece no ocorrer; este perodo refere-se fase lag e pode ser considerado como uma fase de adaptao. Seguindo um perodo durante o qual a taxa de crescimento das clulas aumenta gradualmente, as clulas crescem a uma taxa constante, este perodo conhecido como fase exponencial. Quando o crescimento diminui ou cessa e as clulas entram fase estacionria. Aps um
longo perodo de tempo o nmero de clulas viveis decresce e a cultura entra na fase de morte ou declnio. Tanto quanto esta cintica de crescimento, o comportamento de uma cultura pode ser descrito de acordo com os produtos, os quais so gerados durante os estgios da curva de crescimento. Quando um microrganismo inoculado em um meio rico em nutrientes, a velocidade da diviso celular, e portanto a produo de biomassa, varia de acordo com uma seqncia caracterstica. A fase lag pode virtualmente ser eliminada aumentando o tamanho do inculo e otimizando as condies fsicas dentro do fermentador. Em um processo industrial a durao da fermentao contribui pra o custo do produto, logo uma fase lag mnima aconselhvel.
FIGURA 4. Curva de crescimento de biomassa e consumo de glicose em um cultivo em batelada. Quando um microrganismo cresce em um ambiente no qual todos os seus nutrientes essenciais esto em excesso, esses nutrientes se transformam em produtos finais do metabolismo energtico, em calor, ou em compostos requeridos para a reproduo de novas clulas. Durante a fase exponencial de crescimento a diviso celular ou velocidade de aumento da biomassa chega a ser mxima e os produtos gerados so essencialmente para o crescimento das clulas e incluem: aminocidos, nucleotdeos, protenas, cidos nuclicos, lipdios, carboidratos, etc. Estes produtos so conhecidos como os primeiros produtos do metabolismo ou METABOLITOS PRIMRIOS e a fase a qual eles so produzidos (fase log ou exponencial) como trofofase. Tambm se inclui nesta categoria a biomassa celular que pode ser considerada como o metablito mais primrio. Muitos produtos do metabolismo primrio so considerados economicamente importantes e so produzidos por fermentao. Durante a desacelerao e na fase estacionria, algumas culturas microbianas sintetizam compostos os quais no so produzidos durante a trofofase e os quais parecem no ter nenhuma funo bvia no metabolismo celular. A estes compostos nos referimos como METABLITOS SECUNDRIOS e a fase na qual eles so produzidos (equivalente fase estacionria) como idiofase. importante salientar que os metablitos secundrios ocorrem em cultivos contnuos a
baixas taxas de crescimento sendo uma propriedade destas, baixas taxas de crescimento, e tambm, da fase onde no tem crescimento celular. TABELA 3. Produtos do metabolismo primrio microbiano e sua significncia comercial. Metabolismo Primrio Etanol cido Ctrico cido glutmico Lisina Nucleotdeos Fenilalanina Polissacardeos Vitaminas Significncia Comercial Ingrediente ativo em bebidas alcolicas, usado como combustvel em motores quando misturado ao petrleo Vrios usos na indstria alimentar Intensificador de Flavor Suplemento alimentar Intensificador de Flavor Precursor do Aspartame - Adoante Aplicao na indstria alimentar Suplementa Alimentar
Fonte: Stanbury, Whitaker & Hall in Principles of Fermentation Technology. 1995. Os metablitos secundrios so compostos que no so necessrios para a biossntese celular, no tendo um papel direto no metabolismo energtico. A biossntese destes compostos est intimamente ligada com o metabolismo primrio das clulas que os produzem, j que normalmente seus precursores so metablitos primrios ou modificados, como cidos orgnicos, aminocidos, derivados de acares e bases nitrogenadas. Um conceito apropriado para os metablitos secundrios so os compostos no essenciais para o crescimento exponencial (Wiseman, A.) Os metablitos secundrios mais importantes do ponto de vista comercial so os antibiticos, entre eles a Penicilina, cuja produo anual chega a 10.000 ton/ano. As toxinas e os alcalides representam o resto dos metablitos secundrios de importncia industrial. Quando se observa que microrganismos crescem a taxas relativamente baixas de crescimento no seu meio ambiente natural, isto sugere indicio de que a idiofase que prevalece sobre a trofofase, a qual pode ser mais uma das propriedades da cultura de microrganismos. METABOLISMO ENERGTICO A energia necessria aos microrganismos pode ser fornecida pela luz (organismos fototrficos), ou pela oxidao de substncias qumicas (organismos quimiorganotrficos). Nos dois casos a energia vai ser estocada pela forma de energia de ligao qumica, biologicamente utilizvel. Trata-se essencialmente da ligao anidridofosfrica do trifosfato de adenosina (ATP), formada pela fosforilao do difosfato de adenosina (ADP). ORGANISMOS QUIMIORGANOTRFICOS A maioria das bactrias, leveduras e mofos so incapazes de efetuar a fotossntese, utilizam a energia liberada no decorrer das reaes qumicas de oxidao. So chamadas quimiorganotrficas. As reaes de oxidao podem ser efetuadas de vrios modos:
- Perda de eltron: Fe++ Fe+++ + e- + energia - Desidrogenao: R-CH2 OH - Hidratao-desidrogenao: R-CHO + H2 O - Descarboxilao-desidrogenao: R-CO-COOH + H2 0
R-CHO + 2H+ + 2e- + energia
R-COOH + 2H+ 2e- + Energia
R-COOH + CO2 + 2H+ + 2e- + Energia
Em todos os casos h perda de eltrons freqentemente acoplada a uma perda de prtons. Estes eltrons e prtons, aps transferncia mais ou menos longa, feita por intermdio de uma cadeia de oxireduo, vo reduzir um aceptor final. Os microrganismos quimiorganotrficos tiram sua energia da oxidao de substncias orgnicas elaboradas, as quais devem obrigatoriamente encontrar-se no meio, logo, trata-se de microrganismos heterotrficos. A grande maioria dos microrganismos que intervm na biotecnologia faz parte deste grupo. ACEPTOR FINAL DE ELTRONS O sistema de transporte de eltrons mais ou menos complexo e recorre as enzimas (desidrogenases, citocromos redutases, etc.) e co-enzimas (FAD, NAD, NADP, citocromos, etc.) que so intermedirios aceptores de eltrons (e de prtons); trata-se de um seguimento de reaes acopladas com oxireduo. No final desta cadeia, eltrons (e prtons) servem para reduzir um aceptor final que pode ser de diversas naturezas: Oxignio molecular, composto mineral oxidado ou composto intermedirio do metabolismo. Existe, tambm, um mecanismo de eliminao de eltrons e prtons prprio de numerosas bactrias anaerbias, sob a forma de hidrognio, devido a hidrogenase. Se o substrato for completamente oxidado, diz-se que h respirao (fala-se s vezes, de via oxidativa). Se o substrato for parcialmente oxidado e, por isso, incompletamente degradado, o que acarreta a formao de metablitos, diz-se que h fermentao. A fermentao traz geralmente o nome da(s) substncia(s) produzida(s) ou da mais abundante se a produo for complexa. RESPIRAO AERBIA Existem vrios mecanismos de respirao aerbia. O fato comum entre eles que o aceptor final de prtons o oxignio do ar e no podem intervir seno quando os microrganismos so cultivados em condies de aerobiose. Para cada par de prtons transformados em gua, h formao de 3 molculas de ATP, podendo s vezes haver uma oxidao direta. Esta via leva a formao de perxido de hidrognio (H2 02 ) que txico para clula; exceto se esta possuir catalase, enzima capaz de decompor o H2 O2 . Quando um microrganismo p ossui esta via, e no tem catalase, morto pelo oxignio do ar, sendo portanto, um anaerbio estrito.
FERMENTAO / RESPIRAO Na fermentao propriamente dita, uma substncia orgnica originria da degradao do substrato serve como aceptor de eltrons (e de prtons). De fato, pode-se considerar que a mesma substncia que serve, ao mesmo tempo, de doador e aceptor. Numerosas fermentaes podem ser efetuadas em anaerobiose, pois todos os prtons liberados servem para reduzir um substrato orgnico; outras devem ser efetuadas em aerobiose, pois pelo menos uma parte dos prtons liberados servem para reduzir o oxignio.
CINTICA DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Na fase logartmica podemos dizer que dobram por intervalo de tempo: O nmero de clulas (bactrias e leveduras): A biomassa (actomicetos e fungos).
A velocidade de crescimento se mantm constante durante a fase logartmica, ainda que o meio se altere pelo consumo de substrato e excreo de metablitos. A velocidade de crescimento independe da concentrao do substrato, pois um excesso de substrato est presente. O substrato limitante a substncia que pela mudana de sua concentraao promove: mudanas na velocidade de crescimento do microrganismo mudanas na velocidade de consumo do substrato mudana na velocidade de formao do produto. Na pratica podemos dizer que todo o substrato limitante. O processo industrial interrompido ao final da fase logartmica ou antes da fase de declnio, depende se o processo associado ou no associado. A taxa de aumento da biomassa est relacionada com a velocidade especfica de crescimento () e a concentrao da biomassa (X) expressa em g/L. dx ------- = X , onde dt = velocidade mxima da biomassa X = concentrao de biomassa
A taxa do aumento do nmero de clulas est relacionada com a velocidade especfica de
crescimento e com a densidade celuIar (N) expressa em clulas/L. dN ------- = N , onde N = densidade celular dt O tempo de gerao (G) uma constante da cepa da clula e depende das condies de cultivo. o espao de tempo necessrio para que uma clula se duplique. Quando o microrganismo est na fase exponencial o tempo de gerao constante e dado por:
t G = --- = z METABOLISMO MICROBIANO
t -------------------3,322 log Nf/Ni
A sntese do produto se d no interior da clula, para que o substrato seja convertido em produto, ele deve entrar na clula e ser biotransformado por uma seqncia especfica de enzimas. Quanto mais complexo o produto, maior ser o nmero de enzimas envolvidas no metabolismo. Esquema simplificado do metabolismo celular. S [X P] P
ENTRADA DO PROCESSO: transporte do substrato para dentro da clula METABOLISMO - TRANSFORMACO: o que diferencia o processo qumico do fermentativo. s vezes X =P. SAIDA DO PROCESSO: liberao do produto da enzima, podendo ficar intra ou extracelular. S = concentrao do substrato em g/L X = concentrao de clulas em g/L P = concentrao do produto em g/L ou mg/L VELOCIDADE DE FORMAO DE CLULAS A velocidade de formao de clulas e dada pela variao da concentrao de clulas em funo do tempo, na fase exponencial de crescimento (fase log), a velocidade constante e pode ser calculada pelo numero de clulas (N) por contagem direta dos microrganismos ou por contagem em placas e ainda pela massa seca de clulas (X). Ela chamada velocidade especifica de crescimento, calculada por: ln Nf ln Ni ------------------ou tf ti para [ ] de clulas ln Xf ln Xi -------------------tf - ti para Biomassa ln DOf ln DOi --------------------tf - ti para densidade tica
ou
FIGURA 5- Variao da Concentrao Celular em Funo do Tempo OBS.: Para microrganismos no filamentosos prefervel utilizar nmero de clulas e para microrganismos filamentosos, a massa seca de clulas.
VELOCIDADE DE CONSUMO DE SUBSTRATO A medida que a clula est se reproduzindo os substratos esto sendo consumidos, a velocidade de consumo do substrato ser teoricamente constante, enquanto for constante o crescimento celular, isto quase nunca acontece, uma vez que o substrato no s utilizado para o crescimento celular, mas tambm para formao de metablitos, em alguns processos o substrato pode ter uma velocidade de consumo quase linear por um perodo de tempo, e a velocidade chamada de velocidade especfica de consumo do substrato e calculada por:
ln Sf ln Si ------------------tf ti
Sf = concentrao de substrato
FIGURA 6 - Variao da Concentrao de Substrato em Funo do Tempo
VELOCIDADE DE FORMAO DO PRODUTO A velocidade de formao do produto tende a ser constante durante um perodo de tempo. chamada de velocidade especifica de formao do produto e calculada por: ln Pf ln Pi ------------------tf ti
Pf = Produto final
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FIGURA 7 - Variao da Concentrao de Produto em Funo do Tempo
VELOCIDADE ESPECFICA DE CRESCIMENTO funo de trs parmetros: - Concentrao de substrato limitante (S) - Velocidade mxima de crescimento ( max ) - Constante especifica do substrato (ks), equivale a concentrao em = 0,5 max a concentrao de substrato que d a metade da velocidade mxima de crescimento. E dada pela equao de MONOD, que equivale a equao de Henri-Michaelis-Menten para cintica enzimtica. S = max --------------Ks = corresponde a metade do max Ks + S
FIGURA 8 - Relao entre a Velocidade de crescimento e Concentrao de Substrato

Existindo vrios substratos limitantes, podemos estender a equao de Monod para: K1 .S1 K2 .S2 Kn .Sn = max . --------- + --------- + + .......+ ----------K 1 + S1 K 2 + S2 K n + Sn - Se existir um excesso de todos os substrato, ento = max e a cultura est na fase log, na sua velocidade mxima de crescimento. Se o primeiro substrato for exaurido e outro substrato estiver presente, teremos uma segunda fase lag e log com outro tempo de gerao que caracteriza a metabolizao deste segundo substrato, este fenmeno chamado de DIAUXIA. Isto ocorre porque um dos substratos, geralmente a glicose, catabolizada preferencialmente e inibe a quebra de outros substratos. As enzimas que catabolizam os outros substratos so induzidas (durante a segunda fase lag) aps a metabolizao completa do primeiro substrato. TABELA 4 - Efeito do comprimento da cadeia de glicose na velocidade mxima de crescimento de Fusarium graminearum a 30C ACAR Glicose Maltose Maltotriose N de UNIDADE de GLICOSE 1 2 3 max (h-1 ) 0,28 0,22 0,18 G (h) 2,48 3,15 3,85
FIGURA 9 Crescimento triuxico de Fusarium graminearum Com isto chegamos a concluso que o mximo depende do: microrganismo; condies de cultivo; composio do meio de cultura; temperatura de incubao; outros fatores (pH, oxignio, etc.)
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CLASSIFICAO DOS PROCESSOS
TIPO 1 - ASSOCIADO No processo associado o produto derivado diretamente do metabolismo primrio, usado para a produo de energia. O crescimento, o c atabolismo de carboidratos e a formao do produto ocorrem ao mesmo tempo. A TROFOFASE (fase de crescimento) e a IDIOFASE (fase de formao do produto) no so separadas. Ex. produo de biomassa, etanol e cido glucnico. Sendo A, B, e C, produtos intermedirios do metabolismo primrio, a formao do produto pode ser considerada: A
C PRODUTO
FIGURA 10 - Relao entre Crescimento Celular e Formao de Produto em um Processo Associado TIPO 2- SEMI-ASSOCIADO O Produto derivado de um substrato usado no metabolismo primrio, mas segue uma rota colateral. A tropofase e a idiofase so separadas. Em fermentao em batelada este tipo de cintica possui dois pontos importantes: 1) crescimento celular acompanhado de alto consumo de substrato e pouca ou nenhuma formao de produto; 2) O crescimento diminui e a formao do produto comea acompanhada de um alto consumo de substrato. Ex.: produo de cido ctrico e de alguns aminocidos. A reao de formao do produto pode ser exemplificada como: A B C Metabolismo Primrio
D
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Produto
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FIGURA 11 - Relao entre Crescimento Celular e Formao de Produto em um Processo Semi-Associado TIPO 3 - NO ASSOCIADO O metabolismo primrio e a formao d produto ocorrem em tempos separados. O produto o no derivado do catabolismo, mas de rotas anfiblicas. Neste tipo de fermentao, o metabolismo primrio ocorre acompanhado do consumo de substrato, aps isto o produto formado por reaes do metabolismo intermedirio. Ex.: muitos antibiticos e vitaminas. Nesse tipo de processo freqentemente condies timas para o crescimento celular no so as mesmas para a formao do produto e a fermentao pode ser dividida em duas etapas, onde na primeira se d condies s clulas crescerem e aps altera-se a temperatura, pH, quantidade de oxignio ou concentrao de nutrientes para favorecer a formao do produto.
FIGURA 12 - Relao Entre Crescimento Celular e Formao de Produto em um Processo No associado A classificao dos processos depende da produo do metablito, da composio do meio de cultura e da regulao da cepa utilizada. Podem ocorrer formas intermedirias:
- Produo de cido lctico: tipo 1 e 2 - Produo de antibiticos aminonoglicosdicos: tipo 2 e 3 Um processo pode se comportar de duas formas distintas, conforme os parmetros de fermentao. Por exemplo, a produo de etanol um processo associado, mas pela modificao das condies de fermentao, pode ser forado a se comportar como no-associado.
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Cultivos starters na industria de alimentos
EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES - STARTERS
Os cultivos starters so utilizados atualmente no processamento de alimentos para induzir diversas mudanas em suas propriedades, tais como a modificao da textura, a conservao, o desenvolvimento de aromas ou melhora nutricional, e na produo de enzimas. As principais aplicaes de cultivos starters se encontram nas indstrias de panificao, crnea e leiteira, ainda que existam leveduras starters destinadas a fermentao de bebidas alcolicas e a produo de lcool industrial. Atualmente est se impondo o emprego de starters preparados com cepas de microrganismos mais adequados para elaborao de cada produto. As culturas starters usadas nos produtos crneos curados consistem, normalmente de um organismo tipicamente acidificante como Lactobacillus ou Pediococcus para estabilizar o produto biologicamente e um organismo com caractersticas nitrato redutoras que, por uma srie de reaes produzir uma atrativa cor avermelhada associada com o tipo de produto, sendo que o organismo nitrato redutor normalmente Micrococcus ou Staphylococcus coagulase negativa. 1. DEFINIAO: Starters so grupos de microrganismos selecionados com caractersticas bioqumicas desejadas e definidas produzidos sob rigorosas e controladas condies (pH, temperatura, acidez, substrato, etc.) e so usados na elaborao de produtos fermentados. 2. OBJETIVOS DO USO DE STARTERS. Incorporar um nmero desejado de microrganismos no meio de modo que estes possam crescer, multiplicar-se e produzir as alteraes desejveis no meio e no produto final; Superar o desenvolvimento de qualquer agente contaminante, competindo com estes pelos substratos e pela produo de substncias que inibam os contaminantes; Ajustar uma escala de produo, permitindo uma produo programada de produtos (se inocular, pode-se ter certeza do que ser o produto final e o tempo que leva a produo); Obter uma maior uniformidade em diferentes lotes de produo; PARA UMA CULTURA MICROBIANA SER UTILIZADA COMO STARTER DEVE POSSUIR ALGUNS REQUISITOS FUNDAMENTAIS COMO: ser tolerante ao sal (salmoura de 6 a 10%); ser tolerante a presena de nitritos (50 a 100 ppm) ter crescimento na faixa de 26 a 43 C e temperatura tima de crescimento entre 32 a 35 C; ser homofermentativo (produzir somente cido lctico); no ser proteoltico; no ser lipoltico; no produzir sabores e aromas atpicos ao produto final;
no ser patognico; apresentar destruio trmica a 57-60 C. Os cultivos starters no devem ser patognicos, toxignicos nem formar antibiticos, alm disso no devem degradar os aminocidos a aminas farmacologicamente ativas (ex. histamina) ou a cido sulfidrico. As bactrias lcticas devem formar muito pouco ou nenhum perxido de hidrognio, no formar gs e pouco ou nenhum cido actico. 3. PRODUO DE CULTURAS PARA FERMENTAAO EM ALIMENTOS Seleco: Selecionar cepas ou microorganismos que vo produzir a caracterstica ideal. O microorganismo deve ser geneticamente estvel. Manuteno: Uma vez obtido o cultivo satisfatrio devemos mant-lo puro e ativo. Mantm-se a cultura ativa por transferncia ou repicagem em meio de cultura apropriado. O meio de cultura de repicagem deve ser o mesmo da atuao, de preferncia; No ponto mdio da fase exponencial de crescimento, guardar sob refrigerao para paralisar o crescimento. Neste ponto temos o maior nmero de clulas viveis e mais saudveis de uma cultura, se a usarmos como inoculante de um processo. O nvel de sobrevivncia depende do ambiente: cuidar a temperatura, culturas mantidas a altas temperaturas (ou mesmo ambiente) continuaro metabolizando e suas enzimas podem ser descaracterizadas. Usar sempre a mesma porcentagem de inculo. Usar culturas que esto com o seu crescimento no ponto mdio da fase exponencial. Se o inculo for uma cultura mais resistente, podemos usar a cultura at o final da fase estacionria. 4. PUREZA DA CULTURA Evitar a presena de contaminantes. Os mtodos de controle usados para checar a pureza do inculo vo depender do tipo de microrganismo em questo: Exame microscpico um mtodo utilizado para identificao de contaminantes desde que se conhea a morfologia do microrganismo que estamos trabalhando e que o contaminante tenha uma morfologia diferente A deteco de substncias produzidas pelos contaminantes e que no so produzidas pelos starters. Ex.: culturas lcticas so todas catalase negativa, enquanto que a grande maioria dos contaminantes so catalase positiva. Repicar uma amostra para o meio onde o contaminante cresce bem e de preferncia tenha colnias caractersticas. Em caso de a contaminao retornar para a cultura estoque, ou se houver a suspeita de que esta est contaminada, fazer a repurificao estriando a cultura em meio seletivo para a cultura desejada e proceder a purificao.
5. CARACTERSTICAS DAS BACTRIAS CIDO LCTICAS So anaerbias facultativas: crescem melhor com baixa tenso de oxignio; So basicamente sacarolticas: outros componentes so pouco alterados Produzem grande quantidade de cido lctico: so ineficientes quanto a produo de energia Diviso quanto a fermentao da lactose: homo e heterofermentativas; Mecanismos biossintticos pobres: necessrio o suprimento de carboidratos, aminocidos, lipdios, minerais, etc, para que se desenvolvam: No usam O2 no seu metabolismo, por isto no decompem completamente o alimento e seus metablitos bsicos acumulam no meio. A nica forma de metabolismo energtico a fermentao: So gram-positivas. 6. FERMENTAO POR STARTERS alterao da matria-prima, formando alimentos com caractersticas sensoriais agradveis e proporcionando uma maior vida-de-prateleira. Os primeiros produtos fermentados foram descobertos empiricamente e serviam apenas para conservar. Aps desenvolveu-se um certo gosto por produtos fermentados, hoje fabricados para obter propriedades de conservao e atender a demanda do mercado. E considerada como um mtodo de preservao provocando modificaes das caractersticas qumicas da matria-prima e pelo fato de que os agentes conservadores se formam como produto da mesma, por ao dos microrganismos so, no entanto alteraes dirigidas. As transformaes mais importantes de produtos alimentcios tem como principal substrato os carboidratos. Quase todos os conservantes produzidos por ao microbiana so cidos (cido lctico) e lcool. O efeito conservante dessas substncias geralmente complementado pela aplicao de outros mtodos: baixas temperaturas, calor, anaerobiose, sal, acar, adio de um cido (vinagre). As bactrias lcticas so utilizadas em uma srie de produtos como: queijos, leites fermentados, vegetais e produtos crneos produzem substncias inibidoras (cidos, lcool, H2 O2 e antibiticos (bacteriocinas)). 7. TIPOS DE FERMENTAO Os microrganismos lcticos utilizados na indstria de alimentos uns so homo e outros heterofermentativos, ou seja, alguns produzem apenas cido lctico (homofermentativos) como produto da transformao do substrato em questo e, outros produzem cido lctico e uma gama de outros cidos que ficam incorporados ao produto. Lctica: picles, chucrute, azeitonas verdes, queijo, leites fermentados, produtos crneos, etc.. Alcolica: vinho, cerveja, sucos de frutas fermentadas, licores, destilados. etc... Actica: maionese, vinagre, etc. Propinica: cido propinico.
8. IMPORTNCIA DO DESENVOLVIMENTO DA ACIDEZ a) Controle de contaminaes indesejveis, antagonismo (patognicos); b) Ajuda na eliminao de umidade. Ex. queijos. c) Formao do sabor; d) Formao de corpo e textura; e) Facilita a ao de outros aditivos. Ex. a renina atua melhor em pH cido; f) Ajuste do pH adequado para os diversos processos fermentativos; g) Conservao dos produtos (aumenta a vida til ou vida-de-prateleira dos produtos.); h) Produo de bacteriocinas (protenas que so produzidas a partir de seu metabolismo) 9. IMPORTANCIA DO CIDO LACTICO NOS PRODUTOS FERMENTADOS a) Preservao do produto; b) Seleo da flora microbiana, evitando contaminaes; c) Contribui para o sabor, aroma e flavor dos produtos fermentados; d) Melhora a digestibilidade de alguns produtos: Ex.: a precipitao de protenas em partculas finas facilita a digesto enzimtica; e) Melhora a utilizao do Clcio, Fsforo e Ferro no organismo (so melhores absorvidos em pH cido); f) Estimula a secreo do suco gstrico. 10 FATORES IMPORTANTES NO DESENVOLVIMENTO DA FERMENTAO A presena de antibiticos constitui um srio problema para obteno de starters lcticos. A penicilina, muito utilizada para combater mamites, e a aureomicina em concentrados da dieta. Os resduos desses antibiticos no leite produzem inibio dos microrganismos lcticos ate 96 horas aps a aplicao ter sido feita no animal. Nveis de 0,05 a 0,10 U.I. de penicilina/mL inibem o desenvolvimento da maioria dos Streptococcus e 0,5 U.I./mL inibe por completo a fermentao. Os Lactobacillus so mais resistentes, embora algumas espcies so inibidas por completo com 5 U.I./mL de penicilina no leite. Presena de resduos de sanitizantes (iodforos e amonioquaternrios), os iodforos em baixas concentraes estimula a presena de cidos enquanto que em nveis maiores (50 a 100 ppm) a reduzem. Geralmente o cloro ativo em concentraes entre 25 e 200 ppm impedem a fermentao lctica. Amonioquaternrios, nveis entre 25 e 75 ppm causam diminuio da velocidade ou deteno da fermentao. 11. IMPORTNCIA DAS CULTURAS STARTERS PARA INDSTRIA As formas de obteno e estocagem de culturas starters tem proporcionado o aparecimento de culturas em melhores condies de uso do que as tradicionalmente usadas. O estoque das culturas mantido em plantas de processamento via sub culturas em laboratrio
O uso de culturas congeladas ou liofilizadas tem tomado possvel inocular o volume de cultura diretamente no produto ou na preparao deste em uma cuba. Existem diversas vantagens para o uso de culturas starters concentradas: A atividade da cultura pode ser cuidadosamente controlada para monitorar a planta de processamento; A manuteno do estoque de cultura da planta de processamento pode ser eliminado; Menos trabalho requerido; O sistema de rotao de cultura starter fcil de estabelecer ajudando a manter o controle sobre a bacteriofase; Os recentes desenvolvimentos da cincia e tecnologia de starters esto gradualmente encontrando novas aplicaes. As seguintes tendncias certamente figuraro nos futuros negcios da indstria de alimentos:
Uso de bactrias cido lcticas especializadas em trocar ou promover certos tipos de
funcionalidade protica; Controlar a maturao de produtos fermentados; Produo de novos produtos (diferentes composies, textura e flavor); Novos produtos lcteos (produtos lcteos puros ou misturada com cereais); Uma nova gerao de bebidas fermentadas (teraputicas e bebidas profilticas; novos flavors); Produtos com baixo teor de gordura; Suplementos dietticos para atletas, crianas e idosos; Produtos lcteos no alergnicos;. Destoxificao de certos produtos fermentados; Produtos enriquecidos com antimicrobianos; Disponibilidade de um largo espectro de bactrias ready-set starter. Existem inmeros fatores que ajudam a proteger os produtos crneos fermentados da rancificao pelo oxignio do ar e dentre eles destaca-se a catalase dos micrococcaceae a qual quebra os perxidos, incluindo o perxido de hidrognio produzido por Lactobacillus, alm disso, os micrococcaceae tambm ajudam a aromatizar os produtos curados e o presunto cru, conforme mostra a figura 13. Reduo do Nitrato
Desenvolvimento e estabilizao da cor e do produto curado e inibio da rancidez
Degradao dos Perxidos Hidrlise das gorduras

