Escola Superior de Ciências Marinhas e Costeiras

Curso de Licenciatura em Biologia Marinha

Monografia para Obtenção do Grau de Licenciatura em Biologia Marinha

Estudo da Sensibilidade de Antibióticos de Escherichia coli isolada no Estuário dos

Bons sinais Cidade de Quelimane

Autor:
Ntaça Augusto Ntaça
 Escola Superior de Ciências Marinhas e Costeiras
Curso de Licenciatura em Biologia Marinha
Monografia para Obtenção do Grau de Licenciatura em Biologia Marinha

Estudo da Sensibilidade de Antibióticos de Escherichia coli isolada no Estuário dos

Bons sinais Cidade de Quelimane

.
Autor: Supervisor:
Ntaça Augusto Ntaça Msc: Mauro Gabriel Uqueio,

Quelimane, Outubro de 2021

 CAPÍTULO I

1. INTRODUÇÃO
1.1. Contextualização

A microbiota intestinal humana é extremamente rica e diversa. Os microrganismos

membros desta comunidade, a princípio, não são agentes de doenças entéricas, mas, em
situações específicas, estão associados à etiopatogenia de infecções em outros órgãos
(Moreira, 2018). Encontram-se, nesse grupo, os denominados coliformes totais, vários
géneros bacterianos da família Enterobacteriaceae como, por exemplo: Enterobacter,
Citrobacter, Serratia, Klebsiella, Proteus e Providencia, além das amostras indígenas de E.
coli. A espécie Escherichia coli é tida como indicador de contaminação fecal recente,
devido ao habitat intestinal preferencial (Baptista, 2013).

Escherichia coli é uma bactéria mesófila típica, com crescimento óptimo a temperaturas
entre os 30 a 37 ºC, não crescendo normalmente a temperaturas inferiores a 8-10 ºC ou
superiores a 44-45 ºC (Guerreiro, 2012). É Gram negativa, anaeróbia facultativa, não
esporulada, com forma de bastonetes de extremidades arredondadas (com cerca de 1,1 – 1,5
mm de diâmetro e 2 a 6 mm de comprimento, Pode ser móvel). É b-D-glucuronidase
positiva (fermentam a lactose), fermentadora da glucose, produtora de catalase e citocromo
c-oxidase negativa. Pode ser móvel, contendo múltiplos flagelos (Vaz, 2014).

A diarreia é um dos problemas de saúde pública e uma das maiores causas de mortalidade
em bebés e crianças. As estirpes de Escherichia coli envolvidas em doenças que causam
diarreia são um dos agentes etiológicos mais importantes, uma vez que estas estirpes
evoluíram pela aquisição (através da transferência horizontal de genes) de um conjunto
particular de características que persistiram com sucesso no hospedeiro (Gonçalves, 2018).
Outras doenças envolvidas com a contaminação por Escherichia coli são infecções
urinárias, doenças respiratórias e pneumonias (Quintas, 2014).
Para combater estes organismos são usados antibióticos, porém, o seu uso excessivo,
incorrecto e um pouco desequilibrado tem feito com que as bactérias ganhem resistência a
estes antibióticos e se tornem mais difíceis de serem tratadas (Gonçalves, 2018).
Neste âmbito, preocupado com a saúde pública da comunidade residente no Estuário dos
Bons Sinais e em geral na província da Zambézia, propõe-se esta pesquisa como contributo
ao conhecimento da saúde ambiental daquela comunidade.
 1.2. PROBLEMATIZAÇÃO

A bactéria Escherichia coli é considerada o principal agente causador de infecções

entéricas causadas pela água e alimentos contaminados, principalmente em grupos
populacionais que não dispõem de sistema de saneamento, ou, que apresentam imunidade
vulneráveis como os idosos e crianças (Quintas, 2014). Este é o caso da população que vive
ao longo de zonas costeiras em Moçambique, particularmente na região costeira da
província da Zambézia na cidade de Quelimane, no qual a falta de sistema de saneamento
básico leva grande parte da população a depositar seus excrementos sólidos em locais
inapropriados, sendo os mangais o local de maior preferência.
Uma vez que os mangais são zonas ribeirinhas que frequentemente são bainhadas por
marés, os excrementos são arrastados por acção das ondas para regiões diversas que
incluem o próprio estuário, para corpos hídricos interiores como poços, entre outros. Mais
grave ainda, é a contaminação de produtos comerciais como o pescado, uma vez que este
produto atinge maior número de consumidores.

