Limitar O Tempo De Abertura Do Ryr2 Evita A Hiperatividade Neuronal Relacionada À Doença De Alzheimer E A Perda De Memória, Mas Não O Acúmulo De Β-Amilóide

02/11/2020 Limitar o tempo de abertura do RyR2 evita a hiperatividade neuronal relacionada à doença de Alzheimer e a perda de memória, m…
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ARTIGO | VOLUME 32, ISSUE 12 , 108169 ,22 DE SETEMBRO DE 2020
Limitar o tempo de abertura do RyR2 evita a hiperatividade

neuronal relacionada à doença de Alzheimer e a perda de
memória, mas não o acúmulo de β-amilóide
Jinjing Yao • Bo Sun 7 • Adam Institoris • ... Ray W. Turner • Grant R. Gordon •
7
S.R. Wayne Chen  8  • Show all authors • Show footnotes

Acesso Livre • DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.108169 •
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luzes
• Limitar o tempo de abertura do RyR2 evita a hiperatividade neuronal, bem como grandes
déficits de AD
• Limitar o tempo aberto do RyR2 aumenta a corrente K + do tipo A para restringir a

excitabilidade neuronal
• R- carvedilol resgata hiperatividade neuronal relacionada à DA, perda de memória e morte

celular
• Os déficits de AD podem ser evitados em face do acúmulo contínuo de β-amiloide
Resumo
A hiperatividade neuronal é uma disfunção primária precoce na doença de Alzheimer (DA) em
humanos e modelos animais, mas faltam agentes terapêuticos anti-DA direcionados à
hiperatividade neuronal eficazes. Aqui nós definimos um modo anteriormente desconhecido de

controle do receptor 2 de rianodina (RyR2) da hiperatividade neuronal e progressão da DA.  
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(20)31158-X 1/76
Mostramos que uma única mutação pontual do RyR2, E4872Q, que reduz o tempo aberto do
RyR2, evita a hiperexcitabilidade, hiperatividade, prejuízo da memória, morte celular neuronal e
perda da coluna dendrítica em um modelo de camundongo com DA de início precoce grave
(5xFAD). A mutação RyR2-E4872Q regula positivamente a corrente K + da célula piramidal CA1
hipocampal A , um controle de excitabilidade neuronal bem conhecido que é regulado
negativamente na DA. Limitar farmacologicamente o tempo aberto do RyR2 com o RO
enantiômero -carvedilol (mas não o carvedilol racêmico) previne e resgata a hiperatividade
neuronal, o comprometimento da memória e a perda de neurônios, mesmo nos estágios finais
da DA. Esses déficits relacionados à AD são evitados mesmo com o acúmulo contínuo de β-
amilóide. Assim, limitar o tempo de abertura do RyR2 pode ser uma estratégia anti-AD
direcionada para hiperatividade e não direcionada para β-amiloide.
Resumo Gráfico
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Palavras-chave
doença de Alzheimer • deposição de β-amilóide • aprendizagem e memória •
neurônios piramidais CA1 hipocampais • hiperatividade neuronal • excitabilidade neuronal •
  
receptor de rianodina • Canal K + tipo A • Kv4.2 e KChIP4 •

imagem de cálcio hipocampal in vivo
Introdução
A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum de demência e atinge uma população em
rápido crescimento em todo o mundo. Apesar de um grande esforço mundial, não há
atualmente nenhum tratamento eficaz para a DA. Ao longo das últimas décadas, a pesquisa de
AD tem em grande medida como alvo a cascata amilóide, que se pensa conduzir a progressão
da AD devido à deposição de placas β-amilóide (Aβ) no cérebro (Berridge, 2010; Hardy e
Selkoe, 2002; Karran et al., 2011) Portanto, a estratégia terapêutica anti-AD dominante tem
reduzido as deposições de Aβ (Demattos et al., 2012; Kennedy et al., 2016; Sevigny et al.,
2016) Infelizmente, todos os principais ensaios clínicos direcionados ao Aβ até o momento não
tiveram sucesso (Chakroborty e Stutzmann, 2014; Honig et al., 2018; Karran et al., 2011),
destacando a necessidade urgente de desenvolver novas estratégias de terapia de AD não
direcionadas a Aβ.
Evidências convincentes apontam para a hiperatividade neuronal como uma disfunção neuronal
primária precoce em pacientes humanos com DA, bem como em modelos animais de DA
(Busche et al., 2008, 2012; Busche e Konnerth, 2015; Dickerson et al., 2005; Keskin et al., 2017;
Lerdkrai et al., 2018; Nuriel et al., 2017; O'Brien et al., 2010; Stargardt et al., 2015; Zott et al.,
2019) A hiperatividade neuronal pode ser induzida in vivo por tratamento agudo com Aβ solúvel
exógeno (Busche et al., 2012; Keskin et al., 2017; Zott et al., 2019) É importante ressaltar que a
própria hiperatividade neuronal pode desencadear a liberação de Aβ solúvel endógeno (Cirrito
et al., 2005; Kamenetz et al., 2003; Yamamoto et al., 2015) Assim, o Aβ solúvel não apenas
torna os neurônios ativos mais ativos (hiperativos), mas também desencadeia a liberação de Aβ
solúvel, que, por sua vez, promove ainda mais a hiperatividade. Acredita-se que este ciclo
vicioso conduza o acúmulo de Aβ, hiperatividade neuronal, disfunção do circuito e progressão
da AD (Busche e Konnerth, 2015, 2016; Stargardt et al., 2015; Zott et al., 2019) Ter como alvo
Aβ provou ser insuficiente para interromper este ciclo vicioso em humanos. Uma abordagem
alternativa e lógica é visar a hiperatividade neuronal (outro componente do ciclo vicioso).
O receptor 2 de Ryanodine (RyR2) é um canal de liberação de Ca 2+ intracelular . RyR2 é

predominantemente expresso no coração e cérebro, especialmente no hipocampo e córtex
(Bers, 2002; Furuichi et al., 1994; Giannini et al., 1995; Murayama e Ogawa, 1996) A liberação
de Ca 2+ mediada por RyR2 desempenha um papel importante na regulação da excitabilidade
da membrana de várias células (Alkon et al., 1998; Bogdanov et al., 2001; Mandikian et al.,