Intensificao do odor e flavor
Figura 13 - Efeito da catalase positiva (micrococcaceae) em produtos curados e produtos crus. Fonte: Lcke, 1986.
A figura 14 mostram de forma simplificada como os grupos de bactrias so importantes na carne e nos produtos crneos e como elas podem ser distinguidas entre si. Os microrganismos mais importantes na fabricao de linguia seca e presunto cru pertencem aos gneros Lactobacillus. Staphyllococcus e Micrococcus A funo mais importante das bactrias catalase positivas (particularmente Micrococcaceae) em produtos crneos curados manter a cor do produto e proteger as gorduras contra o ataque do oxignio do ar, pois a rancidez um problema maior nos produtos crneos crus do que nos cozidos. Isto e devido ao fato de que muitos Lactobacillus produzem perxidos durante a cura do produto e nos produtos cozidos no existem enzimas lipolticas.
Coccus
Bastonetes
Catalase positiva
Micrococcus Staphylococcus
No forma esporos Catalase

negativa
No forma esporos
Forma esporos
Catalase negativa
Catalase positiva
Aerbio ou anerbio facultativo Bacillus
Aerbio obrigatrio Clostridium
Obrigatoriamente anaerbia
Aerotolerante anaerobia
Obrigatoriament e anaerbia
Aerotolerante anaerobia
Anaerbio facultativo
Aerbio
Lactobacillus
Brochothrix
FIGURA 14- Bactrias gram-negativas importantes para a carne e produtos crneos. Fonte:Lcke, 1986. Atividade Lipolitica dos Micrococcus Micrococcaceae so tambm usados como starters devido a sua atividade lipoltica que dar uma contribuio essencial ao flavor do produto. Os micrococcus tm uma grande atividade lipolitica sendo capazes de atacar cidos graxos de cadeia longa ou curta, triglicrides de 16 a 18 tomos de carbono. Observou-se que o mximo de atividade lipoltica do micrococcus ocorreu a pH 7,0 e a 32 C e esta atividade decresce com o decrscimo do pH e temperatura. Por exemplo a pH 5,5 e 11 C nenhuma atividade lipoltica extracelular foi observada sobre diversos triglicrides e gordura de suno. Talon (1993), testou Staphylococcus warnieri 854, 863 e 864, Sraphylococcus saprophyticus M252 e 852 e Micrococcus varians M204 com relao a sua atividade lipolitica e percebeu que amostra inoculada com Micrococcus varians teve uma atividade menor que as outras bactrias testadas, no entanto, segundo o mesmo autor, a diferena entre estas cepas no pode ser explicada
pelo seu crescimento, embora microccocus varians tenha mostrado o maior crescimento, sua atividade lipoltica foi inferior as demais bacterias, sendo Staphylococcus saprophyticcus 852 a capa que apresentou a maior atividade lipoltica. Conforme relata Talon (1993), a produo de lipases por M icrococcus varians depende do O2, pois nenhuma atividade lipolitica pode ser detectada quando esta cepa foi cultivada sem agitao e aerao. Debevere (1976), j relatava que Micrococcus varians necessita crescer sob agitao e aerao para hidrolisar gordura de suno. Esta atividade pode ser evidenciada pelo decrscimo dos cidos graxos insaturados ao final da incubao e pode ser devido ao metabolismo bacteriano ou a oxidao, pois as bactrias forem obtidas sob condies de agitao e aerao apropriadas. Outros autores tambm mostraram que Micrococcus varians foi capaz de produzir em adio a oxidao outros compostos carbonlicos a partir de cidos graxos saturados (Talon, 1993). O flavor tpico dos salames devido a produo de cidos durante a fermentao, ao sal e a diferentes compostos derivados ao catabolismo dos aucares ou ainda a compostos produzidos durante a maturao da carne estes compostos podem ser de origem no enzimtica, como durante a oxidao dos lipdios ou pode ser resultado de uma Esta catlise e devida a enzimas endgenas no caso dos produtos onde so usados starters como o presunto curado mas depende tambm de enzimas exgenas no caso dos produtos. Efeito dos Cultivos Starters em Embutidos Secos As bactrias lcticas inibem, pela formao de cido lctico, o desenvolvimento de microrganismos indesejveis e melhoram a textura dos embutidos secos. Em troca. a microbiota catalase positiva, melhora a cor, aroma e proteo do produto frente ao efeito prejudicial do oxignio. Para tanto, depende do tipo de produto desejado a convenincia do emprego de cultivos starters e quais deles devem ser empregados. Formao de Cor e Flavor A formao de cor no produto curado resultado de uma srie de reaes desencadeadas pelas bactrias nitrato redutoras, principal caracterstica do gnero Micrococcus e Staphylococcus que inicialmente, reduzem o nitrato a nitrito e, posteriormente, devido produo de cido pelas bactrias acidificantes (acidolcticas) ocorre a queda do pH, a reao prossegue e os nitritos so decompostos a xido ntrico para entao reagir com a m ioglobina, formando nitromioglobina que vai conferir a cor caracterstica dos produtos curados, conforme mostra a figura 15.
Ao bacteriana
NaNO3 (Nitrato de Sdio) NaNO2 + H2 O 3HNO2
NaNO2 + O2
PH = 5,4 a 6,0
HNO2 + NAOH
(cido nitroso)
2NO + H2 O + HNO
NO + Mioglobina Nitrosomioglobina FIGURA 15- Esquema das reaes de formao de cor pela ao das bactrias nitrato redutoras. Fonte: Coretti, 1971
As reaes de formao de cor so fortemente influenciadas pela velocidade e intensidade de acidificao que, quando muito intensa, resulta na inibio dos microrganismos redutores do nitrato. Em conseqncia, o produto apresenta o centro de cor cinza. Ocasionalmente pode surgir um defeito chamado nitrite burn quando houver uma fase de latncia muito grande dos microrganismos lcticos, os microrganismos sensveis ao cido e redutores de nitrato reduzem quantidades excessivas deste. Posteriormente, as bactrias lcticas reduzem o pH e uma colorao marrom-esverdeada torna-se aparente. Um balano dinmico entre microrganismos redutores de nitrato e microrganismos lcticos previne este tipo de deteriorao. A formao do flavor no produto curado, importante contribuio dos Micrococacceae, pode ser produzido de 4 maneiras: Oxidao lipdica Fermentao dos acares Catabolismo derivado de aminocidos como a valina, leucina ou isoleucina; Alimentao do animal, Outra importante contribuio desta espcie a produo de catalase a qual remove o H2 O2 produzido nelas bactrias acidolticas, pois este representa um forte agente oxidante exercendo efeitos adversos sobre a cor, aroma e vida de prateleira dos produtos curados. PROCEDIMENTOS DE MANUTENO Micrococcus sp so inicialmente cultivados em Agar nutriente ou em caldo de levedura. Incubao a 30-37 C, com crescimento abundante. As culturas podem ser estocadas em refrigerador (5C) em tubos hermeticamente fechados por 3 a 5 meses ou em meio lquido com uma camada superficial de parafina por 1 a 2 anos ou ainda na forma liofilizada por 5 anos ou mais. Para uma cultura starter ter significncia comercial preciso um tratamento de preservao para que as clulas mantenham sua viabilidade e atividade fermentativa durante o transporte e estocagem. A liofilizao freqentemente utilizada como metodologia conveniente para este fim. A exposio das clulas a este tratamento e a subseqente reidratao podem ter efeito adversos sobre as clulas, tais como aumento da fase lag e reduo da atividade fermentativa. A imobilizao da bactria em um gel de polmero (prolas de alginato de clcio com glicerol 1M e um crioprotetor) antes da liofilizao, confere as prolas de gel uma proteo adicional durante o processo de liofilizao e proporciona um melhor controle do ambiente ao qual as clulas sero expostas durante a reidratao e sobre a inoculao direta no substrato para fermentao.
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Sistemas de Fermentao
SISTEMAS DE FERMENTAO O termo fermentao no sentido mais amplo possvel, pode ser definido como todo o processo no qual microrganismos catalisam a converso de uma dada substncia num determinado produto. O processo de converso pode requerer ou no oxignio, e os prprios microrganismos podem estar includos entre os produtos formados. Os processos fermentativos podem ser classificados de acordo com a maneira atravs da qual o substrato adicionado e o produto retirado. Assim sendo, numa fermentao descontnua, o substrato pe inicialmente carregado num recipiente e, ao trmino do processo, o produto retirado do mesmo. Em uma operao contnua a matria-prima adicionada com uma vazo constante e o meio fermentado retirado com a mesma vazo de alimentao. Devem ainda ser mencionados os processos semicontnuos, nos quais a adio do meio e a retirada do produto so efetuadas intermitentemente. Tais processos podem ser considerados como intermedirios entre os descontnuos e os contnuos. FERMENTAO DESCONTNUA O sistema descontinuo e considerado um sistema fechado exceto pela adio de oxignio, um agente antiespumante e um acido ou base para controlar o pH. Contm uma quantidade limitada de meio, em que o inculo passa por um numero de fases (curva de crescimento). Utiliza-se sempre um inoculo novo, depois de terminada a fermentao retira-se o produto e o resto vai fora; tem elevado custo. Os processos descontnuos podem ser classificados em trs grandes grupos: Processo em cada dorna recebe o inculo; Processos com recirculao dos microrganismos; Processo por meio de cortes. No primeiro caso cada fermentador recebe um inculo recentemente preparado. Desde que a tcnica de preparo do p-de-cuba tenha sido adequadamente obedecida, este sistema de trabalho o que oferece melhores condies para uma boa fermentao, uma vez que cada fermentador recebe uma suspenso de microrganismos de elevada atividade e, praticamente, isenta de clulas contaminantes. Na fermentao com circulao ou aproveitamento dos microrganismos, procede-se da seguinte maneira: No incio de funcionamento da instalao, algumas dornas so inoculadas com pde-cuba; o meio, uma vez completamente fermentado, centrifugado, obtendo-se assim uma suspenso de microrganismos de elevada concentrao; a suspenso obtida quase sempre submetida a um tratamento com vistas a eliminao de clulas inativas e de microrganismos contaminantes e ento, utilizada como inculo de outro fermentador. Quando bem conduzida, essa tcnica pode ser desenvolvida durante meses consecutivos sem necessidade de preparo de novo pde-cuba.
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Finalmente, na fermentaco por meio de cortes, opera-se do seguinte modo: inicia-se o trabalho inoculando-se uma dorna (que ser chamada de dorna A) com p-de-cuba: quando a fermentaco atinge um estgio apropriado, passa-se parte do contedo do fermentador A para um fermentador vazio (que ser chamado de dorna B) e, em seguida, enche-se as duas dornas com o meio a fermentar. Essa operao recebe o nome de corte. Diz-se que a dorna A foi cortada para a dorna B, ou ainda, que B recebeu um corte de A. A sucesso de cortes pode acarretar srias quedas de rendimento, principalmente quando se trabalha com meio no esterilizado. As Figuras 1 e 2 mostram o que pode acontecer nesse caso. O nmero mximo de cortes sucessivos no pode ser previsto. Em cada caso somente o controle do rendimento ao processo poder dizer em que momento e conveniente suspender-se o trabalho por meio de cortes e iniciar-se nova fermentao com inculo novo. s vezes, o processo de cortes utilizado na fase industrial do preparo do p rprio inculo, podendo-se operar do seguinte modo: em u dos tanques de crescimento do microrganismo uma vez m alcanado o momento da transferncia para o tanque subseqente apenas uma frao da suspenso microbiana transferida, completando-se o tanque com mosto novo. Consegue-se, dessa maneira, em alguns casos evitar diversas das etapas iniciais do processo de preparo do inculo. Convm lembrar a possibilidade, na prtica industrial, de serem utilizados processos mistos (batelada + cortes). o que acontece, por exemplo, em algumas fbricas de aguardente de cana que durante a semana trabalham pelo processo de corte e no fim da semana submetem o contedo de alguns fermentadores a uma centrifugao, utilizando a suspenso microbiana obtida como inculo de fermentadores para a semana subseqente. A principal desvantagem das fermentaes descontnuas quando se utiliza para produo de produtos associados ao crescimento, que a formao eficiente de produto tem lugar unicamente durante uma frao do ciclo de fermentao.
FIGURA 16 Ilustrao do ciclo de uma fermentao descontnua