De acordo com Baptista (2013) a resistência aos antibióticos pode ser intrínseca (também
chamada de natural), se a bactéria possuir características estruturais ou enzimáticas que
levam à resistência a um determinado antibiótico, ou, na maioria das vezes, adquirida. A
resistência adquirida refere-se a quatro grandes grupos, que são, a alteração da
permeabilidade ou do local de acção do antibiótico, bombas de efluxo e o mecanismo
enzimático da degradação ou inactivação do antibiótico.

Desta forma, surge a seguinte pergunta de pesquisa. Serão as bactérias E. coli do Estuário
dos Bons Sinais resistentes a antibióticos?

1.3. JUSTIFICATIVA.

O estudo da resistência a antibióticos dos organismos patogénicos é de suma importância,

uma vez que pode indicar o grau de alteração dos ecossistemas pela acção humana, além
identificar o grau de vulnerabilidade da população a exposição de várias doenças
peculiares. A resistência microbiana pode ser transferida por diversos mecanismos,
podendo estabelecer-se entre espécies da mesma população ou diferentes populações, tanto
da microbiota animal para a humana como vice-versa.

Estudos realizados em 29 países da comunidade europeia, relativos à resistência

bacteriana entre 2008 e 2011 revelaram um crescimento da mesma em bactérias Gram
negativas, como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa. Em
termos percentuais, um dos maiores problemas é a resistência da Escherichia coli à
Fluoroquinolonas e Aminoglicosídeos que tem vindo a aumentar ao longo dos anos, e
embora nos últimos quatro anos se tenham mantido estável, a sua percentagem continua
elevada (16 a 27% ao ano) (Baptista, 2013).

Em Moçambique, a incidência de doenças causadas por E. coli é maior em crianças com

idades iguais ou inferiores aos 3 anos. Tal como acontece com a maioria dos patógenos na
área rural de Moçambique, E. coli mostrou ter elevados níveis de resistência aos
antibióticos de primeira linha recomendados a nível nacional e de baixo custo: 78% dos
isolados foram não susceptíveis ao cloranfenicol e uns alarmantes 96% dos isolados foram
resistentes à ampicilina/penicilina. Só 4% dos isolados foram resistentes ao ácido nalidíxico
e 1% à ciprofloxacina.

É essencial consciencializar a sociedade sobre este problema, principalmente numa

sociedade onde os serviços de saúde são precários vale difundir este conhecimento como
meio de incentivo para a adopção de princípios preventivos. Assim a resistência bacteriana
não é um problema de cada individuo, mas sim um problema da sociedade.
Portanto é importante fundamentar a realização de antibiogramas para a avaliação de perfil de
sensibilidade aos antibióticos, pois permite que os cientistas escolham entre as diversas
alternativas terapeuticas os antibioticos mais indicados ao tratamento. Investigar a resistências
desses-microorganismos isoladas de águas, é importante devido ao desenvolvimento de
bactérias multirresistentes patogenicas ou comensais de seres humanos e animais e sua
disseminação no meio ambiente (Miranda, 2013).
1.4. OBJECTIVOS.
1.4.1. Geral
Estudar a sensibilidade a antibióticos da bactéria Escherichia cóli em amostras
ambientais.
1.4.2. Específicos

 Isolar as cepas e estirpes da bactéria E. coli, retiradas nas amostras de águas no

estuário dos bons sinais;
 Determinar a prevalência
 Determinar a sensibilidade a antimicrobianos de E. cóli, provenientes de amostras
ambientais;
 Avaliar a resistência dos isolados de Escherichia coli aos antibioticos de Penicilinas
e Cloranfenicol, identificado nas amostras de águas.
 .

CAPÍTULO II
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Indicadores de qualidade de água
O conceito de qualidade da água está relacionado com o uso a que a água se destina (Fonseca
& Lima, 2011). No caso do presente trabalho, a qualidade da água esta relacionada com
parâmetros físico-químicos, biológicos e geoquímicos e pode ser avaliada a partir de
bioindicadores, que é a observação e acompanhamento da espécie ou grupo indicador durante
um intervalo de tempo, visando obter informações sobre a condição do ambiente e mudanças
nas comunidades biológicas (Pimenta et al., 2016). Alguns destes parametros são pH,
Oxigenio dissolvido, macro e micronutrientes, Clorofilas, Coliformes termotolerantes e totais,

Para a avaliação da qualidade microbiológica da água usualmente é realizada a pesquisa e

quantificação de Clostridium perfringens e de coliformes termotolerantes. Os coliformes
termotolerantes são os microrganismos amplamente utilizados para avaliação da poluição de
origem fecal recente, sendo constituídos predominantemente pela bactéria Escherichia coli,
considerada o indicador mais adequado (Miranda, 2013).