2014; Nelson et al., 1995) A função RyR2 aprimorada pode causar arritmias cardíacas e morte  
súbita e também foi implicada na patogênese da DA (Bruno et al., 2012; Chakroborty et al.,
2009; Kelliher et al., 1999; Lacampagne et al., 2017; Oulès et al., 2012; Priori e Chen, 2011;
SanMartín et al., 2017; Smith et al., 2005) Assim, o direcionamento de RyR2 pode ser um meio
de controlar a excitabilidade da membrana e a hiperatividade neuronal relacionada à AD. No
entanto, dados os múltiplos papéis fisiológicos essenciais de RyR2, bloquear drasticamente a
função ou expressão de RyR2 seria prejudicial (Bround et al., 2012; Liu et al., 2014; Takeshima
et al., 1998) O desafio é como suprimir RyR2 hiperativo sem efeitos prejudiciais.
Mostramos que o resíduo E4872 é importante para o gating do canal RyR2. A mutação deste
resíduo (E4872Q) encurta substancialmente o tempo de abertura do RyR2 sem alterar a
condução de íons do canal (Chen et al., 2014) É importante ressaltar que limitar o tempo de
abertura do RyR2 protege completamente contra taquiarritmias ventriculares sem efeitos
prejudiciais no coração (Chen et al., 2014) Isso levanta a possibilidade intrigante de que a
mesma supressão de RyR2 também pode proteger contra AD, que está associada à função de
RyR2 aprimorada. Para testar essa possibilidade, cruzamos os camundongos heterozigotos
RyR2-E4872Q +/− mutantes com o modelo de camundongo AD de início rápido e rápido robusto
5xFAD (Oakley et al., 2006) Nós mostramos que o tempo aberto do RyR2 geneticamente
limitado evitou a hiperexcitabilidade intrínseca da membrana, hiperatividade neuronal, déficits
de potenciação de longo prazo (LTP), comprometimentos de aprendizagem e memória, morte
de células neuronais e perda da coluna dendrítica em camundongos 5xFAD. Além disso,
descobrimos que limitar o tempo aberto do RyR2 regula positivamente a corrente K + do tipo A,
mas não a corrente de pós-hiperpolarização regulada por RyR comumente conhecida ( I AHP )
de neurônios CA1 do hipocampo. Além disso, descobrimos que o enantiômero R- carvedilol de
limitação de tempo aberto RyR2 (Zhang et al., 2015; Zhou et al., 2011), mas não uma mistura
racêmica de carvedilol, preveniu e resgatou a hiperatividade neuronal, deficiências de
aprendizagem e memória e perda de neurônios em camundongos 5xFAD. É importante
ressaltar que esses déficits associados à AD foram evitados mesmo nos estágios finais da AD
com extensa acumulação de Aβ. Portanto, limitar o tempo de abertura do RyR2 pode ser uma
estratégia direcionada à hiperatividade para combater a DA, independentemente do acúmulo de
Aβ.
Resultados
Limitar o tempo de abertura do RyR2 evita a hiperexcitabilidade intrínseca
associada ao AD de neurônios piramidais hipocampais CA1
A hiperexcitabilidade intrínseca dos neurônios piramidais CA1 do hipocampo foi implicada na

patogênese da DA em modelos animais (Brown et al., 2011; Kerrigan et al., 2014; Scala et al.,
 
2015; Isková et al., 201) Assim, é de interesse determinar se a limitação do tempo aberto do
RyR2 afeta a hiperexcitabilidade intrínseca associada à AD de células CA1. Para este fim,
cruzamos ratos heterozigotos 5xFAD +/− (Oakley et al., 2006) com camundongos heterozigotos
RyR2 E4872Q +/− mutantes (Chen et al., 2014) Este cruzamento gerou quatro genótipos: 5xFAD
+/−
, 5xFAD +/− / E4872Q +/− (5xFAD +/− / EQ +/− ), E4872Q +/− (EQ +/− ) e tipo selvagem (WT).
Digno de nota, RyR2 é predominantemente expresso no hipocampo e córtex, bem como no
soma e dendritos de neurônios piramidais CA1, conforme revelado por imagens de
fluorescência de seções cerebrais RyR2 marcadas com GFP (Hiess et al., 2015; Figuras 1 A –
1D).
  
Figura 1 A mutação RyR2 E4872Q +/− diminui a excitabilidade neuronal e regula positivamente a corrente K + tipo A dos

neurônios CA1
 
 Mostrar legenda completa
(A–D) Images of GFP-tagged RyR2 (A and C) and RyR2-WT (GFP-negative; B and D) mouse brain
sections.
(E) Traces of action potential (AP) firing.
(F) Current thresholds for AP firing in WT (10 mice, 30 neurons), 5xFAD+/− (10 mice, 30 neurons), 5xFAD+/
−/EQ+/− (10 mice, 30 neurons), and EQ+/− (10 mice, 30 neurons) CA1 neurons.
(G) Current injection-triggered AP firing frequency in WT (10 mice, 30 neurons), 5xFAD+/− (10 mice, 30
neurons), 5xFAD+/−/EQ+/− (10 mice, 30 neurons), and EQ+/− (10 mice, 30 neurons) CA1 neurons.
(H) Traces of A-type K+ current (IA) from 3- to 4-month-old WT, 5xFAD+/−, 5xFAD+/−/EQ+/−, and EQ+/− CA1
neurons.
(I) Normalized IA traces.
(J) Steady-state activation curves of IA.
(K) IA amplitude in 3- to 4-month-old WT (10 mice, 30 neurons), 5xFAD+/− (10 mice, 30 neurons),
5xFAD/EQ+/− (10 mice, 30 neurons), and EQ+/− (10 mice, 30 neurons) CA1 neurons.
(L) IA inactivation kinetics (Tau) from the same number of neurons as in (K).
(M) The midpoints of voltage-dependent activation of IA (VA) for WT (10 mice, 30 neurons), 5xFAD+/− (10
mice, 30 neurons), 5xFAD+/−/EQ+/− (10 mice, 30 neurons), and EQ+/− (10 mice, 30 neurons) CA1 neurons.
(N and O) Current threshold for AP firing (N) and current injection-triggered AP firing frequency (O) without
or with the Kv4 channel agonist NS5806 (10 μM) in 5xFAD+/− CA1 neurons (7 mice, 14 neurons).
(P and Q) Whole-cell IA (P) and inactivation time constant Tau (Q) in Kv4.2/KChIP4-transfected HEK293
cells expressing RyR2 WT (n = 21) or the RyR2 E4872Q+/− mutation (n = 26).
(R) Biotin-labeled surface Kv4.2 in Kv4.2/KChIP4-transfected HEK293 cells expressing RyR2 WT or the
RyR2 E4872Q+/− mutation.
Scale bars, 2 mm in (A) and (B) and 10 μm in (C) and (D). Data shown are the median and range (Kruskal-
Wallis test with Dunn-Bonferroni post hoc test, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, and Mann-
Whitney U test; ∗p < 0.5, ∗∗p < 0.01 versus WT, ##p < 0.01; 5xFAD+/−/EQ+/− versus 5xFAD+/−; NS, not
significant). See also Figure S1.
  