Os sistemas contnuos, com volumes de sada de produto elevados podem ser, em conseqncia, muito mais eficazes em determinadas aplicaes em termos de produtividade do fermentador (volume de produo por unidade de volume por unidade de tempo, Kg.m-3 .h-1 ). PROCESSOS SEMICONTINUOS Os processos fermentativos chamados semicontnuos, utilizados, em alguns casos, em escala industrial, consistem no seguinte: carrega-se o fermentador com meio, adiciona-se o inculo e aguarda-se o termino da fermentao; retira-se, ento, da dorna, um certo volume de lquido fermentado e adiciona-se igual volume de meio novo: terminada a fermentao retira-se novamente do fermentador, um dado volume de liquido e adiciona-se igual volume de meio; e assim por diversas vezes durante meses consecutivos. Tambm nesse caso, o controle do rendimento do processo poder determinar o momento em que o trabalho pela tcnica descrita deva ser suspenso, para ser iniciada uma nova fermentao com inculo recentemente preparado. Os produtos gerados no vo atrapalhar, pois vai haver uma diluio e as concentraes retornam a nveis iniciais de diluio. PROCESSO DESCONTNUO ALIMENTADO Este processo e uma melhoria do processo descontnuo tradicional. Utiliza-se para produo de produtos como a penicilina. Neste sistema o substrato vai sendo adicionado em intervalos ao longo do processo de maneira escalonada a medida que se processa a fermentao com objetivo de que a clula no se reproduza muito e assim continuar a fermentao. Geralmente no possvel medir a concentrao de direta e continuamente durante fermentao a fim de controlar o processo de alimentao, tem que ser medidos parmetros indiretos que esto correlacionados com o metabolismo do substrato crtico. Ex: na produo de cidos orgnicos o valor do pH pode ser utilizado para determinar a velocidade de alimentao de glicose. Esta forma de processo elimina os efeitos limitantes pelas fontes de carbono utilizadas rapidamente, reduz a viscosidade do meio e o efeito dos constituintes txicos ou simplesmente faz com que a etapa de formao do produto seja a mais longa possvel. Desvantagem - a formao do produto tem lugar unicamente durante uma frao do ciclo de fermentao (na fase exponencial) Em um cultivo descontnuo, a concentrao de biomassa por unidade de tempo (t) :
X XR = (S R - s)
Onde: X = concentrao celular no tempo t; XR = inculo ou concentrao celular inicial; = rendimento para o substrato limitante (g de biomassa por g de substrato consumido); s = concentrao de substrato no tempo t; SR = Concentrao inicial do meio.
x XR Por tanto: = -------------SR s
A quantidade de biomassa alcanada na fase estacionria depende teoricamente da concentrao inicial do substrato limitante do crescimento e da eficincia do organismo em converter o substrato em material celular. Por tanto, supondo que o substrato limitante do crescimento seja S = 0 na fase estacionria o rendimento ser: x XR = -------------SR SISTEMA CONTNUO Antes de fixarmos os objetivos deste captulo, devemos definir o que se entende por fermentao contnua. E considerado um sistema aberto em que o meio vai sendo adicionado continuamente ao bioreator e vai eliminando-se simultaneamente igual volume de meio fermentado. Existem 2 tipos fundamentais de reatores contnuos: reatores de mistura completa e reatores de fluxo de pisto. Apesar do grande esforo devotado por inmeros pesquisadores ao assunto, as fermentaes contnuas ainda constituem um enorme campo a ser explorado, principalmente no que se refere a sua aplicao em processo de interesse econmico. Essa afirmativa poder ser melhor compreendida se atentarmos para o numero relativamente pequeno de instalaes industriais que utilizam os processos contnuos de fermentao e, entre as instalaes existentes, para o nmero ainda pequeno de produtos fabricados por esses processo. Assim sendo, os processos contnuos constituem uma das tecnologias mais promissoras no campo da biotecnologia pois, apesar da escassez das instalaes industriais existentes e da pouca diversificao dos produtos fabricados, muitos pesquisadores tm mostrado. em escala-piloto ou semiindustrial, a possibilidade de fabricao de diversos produtos atravs de cultivo contnuo, e tambm as vantagens deste sobre as fermentaes descontnuas. A titulo de exemplo, podemos mencionar o cido glicnico, cido lctico, glicognio, cloranfenicol penicilina, vitamina B12. Entre os microrganismos produzidos, podemos citar os gneros Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Penicillium, Saccharomyces, Torula, etc. Os fatos mencionados anteriormente, aliados s vantagens que um cultivo contnuo apresenta para estudos da fisiologia de microrganismos, visto que as condies ambientais permanecem constantes com o tempo, o que, evidentemente no acontece com os processos descontnuos, justificam plenamente o interesse em pesquisarmos e entendermos melhor este tipo de sistema. As teorias da fermentao contnua foram estabelecidas a partir de balanos materiais e da introduo de alguns conceitos e definies. Um dos conceitos importantes o substrato limitante. Entende-se por substrato limitante o material que, quando submetido a uma mudana de concentrao, afeta o crescimento, o consumo de substrato e a formao de produtos do
microrganismo cultivado. REATORES DE MISTURA COMPLETA Neste reator em estado de equilbrio, o crescimento das clulas se controla ajustando a concentrao de um substrato. Qualquer substrato que requeira carboidrato, nitrognio, sais e oxignio pode ser usado como substrato limitante. O crescimento das clulas se mantm constante utilizando a turbidez para controlar a concentrao de biomassa e a velocidade de alimentao da soluo de nutrientes se ajusta de forma apropriada. Num processo contnuo no se tem cepas preparadas para o processo, a contaminao no controlada com facilidade porque o mosto est sempre entrando. Se o processo for aerbico temos o ar como fonte de contaminao. Uma alternativa o processo semi-contnuo onde de tempo em tempo se adiciona o inculo adaptado a um antibitico, porm o rendimento ruim. Em um reator contnuo de mistura completa de uma s etapa, a adio de substrato a uma velocidade adequada combinada com a eliminao a uma velocidade volumtrica igual de meio de cultivo do recipiente produz um estado estacionrio em que a formao de biomassa est em equilbrio com a perda de clulas, e nestas condies podemos dizer que: a) a velocidade de crescimento especifico ( controlada pela velocidade de diluio (D), posto que ) = D. b) A concentrao de substrato no estado estacionrio S em um fermentador e determinada pela taxa de diluio, segundo a equao abaixo, se as cinticas seguem o modelo de Monod e D < max. KS D S = ------------max - D c) A concentrao de biomassa no estado estacionrio, X determinada pelas variveis operacionais SR e D, segundo a equao abaixo: KS D X = [ SR ------------- ] X = [S R s] max - D Na figura seguinte mostrado o efeito da velocidade de diluio sobre as concentraes de substrato e biomassa no estado estacionrio e sobre a produtividade de biomassa. Como podemos ver, a medida que D se aproxima de max, a concentrao residual de substrato limitante necessria para suportar o aumento de velocidade de crescimento se eleva e portanto a concentrao de substrato tambm aumenta (at o limite superior s = S ) enquanto que a F biomassa diminui. Quando se utiliza um sistema de cultivo contnuo, por exemplo em um processo de fermentao industrial de produo de protenas de organismos unicelulares, a quantidade de clulas produzidas por unidade de tempo (velocidade de produo) e por unidade de substrato utilizado ( ) deve ser mxima. No estado estacionrio, a velocidade de produo ser igual ao produto da velocidade de fluxo pela concentrao celular. Para que a produo celular seja mxima a velocidade de diluio dever ser alta embora no exceda o max ou se perder material.
FIGURA 17 Influencia da velocidade de diluio nas concentraes de biomassa (x) e substrato (s) no estado estacionrio e a produtividade da biomassa (P) Na produtividade mxima combinando uma produo elevada com uma de substrato eficaz, se obtm uma velocidade de fluxo igual a mxima velocidade de produo, ou ligeiramente inferior, e com a maior concentrao de substrato possvel no fluxo de alimentao. REATORES DE FLUXO PISTO Neste tipo de fermentao contnua a soluo de cultivo flui atravs de um reator tubular sem mistura. A composio da soluo de nutrientes, nmero de clulas, transferncia de massa (consumo de oxignio) e as concentraes de produto variam em diferentes posies dentro do sistema, de uma forma anloga a das trocas ocorridas ao longo do tempo em um fermentador descontnuo. Na entrada do reator as clulas devem adicionar-se continuamente junto com a soluo de nutrientes (geralmente um fluxo que reverte de um desvio da sada do fermentador ou da sada de um segundo fermentador), ou seja, um sistema de reciclagem de biomassa. Em um processo contnuo em condies de equilbrio a perda de clulas devido ao fluido que sai deve ser balanceada, pelo crescimento dos microrganismos. A velocidade do fluxo se define como a velocidade de fluxo volumtrico (que entra e sai) atravs do volume do fermentador.
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Fermentao alcolica
INTRODUO AO ESTUDO DA FERMENTAO ALCOLICA