Os clostrídios, também constituintes da flora fecal humana e de animais de sangue quente, são
considerados importantes indicadores biológicos e a sua presença pode ser natural ou causada
por descargas de origem antrópica. Por serem microrganismos produtores de esporos são
capazes de resistir por muito mais tempo no ambiente em comparação aos coliformes
termotolerantes. Clostridium perfringens é usado como indicador de poluição fecal remota.
Sabe-se que a concentração dessa espécie diminui com a profundidade e com a distância das
fontes de esgoto (CETESB, 2019).

As interacções bióticas são também muito importantes. Listagens de espécies, densidades

populacionais, mudanças sazonais na biocenose e diversidade da comunidade em condições
naturais (não poluídas), são informações necessárias para avaliar as mudanças na qualidade da
água com bases biológicas (Silva, et al., 2008).
Figura 1. Factores que influenciam a qualidade das águas costeiras. Fonte: CETESB (2019).

2.2 Escherichia coli

De acordo com Santiago et al.,(2013) Escherichia coli são bacilos Gram negativos
pertencentes à família Enterobacteriaceae, anaeróbica facultativa que colonizam o trato
gastrintestinal infantil, tornando-se um hospedeiro mutualista, embora em pacientes
debilitados ou imunossuprimidos, possam causar infecção.

Escherichia coli é o principal agente etiológico de infecções entéricas causada pela água e
alimentos contaminados, principalmente em grupos populacionais que não dispõem de sistema
de saneamento, ou se apresentam vulneráveis como os idosos e crianças
imunocomprometidos, é o indicador de contaminação de origem fecal mais comummente
utilizado, pois ocorre em grande número na microbiota intestinal de humanos e animais
(Vasconcelos, et al., 2010).
A maioria das linhagens de E. coli são comensais, algumas podem causar uma variedade de
doenças, incluindo diarréia, disenteria, síndrome hemolítica-urêmica, infecções de bexiga e
rim, septicemia, pneumonia e meningite (Carvalhais, 2015). A diversidade destes
microorganismos tem sido associada ao fato de diferentes linhagens de E. coli terem adquirido
diferentes genes de virulência. Estima-se que 10-20% da informação genética encontrada em
uma espécie de E. coli patogénica não está presente em sua linhagem (Afonso, 2016). Por
exemplo, as linhagens diarreiogênicas de E. coli são classificadas em seis categorias de acordo
com a categoria de patogenicidade: enteropatogênica clássica (EPEC), enterotoxigênica
(ETEC), enteroinvasoras (EIEC) e enterohemorrágica ou produtora de toxina shiga (EHEC),
enteroagregativa (EAEC) e difusamente aderente (DAEC) (Afonso, 2016).

De acordo com Oliveira, et al., (2014) o aparecimento de bactérias resistentes a antibióticos

pode ser considerado como uma manifestação natural regida pelo princípio evolutivo da
adaptação genética de organismos a mudanças no seu meio ambiente. O tempo de duplicação
da Escherischia coli pode ser de apenas 20 minutos, dessa forma há possibilidade de serem
produzidas muitas gerações em apenas algumas horas. Portanto, existem inúmeras
oportunidades para uma adaptação evolutiva. Consequentemente o emprego frequente dos
antibióticos é provavelmente um dos factores responsáveis pelo surgimento da resistência
antimicrobiana.

2.3 Os antibióticos

Os antibióticos são substâncias naturais ou sintéticas que agem sobre microorganismos

inibindo o seu crescimento ou causando a sua destruição (Azevedo, 2014). Os antibióticos são
as classes de medicamentos mais utilizados e mais prescritos tanto para uso intra-hospitalar
quanto para a automedicação. Podem ser classificados como bactericidas, quando causam a
morte da bactéria, ou bacteriostáticos, quando promovem a inibição do crescimento
microbiano (Carvalhais, 2015).
Os antibióticos podem apresentar duas funções distintas, a inibição do crescimento bacteriano
através da acção bacteriostática, e a destruição de uma população bacteriana, por uma acção
bactericida. A acção bacteriostática impede o crescimento das bactérias, mantendo o mesmo
na fase estacionária. Um bactericida actua em processos vitais para a célula levando à morte
celular (Baptista, 2013).