Realizamos gravações de patch-clamp de células inteiras de neurônios piramidais CA1 de 3 a 4

meses de idade em fatias do cérebro para avaliar a excitabilidade intrínseca. Em neurônios
5xFAD +/− CA1, o limiar de corrente para o disparo do potencial de ação indutor (AP) foi
significativamente reduzido e a frequência do disparo do AP induzido pela corrente foi
aumentada em comparação com as células WT ( Figuras 1 E-1G). Notavelmente, a mutação
E4872Q +/− aumentou substancialmente a corrente de limiar para disparo de AP e evitou o
aumento da frequência de disparo de AP em neurônios piramidais 5xFAD +/− / EQ +/− e EQ +/−
CA1 ( Figuras 1 E – 1G). Assim, limitar o tempo de abertura do RyR2 restringe marcadamente a
excitabilidade intrínseca de 5xFAD +/−/ EQ +/− e EQ +/− neurônios piramidais CA1.
Limitar o tempo de abertura do RyR2 regula positivamente a corrente K +

tipo A de neurônios piramidais CA1
Em seguida, medimos o I AHP porque o I AHP influencia a excitabilidade intrínseca (Bodhinathan
et al., 2010; van de Vrede et al., 2007) Em neurônios piramidais 5xFAD +/− CA1, os
componentes médio e lento de I AHP foram substancialmente reduzidos em comparação com o
WT ( Figuras S1 A – S1C; Figuras 1 E – 1G). Não houve diferença significativa no I AHP entre
5xFAD +/− e 5xFAD +/− / EQ +/− e entre WT e EQ +/− neurônios ( Figuras S1 A – S1C). Assim, a
mutação E4872Q +/− não afetou significativamente I AHP de 5xFAD +/−ou neurônios piramidais
WT CA1, embora inibisse fortemente a excitabilidade intrínseca. Assim, é improvável que a
ação de E4872Q +/− na excitabilidade intrínseca seja mediada por I AHP .
A regulação negativa da corrente de K + do tipo A do hipocampo foi implicada na hiperatividade

neuronal relacionada à AD (Chen, 2005; Good et al., 1996; Hall et al., 2015; Scala et al., 2015)
Isso nos levou a avaliar se a mutação E4872Q +/− afeta a corrente K + tipo A. Descobrimos que
a corrente K + tipo A foi diminuída, o tempo de decaimento (Tau) foi encurtado e o ponto médio
para ativação dependente de voltagem (V A ) foi aumentado, mas o ponto médio para inativação
dependente de voltagem (V H ) foi inalterado em neurônios piramidais 5xFAD +/− CA1 de 3 a 4
meses de idade em comparação com o WT ( Figuras 1 H – 1M; Figuras S1 E e S1F),
consistente com relatórios anteriores (Chen, 2005; Good et al., 1996; Hall et al., 2015; Scala et
al., 2015) A mutação E4872Q +/− regulou positivamente a corrente K + do tipo A de 5xFAD +/− /
EQ +/− e EQ +/− neurônios CA1 do hipocampo em comparação com o WT. Especificamente, a
mutação E4872Q +/− aumentou a corrente K + do tipo A e o tempo de decaimento sem alterar o V
A ou V H ( Figuras 1 H – 1M; Figuras S1 E e S1F). O agonista de corrente K + tipo A NS5806 (10
μM) aumentou drasticamente a corrente de limiar para induzir o disparo de AP e diminuiu a
frequência de disparo de AP em neurônios piramidais 5xFAD +/− CA1 ( Figuras 1N e 1O; Figura
S1 D). Assim, limitar o tempo de abertura do RyR2 regula positivamente a corrente K + do tipo A
dos neurônios piramidais CA1.
  
Os neurônios CA1 do hipocampo expressam o complexo do canal Kv4.2 / KChIP4, que se

acredita contribuir significativamente para a corrente K + do tipo A (Lin et al., 2010; Rhodes et al.,
2004; Serôdio e Rudy, 1998; Xiong et al., 2004) KChIP4 é uma proteína de ligação de Ca 2+
conhecida por modular a atividade de Kv4.2 (Morohashi et al., 2002) Assim, a liberação de Ca
2+
mediada por RyR2 pode regular a corrente de K + tipo A modulando Kv4.2 via KChIP4. Para
testar isso, avaliamos a ação do RyR2-E4872Q +/− na corrente K + do tipo A em células HEK293
transfectadas com Kv4.2 / KChIP4. A mutação E4872Q +/− aumentou a corrente mediada por
Kv4.2 e o tempo de decaimento sem alterar sua ativação ou inativação dependente de voltagem
( Figuras 1 P e 1Q; Figuras S1 G e S1H). Esta ação de E4872Q +/− na corrente mediada por
Kv4.2 depende de KChIP4 porque E4872Q +/− não teve efeito na corrente mediada por Kv4.2
em células HEK293 transfectadas com Kv4.2 sozinho (ou seja, sem KChIP4) (Figuras S1 I –
S1L). O tráfego e a expressão de superfície de Kv4.2 são regulados pela atividade neuronal e
influxo de Ca 2+ (Kim et al., 2007a) A liberação de Ca 2+ mediada por RyR2 também pode
modular o tráfego de Kv4.2. Na verdade, os experimentos de marcação de superfície revelaram
que a mutação E4872Q +/− aumentou a expressão de superfície de Kv4.2 em células HEK293 (
Figura 1 R; Figura S1 M). A cafeína (um agonista de RyR2) diminuiu a corrente mediada por
Kv4.2 e o tempo de decaimento sem alterar sua ativação ou inativação dependente de voltagem
( Figuras S1 N – S1U). Assim, a manipulação farmacológica de RyR2 também afeta a corrente
de K + tipo A.
A liberação intracelular de Ca 2+ através dos RyRs demonstrou modular a atividade pré-

sináptica (Chakroborty et al., 2019, 2012b; Le Magueresse e Cherubini, 2007) Assim,
determinamos se a limitação do tempo aberto do RyR2 afeta a corrente pós-sináptica excitatória
espontânea (sEPSC) de neurônios piramidais CA1. Não houve diferenças significativas na
amplitude ou nos intervalos entre eventos entre os neurônios WT, 5xFAD +/− , 5xFAD +/− / EQ +/−
e EQ +/− CA1 ( Figuras S2 A – S2C). Isso sugere que a ação de limitar o tempo aberto do RyR2
na excitabilidade da membrana é improvável de ser mediada por mudanças na eficácia
sináptica. Assim, o tempo aberto de RyR2 geneticamente limitado regula positivamente a
corrente de K + tipo A e restringe a excitabilidade intrínseca dos neurônios piramidais CA1.
Limitar o tempo de abertura do RyR2 impede a hiperatividade neuronal

associada a AD de neurônios piramidais CA1 Ex Vivo e In Vivo
Para determinar se a limitação do tempo de abertura do RyR2 também pode prevenir a
hiperatividade neuronal associada à AD de neurônios piramidais CA1, medimos a atividade
neuronal espontânea (disparo AP espontâneo) de neurônios piramidais CA1 em fatias do
cérebro. Semelhante a relatórios anteriores (Leão et al., 2012; Isková et al., 201), a fração de
neurônios exibindo disparos AP espontâneos e a frequência de disparos AP espontâneos foram
acentuadamente aumentados em neurônios piramidais 5xFAD +/− CA1 em comparação com o
  
