Contagem de coliformes totais e

coliformes termotolerantes em alimentos

Profa Leila Larisa Medeiros Marques
Definição
 COLIFORMES TOTAIS: grupo de bactérias constituído por
bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não
formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na
presença de sais biliares e que fermentam a lactose com produção
de aldeído, ácido e gás a 35ºC em 24-48 horas. O grupo inclui os
seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.

 COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES

TERMOTOLERANTES: são coliformes capazes de se
desenvolver e fermentar a lactose com produção de ácido e gás à
temperatura de 44,5 ± 0,2°C em 24 horas. O principal
componente deste grupo é Escherichia coli, sendo que alguns
coliformes do gênero Klebsiella e Citrobacter também apresentam
essa capacidade.
Definição
Coliformes- significado em alimentos
 Totais: Utilizado para avaliar as condições higiênicas,
sendo que altas contagens significam contaminação pós-
processamento, limpezas e sanificações deficientes,
tratamento térmicos ineficientes ou multiplicação durante o
processamento ou estocagem.
 Termotolerantes: empregado como indicador de
contaminação fecal, ou seja, de condições higiênico-
sanitárias, visto presumir-se que a população deste grupo é
constituída de uma alta proporção de E. coli, que tem seu
habitat no trato intestinal do homem e de outro animais.
Além de indicar possibilidade de presença de outros
patógenos entéricos.
 Técnicas

» Plaqueamento (sólido): aplica-se a amostras de matérias-

primas, alimentos e rações, devendo ser utilizada quando o limite
máximo tolerado ≥ 100 UFC/g ou mL.

»NMP (líquido) em alimentos: aplica-se a amostras de matérias-

primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite
máximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL.

»NMP (líquido) em água e gelo: Aplica-se a amostras de água e

de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. O
valor é obtido em NMP/100mL.
 Pesquisa de coliformes: método em placas.
Amostra: açúcar cristal, morango, coxinha, hambúrguer ,
bolacha recheada e amendoim cru

Técnica: Contagem em placas, Plaqueamento

em profundidade, plaqueamento sobrecamada
ou pour plate
 Ágar cristal violeta (VRBA)
 sais biliares e cristal violeta que inibem Gram+;
 Vermelho neutro (indicador)- revela a fermentação da lactose.

Caldo verde brilhante bile 2% lactose

 Bile bovina e corante verde brilhante que inibem Gram+.

Caldo EC
 Sais biliares – inibem Gram+;
 Mistura de fosfatos– impedem a acidificação do meio.

Ágar eosina azul de metileno (EMB)

 Eosina e azul de metileno são corantes inibidores de Gram +. Com a
fermentação da lactose e produção de ácido, ocorre precipitação desses corantes
que fornecem o brilho verde metálico característico da E. coli.
IN 62, 2003

Ler capítulo VI
 Plaqueamento sobrecamada

15 mL

Em posição invertida

Prova presuntiva
Selecionar 3 colônias típicas e
para coliformes totais 3 atípicas para investigar

Prova confirmativa Cada colônia para um caldo verde brilhante

para coliformes totais

Prova confirmativa Para cada tubo positivo no caldo

verde brilhante passar para um
para coliformes
45C°/24 a 48h
tubo de caldo EC
termotolerantes
Colônias em VRBA e Caldo EC
 Colônias típicas e atípicas
Caracterização da E. coli
De cada tubo EC positivo
 Expressão dos resultados
R =(C x c x d)/r
 R = Resultado
 C = número de colônias contadas Atenção!!!
 c = número de colônias confirmadas Será um cálculo para coliformes
totais, outro para coliformes
 r = número de colônias repicadas termotolerantes e outro para E. coli!!!!
 d = diluição utilizada

Resultado final= Rt (colônias típicas) + Ra (colônias atípicas)

 Exemplo de resultado parcial
Diluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10 atípicas.

 Para confirmação de coliformes a 35°C, foram repicadas 5 colônias de cada tipo.

 Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos.
 Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas:
 RT = ?

 Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas:

 RA = ?

 O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas:

 Resultado final = RT + RA = ????????????? UFC/g ou mL de coliformes a 35°C..

 Exemplo de resultado parcial
Diluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10 atípicas.

 Para confirmação de coliformes a 35°C, foram repicadas 5 colônias de cada tipo.

 Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos.
 Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas:
 RT = 20 x 4 x 100/5 = 1.600

 Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas:

 RA = 10 x 2 x 100/5 = 400

 O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas:

 Resultado final = RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/g ou mL de coliformes a

35°C.
 Exercício
1. Na placa de VRBA e diluição 10-2 = 20 colônias contadas, das quais 15 eram típicas e
5 atípicas; Para confirmação, foram repicadas 3 colônias de cada tipo para tubos
verde brilhante e depois para tubos EC;
2. Todos os tubos de caldo verde brilhante repicados deram positivos para a
confirmação de coliformes totais;
3. Para confirmação de coliformes termotolerantes, obtiveram-se dos 3 tubos
repicados de colônias típicas, 2 positivos; e das 3 atípicas repicadas, 1 positiva.
4. Na pesquisa de E. coli, dos 3 tubos EC repicados (tanto de típicas quanto atípicas), 1
placa EMB típico deu positivo e 1 atípico positivo para E. coli.