As drogas antmicrobianas exercem o seu mecanismo de acção de várias formas, por

exemplo, interferindo na síntese da parede celular, alterando a permeabilidade da membrana
citoplasmátca, promovendo alterações na síntese proteica, inibindo a síntese de ácidos
nucleicos e interferindo na replicação do cromossomo (Figura 2) (Machado et al, 2019).
Azevedo (2014) divide estes mecanismos em 4 etapasque são:

1. Ruptura da parede celular bacteriana por inibição da síntese de peptídeoglicanos

(penicilina, cefalosporinas, glicopeptídeos, monobactano e carbapenens);
2. Inibição da síntese das proteínas bacterianas (aminoglicosídeos, macrolídeos, tetraciclinas,
cloranfenicol, oxizolidinonas, estrepetograminas e rifampicina);
3. Interrupção da síntese do ácido nucleico (fluoroquinolona, ácido malidixico); e
4. Interferência no metabolismo normal (sulfonamidas e trimetoprima).

Figura 2. Locais de acção dos antmicrobianos. Fonte: Machado et al, (2019).

Legenda: PABA: ácido para-aminobenzoico; DHF: ácido diidrofólico;
THF: ácido tetraidrofólico.
2.3.1 Classificação das famílias dos antibióticos

Ao longo dos anos foram descobertos e posteriormente descritos os antibióticos hoje

conhecidos. Desta forma foi necessário arranjar uma classificação. A classificação mais
comum dos antibióticos baseia-se no seu mecanismo de acção. Assim são descritos cinco
mecanismos de acção, tal como representado na figura 2:

 Inibição da síntese da parede celular;

 Inibição da síntese ou dano da membrana citoplasmática;
 Inibição da síntese proteica nos ribossomas;
 Alterações na síntese dos ácidos nucleicos;
 Alteração de metabolismos celulares.

Os antibióticos de origem natural e seus derivados semi-sintéticos compreendem a

maioria dos antibióticos em uso clínico e podem ser classificados em β-lactâmicos
(penicilinas, cefalosporinas, carbapeninas, oxapeninas e monobactamas), tetraciclinas,
aminoglicosídeos, macrolídeos, peptídicos cíclicos (glicopeptídeos, lipodepsipeptídeos),
estreptograminas, entre outros (lincosamidas, cloranfenicol, rifamicinas etc). Os antibióticos
de origem sintética são classificados em sulfonamidas, fluoroquinolonas e oxazolidinonas

2.4 Resistência de E. coli a antimicrobianos

A descoberta dos antibióticos e quimioterápicos permitiu o controlo e cura das doenças

infecciosas, mudando a evolução natural dessas doenças de forma marcante. Porém, pouco
tempo depois da descoberta, a penicilina antes mesmo de estar disponível para uso clínico, foi
identificada a presença de β -lactamases em bactérias, caracterizando resistência de algumas
espécies e logo o surgimento de resistência adquirida aos antimicrobianos passou a ser um
problema cada vez mais preocupante (Azevedo, 2014).

Os mecanismos de resistência bacteriana consistem na produção das enzimas que

inactivam os antibióticos. Mutações genéticas que alteram os locais de ligação dos
antibióticos, vias metabólicas alternativas que contornam a actividade antibiótica e alterações
na qualidade de filtração da parede celular bacteriana, que impede o acesso de antibióticos ao
local alvo do microrganismo (Santana, 2015).
De acordo com Vasconcelos et al., (2010) o perfil de susceptibilidade de E. coli por grupos de
antimicrobianos como β-lactâmicos, tetraciclinas, quinolonas, nitrofuranos e sulfonamidas,
somente aos β-lactâmicos as cepas não apresentam resistência. Os bacilos gram-negativos
entéricos são na actualidade muito resistentes aos antimicrobianos tradicionalmente activos,
tais como sulfonamidas, a ampicilina, cefalosporinas de terceira geração e fluoroquinolonas. A
susceptibilidade das cepas de E. coli aos β-lactâmicos é satisfatória uma vez que este grupo de
drogas tem sido o mais utilizado no controlo de doenças infecciosas.