WT ( Figuras S2 D-S2F). Notavelmente, a mutação E4872Q +/− evitou o aumento do disparo AP

espontâneo de neurônios piramidais 5xFAD +/− / EQ +/− CA1 ex vivo em fatias do cérebro (
Figuras S2 D-S2F).
Para avaliar se a limitação do tempo aberto do RyR2 pode suprimir a hiperatividade neuronal
associada à AD in vivo , cruzamos camundongos 5xFAD +/− / E4872Q +/− heterozigotos com
heterozigose Thy-1 GCaMP6f +/− camundongos transgênicos para introduzir o GCaMP6f +/−
transgene em cada um dos quatro genótipos. GCaMP6f é uma proteína sensível ao Ca 2+
rápida e ultrassensível, capaz de detectar APs individuais em neurônios com alta confiabilidade
(Chen et al., 2013; Dana et al., 2014; Peron et al., 2015) Realizamos imagens in vivo de dois
fótons de neurônios piramidais CA1 expressando GCaMP6f para monitorar transientes
espontâneos de Ca 2+ , que são amplamente utilizados para avaliar a atividade neuronal
espontânea de populações de células (Busche et al., 2008, 2012; Chen et al., 2013; Dana et al.,
2014; Kerr et al., 2005; Peron et al., 2015; Sato et al., 2007; Zott et al., 2019) Descobrimos que
camundongos 5xFAD +/− anestesiados de 5 a 6 meses de idade exibiram hiperatividade
neuronal, conforme evidenciado por um aumento significativo na fração de neurônios
hiperativos (conforme definido porBusche et al., 2012) e na frequência média de transientes
espontâneos de Ca 2+ e uma diminuição significativa na fração de neurônios normais em
comparação com o WT ( Figuras 2 A, 2B, 2E, 2F, 2I, 2J, 2N, 2P e 2Q). Não há diferença
significativa na fração de neurônios silenciosos entre WT e 5xFAD +/− ratos ( Figura 2 O). As
distribuições de frequência de neurônios hiperativos em camundongos WT e 5xFAD +/− são
semelhantes ( Figuras 2 I e 2J). Isso é consistente com relatórios anteriores (Busche et al.,
2012, 2019; Lerdkrai et al., 2018) A análise de probabilidade cumulativa também revelou que
5xFAD +/− camundongos aumentaram significativamente a atividade neuronal espontânea geral
em comparação com o WT (p <0,0001) ( Figura 2 M). Notavelmente, a mutação RyR2 E4872Q
+/−
diminuiu acentuadamente a fração de neurônios hiperativos e a frequência média de
transientes espontâneos de Ca 2+ , aumentou a fração de neurônios normais e reduziu a
atividade neuronal espontânea geral (conforme revelado pela análise de probabilidade
cumulativa) em camundongos 5xFAD +/− / EQ +/− e EQ +/− em comparação com camundongos
5xFAD +/− e WT, respectivamente ( Figura 2) Por outro lado, consistente com um estudo anterior
(Lerdkrai et al., 2018), não há diferença significativa na amplitude dos transientes espontâneos
de Ca 2+ entre os diferentes genótipos ( Figura S2 G). A hiperatividade neuronal já ocorreu em
camundongos 5xFAD +/− de 3 a 4 meses de idade , como evidenciado por um aumento
significativo na fração de neurônios hiperativos, a frequência média de transientes espontâneos
de Ca 2+ e a atividade neuronal geral em comparação com o WT na mesma idade ( Figura S3 ).
Da mesma forma, a mutação RyR2 E4872Q +/− diminuiu a fração de neurônios hiperativos e a
frequência média de transientes espontâneos de Ca 2+ e reduziu a atividade neuronal
espontânea geral em 5xFAD +/− de 3 a 4 meses de idade/ EQ +/− camundongos em comparação

com 5xFAD +/− camundongos ( Figura S3 ). No geral, isso mostra que limitar o tempo aberto de  
RyR2 em camundongos 5xFAD +/− evita a hiperatividade neuronal associada a AD de neurônios

piramidais CA1 ex vivo e in vivo .
Figura 2 RyR2-E4872Q +/− impede a hiperatividade neuronal de 5xFAD +/− Neurônios CA1 do hipocampo In Vivo
(A–D) Two-photon Ca2+ images of the hippocampal CA1 region of 5- to 6-month-old WT (A), 5xFAD+/− (B),
5xFAD+/−/EQ+/− (C), and EQ+/− (D) mice in vivo. Colored dots indicate the number of Ca2+ transients per
minute.
(E–H) Ca2+ traces of the five neurons circled in (A)–(D), respectively.
(I–L) Histograms showing the frequency distribution of Ca2+ transients in (I) WT (8 mice, 2,375 cells), (J)
5xFAD+/− (8 mice, 1,708 cells), (K) 5xFAD+/−/EQ+/− (8 mice, 2,283 cells), and (L) EQ+/− (8 mice, 2,392
cells). Pie charts show the relative proportions of silent, normal, and hyperactive neurons as defined

previously (Busche, 2018; Busche et al., 2008, 2012).
 
(M) Cumulative probability functions showing frequency distributions of spontaneous Ca2+ transients in the
CA1 region of WT (black), 5xFAD+/− (red), 5xFAD+/−/EQ+/− (green), and EQ+/− (blue) mice (Kruskal-Wallis
test with Dunn’s multiple comparisons test).
(N) Mean Ca2+ transient frequency in the WT, 5xFAD+/−, 5xFAD+/−/EQ+/−, and EQ+/− CA1 region.
(O–Q) Percentage of silent (O), normal (P), and hyperactive (Q) cells in the WT, 5xFAD+/−, 5xFAD+/−/EQ+/−,
and EQ+/− CA1 region.
Scale bars: 10 μm. Data shown are the median and range (Kruskal-Wallis test with Dunn-Bonferroni post
hoc test; ∗p < 0.5, ∗∗p < 0.01 versus WT, #p < 0.05, ##p < 0.01; 5xFAD+/−/EQ+/− versus 5xFAD+/−). See also
Figures S2 and S3.
Limitar o tempo de abertura do RyR2 impede a função RyR2 aprimorada

associada ao AD de neurônios piramidais CA1
Realizamos imagens de Ca 2+ de 2 fótons de neurônios piramidais CA1 em fatias do cérebro
preparadas a partir de camundongos WT expressando GCaMP6f, 5xFAD +/− , 5xFAD +/− / EQ +/−
e EQ +/− . Consistente com outros modelos de mouse AD (Bruno et al., 2012; Chakroborty et al.,
2009, 2012a), a liberação de Ca 2+ induzida por cafeína em neurônios piramidais 5xFAD +/− CA1
foi acentuadamente aumentada em comparação com células WT ( Figura S2 H). Por outro lado,
a liberação de Ca 2+ induzida por cafeína em neurônios piramidais 5xFAD +/− / EQ +/− ou EQ +/−
CA1 foi inalterada ou reduzida (respectivamente) em comparação com as células WT ( Figura
S2 H). Esses dados indicam que a função RyR2 é acentuadamente aumentada em neurônios
piramidais 5xFAD +/− CA1 e que esta ativação aberrante de RyR2 é evitada pela mutação
RyR2-E4872Q +/− .
Também avaliamos o efeito da presenilina 1 (PS1) WT e as mutações PS1 M146L e L286V na

função de RyR2 medindo a propensão para liberação espontânea de Ca 2+ em células HEK293
expressando RyR2 transfectadas com ou sem PS1 WT ou mutantes (Chen et al., 2014; Jiang et
al., 2004, 2005) Consistente com os primeiros estudos (Chan et al., 2000; Rybalchenko et al.,
2008; Wu et al., 2013), descobrimos que PS1 WT e mutações aumentaram significativamente a
liberação espontânea de Ca 2+ mediada por RyR2 ( Figura S2 J). A mutação E4872Q +/−
diminuiu esta liberação espontânea de Ca 2+ em todas as células que expressam RyR2 ( Figura
S2 K). Assim, limitar o tempo de abertura do RyR2 evita a ativação aberrante induzida por AD
da liberação de Ca 2+ mediada por RyR2 .
  
