ETEC Osasco II – Vila dos Remédios
Disciplina: Microbiologia e Higiene dos Alimentos
Prof. Vitor Amaral, Jorge Luis e Luiz Henrique
Curso/Módulo: 1°MAN, 3°QN, 3°QT e 1°NDT
Nome:________________________________
Nº______
Módulo e Período:________
Aula Prática 3 - Técnica de Coloração GRAM
INTRODUÇÃO
Uma vez que os microrganismos são
transparentes quando vimos ao microscópio, é
frequente o uso de corantes para melhor
visualização, ou seja, melhorar o contraste entre o
fundo e as bactérias coloridas. Assim, podemos
identificar seu formato e do arranjo de colônia. O
método de coloração mais empregado em
bacteriologia é a Coloração GRAM.
O termo GRAM surgiu do nome do
pesquisador dinamarquês chamado de Christian
Gram, que me 1884, desenvolveu de maneira
empírica (experiência de acerto e erro) o método
de coloração que passou a ter o seu nome e que
permite identificar e dividir as bactérias em dois
grandes grupos: GRAM positivas e GRAM negativas.
Esta coloração está intimamente ligada ao tipo de
parede que certas bactérias possuem.
A parede de bactérias GRAM positivas com
tem uma espessa camada de peptídeoglicano (20
camadas) como proteção mecânica e osmótica. Já a
parede de bactérias GRAM negativas possuem uma
camada delgada de peptídeoglicano e uma
membrana externa com Lipopolissacarídeos (LPS),
considerados de acordo com os pesquisadores
como endotoxinas.
Antes da coloração GRAM as amostras de 1° Passo – Fixação
bactérias devem ser fixadas na lâmina de vidro por
calor (fixação), atentando sempre com o tempo de
exposição à chama, pois podem matar a bactérias
de interesse.
OBJETIVOS DA AULA
O objetivo da aula é ensinar aos alunos dos
cursos de nutrição, química e meio ambiente a
coloração GRAM e seus passos e exemplificar a
parte teórica dos tipos de parede bacteriana e suas
implicações na saúde e no seu controle.
MATERIAIS
- Lâmina de vidro
- Água destilada
- Álcool ou 95 ou 99%
- Álcool 70%
- Solução de Cristais de Violeta (corante)
- Solução de Lugol (fixador ou mordente)
- Solução de Fucsina (corante)
- Amostra de bactéria isolada
- Alça de platina
- Papel toalha
- bico de bunsen
METODOLOGIA
Coloração GRAM
Lavagem da Lâmina - a lâmina de vidro deve antes
ser lavada com álcool 70% para desengordurar e
em seguida, lavada com água destilada para retirar
os resíduos do álcool.
Pingar uma gota de água destilada no meio da
lâmina. Coletar uma amostra de bactéria (colônia
isolada e pura) com a alça de platina previamente
flambada e esfriada. Homogeneizar e espalhar a
amostra coletada na gota de água. Passar
levemente no fogo para secar e fixar a amostra de
bactérias no vidro sem que a lâmina esquente
demais.
2° Passo – Cristais de Violeta
Pingar algumas gotas de cristais de violeta na
amostra fixada e deixar agir por 1 min. Desprezar o
restante do corante.
3° Passo – Fixador do corante cristal de violeta
Pingar a solução de lugol e deixar agir por 1 min.
Desprezar o restante.
4° Passo – Lavagem com álcool
Lavar a lâmina com álcool 99% ou 95% até parar de
sair corante. Em seguida lavar com água destilada
para retirar os resíduos de álcool.
5° Passo – Fucsina ou Safranina
Pingar algumas gotas de fucsina ou safranina na
amostra e deixar agir por 1 min. Desprezar o resto e
lavar com água destilada até para de sair corante.
Deixar secar à temperatura ambiente em cima do
papel toalha.
6° Passo – Observação
Depois de seca observar em microscópio ótico com
as objetivas de 4X, 10X, 40X e 100X com o óleo de
imersão. Identificar o formato, arranjo de colônia e
qual grupo GRAM as bactérias pertencem. Isso
devera ser feito em cada lâmina.
RESULTADOS
Os resultados devem ser analisados ao
microscópio ótico através da lente objetiva de 100x,
juntamente com o óleo de imersão. As
características microscópicas das colônias deverão
ser organizadas da seguinte forma:
Lâmina n°:____
Nome da Placa (tipo de coleta e local):
Características da Macrocolônia:_______________
__________________________________________
Formato da célula:__________________________
Arranjo de colônia:__________________________
Coloração GRAM:__________________________
Aumento: 100X
Deve ser feito um esboço do que foi
visualizado no microscópio para cada lâmina
observada, respeitando os formatos arranjo de
colônia e coloração. Caso tenham tirado foto,
colocá-la para exemplificar ao invés desenhar.
CONCLUSÃO
1) Por que as bactérias GRAM positiva coram
com o corante cristal de violeta e as GRAM
negativas coram com a fucsina?
2) Faça um esquema explicando as estruturas ANEXO – Esquema da Técnica da Coloração
presentes nas paredes de bactérias GRAM GRAM.
positiva e negativas.
3) Por que é essencial no passo quatro a
lavagem com o álcool 95 ou 99%? Explique.
4) Se eu inverter os corante a coloração dará
certo?
5) Qual a finalidade da coloração para a
bacteriologia?
REFERÊNCIAS
Microbiologia de Brock – 10ª Ed.
Microbiologia – Trabulsi e Alterthum. 5ª Ed.
Atheneu, 2008.
Anotações:________________________________
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