Coloração

Coloração de Gram

Vicente Senna Jr
 Introdução
A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a
seu descobridor, o médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim
Gram, que em 1884 observou que as bactérias adquiriram cores
diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu
classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que
foram chamadas de Gram positivas, e as que ficavam vermelhas,
chamadas de Gram-negativas.

Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em

Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia
das amostras analisadas.
 A coloração de Gram é o método
bacterioscópico mais importante
e mais utilizado atualmente
na bacteriologia e sua finalidade é
a classificação de microrganismos
com base em suas características
tintoriais, tamanho, forma e arranjo
Celular.
 O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular, sendo
que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido
teicóico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se
encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e
lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-acetona
extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da
parede celular das bactérias Gram-negativas.
Assim, o complexo cristal violeta (CVI) pode ser retirado e as bactérias Gram-
negativas são descoradas. A parede celular das bactérias gram-positivas, em virtude de
sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-
acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode
ser extraído.
Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois
grupos de bactérias. Nas Gram-positivas, o complexo CVI é retido na parede após
tratamento pelo álcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição do
diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. A
parede das bactérias Gram-negativas permanece com porosidade suficientemente
grande, mesmo depois do tratamento com álcool acetona, possibilitando a extração do
complexo CV-l.
 Princípio do Método

O método da coloração de Gram é baseado

na capacidade das paredes celulares de bactérias
Gram-positivas de reterem o corante cristal
violeta no citoplasma durante um tratamento com
etanol-acetona, enquanto que as paredes celulares
de bactérias Gram-negativas não o fazem. É um
dos mais importantes métodos de coloração
utilizados em laboratórios de microbiologia,
sendo quase sempre o primeiro passo para a
caracterização de amostras de bactérias.
 Vantagens

• É possível a análise de vários

esfregaços por lâmina.

• As lâminas podem ser montadas

de forma permanente e preservadas
como documentação.
 Descrição da técnica
O método consiste no tratamento de uma
amostra de uma cultura bacteriana crescida em
meio sólido ou líquido, com um corante
primário, o cristal violeta ou azul de metileno,
seguido de tratamento com um fixador, o lugol.
Tanto bactérias Gram-positivas, quanto Gram-
negativas absorvem de maneira idêntica o
corante primário e o fixador, adquirindo uma
coloração violeta/roxa devido à formação de um
complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em
seus citoplasmas.
 Segue-se um tratamento com um
solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O
solvente dissolve a porção lipídica das
membranas externas das bactérias Gram-
negativas e o complexo cristal violeta-iodo é
removido, descorando as células. Por outro
lado, o solvente desidrata as espessas paredes
celulares das bactérias Gram-positivas e
provoca a contração dos poros do
peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao
complexo; o corante primário é retido e as
células permanecem coradas.
 A etapa da descoloração é crítica,
pois a exposição prolongada ao
solvente irá provocar a remoção do
cristal violeta dos dois tipos de
bactérias, podendo produzir resultados
falsos. A retenção, ou não, do corante
primário é, portanto, dependente das
propriedades físicas e químicas das
paredes celulares bacterianas tais como
espessura, densidade, porosidade e
integridade.
 Em seguida, a amostra é tratada com um corante
secundário, a fucsina básica ou safranina. Ao
microscópio, as células Gram-positivas aparecerão
coradas em violeta/roxo e as Gram-negativas em
vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-
positivas, células velhas, mortas ou com envelopes
danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a
perder o cristal violeta e uma mesma amostra
bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas
como Gram-negativas. Portanto, o uso de material
fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo
"falso Gram-positivos" só são obtidos se o tratamento
com etanol-acetona for omitido.
OBSERVAÇÕES:

1 - O corante cristal violeta pode ser

substituído, com os mesmos resultados,
pelo azul de metileno e a fucsina básica
pode ser substituída pelo corante vermelho
safranina. A fucsina cora muitas bactérias
Gram-negativas mais intensamente que a
safranina, que por sua vez não cora
prontamente algumas espécies de bactérias.
O solvente etanol-acetona pode ser
substituído por álcool 95%.
 2 – A técnica da coloração de Gram não é
infalível e pode-se fazer o teste do hidróxido de
potássio (KOH). Em um lâmina de microscopia
adicionam-se duas gotas de uma solução de KOH a
3%. Com o auxílio de uma alça de semeadura coleta-se
uma colônia isolada da bactéria a ser testada e mistura-
se com a solução de KOH na lâmina por 30 segundos.
Durante a mistura deve-se erguer a alça de semeadura
cerca de 1 a 2 cm da superfície da lâmina observando-
se se há fios de material viscoso pendentes. Se a
bactéria for verdadeiramente Gram-negativa, o KOH
irá romper sua parede celular e liberar seu DNA que
será observado como fios viscosos. Se a bactéria for
Gram-positiva não haverá a formação de fios.
 Material
• Óleo de cedro. • Culturas bacterianas em
• Pinça; meio sólido ou líquido;
• Corante CRISTAL
• Água destilada;
VIOLETA;
• Microscópio óptico e • Corante FUCSINA
bico de Bunsen; BÁSICA;
• LUGOL;
• Etanol-acetona (1:1 v:v);
• Lâmina para
microscopia;
• Alça de platina (ou
descartárvel);
 Composição dos corantes
Solução de Cristal Violeta