Limitar o tempo de abertura do RyR2 evita a perda de memória associada

ao AD e o déficit LTP hipocampal
Realizamos testes de labirinto aquático de Morris (MWM) e de reconhecimento de objeto novo
(NOR) para avaliar se a mutação RyR2 E4872Q +/− previne a perda de memória característica
em camundongos 5xFAD +/− . Camundongos 5xFAD (5-6 meses de idade) têm prejuízo
significativo na aprendizagem e memória ( Figuras 3 A-3C), como evidenciado por um aumento
significativo da latência para o alvo, diminuição do tempo gasto na zona alvo no MWM e índice
de discriminação reduzido em o teste NOR em comparação com o WT. Notavelmente, a
mutação E4872Q +/− evitou esses déficits em camundongos 5xFAD +/− / EQ +/− . Não houve
diferenças significativas nos testes MWM ou NOR entre 5xFAD +/− / EQ +/− de 5 a 6 meses de
idadee camundongos WT ou entre camundongos EQ +/− e WT ( Figuras 3 A – 3C). Resultados
de teste MWM e NOR semelhantes também foram observados em camundongos de 3 a 4
meses de idade ( Figuras S4 A-S4C). Para determinar se a mutação E4872Q +/− poderia
prevenir déficits de aprendizagem e memória em camundongos 5xFAD +/− com idade ,
realizamos testes de labirinto de Barnes (BM) e MWM em camundongos de 10 a 15 meses de
idade. Como esperado, os camundongos 5xFAD +/− mais velhos tinham graves problemas de
aprendizagem e memória ( Figuras 3 D e 3E; Figuras S4 D-S4F). É importante ressaltar que a
mutação E4872Q +/− evitou esses comprometimentos de aprendizagem e memória em 5xFAD +/
− / EQ +/− camundongos, mesmo neste estágio final da DA.
  
Figura 3 A mutação E4872Q +/− impede a perda de memória e o comprometimento de LTP de 5xFAD +/− ratos
(A) The latency to reach the target platform of 5- to 6-month-old WT (n = 10), 5xFAD+/− (n = 7), 5xFAD+/
−/EQ+/− (n = 11), and EQ+/− (n = 15) mice in the Morris water maze (MWM) test.
(B) The time spent in the target quadrant.
(C) The percentage of time spent on the novel object in the novel object recognition (NOR) test in 5- to 6-
month-old WT (n = 10), 5xFAD+/− (n = 7), 5xFAD+/−/EQ+/− (n = 11), and EQ+/− (n = 15) mice.
(D) The latency to reach the target hole of 10- to 15-month-old WT (n = 12), 5xFAD+/− (n = 14), 5xFAD+/
/EQ
− +/− (n = 8), and EQ+/− (n = 8) mice in the Barnes maze (BM) test.  
(E) The number of nose pokes to each hole on the BM test platform (∗∗5xFAD versus WT).
(F) Effect of 100-Hz high-frequency stimulation (HFS) on the mean Schaffer collateral-evoked fEPSP slope
in hippocampal slices from 5- to 6-month-old WT (10 mice, 20 slices), 5xFAD+/− (10 mice, 20 slices),
5xFAD+/−/EQ+/− (10 mice, 20 slices), and EQ+/− (10 mice, 20 slices) mice.
(G) The averaged normalized fEPSP slope.
(H) Effect of HFS on the fEPSP slope of 10- to 15-month-old WT (10 mice, 20 slices), 5xFAD+/− (10 mice,
20 slices), 5xFAD+/−/EQ+/− (10 mice, 20 slices), and EQ+/− (10 mice, 20 slices) mice.
(I) The averaged normalized fEPSP slope.
Data shown are the median and range (Kruskal-Wallis test with Dunn-Bonferroni post hoc test; ∗p < 0.5,
∗∗p < 0.01 versus WT, #p < 0.05, ##p < 0.01; 5xFAD+/−/EQ+/− versus 5xFAD+/−). See also Figures S4 and
S5.
O efeito da mutação E4872Q +/− no aprendizado e na memória também foi avaliado no nível
celular medindo o LTP do hipocampo em fatias do cérebro. Consistente com nossos estudos
comportamentais, 5xFAD +/− camundongos com 3–4, 5–6 e 10–15 meses de idade mostraram
pouco ou nenhum LTP hipocampal ( Figuras 3 F – 3I; Figura S4 G e S4H). A mutação E4872Q
+/−
evitou essas deficiências LTP do hipocampo, conforme evidenciado pelos níveis
semelhantes de LTP do hipocampo em WT, 5xFAD +/− / EQ +/− e EQ +/− camundongos ( Figuras
3 F – 3I; Figuras S4 G e S4H). 5xFAD +/−camundongos também exibiram transmissão sináptica
basal hipocampal ligeiramente reduzida, conforme revelado pelo potencial pós-sináptico
excitatório de campo reduzido (fEPSP) em relação à entrada atual ( Figuras S5 A-S5F),
semelhante a um relatório anterior (Waring et al., 2012) Assim, limitar o tempo de abertura do
RyR2 evita o comprometimento LTP do hipocampo e a perda de memória em camundongos
5xFAD +/− .
R- carvedilol previne e resgata hiperatividade neuronal e perda de memória

em camundongos 5xFAD +/−
Mostramos anteriormente que o R- carvedilol encurta o tempo de abertura do RyR2 (Zhang et
al., 2015; Zhou et al., 2011) Dado o efeito da mutação E4872Q +/− na atividade neuronal do
hipocampo, este agente pode fornecer um meio farmacológico para limitar o tempo aberto do
RyR2, hiperatividade neuronal e progressão da DA. Para testar isso, nós pré-tratamos
camundongos 5xFAD +/− de 2 a 3 meses de idade (ou seja, antes da ocorrência da patologia de

DA) ou camundongos 5xFAD +/− de 3 a 4 meses de idade (ou seja, após a ocorrência de  
Patologia AD) (Oakley et al., 2006) com R- carvedilol (3,2 mg / kg / dia) ou seu controle de
veículo (DMSO) por 1 mês. O pré-tratamento com R- carvedilol preveniu e resgatou a
hiperatividade neuronal de neurônios CA1 5xFAD +/− hipocampal CA1 in vivo , conforme
evidenciado pela observação de que a fração de neurônios hiperativos, a frequência média de
transientes espontâneos de Ca 2+ e a atividade neuronal espontânea geral foram
significativamente menores em camundongos 5xFAD +/− pré-tratados com R -carvedilol do que
em camundongos pré-tratados com veículo em ambas as idades ( Figura 4 ), mas semelhantes
aos do WT ( Figura S3 ). A liberação de Ca 2+ induzida por cafeína também foi
significativamente reduzida emNeurônios piramidais 5xFAD +/− CA1 pré-tratados com R -
carvedilol em comparação com células tratadas com DMSO (controle) em fatias de cérebro (
Figura S2 I). Assim, R- carvedilol, como a mutação RyR2-E4872Q +/− , pode prevenir a ativação
aberrante induzida por AD da liberação de Ca 2+ mediada por RyR2 .
Figura 4 R- carvedilol Previne e Resgata Hiperatividade Neuronal de 5xFAD +/− Hipocampal CA1 Neurônios In Vivo
Mostrar legenda completa