Em Escherichia coli, a resistência aos antibióticos β-lactâmicos é

essencialmente por enzimas chamadas β-lactamase por elas sintetizadas, também
denominadas de cefazidimases, codificadas em plasmídeos. Estas enzimas hidrolisam
penicilinas e cefalosporinas, com maior actividade hidrolítica para a cefazidima e são inibidas
pelo ácido clavulânico (Narciso et al., 2010).

Oliveira (2014) em sua pesquisa de resistência a antibióticos com Escherichia coli, Klebsiella
e Proteus, constatou que estes são os micro-organismos que mais apresentam resistência aos
antibióticos, sendo 46,9% a sulfametoxazoltrimetoprim, 46,7% a cefalotina, 27,6% ao ácido
nalidíxico e 22,3% a nitrofurantoína.

Vasconcelos (2010) estudou a resistência de Escherichia coli a oito antibióticos e os resultados

do teste de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos mostraram que 32,6% (14) das cepas
apresentaram resistência a pelo menos um dos oito antimicrobianos usados. Os
antimicrobianos ampicilina, cefoxitina e imipenem apresentaram eficiência de 100% sobre as
cepas.
Cloranfenicol

O cloranfenicol foi isolado a primeira vez no micro-organismo Streptomyces

venezuela. Actualmente, o cloranfenicol é sintetizado e somente o isômero R,R é activo. O
cloranfenicol liga-se à subunidade 30S do ribossomo para inibir o movimento dos
ribossomos ao longo do mRNA, provavelmente pela inibição da peptidil transferase,
responsável pela extensão da cadeia peptídica. Uma vez que o cloranfenicol se liga à mesma
região que os macrolídeos e as lincosamidas, eles não podem ser administrados em
associação (Azevedo, 2014).

São derivados de uma molécula a qual a estrutura química se mostra como uma porção
constituída por propanol ligada a duas hidroxilas alcoólicas, em que se mostram essenciais
para a actividade antmicrobiana. Nesse mesmo ponto, a molécula deve sofrer esterificação
que, ao ser hidrolisada, libera a molécula activa. Devido ao seu baixo potencial de
solubilidade, essas drogas são associadas a ésteres para que possam passar por essa etapa e
liberar a droga activa. Ademais, na molécula do cloranfenicol, observa-se uma estrutura com
composto químico nitroso, sendo este associado a discrasias sanguíneas (CETESB, 2019).

Figura 3. Estrutura química do Cloranfenicol. Fonte: (CETESB, 2019)

Penicilina
As penicilinas foram o primeiro verdadeiro antibiótico a ser desenvolvido e utilizado
contra bactérias patogénicas no ser humano. Actualmente continuam a ser dos
antibióticos mais importantes na terapêutica (Azevedo, 2014).

Assim como os demais betalactâmicos, as penicilinas são bactericidas para os germes

sensíveis, pois agem na parede celular, impedindo que as camadas de peptdoglicano
mantenham-se estáveis, tornando a bactéria mais susceptível à lise osmótca. Todas as
penicilinas apresentam uma mesma estrutura básica que consiste em um anel tazolidínico (B)
ligado a um anel β-lactâmico (A), formando o ácido penicilânico. Este, ao ligar-se a um
grupamento amina no carbono 6, torna-se o ácido 6-aminopenicilânico (6-APA). A adição de
radicais (C) na posição 6 origina as diversas variações de penicilinas com diferentes
propriedades (CETESB, 2019).

Figura 4. Estrutura geral das penicilinas (Wright, 1999). Fonte: Baptista (2013)
 CAPÍTULO III
3. METODOLOGIA
3.1. Área de estudo.

O estuário dos Bons Sinais está localizado na zona centro do país, na Província da Zambézia
entre as coordenadas 17°52’ 24.04” Sul e 36°51’ 26.79” Este, onde faz fronteira a Oeste com a
cidade de Quelimane e a Este com o distrito de Inhassunge (Chaia, não publicado). O estuário
possui uma profundidade média de cerca de 12 metros, largura e comprimento médio de 0.6 e
30 km respectivamente.