Durante milhares de anos o lcool etlico tem sido produzido para o consumo humano, e tambm h milhares de anos tem sido possvel fazer bebidas alcolicas concentradas mediante destilao. Em pases de extensas reas agrcolas como Brasil, EUA e frica do Sul, tem sido feitos estudos para elaborao de etanol a partir de amido e sacarose, para ser utilizado como combustvel juntamente com a gasolina. PRIMEIROS ESTUDOS SOBRE FERMENTAO ALCOLICA BECHNER: Sculo 17 - somente os lquidos aucarados so capazes de entrar em fermentao alcolica. O lcool se formava durante o processo de fermentao, erradamente julgando a necessidade de ar para causar o fenmeno que dizia ser semelhante combusto; BLACK: Sculo 18 - postulou que o lcool etlico e o gs carbnico eram os nicos produtos formados do acar durante a fermentao alcolica; LAVOISIER: 1789 - primeiro a efetuar um estudo quantitativo da fermentao alcolica, identificou alm do lcool etlico e do gs carbnico um outro composto, o cido actico. GAY LUSSAC: Seguiu os estudos de Lavoisier, formulou a equao que julgava representar o fenmeno da fermentao alcolica: C6 H12 O6 2C2 H5 OH + 2CO2 PASTEUR: 1857 - Explicou a natureza da fermentao alcolica, atribuindo-a a atuao de seres vivos, as leveduras, como agentes causais. EMBDEN, MEYERHOF, ROBISON, NEUBERG, CORI, PARNAS E WARBURG: Sculo 19 Foram os arquitetos pioneiros da identificao das rotas bioqumicas que hoje representam a fermentao alcolica em todas as suas etapas. FERMENTAO ALCOLICA POR MICRORGANISMOS Generalidade - a fermentao alcolica pode ser considerada como a oxidao anaerbica, parcial, da glicose, por ao de leveduras, com a produo final de lcool etlico e anidrido carbnico, alm de outros produtos secundrios. processo de grande importncia, atravs do qual obtido todo o lcool industrial, e todas as bebidas alcolicas, destiladas e no destiladas e, como produto secundrio, o gs carbnico. E ainda utilizado na panificao e na obteno de leveduras prensadas. Bebidas alcolicas so produzidas de um grande nmero de substratos ou matrias cruas, mas especialmente de cereais, frutas e sementes com alto teor de acar, incluem as bebidas no destiladas como cerveja, vinho (11,5%), cidras e sak, as destiladas como o whiski (43%) e rum so produzidos de cereais fermentados e melaos, respectivamente, enquanto o brandy produzido pela desti1ao do vinho. Outras bebidas destiladas tais como vodka (40%) e gin, so produzidos pela destilao de melaos fermentados, gros e batata. Uma variedade de vinhos fortes so produzidos pela adio de lcool destilado para obter um contedo de lcool entre 15-20%, inclui-se este caso os sherries e vinhos amadeirados.
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MATRIAS-PRIMAS Qualquer produto que contenha acar ou outro carboidrato, constitui-se em matria-prima para obteno de etanol. Entretanto, para que seja vivel economicamente, preciso considerar seu volume de produo, o rendimento industrial e o custo de fabricao. Trs tipos de substratos podem ser utilizados na obteno de etanol por fermentao: a) razes que contm amido, tubrculos ou gros; b) melaos ou suco de cana-de-acar ou de beterraba; c) madeira ou resduos do processamento de madeiras. O uso do soro de queijo no tem valor comercial, atualmente. A matria-prima utilizvel na fermentao alcolica varia com as caractersticas agrcolas da regio, com as caractersticas da prpria matria-prima e com a finalidade da fermentao alcolica. PREPARAO DO SUBSTRATO As matrias-primas de interesse nacional, destinadas fabricao de lcool fornecem uma mistura de glicdios e outras fornecem amido. Os substratos requerem preparao prvia adequada, para somente depois passarem as dornas de fermentao. Sacarinas - nas quais figuram a glicose a levulose (melao, uso de uvas, suco de frutas, mel e outras), e a sacarose (caldo de cana-de-acar). Neste caso, a sacarose hidrolisada por uma exo-enzima, sacarase, produzida pela levedura. C12 H22 O11 sacarose + H2 O + sacarase C6 H12 O6 + C6 H12 O6 glicose levulose
O caldo de cana-de-acar invariavelmente utilizado in natura, podendo ,s vezes ser diludo e/ou aquecido e clarificado; O melao deve ser diludo com gua. As concentraes do mosto so comumente expressas em graus brix, diluindo-se os melaos para graduaes entre 15 e 25 Brix, com mdias de 18-20 Brix. Mostos muito diludos fermentam mais rapidamente e sujam menos os aparelhos de destilao, mas exigem, maior espao para fermentao, mais consumo de vapor, mais mo-de-obra e favorecem contaminaes do mosto Amilceas - tais como a mandioca, batata, milho, arroz, trigo, e outros cereais, utilizados na produo de lcool fino, cerveja, e certas bebidas destiladas. Tem que se considerar que as leveduras no produzam amilase, para a hidrlise do amido. Conseqentemente, tais substncias tem que sofrer uma operao prvia de sacarificao, para ficarem em condies de serem utilizadas pelas leveduras. Essas sacarificao ou hidrlise do amido, pode se puramente qumica, por ao de cidos fortes, como na produo de lcool de mandioca ou batata. (C 6 H10 O5 )n + H2 SO4 amido n C6 H12 O6 glicose
Entretanto, na obteno de bebidas como a cerveja, o usque, o sak e do prprio lcool, o amido hidrolisado, pela ao enzimtica.
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(C 6 H10 O5 )n +
n2
H2 O + amilase
n2
C12 H20 O11 maltose
A maltose surge de modo semelhante sacarose. A sacarificao enzimtica do amido pode ser feita por trs processos diferentes: Atravs da maltagem, ou emprego do malte. Este produto preparado a partir de sementes de cereais, em germinao, secas e reduzidas a p, e se caracteriza pela sua riqueza em amilase. Adicionado ao amido previamente preparado, transforma-o em maltose. A maltose utilizada entre outros, em cervejaria e na produo de usque. Pelo processo amilo, que consiste no emprego simultneo de um fungo capaz de produzir a amilase que atua sobre o amido (Rhizopus japonicum, Aspergillus orizae, Mucor delemar, Amylomyces rouxii e outros) e da levedura encarregada da fermentao do acar proveniente da hidrlise. Este processo utilizado na produo do sak. Pelo emprego de preparados enzimticos produzidos previamente em culturas puras, por certos microrganismo (Fungos e Bactrias). Celulsicas, a celulose da madeira pode, eventualmente, ser utilizada na fermentao alcolica, necessitando, porm, ser hidrolisada por via qumica: (C 6 H10 O5 )n celulose + H2 SO4 n C6 H12 O6 glicose
AGENTES DE FERMENTAO ALCOLICA As leveduras, de um modo geral, so capazes de desdobrar a glicose, com produo de lcool etlico e gs carbnico. Entretanto, o nmero de espcies envolvidas na fermentao industrial bastante reduzido. Mais de 96% do etanol produzido por fermentao atravs da utilizao de Saccharomyces cerevisiae ou espcies semelhantes, particularmente Saccharomyces uvarun. Somente poucas espcies desses microrganismos so utilizados na fabricao de lcool. As mais importantes so: a) Saccharomyces cerevisiae Hansen utilizada principalmente na produo de lcool comum, aguardente, cerveja e outras bebidas e na panificao; b) Saccharomyces ellipsoideus Hansen (Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus Dekker) utilizadas na produo de vinho de uva; c) Saccharomyces calbergensis, para a produo de cerveja Utiliza-se a Saccharornyces cerevisae e Schizosaccharomyces pombe, quando o substrato costituido de hexoses, e Candida utilis quando uma parcela do substrato for constitudo por pentoses O microrganismo utilizado para fermentao pode ser: selvagem, selecionado ou prensado. A levedura empregada na fermentao, depende de vrias fatores, entre as quais o substrato ou matria prima utilizada, o teor alcolico desejado no produto final, a durao da fermentao, as propriedades do produto, e outros. MICRORGANISMO SELVAGEM: o microrganismo natural que acompanha o prprio mosto. Atravs desta fermentao tem-se uma fermentao impura, pois junto com o microrganismo ou levedura utilizada na fermentao tem-se tambm bactrias que vo competir causando o que se
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chama DESVIO DE FERMENTAO, tendo-se uma fermentao de baixo rendimento e lenta pois a fermentao no tem um controle da qualidade dos microrganismos e, por ser lenta facilita a contaminao; tem-se um produto com baixo teor alcolico o que facilita sua deteriorao. MICRORGANISMO SELECIONADO: de origem natural (Ex. caldo de cana, pode-se isolar o microrganismo) isolado da natureza e selecionado para determinado uso, isto feito pela srie bioquimica onde se faz um estudo do microrganismo. Aps tem-se uma cultura pura, tendo-se conhecimento por exemplo da velocidade de fermentao, resistncia ao lcool; esta cultura pura pode ser seca ou liofilizada ou ainda congelada. PREPARAO DO MICRORGANISMO SECO: chama-se p-de-cuba; pega-se o envelope contendo o microrganismo e coloca-se em contato com gua morna estril para reidratar, aps o fermento adicionado em uma pequena quantidade estril do mosto em que vai ser usado e mantido por 24 horas, aps este tempo por mais 24 horas em uma quantidade maior de mosto, tambm estril, sempre controlando-se o grau Brix e continua-se aumetando a quantidade de mosto at atingir o grau Brix desejado na concentrao celular desejada, pode-se tambm fazer uma adaptao deste microrganismo a agentes antispticos como o metabissulfito, este processo gradativo visto que o microrganismo tem que sofrer uma adaptao aos meios que se deseja usar. MICRORGANISMO PRENSADO: neste caso usa-se normalmente Saccharomnyces cerevisiae; fazse um mosto de melao e coloca-se o microrganismo, injeta-se tambm oxignio as clulas de Saccharomyces c.; aps estas clulas passam por uma centrfuga e depois so prensadas. No caso de Saccharomyces cerevisiae um bom processo para produo de fermentados alcolicos. NUTRIO CELULAR Levedura quimiorganotrfica, pois obtm energia atravs da oxidao de compostos orgnicos desdobrando-os para retirar energia. Os elementos nutritivos mais importantes representam-se pelo carbono, nitrognio, fosfatos, sais de magnsio, potssio e clcio. Certos tipos de matrias-primas requerem a adio de substncias minerais para suprir as necessidades da levedura em certos elementos principalmente P e K . O caldo de cana-de-acar uma matria prima quase completa sendo deficiente em Nitrognio e Fsforo, dai adio de 0,1 g/L de sulfato de amnio e 0,1 g/L de fosfato. O mosto preparado com caldo de cana-de-acar deve conter entre 14 e 18% de slidos solveis, no menos porque a produo de lcool seria pequena, logo esta fermentao estar sujeita a contaminao e, acima de 18% a produo de lcool vai inibir a diviso celular (microrganismo no vai multiplicar-se). FATORES QUE AFETAM A FERMENTAO Entre os vrios fatores ambientes que afetam a fermentao citamos: Temperatura, varivel de acordo com o tipo e finalidade do processo; assim, o timo para a produo de lcool, aguardente, vinho e outros produtos se situa entre 26 e 32 C, ao passo que, para a cerveja, est entre 6 a 20C;
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pH do mosto, tambm varivel entre 4,0 e 5,0 para a produo de lcool, entre 4,0 e 4,5 para a cerveja. O pH baixo inibe o desenvolvimento de bactrias contaminantes, sem prejudicar o desenvolvimento das leveduras. Concentrao matria prima: se bem que a levedura suporta concentraes de acar em torno de 22 a 24%, nos processos industriais ela varivel de acordo com a finalidade do processo: situa-se entre 12-14% no melao, para a produo de lcool, entre 6-9% para a produo de cerveja, entre 22-24% no suco de uva para obteno de vinho; Teor alcolico do produto, o aumento do teor alcolico do mosto em fermentao inibe o desenvolvimento da prpria levedura: no geral este cessa em concentraes de 11-12% do lcool. Deve-se ter em conta que o teor alcolico depende do teor inicial em aucares, o qual, por sua vez, varivel com o fim a que se destina. Na produo do lcool industrial, por exemplo, parte-se de uma concentrao baixa de aucares (12-14%) para se obter seu desdobramento total em 24-48 horas, sem que a levedura seja inibida pelo teor alcolico final; Oxignio - em anaerobiose, o rendimento em lcool maior, uma vez que, em aerobiose, h oxidao total da glicose; Anti-spticos e Antibiticos utilizados para controlar o problema das contaminaes. Cada produto age diferentemente. Alguns favorecem a atividade de leveduras ao mesmo tempo em que inibem bactrias e fungos. No processamento de vinhos muito comum o uso de SO2 . O uso dos antibiticos de agente esterilizante, em virtude de suas propriedades bacteriostticas. A penicilina um bom inibidor de contaminaes. Pode-se usar, tambm, cloranfenicol, tetraciclina e clorotetraciclina. CORREES DO MOSTO Normalmente se fazem correes em termos de elementos nutritivos. A correo dependa da natureza da matria-prima. Substratos amilceos sofrem esterilizao, adio de fosfatos e correo de pH. Substratos como o melao faz-se a diluio e pode-se adicionar fosfatos e sas de amnio. Caldo de cana-de-acar adiciona-se fosfatos, sais de amnio e vitaminas. Pode-se adicionar farelo de arroz como fonte de vitamina e aminocidos, e tambm magnsio, cobalto e mangans. Alm de antibiticos e anti-spticos. PREPARO DO INCULO Podem ser utilizadas leveduras selvagens (pequenas cantinas e destilarias de aguardente) ou selecionadas, tolerantes a altas concentraes de etanol e com boa velocidade de fermentao. Tambm se utilizam as leveduras de panificao, prensadas e secas. Em qualquer caso conveniente preparar adequadamente o p-de-cuba, pois esta prtica melhora sensivelmente a fermentao. CRESCIMENTO DA CLULA NO TANQUES DE FERMENTAO MTODO DA MASSA SECA No momento em que se tem mosto e adiciona-se o microrganismo comea a fermentao, acompanha-se o crescimento atravs da massa seca: coleta-se uma amostra de 50 ml, coloca-se em
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uma cpsula (tarada) em banho-maria para evaporao do liquido, aps todo o liquido ter evaporado leva-se a cpsula para estufa a 100 C por 3 horas, aps pesa-se ou at peso constante. MTODO DA CURVA DE CRESCIMENTO O nmero de clulas visto inoculando-se a massa seca em um caldo e fazendo-se as diluies necessrias e, destas aplicando-se em placas de Petri com meio de cultivo apropriado. Aps incubao conta-se as colnias de acordo com as diluies e monta-se um grfico (curva de crescimento) Log do n de microrganismos versus tempo. MECANISMO DA FERMENTAO O mecanismo de fermentao foi quantificado pela primeira vez por Gay Lussac, baseandose na estequiomtrica da converso de uma hexose em etanol e anidrido carbnico. C6 H12 O6 hexose C2 H5 OH + 2CO2 etanol anidrido carbnico
A fermentao alcolica decore da via catablica da frutose bifosfato (FBP) degradada da glicose. Esta degradao serve a todos os seres vivos, com exceo de algumas bactrias, para obteno de energia e materiais para construo da clula, denomina-se tambm rota de EmbdenMeyerhof-Parnas (EMP), seus descobridores, no entanto tambm na maioria das vezes nomeia-se segundo seu primeiro produto intermedirio caracterstico, a frutose-1,6-bifosfato. A degradao da glicose, a gliclise, transcorre nas clulas fermentativas e naquelas que utilizam o acar at CO2 de maneira comum at o cido pirvico. O piruvato produzido durante a gliclise convertido a acetaldedo e etanol. Este processo se d em duas fases: 1 FASE: o piruvato sofre a descarboxilao em uma reao irreversvel catalisada pela piruvato descarboxilase. Esta reao uma descarboxilao simples e no envolve a oxidao do piruvato A piruvato descarboxilase requer Mg2+ e tem uma coenzima firmemente ligada, a Tiamina Pirofosfato 2 FASE: atravs da ao da lcool desidrogenase, o acetaldedo reduzido a etanol, c NADH, om derivado da atividade da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, fornecendo o poder redutor. Portanto ao invs de lactato, os produtos finais da fermentao alcolica so o etanol eo CO2 . A equao geral da fermentao alcolica : Glicose + 2ADP + 2Pi 2 Etanol + 2C02 + 2ATP + 2H2 0 A piruvato descarboxilase est caracteristicamente presente nas leveduras, as quais so agentes biolgicos ativos responsveis pela fermentao alcolica; por isto a escolha da linhagem apropriada de importncia fundamental para o xito da fermentao. Teoricamente se pode obter a partir de 1g de glicose, 0,511g de etanol e 0,489g de CO2 . Quando se fermentam substratos puros, o rendimento de 95% e se reduz a 91% quando se utiliza matria-prima de grau industrial. Porm, na prtica, aproximadamente 10% da glicose convertida em biomassa e o rendimento de etanol e CO2 deve alcanar 90% do valor terico. O ATP formado usado para suplementar outros requerimentos de energia pela clula.
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Em termos de quantidade, 100 g de glicose pode produzir, aps a fermentao, 48,4g ou 61 mL de etanol, 46,6g de gs carbnico, 3,3g de glicerol, 0,6g de cido succnico e 1,2 g de biomassa (clulas de leveduras). Estes valores refletem o rendimento ideal de Pasteur na fermentao alcolica para a glicose, que representam 94,7% do rendimento ideal de GL. A fermentao s possvel graas a ao das leveduras. SISTEMAS DE FERMENTAO Distinguem-se quatro tipos principais de processos de fermentao industrial, que so: Sistemas de cortes depois que se faz a primeira fermentao, divide-se o volume do mosto em dois recipientes, completa-se os dois e deixa-se fermentar. Um envia-se para destilaria e outro deixa-se para produzir inculo para mais dois. Sistema de reaproveitamento de inculo aps a fermentao deixa-se decantar as leveduras, retirase o vinho para a destilao, trata-se o inculo (pe-de-cuba) e realimenta com novo substrato. Sistema de cultura pura para cada nova fermentao, parte-se de um novo tubo de cultura selecionada, seguindo todos os passos de preparao do inculo em etapas de laboratrio e industrial at as dornas de fermentao, onde junta-se inculo e substrato. Sistema de recuperao de leveduras aps a fermentao, passa-se todo o substato por separadoras centrfugas, onde se separa 10 a 20% do volume, lquido espesso com aparncia de creme, o qual se denomina leite ou creme de leveduras. Envia-se este creme para tratamento com cido sulfurico (at pH 2,2-2,3) e gua, sob agitao, por 4 horas e da, de novo, para as dornas de fermentao. Com este sistema reduz bastante a fase inicial das fermentaes, devido a concentrao de inculo. Nos processos contnuos o crescimento timo das leveduras e a produo de etanol, se realizam em condies de limitaes de acar (<1 g/L) e em ambiente microaerbio (0,2 a 5 mg O2 /g matria seca.h). Os sistemas descontnuos para a produo de etanol se iniciam aerobicamente para obter a mxima biomassa, j que se as condies anaerbias comeam demasiadamente cedo, a densidade celular no ser suficientemente alta para obter uma boa velocidade de converso. Pode ser necessria aerao forada durante determinado tempo, para evitar a perda de rendimento. Freqentemente utiliza-se a fermentao descontnua com recirculao de inculo para a produo de etanol. Quando se utilizam melaos de boa qualidade o rendimento mximo de 95% do valor terico. TABELA 5 - Comparao de vrios tipos de fermentao para a produo de etanol (Moirella, 1984)
Processo de Concentrao Fermentao de acar % Descontnuo 16,7 Contnuo 15,6 Contnuo com 16,7 recirculao Concentrao de clulas g/L 21,3 19,7 100 Etanol g/L 85,6 79,1 85,6 Produtividade especfica g/g clulas.h 0,42 0,72 0,42 Produtividade especfica por unidade de volume g/L.h 11,8 14,1 42,5
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PRTICA DA FERMENTAO ALCOLICA To logo se mistura o inculo ao mosto corrigido, inicia-se a fermentao alcolica dos acares fermentescveis, nele contido. Esta fermentao passa por algumas fases distintas: A fase preliminar inicia-se no momento do contato do levedo com o mosto. Caracteriza-se por multiplicao celular intensa, pequena elevao de temperatura e pequeno desprendimento de dixido de carbono. Nessa fase, garante-se a produo de grande quantidade de clulas de poderfermento mximo, o que se consegue em temperatura baixa e mosto convenientemente preparado. Sua durao de 4 a 6 h e varia de acordo com o sistema de fermentao que se usa na destilaria. A fase tumultuosa caracteriza-se pelo desprendimento volumoso e intenso de dixido de carbono, conseqncia da existncia de um nmero suficiente de clulas para desdobrar os acares fermentescveis do mosto. A temperatura eleva-se rapidamente, a densidade do mosto se reduz e elevam-se a percentagem de lcool e a acidez. O substrato agita-se como em ebulio. Os inconvenientes da elevao exagerada de temperatura corrigem-se com refrigerao. O desprendimento de dixido de carbono evidente. O aspecto da espuma difere para cada raa de levedura e para cada tipo de substrato. No caldo de cana no-clarificado, espessa, viscosa e volumosa, a ponto de transbordar em dornas abertas. Ao contrrio das fermentaes de substratos de melao, no reagem bem adio de antiespumantes comumente usados na indstria de lcool. Nos mostos de melao, com leo vegetal misturado com cido mineral, as espumas cedem com facilidade. A fase tumultuosa ou principal dura de 12 a 16 h. A fase complementar, que leva de 4 a 6 h para se completar, caracteriza-se pela diminuio da intensidade do desprendimento do dixido de carbono, menos agitao no lquido e diminuio da temperatura. Nessa fase, a concentrao de acares chega ao fim. Embora se note aumento da proporo dos lcoois superiores do comeo ao fim da fermentao alcolica, acredita-se que, na fase complementar, esse aumento seja mais notvel, por motivos vrios. A fermentao alcolica um processo rstico, ocorrendo mesmo em condies adversas, embora com desvantagens econmicas. Por esta rusticidade, que se deve principalmente as leveduras, no feito a esterilizao dos substratos, bastando que lhes dem condies de concentrao adequada, nutrientes e alguns desinfetantes, para que ocorra em condies satisfatrias. O controle das fermentaes alcolicas, para contornar possveis infeces faz-se por tpicos: Tempo de fermentao a durao mdia de um processo fermentativo de caldo de cana-de-acar ou melao de 24 horas e as de mosto amilceos de 36 horas. Odor de fermentao o aroma das fermentaes puras penetrante, ativo e tende para o odor de frutas maduras. Cheiro cido, a rano, cido sulfdrico e outros indicam irregularidades. Aspecto da espuma embora varie com a natureza do mosto, temperatura e cepas de leveduras, apresenta-se com aspecto tpico e caractersticos para as mesmas condies. Drosfilas infalivelmente, quando h infeco actica, aparecem as moscas-do-vinagre, em quantidade proporcional contaminao. Temperatura Alteraes importantes na curva de temperatura, do incio ao final da fermentao, alertam para possveis defeitos de fermentao.
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Densidade do mosto Durante a fermentao, a densidade do mosto decresce segundo uma curva harmnica com as fases da fermentao. De sua observao percebem-se as alteraes no processo fermentativo. Acares do mosto Consomem-se de acordo com a curva da densidade. Acidez do substrato em fermentao no deve haver grandes alteraes entre a acidez final e a inicial. Quando a final for mais que o dobro da inicial, indicao de m fermentao. PRODUTOS SECUNDRIOS DA FERMENTAO ALCOLICA Desde que se tem por objetivo a produo de etanol, pode-se considerar como secundrio qualquer outro produto que se origine durante o processo fermentativo. Entre eles, destaca-se: dixido de carbono, lcoois superiores, glicerina, cido succnico e aldedo actico. Pode-se encontrar uma gama muito variada de produtos derivados de fermentaes paralelas, normalmente por efeito de microorganismos contaminantes: cido actico, cido lctico, cido butrico, dextranio, cetonas, gs sulfdrico, bases nitrogenadas, cidos graxos, furfural, aldedos, steres e outros. No processamento de alguns produtos como bebidas fermentadas (cerveja, vinho ,cidra, etc) e destiladas (aguardentes, rum, usque e outras), alguns destes compostos secundrios tem uma grande importncia por conferir sabores e odores s bebidas. SEPARAO DAS LEVEDURAS As tcnicas mais rpidas de fermentao esto baseadas no princpio de Melle-Boint, onde as clulas das leveduras ao final da fermentao so separadas e recicladas a um substrato novo. A recuperao das leveduras igualmente essencial para a converso rpida nos produtos de fermentao contnua. Na prtica, a recuperao nunca total; uma proporo de lerveduras morre por causas naturais e parte da levedura separada deve sempre ser eliminada para impedir o acmulo de material em suspenso. A smior parte das destilarias utilizam a tcnica de centrifugao para a recuperao das leveduras. RECUPERAO DO ETANOL Conseguir uma concentrao alta de etanol ao final da fermentao um requerimento essencial para manter baixos os custos. A medida que aumenta a concentrao de etanol, se requer menos vapor para a destilao primria. Aps a fermentao, os substratos aucarados denominam-se vinhos, com uma constituio varivel, mas encerrando sempre substncia gasosas, slidas e lquidas. As primeiras representam-se principalmente pelo dixido de carbono, que se dissolve em pequena proporo no vinho. Os slidos se fazem presentes pelas clulas de leveduras, bactrias, sais minerais, acares infermentados e impurezas mecnicas em suspenso. Os lquidos mais importantes so a gua e o etanol, em percentagens que variam de 88-93%, a 12-7%, respectivamente nos vinhos comuns. Os lcoois amlico, isoamlico, proplico, butlico, isobutilico, aldedos, cidos, furfural, glicerina, steres e cidos orgnicos constituem outra parcela de lquidos de pequena importncia em relao ao volume, mas de grande efeito quanto a qualidade dos destilados, sobretudo no caso das aguardentes.
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Do vinho, separa-se o lcool, em grau de pureza e concentrao variveis, por destilao. Nessa operao, transforma-se a substncia mais voltil de um slido ou de um lquido em vapor, para, em seguida, condens-lo e resfri-lo de tal forma que se separe dos outros aos quais estava misturado e se recupere de forma lquida. Em relao maneira de se conduzir a destilao, classifica-se em intermitente e contnua. A primeira realiza-se em alambiques e poco usada para produo de etanol, restringindo-se a pequenas instalaes para produo de aguardente ou de lcool vnico. Toda a produo de lcool industrial realiza-se em sistema contnuo. As destilarias de aguardente que, para serem econmicas, devem produzir quantidades superiores a 2 mil litros por hora, tambm operam com aparelhos contnuos. Estabelece-se uma diferena entre as colunas de destilao para aguardentes e as para produo de flegma industrial, ou seja, o destilado que, a seguir, se submeter a nova destilao para purificao e concentrao. Este se obtm em colunas de alto grau. As aguardentes so misturas hidroalcolicas com uma percentagem de lcool em coluna ao redor de 50 GL com aroma e sabor (buqu) caractersticos que dependem das impurezas volteis, que acompanham o destilado e que fazem parte da frao lquida dos vinhos, juntamente com a gua e o etanol. Obtm-se em colunas de baixo grau. Ao considerar a relao de energia para fabricao de etanol, o custo da destilao o mais caro. As etapas de destilao convencional compreendem. a) Destilao primria coluna inicial para concentrar a 85% ou superior, com eliminao de impurezas como aldedos; b) Retificao para conseguir concentraes de 96,5%. Ao mesmo tempo podem ser eliminadas misturas de lcoois superiores por decantao em gua. c) Desidratao Para produo de combustvel com concentrao de 99,4% ou mais, utilizando benzeno ou ciclohexano. DESTILACO DESCONTNUA Quando se realiza uma destilao intermitente, faz-se uma carga no aparelho, esgota-se o vinho por aquecimento, separando-se os vapores por condensao e refrigerao, descarrega-se o resduo ou vinhaa, faz-se nova carga e assim por diante. Esse tipo de destilao realiza-se em alambiques simples de um s corpo ou em aparelhos de dois a trs corpos, nos quais se consegue recuperar calor pela condensao dos vapores destilados, por meio de resfriamento com o lquido que se destilar em uma prxima carga. Quando se executa uma destilao descontinua, realiza-se uma destilao simples vaporizando-se primeiro as substncias mais volteis do que a gua e o lcool. O primeiro destilado e uma mistura de gua, lcool, bases volteis, aldedos, cidos e chamase, na prtica, destilado de cabea. Depois de sua separao, os vapores do vinho so mais ricos em etanol, com menor quantidade de impurezas volteis, e chamam-se destilado de corao. Finalmente, quando j quase se esgotou o etanol do vinho, passam vapores mais impuros, que se constituem de etanol, gua e impurezas menos volteis, como o lcoois superiores. o destilado de s cauda. O destilado que se recolhe como produto final da destilao constitui-se de uma mistura de
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produtos de cabea, de corao e de cauda, ou apenas de corao, separando-se produtos de cabea e de cauda em propores de 10 a 20% do total, conforme o destino que ter. DESTILACO CONTNUA Realiza-se em colunas de destilao fazendo-se a alimentao continua do aparelho com vinho, retirando-se continuamente a vinhaa na base e o destilado no topo. A separao dos componentes secundrios, que se constituem de todas as substncias que no etanol, faz-se pelo topo do aparelho, pela base ou lateralmente em alturas determinadas segundo a natureza das impurezas. As colunas de destilao constituem-se de gomos cilndricos superpostos, contendo sees transversais as quais se d o nome de bandejas ou pratos. Os gomos e as bandejas superpostos, formam como que uma srie de aparelhos de destilao simples, um destilando os seus vapores no outro, atravs de calotas, e recebendo liquido residual do imediatamente superior, atravs de tubos que se denominam sifes. O aquecimento das colunas faz-se na base, por meio de vapor dgua, por injeo, por serpentina ou por trocadores de calor, segundo a riqueza do liquido no interior ou a natureza da operao. O aquecimento das bandejas faz-se pelo calor dos vapores que ascendem na coluna. Os vapores emitidos por uma mistura de etanol-gua so mais ricos do que o lquido gerador. Esses vapores condensando-se no prato imediatamente superior, enriquecem o liquido a existente e aquecem-no ebulio, gerando vapores mais ricos, e assim por diante. A temperatura na coluna decresce da base para o topo, ao mesmo tempo em que o teor alcolico aumenta da base para o topo do aparelho. Os vapores que saem na parte superior da coluna dirigem-se para o condensador, onde passam para a fase lquida. Desse lquido, retorna-se uma parte cabea da coluna e envia-se o restante a um refrigerador e, da, para fora do circuito. A retrogradao, ou refluxo auxilia a manuteno de vapores ricos na cabea da coluna. Se se faz a alimentao da coluna de destilao pelo topo, os vapores que ali se emitem no so muito concentrados e a coluna chama-se de baixo grau. Se a alimentao faz-se pela altura mdia do aparelho, divide-se a coluna em dois troncos: um de esgotamento, abaixo da alimentao e outro de concentrao, acima da alimentao. A coluna chama-se de alto grau, os vapores so mais ricos em etanol, e geralmente mais puros. Numa coluna de destilao, a graduao alcolica maior ou menor obtm-se em funo do nmero de pratos superpostos. Um nmero maior eleva mais a graduao alcolica dos vapores. Numa coluna de baixo grau, emitem-se vapores de graduao alcolica relativamente baixa e, normalmente, recolhem-se depois de condensados, sob a forma de mistura com as impurezas volteis de cabea. As impurezas de cauda eliminam-se parcialmente na vinhaa, pela base. Nas colunas de alto grau, normalmente se retiram os produtos de cabea do condensador deflegmador e o destilado, ou flegma, parcialmente purificado, retira-se lateralmente, do tronco de concentrao. As impurezas de cauda eliminam-se parcialmente nas vinhaas.
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RETIFICAO Da destilao dos vinhos, obtm-se o flegma, que um lquido alcolico mais rico do que o lquido que o originou, mas em estado impuro. A retificao a operao pela qual separa-se o lcool das impurezas que o acompanham no flegma. Freqentemente confunde-se retificao com concentrao porque, durante a retificao, normalmente trabalha-se com flegma de concentrao relativamente baixa que, durante a operao, aumenta a graduao alcolica at o mximo, ao mesmo tempo em que se purifica. As impurezas volteis constituem-se daquelas substncias que, embora em pequena proporo percentual, causam grande efeito, comunicando caractersticas tais que o lcool no se presta fabricao de licores, perfumes e outros usos industriais. As substncias impurificantes tm ponto de ebulio mais alto ou mais baixo que o do etanol e, segundo essa caracterstica, separam-se como produtos de cabea ou de cauda. O ponto de ebulio no , entretanto, condio suficiente para a separao por destilao fracionada porque se formam, nos aparelhos de destilao, misturas azeotrpicas c a gua e o etanol e entre as prprias om impurezas, de forma que produtos de ponto de ebulio mais alto podem vir a se constituir em produtos de cabea. Segundo alguns autores, a separao das impurezas depende da solubilidade no lcool concentrado e quente, produzindo-se maior quantidade de impurezas no destilado quando a impureza pouco solvel. A solubilidade ser maior quanto menor for a concentrao de etanol. Considera-se uma impureza de cabea ou de cauda, relacionando o coeficiente de solubilidade da substncia percentagem de lcool puro no lquido ou nos vapores. Assim sendo, quando a impureza existir em proporo superior a um em relao ao lcool absoluto (100% de etanol), na mistura, ser de cabea; se inferior unidade, ser de cauda e, quando for ora superior e ora inferior, ser ora de cabea e ora de cauda. No se consegue fazer purificao completa do lcool pela retificao. DESIDRATAO DO ETANOL No se pode, pela destilao, obter lcool etlico com concentrao superior a 97,2% em volume porque, nessa concentrao, a mistura de etanol e gua azeotrpica. Os processos industriais para desidratao classificam-se em qumicos e fsicos. Os primeiros baseiam-se no emprego de substncias qumicas como xido de clcio, acetato de s dio, carbonato de potssio e outros, que so capazes de absorver a gua do etanol retificado na fase lquido ou vapor. Os processos fsicos baseiam-se na variao da presso, destilao de mistura hiperazeotrpica, obtida por processos qumicos, absoro de vapores usando corpos slidos, destilao em presena de um terceiro corpo (benzeno, cloreto de butila, tricloroetileno) e uso de absorventes regenerveis (glicerina, soluo de carbonato de potssio em glicerina), que fracionam a mistura azeotrpica por absoro de lcool ou de gua.
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Separao dos produtos de fermentao
SEPARAO DOS PRODUTOS DE FERMENTAO
INTRODUO medida que o processo fermentativo se desenvolve, o produto de assimilao ou de desassimilao vai se formando ou se acumulando. Seu acmulo raramente se d na fase lag, comeando, normalmente, na fase logartmica, podendo, entretanto, coincidir com a fase estacionria ou mesmo de declnio. Em qualquer dos casos, teoricamente, h uma curva correspondente ao aparecimento do produto, seu acrscimo at um mximo e posterior declnio. O industrial no pode se ater exclusivamente ao rendimento mximo. Dever estar atento para o mximo de produo econmica, que, nem sempre, o mximo de produo tcnica. Atingir esse mximo, ou ultrapasslo, pode acarretar dificuldades na recuperao do produto, alm de causar uma alta do custo industrial, com o aumento do tempo da fermentao. Esse aumento concorre para o uso mais prolongado dos recipientes de fermentao com maiores gastos de energia, de aerao, de nutrientes, de antiespumante, de mo-de-obra e outros, podendo ser mais elevados que a receita do produto, quando recuperado em um estgio menos avanado, embora com menos rendimento industrial. Quando as clulas param de se reproduzir ou quando as clulas no tm mais material a metabolizar no substrato, pode haver a autlise, ou iniciar-se a respirao, resultando em mudana de atividades do meio. Num meio de fermentao alcolica, as clulas autolisadas fornecem aminocidos que se transformam em lcoois superiores. Essa transformao pode ser desejvel em indstrias de bebidas destiladas, mas prejudicial para a indstria de lcool industrial. Na recuperao da penicilina, os agentes fermentadores devem ser rapidamente separados do substrato por filtrao e o material retido nos filtros deve ser lavado tambm rapidamente. H um ponto crtico, para essa separao, que, ultrapassado, dificulta a separao devido ao aparecimento de uma camada viscosa, que dificulta a filtrao e a lavagem. As perdas se do por dificuldade da operao e por decomposio do produto. Nas fermentaes de vinagre, o contacto muito prolongado com o meio fermentado pode levar o agente de fermentao a oxidar totalmente o cido actico a CO2 e H2 O, diminuindo o rendimento. Nos processos fermentativos em que a remoo da espuma necessria, esse nico cuidado poder colaborar para o aumento da produo. H antiespumantes que no so metabolizados, como os silicones, tensoativos muito eficientes, usados em pequenas quantidades. Outros, so dispersos em leos animais ou vegetais e podem ser metabolizados, interferindo na produo. O momento e o espaamento entre as aplicaes so importantes. Geralmente, deve-se evitar a adio nos momentos finais da fermentao, para que o microrganismo seja capaz de remover a causa de interferncia na produo, que poder tambm influir no processo de recuperao. Atingindo-se o mximo de rendimento comercial, com a observao dos cuidados especficos para cada processo fermentativo, inicia-se a separao do produto do substrato fermentado, para apresent-lo da forma mais pura possvel, ao tipo particular de consumo a que se destina. Cada processo fermentativo tem uma forma de recuperao. Para facilitar, agrupamos em processos desenvolvidos por leveduras, fungos, bactrias e actinomicetes.
UNIDADES OPERACIONAIS Para a recuperao dos produtos de fermentao, esto envolvidas operaes que se enquadram em alguns casos gerais como filtrao, centrifugao, adsoro, extrao por solventes, precipitao e sedimentao, cristalizao, destilao, evaporao e secagem. FILTRAO E a operao pela qual se separam as partculas suspensas em um fluido que se desloca em um meio poroso, como conseqncia de uma diferena de presso. O meio poroso, que o meio filtrante, retm as partculas, que vo se acumulando e formando camadas porosas superpostas, que constituem o que se denomina de torta. Com a continua deposio de material slido, embora os extratos da torta sejam porosos, estabelece-se um decrscimo progressivo do fluxo, chegando a interromper-se. Para compensar o decrscimo do fluxo, lana-se mo de artifcios como o aumento da diferena de presso e a remoo da torta. H uma grande variedade de filtros, que se classificam de acordo com a presso que provoca a filtrao. Quando se trata de suspenses de clulas, de miclio principalmente, as tortas so compressveis. Nesse caso, h convenincia em se utilizarem os filtros a vcuo, sobretudo os rotativos, cuja rea de filtrao ampla e oferece as vantagens das lavagens concomitantes e a remoo continua da torta esgotada. H necessidade de se adaptar cada meio ao processo de filtrao, por adio de coagulantes, modificao do pH, adio de auxiliares de filtrao e aquecimento da massa miceliar, dependendo do microrganismo usado e das condies da fermentao. No caso de penicilina, o miclio compressvel, mas nas filtraes de estreptomicina, a massa celular mais compressvel ainda, sendo necessrio adicionar um auxiliar de filtrao e, ainda, recobrir o tambor com uma torta desse auxiliar de filtrao, antes de receber o miclio, para se evitar a colmatao total do leito filtrante. Renova-se a torta do auxiliar de filtrao a cada revoluo do tambor. Nos filtros rotativos a vcuo, h geralmente uma diviso de setores no tambor, com diferentes intensidades de vcuo para propiciar a reteno do substrato a filtrar sobre o meio filtrante, para lavar a torta, para esgot-la depois da lavagem e para permitir que ela seja eliminada da superfcie filtrante. Os produtos cristalinos que se obtm por tratamento dos meios de fermentao normalmente facilitam a filtrao e no so compressveis, o que permite que se usem altas presses. Nesse caso, usam-se filtros centrfugos, com possibilidade de se usarem diferenas de presso equivalentes a centenas de vezes a fora da gravidade. A lavagem das tortas realizada com mnimas pores de gua, diluindo-se pouco os licores-me, o que uma vantagem no caso de recuperao secundria. SEDIMENTAO Consiste em separar um fuido claro, lmpido, brilhante, de uma suspenso. Pode ser continua l ou descontnua, mas, em geral, quando se trata de lquidos oriundos de fermentao, a sedimentao descontinua. Ela importante fator no preparo dos vinhos e cervejas. Pela prpria natureza desses produtos, a decantao dos slidos feita de forma descontnua e muito lentamente. O processo leva meses para o caso da purificao dos vinhos. Como em qualquer outra sedimentao descontinua, mantm-se esses substratos fermentados em ambientes onde no haja alteraes importantes de