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 
(A, B, G, and H) Two-photon in vivo Ca2+ imaging of the hippocampal CA1 region of 3- to 4-month-old (A
and B) or 4- to 5-month-old (G and H) 5xFAD+/− mice treated with vehicle control (DMSO; A and G) or R-
carvedilol (R-CV; 3.2 mg/kg/day; B and H). Colored dots indicate the number of Ca2+ transients per minute.
(C, D, I, and J) Ca2+ traces of the five neurons circled in (A), (B), (G), and (H), respectively.
(E, F, K, and L) Histograms showing the frequency distribution of Ca2+ transients in DMSO-treated mice (E
and K, 5 mice, 1,066 cells and5 mice, 897 cells, respectively) and R-CV-treated mice (F and L; 5 mice,
1,181 cells and 5 mice, 757 cells, respectively). Pie charts show the relative proportions of silent, normal,
and hyperactive neurons.
(M) Cumulative probability functions showing frequency distributions of spontaneous Ca2+ transients in the
CA1 region of 3- to 4-month-old 5xFAD+/− mice treated with DMSO (red) or R-CV (blue) and 5- to 6-month-
old 5xFAD+/− mice treated with DMSO (black) or R-CV (green) (Kruskal-Wallis test with Dunn’s multiple
comparisons test).
(N) Mean Ca2+ transient frequency in the CA1 region of 3- to 4-month-old and 4- to 5-month-old 5xFAD+/−
mice treated with DMSO or R-CV.
(O–Q) Percentage of silent (O), normal (P), and hyperactive (Q) cells in the CA1 region of 3- to 4- and 4- to
5-month-old 5xFAD+/− mice treated with DMSO or R-CV.
Scale bars, 10 μm. Data shown are the median and range (Kolmogorov-Smirnov test with Dunn-Bonferroni
post hoc test and Mann-Whitney U test; ∗∗p < 0.01 versus control).
O pré-tratamento com R -carvedilol de camundongos 5xFAD +/− de 2 a 3 meses de idade (antes

dos sintomas de AD) também evitou a perda de memória e deficiências de LTP ( Figuras 5 A-
5E), e o pré-tratamento com R- carvedilol de 3 a 4 meses camundongos 5xFAD +/− antigos
(após sintomas de AD) resgataram esses defeitos ( Figuras 5 F-5J). Para avaliar melhor se o
pré-tratamento com R- carvedilol ainda é eficaz nos estágios finais da DA, testamos a droga em
camundongos 5xFAD +/− de 6 a 7 e de 10 a 12 meses de idade . O pré-tratamento com R-
carvedilol resgatou déficits de memória mesmo em camundongos 5xFAD +/− de 6 a 7 e de 10 a
12 meses de idade (ou seja, estágios finais de DA) ( Figuras S6A – S6H). A transmissão
sináptica basal reduzida em fatias cerebrais 5xFAD +/− hipocampal também foi restaurada pelo
pré-tratamento com R- carvedilol ( Figuras S5 G – S5L). Também testamos a mistura racêmica
de carvedilol usada clinicamente (3,2 mg / kg / dia). Esta mistura de carvedilol não evitou déficits
de aprendizagem e memória ou prejuízo LTP em camundongos 5xFAD +/− de 3 a 4 meses de
idade ( Figuras S5 M, S5N e S6 I – S6M). Assim, o R- carvedilol, mas não a mistura racêmica

de carvedilol, pode ser um agente anti-DA direcionado à hiperatividade promissor.  
Figura 5 R -CV impede e resgata a perda de memória e o comprometimento de LTP em 5xFAD +/− camundongos
(A and F) The latency to reach the target platform of 3- to 4-month-old (A) and 4- to 5-month-old (F)
5xFAD+/− mice treated with DMSO (3–4 months old, n = 11; 4–5 months old, n = 8) or R-CV (3–4 months
old, n = 13; 4–5 months old, n = 10) in the MWM test.
(B and G) The time spent in the target quadrant.
(C and H) The percentage of time spent on the novel object for 5xFAD+/− mice treated with DMSO (3–
4months old, n = 11; 4–5 months old, n = 8) or R-CV (3–4 months old, n = 13; 4–5 months old, n = 10).
(D and I) Effect of HFS on mean CA3-CA1 fEPSP slope in hippocampal slices from 5xFAD+/− mice treated
with DMSO (3–4 months old, 10 mice, 20 slices; 4–5 months old, 10 mice, 20 slices) or R-CV (3–4 months
old, 10 mice, 20 slices; 4–5 months old, 10 mice, 20 slices).
(E and J) The averaged normalized fEPSP slope of 3- to 4-month-old (E) or 4- to 5-month-old (J) 5xFAD+/−
mice treated with DMSO or R-CV.
Data shown are the median and range (Mann-Whitney U test; ∗p < 0.5, ∗∗p < 0.01 compared with the
DMSO group). See also Figures S5 and S6.
Limitar o tempo de abertura do RyR2 não afeta o acúmulo de Aβ, mas

protege contra a morte celular neuronal e a perda da coluna dendrítica
  
Realizamos coloração imuno-histoquímica e análises de imunoblotting para avaliar o efeito da

mutação RyR2-E4872Q +/− no acúmulo de Aβ. Não houve diferença significativa no número ou
na área das placas Aβ detectadas no hipocampo de camundongos 5xFAD +/− e 5xFAD +/− / EQ
+/−
de 10 a 15 meses de idade ( Figuras 6 A-6C). As análises de imunoblot também não
mostraram nenhuma diferença significativa nos níveis de Aβ total ou Aβ (1-42) em homogenatos
de tecido cerebral de camundongo 5xFAD +/− e 5xFAD +/− e 5xFAD +/− / EQ +/− de camundongo
de 10 a 15 meses de idade ( Figuras 6 D– 6F). Nenhuma placa Aβ foi detectada em WT ou EQ
+/−
fatias do cérebro, e nenhum sinal específico de Aβ foi detectado em homogenatos de tecido
WT ou EQ +/− cerebral. Resultados semelhantes também foram observados em camundongos
de 5 a 6 meses de idade ( Figuras S7 A-S7F). Assim, limitar o tempo de abertura do RyR2 não
altera significativamente o acúmulo de Aβ.
Figura 6 E4872Q +/− não tem efeitos significativos na acumulação de Aβ, mas protege contra a perda de neurônios em
camundongos 5xFAD +/−
Mostrar legenda completa