Diante destes resultados, pergunta-se:

1. Qual o valor para coliformes a 35°C?
2. Qual o valor para coliformes a 45°C?
3. Qual o valor de E. coli/mL?
 Pesquisa de coliformes:
Número mais provável (NMP)
Amostra: leite em pó, leite pasteurizado, água, açúcar refinado,
leite fermentado, conserva de vegetais
NMP
 Técnica do número mais provável ou técnica dos tubos múltiplos-
estimativa da quantidade de MO presentes na amostra;
 Pelo número de tubos positivos em cada uma das diluições
empregada determina-se o Número Mais Provável por grama de
produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três,
cinco ou dez tubos;
 Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população
presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a
população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre
a população de coliformes de origem fecal (coliformes
termotolerantes)
NMP
 a) Teste presuntivo para coliformes totais– visa detectar a
presença de microrganismos fermentadores de lactose. Meio
utilizado: caldo lauril sulfato triptose. Princípio: turvamento
e produção de gás, evidenciado pelo tubo de Durham.
 b) Teste confirmativo para coliformes totais-meio caldo
verde brilhante lactose Bile 2%. Princípio: turvamento e produção
de gás por bactérias gram negativas, características do grupo
coliforme.
 c)Teste confirmativo para coliformes termotolerantes-
utilização do meio de cultura seletivo “Caldo EC” e incubação em
44-45ºC. Princípio: turvamento e produção de gás, evidenciado
pelo tubo de Durham.
 c) Teste completo para pesquisa de E. coli - provas
bioquímicas.
Poder tamponante

Inibem
Gram+

Inibe
Gram+
Inibe Gram+
IN 62, 2003

Ler capítulo X e
grupo da água
capítulo IX
 10-1 10-1

10-2
222
00222
10 mL 1 mL 1 mL

1 série em [ ] dupla do meio

NMP –
série 3 tubos De cada tubo positivo:
(alimentos
sólidos)

Para cada EC+, um EMB

2 colônias caract. de cada

EMB em tubo de AN
 100
10-1 10-2

NMP –
De cada tubo positivo:
série 3
tubos
(produtos
líquidos)
Para cada EC+, um EMB

2 colônias caract. de cada

EMB em tubo de AN
De cada tubo AN
Exemplo
Tubos positivos
 10-1
3

 10-2
3

1
 10-3
Técnica de
esgotamento
– por estrias
Técnica de esgotamento – por estrias
Em todos os tubos e placas
de TODAS as etapas,
identificar o número da
equipe, o nome da amostra e
o mais importante a
DILUIÇÃO que está ou a
DILUIÇÃO precedente !!!!!
Combinação tubos positivos 3:3:1 = 460 UFC/g ou mL, com
95% probabilidade de estar entre 90 e 2000 UFC/g ou mL
 A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP
para inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL.

 OBS: Para obter o NMP/g ou mL, para séries de 3 tubos, com inóculos de 1,0, 0,1 e 0,01
g ou mL, e respectivos intervalos de confiança 95%, dividir por 10 os valores da Tabela
1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na análise.
 NMP- água e gelo

 Quando o limite de aceitação for <2,0/100mL, usar série de

5 tubos.

 Quando o limite de aceitação for <1,0/100mL, usar série de

10 tubos.
De cada tubo positivo:
De cada tubo positivo:
 Padrões microbiólógicos
Produto Tolerância Tolerância para Legislação Técnica a ser
para amostra amostra indicativa – utilizada
indicativa – Coliformes
Coliformes Termotolerantes ou
Totais ou a a 45°C
35°C

Água para Ausência em Ausência em 100mL Portaria 518, NMP – série de 10

consumo humano 100mL 2004 tubos

Leite 4NMP/mL 2NMP/mL IN 62, 2011 NMP – série de 3

pasteurizado tubos- amostra pura

Leite em pó - 10NMP/g RDC 12, 2001 NMP – série 3 tubos-

amostra diluída
(10mL na primeira
diluição)
Açúcar cristal - 102UFC/g RDC 12, 2001 Plaqueamento
Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004
Testes bioquímicos para coliformes-
identificação da E. coli
1. Prova do Indol;
2. Vermelho de metila-VM;
3. Voges-Proskauer-VP;
4. Citrato.
Escherichia coli
É um indicador de contaminação fecal.

A presença de número considerável indica:

- Processamento térmico inadequado;
- Recontaminação após processamento;
- Proliferação microbiana no alimentos que irá permitir a
possível multiplicação de MO patogênicos.
 1. Prova do Indol
Triptofano triptofanase Indol + ácido pirúvico + amônia
desaminação

+ p-dimetilaminobenzaldeído +HCl + álcool (reativo de Kovacs)

Composto quinoidal (vermelho)

CH2 do anel pirrólico da molécula do indol + o aldeído

em meio ácido= quinona
 2. Vermelho de metila-VM

ácido láctico
ácido acético
Glicose fermentação ácido fórmico
ácido mista ácido succínico
ácido etílico
INDICADOR:
Vermelho de metila – escala de 4,4 a 6,0.
pH 4,4 cor vermelha - prova positiva
pH 6,0 cor amarela (acetoína) - prova negativa
 3. Voges-Proskauer-VP
Glicose
Fermentação
butilenoglicol
2 ác. pirúvico
Agente
descarboxilação oxidante

Acetilmetilcarbinol + ∝-naftol +KOH 40% Diacetila

(acetoína)
Catalisador

Diacetila + núcleo guanidina do ∝-naftol condensação Composto

Vermelho

OBS .: cor cobre é resultado negativo

 4. Citrato Indicador de pH: azul de bromotimol
pH 8,4=coloração azul-da-prússia
pH 6,9= coloração verde
pH 6,0= coloração amarela
ciclo de Krebs ;

Citrato citratase
ciclo da fermentação do citrato

Citrato piruvato + CO2

CO2 + sódio carbonato de sódio

Amônia como
pH
alto
fonte de N
Resultado das provas bioquímicas da E. coli

Resultado das
provas
bioquímicas
demais
bactérias