O clima da região é tropical húmido marcado por uma estação fria e seca (Agosto-Outubro) e
uma estação quente e húmida (Novembro-Março). A zona é fortemente influenciada pelo
sistema de monções da África Oriental. A salinidade é em geral superior a 24,23 ppt na
estação seca e reduzem na estação chuvosa para 22,3 ppt regista uma precipitação média de
1,84 milímetros na estação seca e na época chuvosa 10,16 milímetros (Nhaca, não publicado).
As temperaturas são em geral superiores à 30ºC na estação quente, mas podem baixar até 20ºC
na estação fria (MAE, 2005).
3.2. Amostragem

Serão amostradas duas áreas com alcance de maré nos locais de maior deposição de
excrementos sólidos ao longo do Estuário dos Bons Sinais durante a maré viva, por ser este
período de maior alcance e consequentemente de maior aporte.

Desta forma, pretende-se colher amostra num dos braços do Estuário dos Bons Sinais
chamada de zona dos pescadores e a outra colecta será feita num local mais afastado do
canal que recebe águas costeiras devido ao fenómeno das marés, este local é vulgarmente
conhecido por Cocotaria. Os pontos amostrais ficarão transversalmente ao canal.

Pretende-se colher um total de cerca de 80 cepas de E. coli, ou seja 40 para cada área
amostral, isoladas de 20 amostras de água em 100 mL provenientes destas áreas. A
identificação das amostras poderá ser confirmada pelo isolamento de colónias
características por meio de método a ser proposto pelo laboratório de microbiologia.

Quantidade de água (Quais parâmetros de água o Dr sugere que eu mesça???), outros

parâmetros (quais parâmetro???)

3.2.1 Isolamento das bactérias E. coli, nas amostras de água

Para isolamento das amostras bacterianas, uma alíquota de 10 μL das amostras de água
serão submetidos a teste de Coliformes totais (Colinert). As testadas positivas, serão
inoculadas em MacConkey Agar. As culturas serão incubadas a 37 °C, por 24 h.
Todos os morfotipos isolados, se possível, cinco colónias de cada morfotipo, serão
cultivados em Tryptic Soy Agar a 37 °C, por 24 h, para obtenção de cultura pura. A
identificação das colónias isoladas serão feitas empregando-se o meio de Rugai.

A sorotipificação do isolado é também importante para caracterização da espécie. Este

agente é classificado sorologicamente em sorogrupos e sorotipos com base na sua
composição antigénica; antígenos somáticos (O) para os sorogrupos e antígenos flagelares
(H) para os sorotipos. Pode, ainda, expressar antígenos capsulares (K) e fimbriais (F), que
são importantes na patogênese (Kolling, 2009).
3.2.2 Determinar a prevalência
Os estudos de prevalência dos diversos patotipos de E. coli são importantes, uma vez que
tem sido demonstrado que ela pode variar, sendo específica para cada região. Os relatos
sobre a detecção dos tipos diarreiogênicos de E. coli em água referem-se, em geral, a
pesquisas nos mananciais aquíferos de águas litorâneas, lagoas e rios. (Moreira, 2018).

A extracção de DNA será realizada pelo método do fenol-clorofórmio, conforme protocolo

estabelecido por (Fox et al., 1994). Assim, após cultivo em TSA, por 24 h, a 37 ºC, as
culturas bacterianas serão centrifugadas e os sedimentos obtidos dissolvidos em 100 µL de
tampão STET [Sacarose (Inlab) 8%, TrisHCl (Promega, Madison, WI, EUA) 50 mM,
EDTA (Life, Gaithesburg, MD, EUA) 50 mM, Triton X-100 (Calbiochem, La Jolla, CA,
EUA) 0,1 %; pH 8,0]. Em seguida, serão adicionados 30 µL de SDS (Calbiochem) 10% e
10 µL de RNase A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) 0,5 mg/mL. Após
homogeneização, as suspensões serão incubadas por 1 h a 37 ºC e, em seguida, foram
adicionados 15 µL de proteinase K (Sigma-Aldrich) a 10 mg/mL. O material será, então,
novamente homogeneizado e incubado a 37 ºC overnight.