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 
(A) Aβ deposition in the hippocampal region of 10- to 15-month-old WT, EQ+/−, 5xFAD+/−, and 5xFAD+/
−/EQ+/− mice.
(B) Averaged Aβ plaque numbers in the hippocampal region of 10- to 15-month-old 5xFAD+/− (12 mice, 36
slices) and 5xFAD+/−/EQ+/− (12 mice, 36 slices) mice.
(C) Percentage of the hippocampal area showing positive Aβ staining.
(D) Immunoblot analysis of brain homogenates from 10- to 15-month-old WT, EQ+/−, 5xFAD+/−, and
5xFAD+/−/EQ+/− mice.
(E and F) Normalized total Aβ levels (E) and normalized Aβ (1–42) levels (F) in WT (n = 15), EQ+/− (n =
11), 5xFAD+/− (n = 21), and 5xFAD+/−/EQ+/− (n = 20) brains.
(G) Images of Nissl staining of 10- to 15-month-old WT, EQ+/−, 5xFAD+/− and 5xFAD+/−/EQ+/− mouse brain
sections.
(H) Numbers of pyramidal neurons in the subiculum region (red oval) of WT (12 mice, 36 slices), EQ+/− (12
mice, 36 slices), 5xFAD+/− (12 mice, 36 slices), and 5xFAD+/−/EQ+/− (12 mice, 36 slices) mice.
(I) Images of Nissl staining of 10- to 15-month-old WT, EQ+/−, 5xFAD+/−, and 5xFAD+/−/EQ+/− mouse brain
sections.
(J) Numbers of pyramidal neurons in the CA1 region of WT (12 mice, 36 slices), EQ+/− (12 mice, 36 slices),
5xFAD+/− (12 mice, 36 slices), and 5xFAD+/−/EQ+/− (12 mice, 36 slices) mice.
Scale bars, 2 mm in (A) and 200 μm in (G) and (I). Data shown are the median and range (Mann-Whitney
U test and Kruskal-Wallis test with Dunn-Bonferroni post hoc test; ∗∗p < 0.01 versus WT, ##p < 0.01;
5xFAD+/−/EQ+/− versus 5xFAD+/−). See also Figure S7.
Também avaliamos se a mutação RyR2 E4872Q +/− pode influenciar a morte de células
neuronais. Consistente com relatórios anteriores (Jawhar et al., 2012; Oakley et al., 2006), o
número de neurônios piramidais na região do subículo (mas não CA1) foi reduzido
significativamente em fatias de cérebro de camundongo 5xFAD +/− de 10 a 15 meses de idade (
Figuras 6 G-6J). A mutação E4872Q +/− evitou a perda de células neuronais do subículo ,
conforme evidenciado pelo número semelhante de neurônios piramidais do subículo em
cérebros 5xFAD +/− / EQ +/− e WT ( Figura 6 H). Como a mutação E4872Q +/− , o pré-tratamento
com R- carvedilol também protegeu contra a perda de células neuronais do subículo sem afetar
o acúmulo de Aβ ( Figura 7 ; Figura S7 G – S7L).
  
Figura 7 O tratamento R- CV não tem efeitos significativos na acumulação de Aβ, mas protege contra a perda de
neurônio em camundongos 5xFAD +/− de 6 a 7 meses de idade
(A) Aβ deposition in 6- to 7-month-old 5xFAD+/− mice treated with DMSO or R-CV.
(B) Averaged Aβ plaque numbers in the hippocampal region of 6- to 7-month-old 5xFAD+/− mice treated
with DMSO (12 mice, 36 slices) or R-CV (12 mice, 36 slices).
(C) Percentage of the hippocampal area showing positive Aβ staining.
(D) Immunoblot analysis of brain tissue homogenates from 6- to 7-month-old 5xFAD+/− mice treated with
DMSO or R-CV.
(E and F) Normalized total Aβ levels (E) and normalized Aβ (1–42) levels (F) in 5xFAD+/− mice treated with
DMSO (n = 10) or R-CV (n = 11).
  
(G) Images of Nissl staining of 6- to 7-month-old 5xFAD+/− mice treated with DMSO or R-CV.
(H) Numbers of pyramidal neurons in the subiculum region (red oval) of 6- to 7-month-old 5xFAD+/− mice
treated with DMSO (12 mice, 36 slices) or R-CV (12 mice, 36 slices).
(I) Images of Nissl staining of 6- to 7-month-old 5xFAD+/− mice treated with DMSO or R-CV.
(J) Numbers of pyramidal neurons in the CA1 region of 6- to 7-month-old 5xFAD+/− mice treated with
DMSO (12 mice, 36 slices) or R-CV (12 mice, 36 slices).
Scale bars, 2 mm in (A) and 200 μm in (G) and (I). Data shown are the median and range (Mann-Whitney
U test; ∗∗p < 0.01 compared with the DMSO group). See also Figure S7.
Realizamos a coloração de Golgi para determinar se a mutação RyR2 E4872Q +/− afeta a
densidade da coluna e a morfologia dos neurônios piramidais 5xFAD +/− CA1. Consistente com
estudos anteriores (de Pins et al., 2019; Kim et al., 2020; Yang et al., 2018), a densidade das
saliências gerais e, especificamente, a densidade dos cogumelos e espinhos ramificados foram
reduzidos significativamente em neurônios piramidais 5xFAD +/− CA1 em comparação com as
células WT ( Figura S7 M). A mutação E4872Q +/− (limitando o tempo aberto do RyR2) evitou a
perda de protrusões gerais e espinhos ramificados, mas não a perda de espinhos em cogumelo,
de células piramidais 5xFAD +/− / EQ +/− CA1 ( Figura S7 M). A mutação E4872Q +/− também
diminuiu a densidade das espinhas filopodiais e aumentou a densidade das espinhas
ramificadas do EQ +/−Células CA1 em comparação com células WT. Isso indica que limitar o
tempo de abertura do RyR2 evita a perda da coluna dendrítica em camundongos 5xFAD +/−
apesar do acúmulo extenso de Aβ.
Discussão
Um crescente corpo de evidências indica que a progressão da AD é conduzida por um ciclo
vicioso de hiperatividade neuronal induzida por Aβ solúvel (Busche et al., 2012; Busche e
Konnerth, 2015; Stargardt et al., 2015; Zott et al., 2019) Intuitivamente, a redução do nível de Aβ
seria esperado para amortecer a hiperatividade neuronal dependente de Aβ e a progressão da
AD. No entanto, alcançar uma redução de Aβ suficiente para prevenir a indução de
hiperatividade neuronal e, consequentemente, a progressão da DA pode ser um obstáculo, o
que explica, em parte, o fracasso de alguns ensaios clínicos direcionados a Aβ recentes
(Chakroborty e Stutzmann, 2014; Honig et al., 2018; Karran et al., 2011) A supressão da