temperatura que possam criar movimentos do fluido por meio de conveco, o que ir causar dificuldade de deposio das partculas em suspenso. Nos mostos fermentados de uvas, a deposio se d rapidamente nos p rimeiros dias, aps o trmino da fermentao, mas o lquido sobrenadante ainda no claro. Elimina-se o sedimento e abandona-se o material ao repouso, para que se forme um novo sedimento de partculas menores. Todas as vezes que se forma um sedimento compacto, este eliminado, at que no haja mais o que depositar. Se no h mais depsitos e o lquido ainda est turvo, faz-se um tratamento pelo calor ou pelo frio, para provocar a aglutinao das partculas que iro se sedimentar, ou lana-se mo de auxiliares de decantao, que envolvem as partculas, dando-lhes as condies necessrias para vencerem a viscosidade do meio, aumentarem a velocidade de sedimentao e se depositarem no fundo. CENTRIFUGAO E uma operao na qual se aplica a fora centrfuga para separar slidos e fluidos de diferentes densidades. Usa-se sempre que h necessidade de aplicar foras superiores da gravidade, que atua nas sedimentaes ou nas filtraes. A fora centrfuga conseguida em equipamentos capazes de fazer o material descrever uma trajetria curva. Os primeiros equipamentos centrfugos foram os filtros centrfugos, que no so mais do que cestas perfuradas para separar slidos de lquidos. Faz-se a centrifugao de forma contnua ou descontnua. Esta se realiza em cestas, perfuradas ou no, que giram comumente sobre um eixo vertical. H centrifugas descontinuas, automticas, verticais. As centrifugas que separam as clulas de levedura para purificao ou para produo de protena alimentar so do tipo contnuo com rotor vertical de discos. A centrfuga consta de uma base, sobre a qual se assenta o conjunto de discos que recebe movimento de um motor eltrico atravs de transmisso por meio de correias trapezoidais. Os discos, de forma cnica e de dimetro aproximado de 300 mm, empilham-se sobre um suporte vertical que se assenta numa base provida de perfuraes com boquilhas tangenciais e que gira sobre um eixo vertical. A montagem fecha-se com uma tampa rosqueada, formando um conjunto rgido. A alimentao feita pela parte superior do suporte, dirigindo-se para a base por uma tubulao central. Durante o percurso, recebe a acelerao centrifuga. O material mais denso, que se constitui de clulas e de substrato, passa para o exterior, pelas boquilhas, e o lquido m enos denso flui para cima, no espao entre os discos, e sai pela parte central. O lquido flui por cima dos discos e o material slido, no caso as clulas, separam-se na parte inferior dos discos e saem pelas perfuraes da base. Em ltima anlise, sobre cada disco, onde flui uma camada delgada de substrato, d-se uma sedimentao de pequena espessura separando o liquido denso, rico em clulas, na parte inferior, do lquido isento de clulas, na parte superior. EXTRAO POR SOLVENTES a transferncia de uma substncia dissolvida de um solvente para outro no qual sua solubilidade maior, observando-se que a miscibilidade entre os dois solventes seja mnima ou
inexistente. A operao bsica a extrao lquido-lquido, a qual s se efetua se houver um contacto muito estreito entre a soluo e o solvente e se houver uma perfeita separao das fases. Aplica-se a extrao por solventes para separar slidos solveis que estejam em mistura com substncias insolveis, para separar componentes pouco volteis de uma mistura, para separar substncias de mesma volatilidade de uma mesma soluo ou quando esto mutuamente dissolvidos, para separar substncias instveis em uma destilao fracionada, para separar substncias pouco volteis existentes em uma soluo em concentrao mnima. A extrao por solventes feita continuamente ou de forma intermitente. Neste ltimo caso, adiciona-se o solvente em um tanque contendo a soluo a extrair, agita-se e deixa-se em repouso para decantar. A extrao continua feita associando-se um recipiente de decantao ao misturador. A operao continua em multiestgio mais eficiente, sendo feita em contracorrente ou com refluxos do material extrado. Enquanto que, normalmente, a extrao lquido-liquido feita em colunas verticais, com circulao descendente da fase mais densa e fluxo ascendente da fase menos densa, a separao do solvente na recuperao de penicilina feita em separadoras centrfugas especialmente projetadas para lquidos de diferentes densidades. Faz-se a separao da mesma forma, porm os lquidos so eliminados pela parte superior da centrifuga: o mais denso na periferia e o de menor densidade na parte central. ADSORO A adsoro uma operao bsica que se realiza pelo contacto de um slido com um fluido, resultando na alterao da composio do fluido pela deposio de alguns componentes na superfcie do slido. A adsoro um fenmeno complexo que se manifesta de diferentes maneiras. A adsoro fsica caracteriza-se pela condensao de gases sobre os slidos em temperaturas acima do ponto de orvalho. A adsoro qumica estabelecida por ligao qumica definida entre os tomos ou molculas da substncia depositada e as molculas da superfcie do slido. A adsoro por troca inica processa-se pelo intercmbio de ons entre a superfcie adsorvente e o material depositado. Para que se possa empregar a adsoro, necessrio que haja contato ntimo entre as fases fluida e slida, que a parte no adsorvida do fluido se separe facilmente do adsorvente e que se possa regenerar o adsorvente por eliminao do adsorvido. A adsoro realizada pela passagem do fluido atravs de um leito estacionrio de adsorvente. A regenerao do adsorvente faz-se de acordo com a natureza do material adsorvido, por diferena de presso, vapor, solues qumicas e aumento de temperatura. Geralmente, submetem-se as solues extradas de penicilina a um tratamento com carvo para descorar, usando-se o mtodo de contacto disperso em estgio simples, acondicionando o carvo em um tanque, agitando e filtrando-se em seguida. CRISTALIZAO Pela cristalizao, obtm-se a penicilina em estado de pureza, estvel e mais potente que por processos de evaporao. A cristalizao pode substituir a liofilizao. A cristalizao uma operao bsica importante na obteno de produtos puros, pois os cristais separados de uma soluo
tm uma composio determinada, geralmente de elevada pureza. As impurezas que acompanham os cristais so levadas da superfcie ou separadas por outros mtodos, como a redissoluo e recristalizao. Para conseguir-se a cristalizao de uma substncia, concentra-se a soluo que a contm at um ponto de supersaturao, a partir do qual aparecem os primeiros ncleos, que depois crescem, esgotando o meio. Industrialmente, procede-se recuperao da penicilina por cristalizao concentrando-se a soluo at a supersaturao e adicionando-se uma semente, ou seja, juntando-se uma quantidade de penicilina soluo. Os cristais que se adicionam funcionam como ncleos de cristalizao que iro crescer pela migrao do antibitico do meio para a superficie dos cristais adicionados. A cristalizao de sulfato de di-hidroestreptomicina consegue-se sob agitao e com adio de metanol soluo aquosa, durante perodo prolongado, evitando-se as superconcentraes localizadas. DESTILAO A destilao a separao de componentes de uma mistura pela vaporizao parcial da mistura e pela recuperao dos vapores por meio de condensao. Uma destilao fracionada feita por uma srie de destilaes e condensaes na mesma coluna, ou em colunas separadas, obtendo-se condensados enriquecidos com o material que se desejou separar. uma operao de extrao vapor-lquido. Emprega-se a destilao e a destilao fracionada na recuperao do etanol e na recuperao de solventes, como o caso de acetona-butanol-etanol, etanol-acetona, acetona-isopropanol e etanolbutanol. Em todos os casos, trata-se de extrair, de um lquido de composio complexa, seus componentes mais volteis, em grau de pureza de acordo com o emprego. A destilao, como operao bsica, pode-se classificar em destilao simples e destilao com refluxo ou condensao parcial. H quem prefira cham-los de destilao simples ou peridica e destilao metdica ou sistemtica. Em relao maneira de conduzir a operao, classifica-se em destilao intermitente e em destilao continua. Em qualquer dos casos, a destilao pode ser conduzida presso atmosfrica ou a presso reduzida. A destilao simples a operao mediante a qual se submete o substrato fermentado a ao do calor, obtendo-se vapores que so diretamente recolhidos, condensados e retirados para fora do aparelho. A destilao continua at se exaurirem completamente do lquido os componentes mais volteis. No caso do etanol, quanto mais destilado se recolher, menor ser a concentrao do componente mais voltil, devido ao arraste de gua junto com os vapores. Na destilao com refluxo, h uma condensao parcial dos vapores de componentes mais volteis nas paredes em contacto com a atmosfera e o retorno ao substrato em aquecimento. Esse retorno toma o nome de refluxo, retrogradao ou deflegmao. Os aparelhos de destilao industriais possuem dispositivos para intensificar essa deflegmao. Nos deflegmadores, onde a condensao parcial efetuada em caixas tubulares, paredes de gua e tubulaes, controla-se voluntariamente a retrogradao. A destilao descontnua executada por meio de cargas em aparelhos providos de uma caldeira e um dispositivo de concentrao provido bandejas perfuradas ou de borbulhamento. Os
vapores concentrados encaminham-se para um condensador de refluxo, de onde uma parte retorna caldeira e outra segue para um refrigerador e dai para a proveta. A destilao continua difere da precedente pela contnua alimentao do aparelho de fracionamento com o liquido alcolico fermentado, com ininterrupta separao do produto puro e eliminao constante de substncias impurificantes como subprodutos, e a eliminao contnua de um resduo. Para a obteno de aguardentes com concentrao alcolica ao redor de 50% de etanol em volume, a destilao processa-se em apenas uma coluna sem tronco de concentrao, sem deflegmao e sem eliminao de impurezas, as quais comunicam ao destilado seu aroma e paladar caractersticos. Somente em casos especiais se faz a retificao de aguardentes. Para a obteno de etanol industrial com concentrao ao redor de 96-97C de lcool em volume, isento de impurezas, fraciona-se o destilado em lcool de primeira e lcool de segunda, separando-se os lcoois superiores como subproduto e os outros componentes secundrios (aldedos, bases volteis, steres e cidos). A purificao do etanol, denominada retificao, industrialmente processada de forma continua, por destilaes sucessivas em vrias colunas, denominadas colunas depuradora, destiladora, retificadora e de repasse final. Na primeira, o substrato fermentado sofre aquecimento em uma coluna com um nmero de bandejas suficiente para produzir, no topo, mistura de vapores de baixo ponto de ebulio, que eliminada aps a condensao e o resfriamento. Na segunda, esgotase o substrato, retirando-se o etanol na cabea da coluna sob a forma de um destilado com uma concentrao ao redor de 50% de lcool em volume. Na base da coluna, escoa-se o substrato isento de lcool. Na terceira coluna, concentra-se o lcool e separam-se os lcoois superiores, de ponto de ebulio mais elevado que o etanol, na base da coluna. No topo, obtm-se uma mistura de vapores de ponto de ebulio menor, ao mesmo tempo que se retira o etanol de alta concentrao. Envia-se este quarta coluna, onde se separam mais impurezas, de ponto de ebulio inferior ao do etanol. Em algumas instalaes, substitui-se essa quarta coluna por um tronco, no topo da coluna retificadora, com apenas alguns pratos. Ao final dessas destilaes, obtm-se uma mistura binria de etanol e gua que, no mximo, pode conter 97,2% de etanol em volume. A mistura binria nessa proporo azeotrpica. A concentrao do etanol a nveis superiores pode ser realizada, na indstria, por meio de tcnicas que absorvem gua ou deslocam o ponto azeotrpico. Quando dois lquidos so mutuamente miscveis, os vapores emitidos por um dos dois sofre a ao dissolvente do outro, e h uma alterao nas respectivas tenses parciais. Na destilao, produzem-se vapores mais ricos do que o lquido gerador. No caso de uma mistura ideal de dois lquidos, os vapores emitidos so mais ricos do que o lquido gerador, no componente mais voltil. Para uma dada presso, verifica-se que, variando a composio do lquido, varia o ponto de ebulio, aumentando gradualmente da temperatura do lquido mais voltil para a dos menos voltil, sem passar por mximos ou por mnimos. Se, nas mesmas condies, o ponto de ebulio do lquido passa por um mximo ou por um mnimo, os vapores que se formam nessa temperatura so saturados e de composio constante. E o
fenmeno de azeotropismo. Em concentraes superiores mistura azeotrpica, obtm-se, da mistura binria etanol-gua, vapores mais pobres do que o lquido gerador. A desidratao feita pela incorporao, mistura azeotrpica, de substncias desidratadoras, como o glicerol, ou pela adio de substncias arrastadoras, como o benzol ou o tricloroetileno. Elas formam misturas azeotrpicas binrias, com a gua, ou ternrias, com etanol e gua, de ponto de ebulio inferior ao da mistura azeotrpica etanol-gua, podendo ser separadas nas colunas de destilao. Obtm-se o etanol com concentraes acima de 99,5% em volume e recuperam-se o desidratante ou os arrastadores. Os solventes so recuperados tambm por destilao dos substratos fermentados, comumente obtidos na indstria com 2,2% de acetona em peso. O equipamento para recuperar acetona, butanol e etanol consta de um conjunto de colunas de destilao com condensadores, deflegmadores e demais acessrios. Nele se obtm, primeiro, um destilado impuro, que encaminhado para uma coluna, para separao da acetona, depois para outra coluna, para separao de etanol e, finalmente, para uma quarta coluna, onde se recupera o butanol. Na seqncia de operaes para obteno da acetona e do butanol, recupera-se o etanol, metiletilcetona e isopropanol como subprodutos em misturas azeotrpicas e, tambm, lcoois superiores e aldedos, que se separam, como nas colunas de retificao de etanol. EVAPORAO E uma operao que tem por fim concentrar uma soluo eliminando parte do liquido por ao do calor. Comumente o aquecimento feito indiretamente, por meio de vapor expandido em uma caixa tubular. A concentrao dos lquidos fermentados para recuperao dos produtos de fermentao feita principalmente em evaporadores de tubos compridos verticais, de 3,5 a 6 m, de pequeno dimetro, fechados em uma caixa e ligados a uma cmara de vapores. Esta, por sua vez, liga-se a um condensador baromtrico e a um gerador de vcuo, que pode ser ejetor, condensador multijato ou bomba de vcuo. O aquecimento feito por vapor de gua que se condensa por fora dos tubos. O lquido movimenta-se no interior dos tubos por meio de conveco natural, circulando de baixo para cima e chocando-se com um anteparo que facilita a separao das fases liquida e vapor, alm de quebrar as espumas. SECAGEM Normalmente se chama de secagem a evaporao de gua contida num material, sendo o vapor de gua arrastado por uma corrente de ar ou gases inertes. Usa-se amplamente a secagem na recuperao dos produtos de fermentao, ligando-se principalmente s operaes de acabamento. Durante a secagem, h uma transferncia simultnea de calor e de matria. Ao contrrio da evaporao, a quantidade de gua eliminada pequena em relao ao teor de slidos do material. Os aparelhos empregados na indstria so agrupados nos seguintes tipos: secadores de armrio, rotativos, por pulverizao ou atomizao, a vcuo e de tambor. A liofilizao um processo especial de secagem.
SEPARAO DOS PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM LEVEDURAS 1. Levedura de panificao As leveduras de panificao so o produto da fermentao de substratos aucarados por Saccharomyces cerevisae, em condies especiais de concentrao, nutrientes e aerao, visando proliferao de clulas. Estas so, posteriormente, separadas do substrato por centrifugao. Dessa centrifugao, obtm-se clulas acompanhadas por uma certa quantidade de substrato, que se elimina por meio de lavagens com gua e centrifugaes. Geralmente as separaes e lavagens se fazem em trs centrifugaes sucessivas, procedendo-se, alm da separao e purificao das clulas, concentrao do material obtido. Este, cuja denominao industrial leite ou creme de leveduras, refrigera-se, a seguir a 8-9 C e conduz-se para filtros-prensa ou rotativos a vcuo, de onde se obtm uma torta de leveduras, muito clara, com aproximadamente 31% de slidos. A umidade extracelular da ordem de 15 %. Essa torta misturada depois com gua, em misturadores semelhantes s amassadeiras de panificadoras, reduzindo-se a concentrao para 25% de slidos. Pode-se adicionar, ainda, plasticizantes, para facilitar a formao dos blocos prensados. Usa-se lecitina, leos vegetais, steres de cidos graxos, que melhoram a aparncia. Da encaminha-se a massa de clulas para mquinas empacotadoras, onde se prensam e se embalam os blocos compactos de clulas de levedura com peso pr-fixado, sem contacto manual. A levedura prensada sob refrigerao conserva-se estvel por um perodo prolongado, mas invivel para regies onde h falta de recursos para armazenamento baixa temperatura. Nesses locais, emprega-se a levedura ativa seca que se obtm a partir das tortas dos filtros, dispersando-a e secando-a sob a forma de grnulos. A secagem feita sob condies especiais, de forma a no prejudicar a integridade fsica e a atividade fisiolgica e enzimtica. O teor de umidade timo de 8% sendo que a 5-6 %, reduz-se atividade da levedura e a 10% no se conserva bem. 2. Levedura alimentar E a levedura produzida para fins de alimentao. Rica em protena e em vitaminas do complexo B, preparada, principalmente para alimentao animal, fermentando-se substratos de resduos por leveduras do gnero Candida ou retirando-se dos meios de fermentao alcolica uma parte de leveduras do gnero Saccharomyces. As leveduras alimentares so leveduras secas, inativas, mortas, sendo irrisria a utilizao de leveduras frescas para esse fim. Sua recuperao de um ou de outro substrato semelhante ao que se descreveu para a levedura de panificao, sem os cuidados de assepsia normalmente utilizados para a produo de levedura de panificao, sobretudo quando se trata da recuperao de parte das leveduras j usadas na fermentao alcolica. Nas indstrias de lcool, obtm-se o leite de levedura geralmente por uma ou duas separaes, e a seguir envia-se para um secador de tambores rotativos. A, presso normal e temperatura de 100 C, ou mais elevadas, seca-se, sob a forma de uma pelcula que, depois de moda, se procede embalagem em sacos de papel.
3. Etanol E produzido industrialmente pela fermentao de sucos aucarados por leveduras das espcies Saccharomyces cerevisiae, S. ellipsoideus e S. uvarum. Pode-se considerar a recuperao do etanol sob diversos aspectos: utilizao direta dos substratos fermentados, recuperao do etanol parcialmente concentrado e parcialmente purificado, concentrado e purificado, e desidratado. Quando se trata da utilizao do etanol conjuntamente com o substrato que sofreu a fermentao alcolica, portanto sem acares, temos a distinguir os substratos originrios de frutas e os originrios de gros. No primeiro caso, o principal representante o vinho de uva, resultante de fermentao de uvas ou do suco de uvas, por leveduras alcolicas. No segundo, o representante mais importante a cerveja, que o resultado da fermentao de gros, sobretudo de cevada. Em ambos os casos, o substrato ou mosto fermentado sofre uma srie de tratamentos com vistas a sua purificao e obteno de um lquido cristalino, transparente e brilhante. Tratamentos pelo frio, pelo calor e adio de agentes de clarificao provocam a deposio das substncias em suspenso. A recuperao do etanol, no caso, feita por sedimentao do substrato fermentado, que se separa em lquido decantado claro contendo de 3 a 6% de lcool em volume nas cervejas e de 10 a 18% nos vinhos. As bebidas destiladas so os lcoois parcialmente concentrados e parcialmente purificados. So obtidos submetendo-se os substratos fermentados a uma destilao pela qual se separa o etanol juntamente com a gua e alguns produtos volteis como lcoois superiores, aldedos, steres e cidos. As bebidas alcolicas tm uma concentrao de etanol que oscila entre 38 e 54% em volume, e um teor de componentes volteis secundrios que varia de acordo com a tcnica de destilao. A apresentao comercial das bebidas varia de acordo com os processos de acabamento do produto, mas a recuperao do etanol depende s de uma operao, a destilao, que se faz em alambiques ou em colunas contnuas de bandejas superpostas e de borbulhamento. Os lcoois industriais so o resultado de destilao fracionada, procedendo-se primeiro obteno de um lcool parcialmente concentrado e parcialmente purificado, por destilao do substrato fermentado. A seguir, procede-se redestilao, para obter-se um lquido alcolico com, no mnimo, 96% de etanol em volume e um teor mnimo de impurezas volteis que so eliminadas no decorrer da operao denominada retificao. O lcool assim obtido, denominado lcool retificado, com um teor mnimo de 96% em volume, tem um emprego amplo, sendo usado em fabricao de bebidas, explosivos, perfumes, borracha sinttica, medicamentos, como solvente, como combustvel, como anti-sptico e em muitos outros campos. Essas operaes se realizam em colunas continuas de bandejas superpostas e de borbulhamento. Para ser usado como combustvel, o etanol deve ter concentrao mais elevada e essa concentrao s se obtm por um tratamento especial de desidratao. A destilao fracionada no mais suficiente porque a 97,2% de lcool em volume forma-se uma mistura azeotrpica binria lcool-gua. A desidratao faz-se necessria e realiza-se industrialmente por emprego de substncia desidratante ou por deslocamento do ponto azeotrpico. No Brasil, as tcnicas mais usadas so os usos do glicerol como substncia desidratante, e da mistura de benzol para deslocar o ponto
azeotrpico. Em um ou em outro caso, recupera-se o auxiliar de desidratao, que volta a ser usado, com um mnimo de perda. 4. lcoois poli-hidricos Entre eles o glicerol o mais importante e h vrias tcnicas para sua recuperao. Em resumo, centrifugam-se os resduos ou os substratos fermentados, para se eliminarem os microrganismos, procede-se a uma concentrao at um mximo de 40 % de gua, adiciona-se hidrxido de metal alcalino terroso em ligeiro excesso e, em seguida, adiciona-se soluo alcolica miscvel com gua, causando-se a precipitao da maior parte das impurezas. Decanta-se e destilase, eliminando-se o solvente e recolhendo-se o glicerol bruto. Novas lavagens, concentrao, mistura com C6 H5 NH2 , evaporao a 100-145 C, separao por decantao, lavagem e nova concentrao, propiciam a obteno do glicerol com alta percentagem de pureza. PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM FUNGOS 1. Riboflavina Leveduras e bactrias so capazes de sintetizar a riboflavina ou vitamina B2, mas, industrialmente, os fungos so mais usados, sobretudo as espcies Ashbya gossypii e Eremothecium ashbyii. Usa-se a riboflavina diretamente com o substrato, sob a forma de concentrado vitamnico, ou isolada do meio fermentado. No primeiro caso, envia-se o substrato fermentado, com 0,5 a 0,6 g de riboflavina por litro, para um concentrador a vcuo, onde se faz a eliminao de gua at consistncia de xarope e, dai, leva-se para um secador de tambor, onde se obtm um concentrado com 2,5% de vitamina B2. As tcnicas de isolamento da riboflavina do meio fermentado envolvem a extrao por meio de solventes, por precipitao e sedimentao, por adsoro e pela reduo da solubilidade por agentes qumicos ou por meio de bactrias. Em linhas gerais, filtra-se a soluo contendo riboflavina, ajusta-se o pH a 5,0-5,5 com cido sulfrico, adiciona-se um agente redutor temperatura de 25-30 C. Os agentes redutores mais comuns so tiossulfato de sdio, cloreto de estanho, cloreto de cromo, sulfato de cromo e cloreto de titnio. Com essa tcnica, precipita-se o precursor da riboflavina, decanta-se e filtra-se com auxiliar de filtrao. A extrao feita sobre o filtrado, com lcool isopropilico a 75%. 2. cido glucnico Industrialmente, usam-se culturas de Aspergilius niger. Sua recuperao faz-se sob a forma de gluconato de clcio, procedendo-se separao do miclio por filtrao e, a seguir, a neutralizao do filtrado com leite de cal. Faz-se a separao dos cristais por centrifugao, enviando-se o licor-me para um concentrador a vcuo onde a temperatura 3. cido ctrico produzido por culturas selecionadas de Aspergilius niger. Sua recuperao feita separando-se o miclio por filtrao e lavagem. A soluo que se obtm, com 2,5 a 3,5% de cido ctrico, impurificada com acares, substncias pcticas, colides e pigmento amarelo, purifica-se
procedendo-se precipitao de sal clcico do cido ctrico, lavagem e posterior regenerao do cido por tratamento com cido sulfrico. Submete-se a soluo obtida a uma concentrao a vcuo, para elev-la de 15 a 60% de slidos, e passa-se purificao, para a eliminao de impurezas minerais, orgnicas e de pigmentos. A purificao feita pelo tratamento com carvo ativo, sulfato de brio e ferrocianeto de potssio, mantendo-se uma acidez no meio ao nvel de 0,200 em cido sulfrico para conservar as impurezas em suspenso.. Faz-se depois uma filtrao para se obter um xarope incolor com 58% de cido ctrico, que recuperado por cristalizao e centrifugao. Os cristais com 99,5% de pureza so enviados a um secador a vcuo e o licor retorna ao processo. 4. Enzimas Dos vrios fungos ensaiados para preparao industrial de enzimas, o Aspergillus niger o mais utilizado. A enzima produzida em maior escala a -amilase, cuja separao do substrato feita separando-se o miclio, por filtrao, concentrando-se o filtrado quatro vezes em evaporador a vcuo, ajustando-se o pH a 7,5-8,5, e precipitando-se a enzima com 1,6 a 2,3 volumes de lcool isopropilico por volume de filtrado concentrado. Separa-se por centrifugao ou filtrao e seca-se o precipitado obtido. 4. Penicilina Os agentes de fermentao so, geralmente, Peniclilium notatum e P. Chrysogenum. Separase o miclio por filtrao e aps faz-se uma srie de extraes por solventes. H tambm um processo de recuperao de penicilina por adsoro em carvo, porm, o processo por solventes mais usado. Para reduzir as perdas durante a filtrao e lavagem, ajusta-se o pH ou adiciona-se um auxiliar de filtrao, que coagula o material em suspenso e contribui para diminuir o arraste da protena. O teor de penicilina no meio da ordem de 0,5 a 1,5 %. Aps a filtrao, o lquido submetido a uma extrao com acetato de butila acidificado, que dissolve o antibitico. Em uma segunda extrao, o solvente orgnico contendo o antibitico tratado com gua e lcali. Nessas novas condies, o cido penicilinico dissolve-se na fase aquosa, que , ento, separada do solvente orgnico. A soluo aquosa obtida submetida a nova extrao com solventes orgnicos acidificados, que dissolvem o cido penicilnico impurificado com outros cidos orgnicos. O tratamento com gua mais base orgnica provoca a cristalizao da penicilina e a separao do solvente e do sal de cido penicilinico. Com uma filtrao em filtro bacteriolgico, consegue-se a cristalizao em condio perfeitamente assptica e, desse ponto at o acabamento final, todas as operaes tm de ser conduzidas dentro da mais rigorosa assepsia. Aps a cristalizao, filtra-se e conduz-se a penicilina para o secador e depois segue para a embalagem. 5. Vitamina B 12 A vitamina B 12 que, industrialmente, produz-se pelo Strepromyces olivaceus, est intimamente associada ao miclio do actinomiceto nas primeiras 60 horas de fermentao. Obtm-se sua atividade com a recuperao da massa de microrganismos por centrifugao ou filtrao e posterior secagem presso normal e a 50C. Para se obter a vitamina livre das clulas, ajusta-se o pH do mosto a 5 com
cido sulfrico, aquece-se a mistura ebulio para libertar a vitamina, elimina-se o microrganismo por centrifugao ou em filtros rotativos a vcuo e concentra-se o filtrado densidade de um xarope. Adicionam-se 100 mg/litro de sulfito de sdio, para evitar a decomposio da vitamina, e prosseguese a operao, secando-se o concentrado em secadores de tambor. Tritura-se o material obtido, com 5% de umidade, em moinhos de martelo e, a seguir, faz-se a embalagem para o consumo. 6. Estreptomicina Aps a fermentao, elimina-se a massa celular de Streptomyces griseus, adicionando-se cido ao meio, que , ento, aquecido e, a seguir, filtrado em filtros rotativos a vcuo. Conduz-se o filtrado a colunas de resinas catinicas e aninicas, onde se retm as bases e a estreptomicina. Com uma soluo diluda de cido clordrico, liberam-se as bases sob a forma de cloretos e a estreptomicina. Concentra-se a soluo substituindo-se a maior parte da gua por metanol, e procede-se a cristalizao do antibitico sob a forma de sal complexo de clcio, em presena de cloreto de clcio. Faz-se a concentrao misturando-se metanol, destilando-se o metanol e a gua e adicionando-se metanol puro. Redissolve-se o sal complexo em gua, purifica-se, liofiliza-se e acondiciona-se, para us-la nessa forma ou para empreg-la no processo de transformao em sulfato de estreptomicina ou sulfato de di-hidroestreptomicina. O uso de resinas intercambiadoras de ons facilitou sobremaneira a tcnica de recuperao da estreptomicina. Com uma resina aninica com grupos amnio-quaternrios, pode-se converter o complexo de cloreto de clcio em sulfato de estreptomicina. A regenerao com cido sulfrico converte o complexo em sulfato de clcio e sulfato de estreptomicina e retm nion cloreto. Pela fluidizao do leito de resina causado pelo uso de fluxo ascendente, pode-se arrastar o sulfato de clcio, insolvel, suspenso na soluo do antibitico. PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM BACTRIAS 1. Dextrnio E um polissacardeo produzido por bactrias do gnero Leuconostoc, destacando-se, como mais importante produtor industrial, o Leuconostoc mesenreroides. O dextrnio separa-se facilmente por floculao com lcoois ou acetonas, adicionando-se ao substrato volume igual de solvente. Do fermentador, passa-se o substrato para um recipiente provido de sistema de aquecimento, onde se adiciona gua e metanol. O sobrenadante encaminhado para colunas de recuperao do lcool e a fase mais pesada levada para um hidrolisador com aquecimento, onde se trata com cido clordrico. A seguir, filtra-se em filtro-prensa e encaminha-se a um tanque de fracionamento provido de aquecimento, onde se adicionam metanol e gua. Separam-se trs fases: uma de baixo e outra de alto peso molecular, que se encaminham para a recuperao do metanol, e uma terceira, contendo o polissacardeo, que enviada a um tanque de dissoluo, tambm aquecido, para ser dissolvida com gua. Desse tanque, passa-se o material para uma coluna intercambiadora de ons, e dai para um concentrador a vcuo, para um filtro bacteriolgico, para um secador por asperso, e para a embalagem em condies asspticas.
2. cido ltico E recuperado dos meios fermentados por Lacobacillus delbrueckii ou L. bulgaricus, tratandose com hidrxido de clcio ate pH 10-11, aquecendo-se ebulio, para matar os microrganismos, precipitando-se o material protico, filtrando-se, concentrando-se e secando-se o filtrado. A purificao pode ser obtida pela esterificao de lcool metlico, separando-se o lcool do ster metilico de cido ltico, em uma coluna de destilao, hidrolisa-se o lactato de metila e separa-se o metanol do cido ltico, em outra coluna de destilao. 3. cido actico O cido actico recuperado com o substrato de fermentao, para ser usado sob a forma de vinagre. Quando se deseja um produto de alta concentrao, procede-se filtrao e concentrao do lquido, que se obtm de fermentaes submersas. 4. Solventes Os solventes normalmente produzidos por fermentao so a acetona, o butanol e o isopropanol, geralmente sob a forma de misturas de etanol-butanol, butanol-acetona, etanol-butanolacetona, butanol-isopropanol e etanol-acetona. Os microrganismos envolvidos so: Clostridium acetobutylicum, para butanol-acetona, Clostridium butyricum, para butanol-isopropanol, e Bacterium acetoethylicus, para etanol-acetona. A recuperao dos solventes feita em colunas de destilao, procedendo-se primeiro separao dos solventes do mosto fermentado, obtendo-se um destilado com aproximadamente 40% dos solventes. Submete-se esse destilado ao fracionamento em colunas especiais, onde se obtm cada um dos componentes separadamente e em alto grau de pureza. Na produo de acetona-butanol-etanol a proporo dos solventes obtidos gira ao redor de 32%, 68% e 2%, respectivamente.
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Fermentao metanognica
DIGESTO ANAERBICA (fermentao metanognica) Digesto anaerbica o nome que se d a produo de metano e gs carbnico a partir de matria orgnica na ausncia de oxignio, mediante uma populao mista de microrganismos. Os principais benefcios comerciais so a produo de energia, a reduo da contaminao e o controle do odor. Em principio qualquer resduo orgnico pode ser tratado desta forma e o processo tem sido aplicado a uma ampla gama de resduos industriais, agrcolas e domsticos. A favor do uso em grande escala da digesto anaerbica, esto os trabalhos de tratamentos de guas residurias realizados h mais de um sculo e ao xito das plantas de biogs na ndia e China. uma fermentao diferente das demais. Na respirao aerbica tem-se reduo do oxignio e oxidao do carbono. O processo preferencial a oxidao da matria orgnica pelo processo aerbio. Ausncia de O2 tem-se oxidante alternativa que dever ser reduzido pelo processo biolgico com utilizao de energia com substncia reduzida e a oxidada no pode ser txica. Ex: CO2 , NO3 , SO4 sos as mais importantes porque esto relacionadas com ciclos biolgicos do C, S e N. O FeIII reduzido para obteno de ferro metlico a partir de minrio de ferro Quando o peixe morre cessa a respirao (fornecimento de O2 ) e a reao no mais reversvel (ocorre a liberao do odor caracterstico). No pescado ocorre a transformao do xido de trimetilamina em trimetilamina Na respirao anaerbia est ligada a cadeia respiratria dos microrganismos Na fermentao ocorre a produo de succinato a partir do fumarato por bactrias fermentativas., que tambm chamada respirao do fumarato. O processo aerbio tem preferncia ao anaerbio, ao contrrio somente sem oxignio. A fermentao metanognica comeou a ter destaque em 1973 com a crise do petrleo. 1) Despoluio 2) Produo de gs: 1 m3 gs = 0,7 m3 CH4 + 0,3 m3 CO2 = 6000 kcal = 6,8 kw/h 1 m3 biogs = 6,8 kwh Biodigestor com 10 m3 produz 10 m3 gs/dia 68 kw hora / dia Na fermentao tem-se: Substancia + Microrganismos PRODUTO Substrato : Biomassa primria Resduos agrcolas Resduos florestais Resduos marinhos Biomassa secundria Resduos urbanos Resduos Industriais Resduos domsticos Resduos Agroindustriais Esgotos domsticos Biomassa terciria Lodos das estaes de tratamentos
BIOQUMICA E MICROBIOLOGIA DA DIGESTO ANAERBIA INTERAO DE ESPCIES A digesto anaerbia dos resduos orgnicos implica um cultivo misto de bactrias com uma complexa interdependncia que culmina com a produo de metano pelas bactrias metanognicas. Estas bactrias utilizam um nmero muito limitado de substrato para a formao de metano, principalmente acetado e hidrognio mais gs carbnico, de forma que as bactrias hidrolticas e fermentativas devem atuar primeiramente sobre a matria orgnica, produzindo, como produtos finais, os substratos para as bactrias metanognicas. POPULAO MICROBIANA NOS DIGESTORES Identificar as espcies de microrganismos que existem nos digestores difcil, j que nunca se est seguro de que as condies utilizadas permitam o crescimento de todos os microrganismos que esto presentes. Contar o nmero de cada espcie ainda mais difcil, especialmente porque a mair parte dos resduos so particulados e existem bactrias unidas as partculas. Portanto, na atualidade, o conhecimento da microbiota dos digestores est baseada em uma concepo de amplos grupos trficos, aparentemente comuns a todos os processos, que atuam sobre a digesto de resduos complexos. As bactrias so muito especficas e desdobram compostos de 1 tomo de carbono. Estes organismos com seus substratos e produtos so mostrados na Figura seguinte e so: Bactrias hidrolticas e fermentativas (Grupo I) Bactrias acetognicas produtoras de hidrognio (Grupo II) Bactrias metanogenicas (Grupo III). Um grupo adicional (Grupo IV) capaz de sintetizar acetato a partir de H e anidro carbnico, 2 as bactrias homoacetogenicas, de pouco significado. BACTRIAS HIDROLTICAS E FERMENTATIVAS Este grupo contm anaerbios estritos e facultativos e responsvel pela eliminao de pequenas quantidades de oxignio, que se introduzem, por exemplo, na alimentao do digestor. Nos digestores realizada a hidrlise das protenas, a celulose a hemicelulose e a pectina. A lignina praticamente no biodegradvel em sistemas anaerbios. Tem tambm as bactrias acidogenicas, que produzem cidos a partir de aucares simples. BACTRIAS ACETOGNICAS OBRIGATRIAS PRODUTORAS DE H2 Estas bactrias tambm so conhecidas como bactrias Vrias so as espcies importantes na digesto, por exemplo, Syntrophomonas wolfei, que oxida butirato a acetato quando cresce com uma metanognica e Sintrophobacter wolinii, que degrada propionato a acetato e H2 . A beta-oxidao dos cidos graxos de cadeia longa a acetato e a fermentao de compostos aromticos tambm ocorrem devido atividade este grupo de microrganismo
Resduos celulsicos, amido, protenas, lipdios, etc
Bactrias hidrolticas e fermentadoras do GRUPO I Formalededo Acetaldedo H2 + CO2
Proprionato, butirato, cidos graxos de cadeia longa
Bactrias homoacetogenicas GRUPO IV Acetato
Acetaldedo
Bactrias acetognicas produtoras estritas de H2 GRUPO II (Requerem baixas presses parciais de H+) Bactrias metanognica GRUPO III
H2
CH4 + CO2
CH4
BACTRIAS METANOGNICAS Estas bactrias esto entre os anaerbios mais estritos conhecidos e seu cultivo tem requerido o desenvolvimento de uma srie de tcnicas capazes de manter o ambiente estritamente livre de oxignio. Essas bactrias atuam sobre uma gama bastante limitada de substratos. Nove espcies podem crescer convertendo o formaldedo a metano mais CO2 e somente trs espcies (todas da espcie Metanosarcina bakeri) so capazes de crescer sobre acetato, metanol e metilamina. Methanobacterium formicum so autotrficos, isto , reduzem o CO2 . Methanosarcina baskeri Methanopirillus bastonetes curvos Methanobacterium bastonetes no curvos Methanotrix
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EQUAO ESTEQUIOMTRICA GERAL DE BUSWELL Cn HaO6 + (n + a/4 b/2) H2 O C6 H12 O6 3 CH4 + 3 CO2 (n/2 a/8 + b/4) CO2 + (n/2 + a/8 + b/4)CH4
C6 H12 O6 + 6 O2 3 CH4 + 6 O2
3 CO2 3 CO2
+ 6 H2 O - 686 kcal + 6 H2 O - 630 kcal
[630/686] % da energia continua sobre a forma de metano e [56/686] liberado. A fermentao metanognica produz uma pequena carga de biomassa. Outra reao : Fonte de CH4 o CO2 CO2 + 4H2 CH4 + 2H2 O - 32,4 kcal O H2 liberado de duas molculas de glicose. 2 CH2 OH CHOH CHOH 2 CH3 CO COOH + 2 H2 O
2 CH3 CO COOH + 2 H2 2 CH3 COOH + CO2 + 2 H2
Fazendo a soma das reaes (carbono marcado) 2 CH3 COOH + 2 CO2 + 4 H2 2 CH4 + CH4 + 3 CO2 + 2 H2 O CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2 O 32,4 kcal 4 CH3 OH (metanol) 3 CH4 + CO2 + 2 H2 O 3 molculas de metanol so reduzidas a metano e 1 molcula oxidada a CO2 Bactrias autotrficas, aquelas que geram sua prpria energia a partir de substncias minerais. Elas utilizam o CO2 para produzir metano e energia. PRODUO DE GS Depende de cada substrato Glicdios C6 H12O6
3 CH4
+ 3CO2 + H2 O
8500 kcal/m3 Biogs 4500 kcal/m3 Protenas 4CH2 NH2 COOH +2H2 O
3 CH4 Biogs 8500
+ CO2 + 4CO2 + 4NH3 6375 kcal/m3