Em seguida, após adição de 10 µL de NaCl (Sigma-Aldrich) 5 M e 30 µL de solução CTAB

(Sigma-Aldrich) 5% p/v/NaCl 0,7 M, as soluções serão gentilmente agitadas e incubadas
por 10 min a 56 ºC, em banho-maria. DNA será extraído adicionando-se gentilmente à
amostra 200 µL de fenol (Phoneutria, Belo Horizonte, MG, Brasil) (equilibrado em
TrisHCl 500 mM, pH 8,0) e 200 µL de clorofórmio (Merck, Darmstadt, Alemanha),
seguida de centrifugação, em baixa rotação, por 4 min. A fase superior será removida e
transferida para outro tubo. O procedimento será repetido por cerca de três vezes e, então,
na última etapa da extracção, utilizar-se-a apenas clorofórmio. DNA será, então, precipitado
a -20 ºC, overnight, pela adição de 30 µL de acetato de sódio (Sigma-Aldrich) e 400 µL de
etanol absoluto (Merck). Após este período, as suspensões serão centrifugadas a 12000 g,
por 75 min, a 4 ºC. Os sobrenadantes serão descartados e acrescentados 400 µL de etanol
70%. As suspensões serão novamente centrifugadas a 12000 g, por 25 min, a 4 ºC, os
sobrenadantes será descartados e os tubos contendo as amostras de DNA mantidos abertos,
vertidos sobre papel absorvente, para evaporação do etanol residual. O DNA será
solubilizado em 50 µL de água Milli-Q® (Direct-Q 3; Millipore, Molsheim, França) estéril.
As amostras serão homogeneizadas, a concentração de DNA será medida em
espectrofotômetro, empregando-se comprimento de onda de 260 nm, e a relação
DNA/proteína . O material será então mantido a -20 ºC até o momento de sua utilização.
A caracterização das amostras de E. coli será realizada por meio de reacção de
polimerização em cadeia (PCR), empregando-se, como alvo, os seguintes marcadores de
patogenicidade: eae (Reid et al., 1999), bfpA (Gunzburg et al.,1995), stx1 e stx2 (Vidal et
al., 2004), elt e est (Aranda et al., 2004).

3.2.3 Sensibilidade a antimicrobianos de E. cóli

Para a sobrevivência de qualquer bactéria é essencial manter a integridade da parede

celular. A parede celular é suficientemente flexível em virtude da estrutura entrelaçada do
seu principal constituinte, o peptidoglicano, com alto índice de ligações cruzadas. Neste
trabalho, sugere-se o uso de antibióticos classificados segundo seu mecanismo de acção
como: Inibidores da síntese da parede celular com preferência aos antibióticos β-lactâmicos
por serem bastante prescritos nos dias que correm, dada a sua eficácia terapêutica e baixa
toxicidade (Baptista, 2013). Nesta perspectiva, foram seleccionados os seguintes
antibióticos a serem usados no teste de sensibilidade: Cloranfenicol e Penicilina.
O presente trabalho propõe o método utilizado no teste de resistência aos antibióticos usada
por Vieira et al., (2010) que seguem as recomendações do Clinical and Laboratory
Standards Institute - CLSI (CLSI, 2007). Este método utiliza colónias crescidas em meio
ágar tryptone soy (TSA - Difco) por 24 h. Posteriormente, retiram-se inóculos das amostras
e colocam-se em solução salina 0,85%, até atingir a turvação correspondente ao tubo 0,5 da
escala Mc Farland aferida em espectrofotómetro. A suspensão bacteriana é então semeada
uniformemente em placas contendo ágar.
Após absorção do inóculo no meio por alguns minutos, os discos de antibióticos são
depositados com pinça esterilizada e as placas ficam incubadas a 37º C por 24 h. Seguido
esse período, é efetuada a leitura dos halos de inibição utilizando-se paquímetro e, de
acordo com seus tamanhos, as cepas são identificadas e classificadas em sensíveis,
intermediárias e resistentes. Porem, o laboratório poderá em particular sugerir o uso de
outro método, pelo que, este método e os materiais usados serão melhores descritos após
execução das análises.
 Cronograma de actividades:

Actividade Dezembro Janeiro Fevereiro Marco Abril Maio

Consulta

Aquisição de materiais

Colectas de amostras

Análises laboratoriais

Aquisição de dados

Análise de resultados

Finalização da monografia

Entrega
 CAPITULO IV
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. RESULTADOS

CAPÍTULO V
4. CONCLUSÃO E RECOMENDAÇÕES
4.1. CONCLUSÃO.
4.2. RECOMENDAÇÕES.

5. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA.
Baptista, M. G. (2013). Mecanismos de Resistência aos Antibióticos. Lisboa: Tese
apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas ao Curso de
Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas, conferido pela Universidade Lusófona de
Humanidades e Tecnologia.

Gonçalves, S. M. (2018). Prevalência e caracterização de Escherichia coli STEC em fezes

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