Solução A Solução B

Cristal violeta 2,0 g Oxalato de amônia 0,8 g

Etanol:Acetona 20 ml Água destilada 100 ml
Misturar as soluções A e B e deixar em repouso por 24 horas antes do uso.
 Solução de Fucsina
Fucsina 1,0 g
Água destilada 100 ml

Solução de Lugol
Iodo 1,0 g
Iodeto de potássio 2,0 g
Água destilada 100 ml
 Preparação dos corantes

NOTA: Na maioria dos casos é

melhor adquirir os corantes já
prontos, que são vendidos por
empresas especializadas.
 Procedimentos
Preparo do esfregaço
• Suspenda uma pequena porção da amostra bacteriana a
ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%,
sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota.
Este procedimento deve ser feito com um alça
bacteriológica flambada, descartável ou uma agulha de
platina flambada ou descartável.

• Em seguida, fixe-o com calor, flambando rapidamente

a lâmina acima da chama de um bico de bunsen.
 Aplicação do corante primário
• Cubra toda a área do esfregaço na lâmina com o corante
cristal violeta e deixe em repouso por um minuto ;
• Descarte o excesso de corante e enxague a lâmina com
água.

Aplicação do fixador
• Cubra toda a sua superfície da lâmina com lugol e deixe
em repouso por um minuto;
• Descarte o excesso do fixador e enxague a lâmina com
água.
Descoloração
• Com a lâmina inclinada, despeje algumas gotas
de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para
remover o complexo cristal violeta-lugol. Este
procedimento não pode exceder a cinco segundos,
pois o descolorizador poderá remover o corante
cristal violeta das células gram-positivas;
• Enxague a lâmina com água para remover
excesso de solvente.
Aplicação do corante secundário
• Cubra toda a sua superfície da lâmina com o
corante fucsina básica; deixe em repouso por trinta
segundos;
• Enxague a lâmina com água e seque-a com papel
toalha, lenço de papel ou deixe em estufa até a
completa secagem da lâmina.
Microscopia

• Pingue uma gota de óleo de cedro na área

do esfregaço na lâmina. O óleo de cedro
serve para ampliar o campo de visão na
lâmina.
• Examine a amostra ao microscópio óptico
em objetiva de imersão (100X).
OBS:

Na aplicação da técnica de coloração de gram de organismos desconhecidos, pode-se

utilizar como controles uma bactéria gram-positiva e uma gram-negativa conhecidas,

preparando-se lâminas com três esfregaços, sendo o esfregaço central o da bactéria

desconhecida. Desta forma, as bactérias controles indicarão se a técnica foi ou não bem

sucedida. Sugere-se utilização de Bacillus subtilis, Escherichia coli e Staphylococcus

aureus como controles bacilos gram, gram negativos e cocos gram positivos,

respectivamente.
 Resultados esperados

As figuras 1 a 4 são micrografias

ópticas de bactérias coradas pelo
método de gram. As figuras 1 e 2
mostram bacilos e cocos gram
positivos, respectivamente e as figuras
3 e 4 mostram bacilos e cocos gram
negativos, respectivamente.
Figura 1. Bacillus subtilis Figura 2. Staphylococcus aureus
Figura 3. Escherichia coli Figura 4. Neisseria gonorrhoeae
 Como armazenar os corantes?

Os recipientes utilizados para os corantes

devem ser de cor âmbar escuro, pois, de forma
geral, as substâncias corantes são fotossensíveis,
produzindo alterações variadas. Sempre que os
frascos com os corantes forem reabastecidos, filtre
o corante. Este procedimento evitará os
inconvenientes advindos da precipitação do
corante.
 Conclusão
A coloração de gram não serve para identificarmos
microrganismos em relação a gênero e espécie, ela apenas
nos fornece dados a respeito da sua morfologia. Para
obtermos informações como gênero e espécie, devemos dar
prosseguimento à identificação, realizando testes
complementares, como os testes da CATALASE e
COAGULASE, (para chegarmos à espécie Staphylococcus
aureus), OXIDASE (para chegarmos à espécie
Pseudomonas aeruginosa ou Enterobactérias), etc.