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Lipdios 4C3 H5 (OH)3 + 2H2 O 12CH3 (CH2 )16 COOH + 2H2 O
7 CH4 + 5CO2 52CH4 + 20CO2 56 CH4 + 25 CO2 59/84 * 8500 5970 kcal/m3
EXEMPLO SACAROSE - 6CH4 6 * 0,0224 = 0,1344 L de gs 0,1344 litros * 1000 kg = 0,39 L/kg 324 g 1 kg 0,4 litros de gs / kg sacarose REATORES EVOLUO Natureza ausncia de oxignio Anaerobiose Rumem Biodigestores (bovinos) Chins Rurais Indiano No biofertilizante h o enriquecimento de N e P e empobrecimento do C. O inconveniente que o biofertilizante lquido, pois transporta 90% de gua. TIPOS DE DIGESTORES Os digestores podem ser desenhados para sua utilizao em situaes rurais (baixa tecnologia) ou para aplicaes industriais sofisticadas. Pode ser operado de forma descontnua ou preferencialmente de forma contnua. Digestores de baixa tecnologia Normalmente no necessitam de aquecimento e so misturados manualmente. Para os climas frios deve-se fazer o isolamento. Digestores descontnuos muito complicado trabalhar com material slido ou semi-slido em digestores contnuos. Nestes casos conveniente utilizar os reatores descontnuos, pois estes necessitam de poucos equipamentos adicionais. Tanques reatores com agitao contnua Estes digestores agitados e com o contedo perfeitamente misturado, de alimentao contnua, so utilizados para tratar de material com baixo teor de slidos (2 a 10%). A agitao serve: a) para distribuir o material administrado no reator; b) para impedir o acmulo de slidos no digeridos; c) para distribuir o calor aplicado, e d) para impedir o acmulo de pelculas. A agitao
pode ser mecnica ou por recirculao de gs, quando o gs produzido borbulhado de volta ao digestor. Os microrganismos sedimentados podem ser recuperados e recolocados no digestor. importante ter um depsito para gs produzido, pois o mesmo n produzido de maneira uniforme o durante o dia. Reatores anaerbios de capa de sedimentos com fluxo para cima (UASB) particularmente indicado para tratamento de resduos solveis de baixa concentrao de slidos (<1% de MS). O material residual entra por uma base do digestor e flui para cima, atravs do lodo, com bactrias sedimentadas e de uma regio do digestor onde as bactrias que floculam sedimentam em grnulos de aproximadamente 4mm de dimetro. Os resduos tratados que emergem na superfcie do lodo passam para uma rea tranqila sem borbulhamento de gs, onde sedimentam as bactrias que se separam. Defeitos: No pode ter entrada muito rpida de afluente; No trata bem material particulado, os quais podem depositar-se no leito reduzindo a eficincia; O afluente pode formar canais na capa de sedimento (lodo) ao invs de passar uniformemente por todo o volume do leito. Reatores de pelcula Estes podem ser subdivididos nos que tem um meio de suporte estacionrio, filtros anaerbios, e aqueles que o prprio suporte est em movimento na corrente do lquido. Filtros anaerbios Os resduos so passados sobre a populao de bactrias unidas a um suporte slido inerte, como, PVC, polister, bolas de cristal, brita, areia grossa. Utilizado para tratar m aterial vegetal com 1 a 10% de MS e resduos animais. Reatores de leito expandido ou fluidizado Os resduos aquosos que fluem atravs destes reatores fluidizam o ao menos expandem o leito de partculas onde esto unidas as bactrias. As partculas em suspenso esto em movimento contnuo e pode conseguir-se uma transferncia muito eficiente de substrato se for impedida a formao de canais ou a obstruo. TIPOS DE RESDUOS PARA A DIGESTO A classificao mais prtica dos resduos com propsitos de digesto anaerbia em resduo de fora baixa, mdia e alta e resduos slidos. Para subdvidir em base de matria seca ou ao contedo de slidos totais (ST), estas categorias correspondem aproximadamente a 0,2-1%; 1-5%; 512% e 2-40% de ST, respectivamente. E necessrio conhecer, tambm se o resduo totalmente solvel ou contenha material particulado. Nem toda a matria seca em um resduo biodegradvel, por exemplo, os compostos inorgnicos, etc. Recorre-se a vrios mtodos para quantificar o contedo orgnico de um resduo: determinao de slidos volteis (cinzas) e determinao da DQO (Demanda Qumica de Oxignio), determinao de DBO 5 (Demanda Biolgica de Oxignio, medida
durante o perodo de 5 dias) e COT (carbono orgnico total, somente para amostra solubilizadas). A lignina, embora orgnica, no totalmente degradada anaerobicamente. COMPOSIO QUMICA Os resduos devem constituir um meio adequado de crescimento para a microbiota do digestor e se no esto presentes, devero ser adicionados nutrientes como fosfatos, microelementos e nitrognio. desejvel uma relao C:N abaixo de 40:1. Os resduos devem ter uma boa capacidade tamponante, ao redor da neutralidade, atribudo aos fosfatos, os de amnio, carbonatos e bicarbonatos, cidos graxos volteis ou outros cidos orgnicos e aminas. Assim no necessrio controle do pH na digesto. Tambm devero ser conhecidos possveis inibidores, por exemplo, amnio em resduos ricos em protenas, sulfatos em resduos do processamento de papel e metais em resduos de cortumes. ORIGEM DOS RESDUOS Resduos do processamento industrial e de alimentos As guas residurias do processamento de acar um substrato clssico. Resduos da industria cervejeira, de destilado, resduos de vegetais, da industria de c onservas podem ser utilizado, porm normalmente so produzidos sazonalmente. Outros substratos que podem serem utilizados so o soro do queijo e resduos de matadouros. Dejetos de Animais e Biomassa Agrcola A digesto anaerbica tem potencial na agricultura para reduzir a contaminao e os patgenos, controle de odores e para produo de energia. Normalmente o esterco de ruminantes contm slidos que j sofreram uma degradao microbiana durante 1-4 dias na passagem pelo rmem, de forma que contm uma maior quantidade de lignocelulose e conseqentemente tero menor rendimento. A biomassa agrcola seca, palha, bagao de cana-de-acar, restos da industrializao de milho, etc. A digestibilidade pode ser pequena e a relao C:N pode ser alta. A biomassa verde tem boa fermentao. Resduos Domsticos Os sedimentos das guas residurias tem sido usados na digesto anaerbica, nos sistemas de esgotos cloacais municipais desde o incio do sculo passado na Europa. O gs produzido utilizado para aquecimento da prpria planta, pois o objetivo primeiro reduzir a contaminao e os odores. OPERAO DO DIGESTOR Temperatura de digesto Existem duas faixas de temperaturas nas quais os digestores so operados: os mesfilos (2025 a 40-45C) e os termfilos (50-55C a 60-65C). Cada um implica uso de diferentes bactrias. A produo de gs diminui rapidamente nos limites destas faixas e os efeitos de um curto perodo de
aumento de temperatura da faixa mesfila para a faixa termfila pode necessitar muitas semanas para ser recuperado. Tempo de reteno e velocidade de carregamento O tempo de reteno hidrulica (TRH) ou seja, o espao de tempo que o lquido adicionado passa no interior do digestor dado pela expresso: Volume do Digestor TRH = Volume dirio de resduos adicionados O tempo de reteno dos slidos ser mais longo que este se as partculas so conservadas no digestor. Os resduos simples podem passar atravs dos digestores, com reteno de microrganismos, com TRH de somente algumas horas, porm os resduos complexos so digeridos a TRH de 10 dias ou mais. A velocidade que os slidos so adicionados no digestor funo do volume adicionado diariamente e do contedo em slidos do material utilizado. A velocidade de carregamento se 3 expressa como peso de matria orgnica (geralmente kg de slidos volteis [VS] ou de DQO) por m de digestor por dia. A carga mxima que pode ser aplicada dependo o desenho do digestor e do tipo do resduo. Para um UASB de escala completa, tratando guas residurias do processamento de acar, pode conseguir-se mais de 15 kgDQO.m-3.dia -1 . Para um digestor de baixa tecnologia operando com esterco animal a 35C uma boa operao seria de aproximadamente 4 kgSV.m-3 .dia-1 . Rendimento O rendimento em gs uma medida do grau de digesto da matria orgnica. o volume de gs gerado por unidade de peso de matria orgnica adicionada ao digestor. Se so adicionados substratos orgnicos puros e estes so degradados completamente a CO2 e CH4 , ento pode-se calcular o rendimento seguinte de gs por kg de substncia adicionada. Amido/celulose/glucose 0,8 m3 kg-1 cidos graxos (baseados em estearato) 1,5 m3 kg-1 Protena (baseada em (C 5 H7 NO2 ) 0,9 m3 kg-1 Rendimentos to altos raramente so conseguidos na prtica, j que geralmente a converso da matria orgnica incompleta. Valores da ordem de 0,6 m3 kg-1 SV so obtidos a partir de sedimentos de leveduras de cervejarias e de destilarias. O esterco suno pode dar rendimentos de gs de 0,4m3 kg-1 de SV adicionados, porm esterco bovino pode dar valores de 0,2m3 kg-1 . O rendimento de gs varia conforme a composio do resduo, o tempo de reteno e a presena de inibidores, entre outros. Digesto em duas etapas Os diferentes grupos da populao microbiana nos digestores tem condies de operao tima diferentes e a eficincia pode ser melhorada separando a etapa de acidificao, que necessita de bactrias feremtativa e hidrolticas, da etapa metanognica que requerem bactrias acetognicas, estritamente produtoras de H2 , e bactrias metanognicas. Isso pode ser conseguido mantendo o pH
do recipiente na reao inicial em 6 ou menos, quando a produo de metano inibida, mas a hidrlise e a fermentao continuam. O gs produzido na primeira etapa est misturado com CO2 e H2 . ENERGIA NOS DIGESTORES O gs produzido na fermentao anaerbia composto por aproximadamente 70:30 de CH4 :CO2 , sendo gs combustvel. A energia de maior interesse aquela chamada energia livre, obtida aps o aquecimento do digestor, do aquecimento do contedo misturado e das perdas produzidas no sistema. Parmetros que afetam a produo total de gs O volume de gs que pode ser produzido a partir de uma quantidade determinada de resduos, o rendimento em gs, um parmetro crtico para o desenho do digestor. Os fatores mais importantes que afetam o rendimento de gs so: o tipo de resduo, a temperatura de operao, tempo de reteno e a presena de inibidores. O volume de gs produzido por um digestor diretamente proporcional a massa de slidos biodegradveis que foi adicionado, dentro dos limites de operao. Tipo de resduos O volume de gs depender da mistura de vrios componentes presentes no resduo. Para substratos complexos como esterco de animais, geralmente no possvel calcular a quantidade de gs que pode ser produzido a no ser empiricamente. Temperatura de operao Geralmente o mximo de gs produzido pelas bactrias anaerbias mesfilas em temperaturas ao redor de 35C, e pelas bactrias termfilas em aproximadamente 55C, podendo variar conforme o tipo de resduo. A produo de gs menor em outras temperaturas, mas difcil estabelecer uma relao entre a temperatura e a produo de gs. Devemos ter em mente em qual temperatura devemos operar o digestor, pois poderia haver a necessidade de muita energia, para o aquecimento do digestor, porm com pequeno rendimento em gs. Tempo de Reteno Para um contedo de slidos constante, um aumento no TRH dar uma maior produo de gs, todavia a relao no linear. Como o m aterial a ser digerido de composio complexa, os componentes individuais sero degradados a diferentes velocidades. Em uma situao real, aumentando o TRH requerido para tratar um volume de resduo afim de dar um maior rendimento em gs, supe desvantagens, principalmente em relao ao aumento do custo do digestor. Se no existe limite de quantidade de material disponvel para a disgesto, ento conveniente colocar maior quantidade de material no digestor e reduzir o TRH, e assim produzir maior quantidade de gs por dia, porm com menor rendimento em gs.
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Volume de material admitido no sistema Quanto maior o teor de slidos biodegradveis, maior ser a produo total de gs, at o limite da velocidade aceitvel de carregamento. O limite do contedo de slidos ser geralmente observado na prtica, ou obtido sobre o que pode ser conseguido por sedimentao, no caso dos lodos, ou pelo que pode ser manejado pelas bombas existentes, no caso de esterco com alto teor de slidos. Se o teor de slidos for maior que 10-12% necessrio adicionar gua para facilitar o manejo. Toxidez a) NH4 +/NH3 Nos resduos agrcolas podem ser encontrados altos teores de amnio (ex.: 3.000 a 4000ppm de nitrognio amoniacal) nos digestores alimentados com esterco de sunos e de aves. A adaptao das populaes microbianas e a seleo natural de cepas capazes de trabalhar em nveis mais altos de amnio podem ocorrer no decorrer de vrios meses, de forma que a digesto pode acontecer em nveis de 5.000ppm de N amoniacal. A toxicidade do amnio depende do pH, sendo maior em pH alcalino. Embora possa perder parte da amnia voltil, todo o N retido durante a digesto, de forma que os efluentes perdem pouco valor fertilizante. b) SO4 2- - Alguns resduos industriais, por exemplo processamento de papel, podem ser ricos em sulfatos. O SO4 2- e o CO2 competem pelo H2 ,sendo utilizado pelas bactrias redutoras de sulfato. c) Contaminante industriais agrcolas antibiticos adicionados a rao de animais pode prejudicar o bom funcionamento dos digestores. Desinfetantes e detergentes presentes nas guas residurias podem ser problemas, mas geralmente nas quantidades recomendadas no tem ocorrido maiores danos. Metais pesados podem tambm conduzir a problemas de funcionamento, mas no tem maiores danos se tambm apresentar altas doses de sulfatos, pois os metais precipitam. Parmetros que afetam a produo de energia A energia livre produzida por um digestor a diferena entre a energia total produzida e a utilizada para manter o processo. Geralmente o material deve ser bombeado at o digestor, deve ser aquecido a temperatura de operao, h perdas de calor atravs das paredes e o contedo do digestor deve ser misturado, cada uma destas operaes consomem energia. O maior aporte de energia para os digestores que operam em climas temperados com resduos a temperatura ambiente e geralmente elevar a temperatura de material que entra at a temperatura de operao, freqentemente uma subida de 25C ou mais. Consideraes Finais Economia A digesto anaerbia, embora muitas vezes utilizada para o controle da contaminao, tambm utilizada freqentemente para a produo de energia. quase impossvel dar um valor monetrio ao controle da poluio, e mesmo quando a produo de energia a principal razo, uma avaliao econmica no simples, especialmente se no for possvel afirmar de antemo qual a quantidade de gs a ser produzido
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TECNOLOGIA DE PRODUO E UTILIZAO DE ENZIMAS INTRODUO Aps os antibiticos, as enzimas so os produtos mais explorados na indstria biotecnolgica. Reaes catalizadas por enzimas utilizando-se clulas intactas de microrganismos vm sendo utilizadas ao longo da histria, principalmente na fabricao de cervejas, vinhos e panificaes. As enzimas isoladas tm sido utilizadas h mais de 50 anos no preparo de raes animais e outras aplicaes industriais. Muitas das enzimas obtidas de vrios tipos de microrganismos podem ter um uso comercial. Por isso devem ser separadas das clulas que as produzem e purificadas. Em qualquer caso, a enzima dever purificar-se o mnimo necessrio para eliminar as atividades que produzem interferncias porque, em alguns casos, como as determinaes analticas, necessrio utilizar altos nveis de purificao. Atualmente comercializam-se em todo o mundo mais de 1500 toneladas de enzimas por ano, correspondendo a um mercado mundial estimado em mais de US$ 2 bilhes. Sendo que mais de deste valor constitudo somente por quatro enzimas: proteases bacterianas usadas em detergentes, a gluco-amilase, -amilase bacteriana e a glucose-isomerase, utilizada na industrializao de xaropes de glucose e frutose a partir do amido. As enzimas so biocatalizadores que as clulas utilizam para realizar uma srie de converses qumicas e so largamente utilizados nas indstrias qumicas, farmacuticas e de alimentos; Para apresentar atividade cataltica, algumas enzimas requerem a participao de molculas menores (co-fatores) de natureza no protica. Estes podem ser ons (Zn, Ca, etc) ou molculas orgnica, as coenzimas (NAD, FAD, NADP, etc). A ao cataltica das enzimas se faz, como a dos catalisadores inorgnicos, atravs da reduo da energia de ativao da reao, sem alterao do seu equilbrio termodinmico. Alm de reduzirem a energia de ativao, incrementando a velocidade da reao, as enzimas apresentam elevada especificidade. A obteno de enzimas comerciais pode ser feita a partir de fontes animais, vegetais e microbianas. Sua produo pode ser aumentada pela transferncia das informaes genticas para um microrganismo hospedeiro. Esses microrganismos geneticamente modificados (OGMs) podem ento, ser cultivados sob as melhores condies. No Japo a produo de enzimas por fonte microbianas o aspecto mais importante no desenvolvimento da rea de biotecnologia; NOMENCLATURA: Os nomes sistemticos incluem o substrato, a reao catalisada e a terminao ase. Exemplo: -1,4 D glicano glicohidrolase. Nomes triviais tambm so empregados (pectina esterase, glutamato desidrogenase, entre muitas). Outra forma pelo cdigo de enzima (EC number), como por exemplo, pectina esterase, a qual apresenta o seguinte numerao EC 3.1.1.11.
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ALGUMAS ENZIMAS DE IMPORTNCIA INDUSTRIAL ENZIMA Amilase Amiloglucosidase Celulases Protease bacteriana Protease fungica Coalho bacteriano Pectinases Inulinase Lacase Xilanases FONTE B. subtilis; niger A. niger; oryzae Diversos fungos B. subtilis A. niger; oryzae Mucor miehei Diversos fungos K. marxinus Diversos fungos Diversos fungos e bactrias APLICAES A. Ind. txtil, lcool, xaropes, produo de glicose, processo fermentativos, panificaes A. Produo de glicose Hidrlise da celulose e produo de lcool Detergentes, ind de filmes fotogrficos A. Ind. De carnes, cerveja, panificao Industria de queijos Indstria de sucos de frutas, vinhos, polpas, etc. Produo de frutose Biodegradao da lignina e remoo de resduos fenlicos Biodegradao de hemicelulose, branqueamento do papel. combustveis e
OBTENO INDUSTRIAL DE ENZIMAS FONTE Vegetais ORIGENS Sementes Sucos Polpas Razes Mucosas Pncreas Fgado Sangue Bactrias Fungos Leveduras MTODO DE OBTENO Triturao de tecidos
Animais
Triturao de tecidos
Microrganismos
Cultura submersa ou semi-slida
VANTAGENS DO USO DE MICRORGANISMOS PARA A PRODUO DE ENZIMAS SO:

Nmero de enzimas que podem ser produzidas virtualmente ilimitado; A produo de enzimas no est sujeita a flutuaes de mercado que afetem a produo ou fornecimento de matrias-primas (Ex.: preo da carne e seus derivados, sazonalidade, polticas de crdito ao cultivo de lavouras, etc);
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A metodologia para obteno de enzimas por fermentao microbiana pode ser facilmente escalonada para atender a qualquer demanda de mercado. Atravs de tcnicas biotecnolgicas, possvel alterar as propriedades das enzimas produzidas, com vistas melhoria na sua aplicabilidade para o barateamento dos processos de produo e purificao. Pode-se utilizar matrias-primas baratas ou mesmo subprodutos que, de outra maneira, seriam descartados exigindo investimentos em proteo ambiental (ex.: soro de leite, vinhoto, resduos de celulose, etc.).
Vantagens do uso de enzimas Poupar Capital Substituio de ingredientes Eliminao /substituio de coadjuvantes no processamento Processamento mais eficiente com menos subprodutos indesejveis e maior capacidade na planta industrial Aumento da produtividade Melhoria do produto Produto original
Gerar Capital
ALGUMAS ENZIMAS E SUAS DOSAGENS MDIAS EM ALIMENTOS (SOBRE % DE SLIDOS ORGNICOS TOTAIS) ENZIMA Papana ALIMENTO Produtos forneados Carnes/carnes enlatadas Cervejas Queijos Gelatinas/pudins Balas/Caramelo leos e Gorduras Snacks Produtos Forneados Frutas Processadas/sucos Sopas no cremosas Doces/Balas/Caramelos Cereais matinais Acar e cobertura Gelatinas e pudins Xarope de milho DOSAGENS (% SOT) 0,0078 0,0044 0,0045 0,0360 0,0040 0,000016 0,000084 0,00056 0,00000026 0,00350 0,060 0,0078 0,0030 0,0520 0,0000020 0,0520
Renina Bromelina
Pectinase
Invertase Amilases
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ENZIMAS NA INDUSTRIA DE ALIMENTOS TEM COMO FUNO:

Reduzir a viscosidade Melhorar extraes Promover reaes de bioconverso e de separao Mudar a funcionalidade de produtos Sintetizar produtos qumicos Funcionarem como bacteriostticos/bactericidas Melhorar os processos do ponto de vista ambiental
APLICAES INDUSTRIAIS Na industria de alimentos tem sido utilizados enzimas durante muitos anos. Isto ocorre principalmente na industria de panificaes e cervejeira. A maioria das enzimas utilizadas enzimas extracelulares de origem microbiana. As proteases constituem aproximadamente 50% das enzimas microbianas. Emprego das amilases A capacidade que tem a amilase de catalisar a degradao do amido mediante o rompimento ao acaso dos enlaces presentes nas pores intermedirias da cadeia, tem aplicaes importantes em determinadas industrias, entre elas a s de panificaes, cervejarias, fabricao de usque e processamento de papel e txtil. Podem ser produzidas a partir do fungo Aspergillus ou por cultivos bacterianos (amilase termoestvel) a partir de bactrias termfilas. Emprego das proteases existe uma enorme variedade de aplicaes para estas enzimas. Os detergentes domsticos tm pequenas quantidades de protease bacterianas (Bacillus subtilis e B. licheniformis). Esta enzima tambm pode ser usada na indstria de couro e na indstria txtil. A papana muito usada e obtida do ltex do mamo (Carica papaya). utilizada para amaciar carnes. Atua prioritariamente na degradao do tecido conjuntivo e tambm sobre a actomiosina. uma enzima bastante termoestvel. Outra aplicao na industrializao da cerveja, para degradar precipitados formados a partir do complexo protena-tanino formado durante o armazenamento a frio da bebida, evitando, assim, a turbidez da cerveja. A obteno de proteases pode ser de origem animal entre as quais destaca-se pepsina, tripsina, quimotripsina, utilizadas na preparao de alimentos infantis. A renina pode ser obtida do 4 estomago de bezerros lactantes e usada no processamento de queijos. A protease fngica (Aspergillus orizae) utilizada na panificao, para modificao das caractersticas das massas. Emprego de enzimas na industria de acar - produo de glicose a partir de amido realizada em todo o mundo. Para isso utiliza-se amiloglucosidase (glucamilase) [Aspergillus niger] para que se possa degradar os enlaces 1,6 da molcula de amido. As -amilases (Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis; Aspergillus orizae). somente podem romper os enlaces -1,4 da cadeia principal do amido, assim no podendo degradar-se at glicose, aparecendo o que se denomina de dextrina limite, as quais podem ser degradas posteriormente pela atividade das amiloglucosidase. A converso do amido a glucose um processo importante na industria, pois a glicose que no muito doce, utilizada como substrato para a produo de frutose via utilizao da
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glucose isomerase de origem bacteriana, que produz quantidades equivalentes de frutose e glicose. Esta mistura se denomina de acar invertido e pode tambm ser produzida pela hidrlise cida da sacarose, pela ruptura enzimtica da sacarose ou pela ao de invertase de leveduras. A glucose isomerase a enzima intracelular mais utilizada na industria de alimentos. Outra enzima importante a -galactosidase (lactases) produzida por leveduras como Kluyveromyces lactis, K. fragilis e bacteriana de Bacillus spp., que hidrolisa a lactose em seus monossacardios constituintes. Isto importante para retirar a lactose de leites, pois algumas pessoas so intolerantes a este dissacardeo. A glucose pode ser eliminada em alguns alimentos, onde pode causar alteraes de cor, mediante o uso de glucoseoxidase fngica. Esta enzima utiliza glucose e oxignio evitando assim a oxidao dos alimentos. Emprego das pectinases e celulases Cepas de Aspergillus niger produzem pectinases e hemicelulases. Os componente principais das pectinases so a pectinaesterase, endometilgalacturonato liase e a poligalacturonase.Nos processos de extrao de sucos de frutas e na elaborao de vinhos, a pectinase eleva o rendimento de suco, reduz a viscosidade e melhora a extrao da cor. As celulases comerciais produzidas por cepas de Trichoderma reesei, Penicillium funiculosum e Aspergillus niger, so usadas na cervejaria, na produo de lcool e no tratamento de resduos. Seu maior potencial de uso na converso de lignocelulose e da celulose de madeira em glucose. O Penicillium emersonii produzem uma -1,3;1,4-glucanase com aplicao nas hidrlise dos -glucanos da cevada. A maioria das enzimas extracelular usada na forma livre e no so recuperadas para reutilizao. Ao contrrio as enzimas intracelulares implica o uso de enzimas ou clulas imobilizadas ou livres que podem reciclar. As glucose isomerases se preparam mediante a imobilizao das enzimas isoladas em suportes sintticos. ALGUNS EXEMPLOS DE ENZIMAS E SUAS CARACTERSTICAS DE PROCESSO Origem vegetal Papana - Classe - proteoltica - Procedncia Carica papaya - Um ltex fresco contm aproximadamente 12% do peso seco em papana - Utilizao industrial: Cervejaria estabilizao coloidal da cerveja Industria da carne amaciamento degrada o tecido conjuntivo duro Fabricao de hidrolisado de peixe alimentao animal Industria farmacutica medicamentos A papana industrial tem timo de temperatura 55/60C e boa termoestabilidade zona crtica 67/70C; Faixa de pH larga 5 a 7
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Origem microbiana A produo de enzimas microbianas voltou-se para processos de fermentao. Vantagens da fermentao em relao s enzimas de extrao: Produo independente das imposies sazonais e geogrficas; Possibilidade de utilizao de matrias-primas baratas; Rendimentos de produo pode ser aumentado pelo aprimoramento das linhagens e otimizao das condies de fermentao Produo de enzimas exocelulares: Os microrganismos so cultivados em meio adequado e a enzima extrada desde meio; Produo de enzimas endocelulares: Os microrganismos crescem em meio adequado, depois as clulas so rompidas e as enzimas so extradas; A produo de enzimas supe um certo nmero de etapas Especificidade tipo preciso de enzima pH timo varia de acordo com a enzima Temperatura tima; Seleo da linhagem; geralmente do local onde as substncias a degradarem so abundantes, meio rico seguido de seletivo; Ex.: amido como nica fonte de carbono para os microrganismos que possuem amilase Caracterstica da linhagem isolada Desenvolver-se em meio simples e barato; Produzir o mnimo de metablitos secundrios Ex.: antibiticos Excretar a enzima de modo que seja facilmente separada e purificada; No conduzir a diferentes poluentes; No ser patognicas ou produzir compostos txicos As linhagens podem ser aprimoradas por mutaes MUTAES Visa obter linhagens que produzem mais enzimas e um menor custo; Visam suprimir caractersticas da linhagem selvagem, caso sejam inconvenientes para a produo industrial; Nas mutaes, os mecanismos de regulao, sejam ao nvel dos genes ou a nvel enzimtico, so alterados; Pode-se obter mutantes onde as necessidades de indutor reduzida ou suprimida em relao ao selvagem, isso importante caso o indutor tenha um custo elevado; Pode-se obter mutantes cuja biossntese das enzimas no seja mais reprimida por um dos produtos terminais;
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Pode-se obter mutantes resistentes a represso catablica cuja sntese das enzimas no seja
mais reprimida pela glicose; s vezes se faz necessrio um mutante que no produza metablito secundrio, o qual pode inibir o microrganismo de interesse. Produo de mutantes que no esporulem, os esporos resistem aos tratamentos de recuperao, e afeta a produo de enzimas extracelulares. ENGENHARIA GENTICA - Permite inserir no genoma de uma bactria um gene de outro microrganismo. - Conservao das linhagens industriais liofilizao e nitrognio lquido. PRODUO DE ENZIMAS Faz muito tempo que as preparaes de enzimas microbianas vem sendo largamente utilizadas para uma variedade de propsitos na produo de numerosos alimentos. Todos os processo de fermentao, inclusive de alimentos fermentados, so manifestaes de reaes enzimticas. As enzimas microbianas so obtidas por fermentao em condies controladas de alto rendimento em cultivos de superfcie ou submersos. As clulas excretam as enzimas extracelulares no meio e a primeira etapa de recuperao da enzima a partir dos cultivos submersos consiste na separao do lquido livre de clulas, que contm a enzima, atravs de filtrao ou centrifugao. Os processos de fermentao com cultivos em superfcie so amplamente utilizadas para a produo de enzimas extracelulares fngicas e neste caso a massa semi-slida da ps-fermentao se extrai, usualmente com gua, antes de ser filtrada. O sobrenadante ou filtrado que contm a enzima se concentra e se vende como uma preparao enzimtica lquida que contm conservantes e/ou estabilizantes ou se precipita, seca-se e se tritura para obter a enzima em forma de p ou grnulos. PROCESSO DE IMOBILIZAO DE ENZIMAS A imobilizao de enzimas dentro da clula hospedeira foi a tcnica utilizada no primeiro processo comercial baseado na glicose isomerase. As clulas de Streptomyces que continham a enzima eram aquecidas durante certo tempo para desnaturar as enzimas autolticas, estabilizar as clulas e torn-las permeveis s molculas pequenas. Outro mtodo se baseia no emprego de agentes floculantes para fixar a glucose isomerase dentro das clulas de Arthobacter. Estas preparaes enzimticas se transformam em grnulos com objetivo se serem usadas em reatores enzimticos. A glicose isomerase tambm pode fixar-se dentro das clulas atravs de um aldedo bifuncional reativo de entrecruzamento, como o glutaraldedo. Em outros processos para a produo de glucose isomerase imobilizada industrial as clulas microbianas que contenham a enzima so fixadas com glutaraldeido e presas em gelatina. Tambm se utiliza o aprisionamento em fibras, em materiais como o triacetato de celulose, para fixar enzima isolada para uso industrial. Entre as enzimas comerciais imobilizadas desta forma se encontra a glucose isomerase, a amiloacilase e a -galactosidase.
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Os microrganismos mais importantes utilizados na produo de enzimas extracelulares industriais so os Bacillus e os Aspergillus, que em conjunto representam 80 a 85% do mercado de enzimas extracelulares Atualmente o T richoderma reesei so os principais produtores de celulase. A glicose isomerase produzida a partir de Arthrobacter, Streptomyces e Actinoplanes para a produo de xaropes de frutose. Enzimas de origem fngica cultura de superfcies, fina camada em meio lquido, meio semi-slido. Ex.: amilases de Aspergillus, proteases de Aspergillus e Mucor, Pectinases de Penicillium Culturas submersas so preferveis so mais bem adaptadas aos diferentes controles, reduzindo riscos de contaminao; Culturas submersas so mais bem otimizadas do fermentadorpiloto para o industrial PREPARAO DO INCULO A linhagem deve ser preservada e sem riscos de contaminao; Deve-se evitar muitas culturas sucessivas; Deve-se partir de linhagem liofilizada e semear um s fermentador que dever inocular o fermentador industrial; O volume do inculo de 3 10% do volume do fermentador; O meio usado na preparao do inculo deve ser semelhante ao do fermentador; O tempo de permanncia varia de 10 a 80 horas dependendo do tipo de processo. COMPOSIO DO MEIO DE CULTURA Fonte de C, N e os principais fatores de crescimento; Pode encurtar a fase de latncia adicionando alguns fatores; A produo de enzima pode no ocorrer num meio prprio para o crescimento do microrganismo; Deve-se levar em conta a necessidade de um indutor, as represses possveis por um composto de meio, a represso catablica produzida pela glicose, podendo esta ser substituda por um glicdio, ou por amido previamente hidrolisado; Pode-se fazer meio concentrados, levando em conta a dificuldade de aerao e o aumento da presso osmtica; As matrias-primas perfazem 60-80% do custo de uma produo de enzimas por fermentao; A composio do meio de cultura deve ser definida com cuidado, levando em conta o custo. A composio deve levar em conta as etapas de extrao; Os meios so geralmente esterilizados no fermentador, geralmente com altas temperaturas, que destri menos os fatores de crescimento e desenvolve menor colorao no meio. As amilases e proteases importantes comercialmente so produzidas de B. amyloliquefaciens e B. licheniformis tem a velocidade de sntese constante com pouca dependncia do substrato presente no meio. As enzimas extracelulares tm sua sntese em velocidade baixa na ausncia de substrato, porm aumenta milhares de vezes quando induzidas. A maltose o melhor indutor para a -amilase de A. orizae. O amido, a maltose e a glucose estimulam a produo de amiloglucosidase por A. niger. A celobiose e a lactose so os melhores indutores de celulase de
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T. reesei e tambm serve de fonte de carbono. A produo de poligalacturonase por A. niger est associada presena de pectina no meio. A sntese de enzimas extracelulares est usualmente associada com as fases de crescimento exponencial e estacionria. Em quase todos as condies, as espcies de Bacillus produzem proteases extracelulares durante a fase de crescimento estacionria. A sntese -amilase por B. licheniformis e A. orizae ocorre durante a fase de crescimento exponencial, porm para o B. subtilis e B. amyloliquefaciens a enzima produzida na fase estacionria. EXTRAO E PURIFICAO Terminada a fermentao, as enzimas devem ser separadas das clulas e do meio e tratadas de modo a obter uma preparao comercial que corresponda aos critrios de pureza e estabilidade desejados. Esses tratamentos so operaes unitrias simples, tais como: centrifugao, filtrao, evaporao, precipitao secagem, etc. As preparaes enzimticas podem ser comercializadas sob diferentes formas, p, lquida, liofilizadas, concentrada, imobilizada, etc. Nos casos de enzimas intracelular (endocelulares), a recuperao mais difcil e supe uma etapa complementar de triturao ou lise das clulas microbianas. Aps este tratamento, essas enzimas so purificadas como as enzimas extracelulares. As formas lquidas so mais fceis de utilizar que as formas desidratadas, porm estas tem maior estabilidade para conservao.
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ESQUEMA GERAL PARA A PRODUO E PROCESSAMENTO DE ENZIMAS
Produtos Celulares Imobilizados Procedimento de Imobilizao Separao Liq /Sol Descarte do lquido Tratamento Posterior e formao de partculas Secagem Produto Slido Ex. glucose isomerase
Fonte de Cultivo Propagao Fermentao Separao das clulas do Meio Produtos intracelulares Liberao da enzima Separao de Sol/liq Slido descartado Concentrao do lquido Purificao e estabilizao Secagem Produto Lquido Produto Slido Ex.: glucose oxidase
Produtos Extracelulares Separao do caldo Descarte de slidos Concentrao do lquido Purificao e estabilizao Secagem Produto lquido Produto Slido Ex. Proteases Proteases Amilases Pectinases
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x/s =coeficiente de rendimento de biomassa

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R-CHO + 2H+ + 2e- + energia

R-COOH + 2H+ 2e- + Energia

R-COOH + CO2 + 2H+ + 2e- + Energia

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CINTICA DO CRESCIMENTO MICROBIANO

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t G = --- = z METABOLISMO MICROBIANO

t -------------------3,322 log Nf/Ni

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FIGURA 6 - Variao da Concentrao de Substrato em Funo do Tempo

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FIGURA 7 - Variao da Concentrao de Produto em Funo do Tempo

FIGURA 8 - Relao entre a Velocidade de crescimento e Concentrao de Substrato

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