hiperatividade neuronal pode ser um meio alternativo para quebrar o ciclo de hiperatividade Aβ,  
mesmo em face da deposição de Aβ. Aqui testamos este conceito e demonstramos que limitar o
tempo aberto do RyR2 (geneticamente ou farmacologicamente) evita a hiperatividade neuronal
dos neurônios piramidais CA1 ex vivo e in vivo em um modelo de camundongo com AD de
início rápido e precoce severo (5xFAD). Também mostramos que limitar o tempo de abertura do
RyR2 evita o déficit de LTP, prejuízo do aprendizado e da memória, morte de células neuronais
e perda da coluna dendrítica em camundongos 5xFAD. É importante ressaltar que todos esses
déficits relacionados à AD foram evitados mesmo com o acúmulo contínuo de Aβ. Estas
descobertas identificam o tempo aberto do RyR2 como um alvo promissor para suprimir a
hiperatividade neuronal e a progressão da AD, independentemente da deposição de Aβ.
O (s) mecanismo (s) exato (s) subjacente (s) à restrição mediada por RyR2 da hiperatividade
neuronal dos neurônios CA1 do hipocampo ainda não foi definido, mas é provável que seja
complexo e multifatorial. Aqui nos concentramos no efeito da limitação do tempo aberto do
RyR2 na excitabilidade intrínseca dos neurônios piramidais CA1, um determinante chave da
atividade neuronal, aprendizagem e memória (Brager e Johnston, 2007; Kerrigan et al., 2014;
Tamagnini et al., 2015; Xu et al., 2005) Intracelular RyR mediada por Ca 2+ de libertação é
conhecida para regular a excitabilidade neuronal intrínseca modulando a Ca 2+ activadas por K
+ mediadas por canal I AHP (Bodhinathan et al., 2010; van de Vrede et al., 2007) A liberação de
Ca 2+ mediada por RyR também afeta a atividade neuronal ao modular a atividade pré-sináptica
(Chakroborty et al., 2012b, 2019; Le Magueresse e Cherubini, 2007) Assim, uma possibilidade é
que limitar o tempo aberto do RyR2 pode contribuir para a supressão da hiperatividade neuronal
ao diminuir a excitabilidade da membrana por meio da modulação de I AHP e / ou atividade pré-
sináptica. Para testar essa possibilidade, empregamos uma abordagem genética para avaliar se
a limitação do tempo aberto do RyR2 altera a I AHP e / ou a atividade pré-sináptica.
Surpreendentemente, o tempo aberto do RyR2 geneticamente limitado não teve um efeito
importante no I AHP ou na entrada sináptica espontânea nos neurônios CA1 do hipocampo.
A corrente K + tipo A desempenha um papel importante no controle da excitabilidade neuronal

dos neurônios CA1 do hipocampo (Hall et al., 2015; Jung e Hoffman, 2009; Kim et al., 2005;
Magee et al., 1998; Varga et al., 2004) Curiosamente, a corrente de K + tipo A é regulada
negativamente pela redução dependente do influxo de Ca 2+ e atividade na expressão de
superfície da subunidade Kv4.2 do canal de K + tipo A, que é modulada por uma proteína de
ligação de Ca 2+ chamada KChIP4 (Kim et al., 2007a; Morohashi et al., 2002) Esta dependência
de Ca 2+ do tráfego de Kv4.2 levanta a possibilidade de que a liberação intracelular de Ca 2+
mediada por RyR2 também pode regular a expressão de superfície de Kv4.2 e, portanto, a
corrente de K + tipo A , considerando a estreita relação entre Ca 2+ influxo e liberação de Ca 2+
mediada por RyR2 (Kim et al., 2007b; Sandler e Barbara, 1999) Como o RyR2 é
abundantemente expresso em neurônios piramidais CA1 do hipocampo, é razoável propor que

limitar o tempo aberto de RyR2 e, portanto, a liberação de Ca 2+ mediada por RyR2 nesses  
neurônios pode afetar o tráfego de Kv4.2 e, consequentemente, a corrente de K + tipo A . De

fato, descobrimos que limitar o tempo aberto do RyR2 aumentou a expressão de superfície de
Kv4.2, regulou positivamente a corrente de K + tipo A de uma maneira dependente de KChIP4 e
diminuiu a excitabilidade da membrana. A corrente K + tipo A é regulada para baixo em modelos
de mouse AD (Chen, 2005; Good et al., 1996; Hall et al., 2015; Scala et al., 2015) Isso é
consistente com nossa descoberta de que a corrente de K + tipo A foi significativamente
reduzida em neurônios 5xFAD +/− CA1, e isso foi completamente restaurado pela limitação do
tempo aberto do RyR2. Assim, nosso trabalho estabelece um modo até então desconhecido de
controle do RyR2 da corrente K + tipo A. Curiosamente, as variantes de perda de função na
proteína associada a Kv4.2, dipeptidil-peptidase 6 (DPP6), foram recentemente associadas à
DA de início precoce (Cacace et al., 2019) DPP6 é conhecido por aumentar a expressão de
superfície de Kv4.2 e regular seu gating (Sun et al., 2011) Assim, a perda de DPP6 pode
contribuir para a hiperatividade neuronal e a progressão da DA ao regular para baixo Kv4.2. De
fato, o nível de mRNA dos canais de K + do tipo A do hipocampo em pacientes humanos com DA
é regulado para baixo (Noh et al., 2019)
Função e expressão aprimoradas de RyR2 foram implicadas na patogênese da DA (Bruno et

al., 2012; Chakroborty et al., 2009; Kelliher et al., 1999; Lacampagne et al., 2017; Oulès et al.,
2012; SanMartín et al., 2017; Smith et al., 2005) Um meio eficaz e seguro de suprimir essa
função aprimorada do RyR2, no entanto, ainda precisa ser identificado. Nós mostramos
anteriormente que limitar o tempo de abertura do RyR2 evita arritmias ventriculares em modelos
animais sem efeitos prejudiciais no coração (Chen et al., 2014; Zhang et al., 2015) Aqui,
mostramos que limitar o tempo aberto do RyR2 evita a disfunção cognitiva em camundongos
5xFAD +/− sem efeitos prejudiciais na função cerebral normal. Isso indica que limitar o tempo de
abertura do RyR2 (em oposição ao bloqueio da condução do canal) é um meio promissor e
eficaz para combater distúrbios neuronais associados ao RyR2 hiperativo.
Relatamos anteriormente que o carvedilol limita o tempo de abertura do RyR2 (Zhou et al.,
2011) A ação desse carvedilol é análoga à da mutação RyR2 E4872Q +/− , sugerindo que o
carvedilol, como o E4872Q +/− , pode suprimir a progressão da DA. Infelizmente, a inibição de
RyR2 requer uma alta dose de carvedilol (Zhou et al., 2011), que produz bloqueio β excessivo e
efeitos adversos graves (Ko et al., 2004; Packer et al., 1996) O carvedilol é uma mistura
racêmica de 50% S- carvedilol (um β-bloqueador) e 50% R- carvedilol (um não β-bloqueador)
(Bartsch et al., 1990; Nichols et al., 1989; Stoschitzky et al., 2001; van Zwieten, 1993) É
importante ressaltar que o enantiômero R- carvedilol sem bloqueio β também limita o tempo
aberto de RyR2 (Zhang et al., 2015) Assim, a aplicação apenas de R- carvedilol pode ser um
meio de limitar a hiperatividade neuronal sem bloqueio β grave. De fato, mostramos que o pré-
tratamento com R- carvedilol de camundongos 5xFAD +/− antes ou depois do aparecimento dos

sintomas de DA preveniu e resgatou a hiperatividade neuronal e a perda de memória. Por outro  
lado, o pré-tratamento com a mistura racêmica de carvedilol não evitou déficits de

aprendizagem e memória em camundongos 5xFAD +/− , o que pode explicar o resultado
negativo de um recente ensaio clínico de AD da mistura racêmica de carvedilol ( https:
//www.clinicaltrials .gov / ct2 / show / study / NCT01354444) A razão exata pela qual a mistura
racêmica de carvedilol é ineficaz em suprimir a progressão da DA é desconhecida. Uma
possível explicação é que a potente ação β-bloqueadora da mistura racêmica de carvedilol
(especialmente em altas doses) pode influenciar adversamente a função neuronal e cognitiva.
Notavelmente, o pré-tratamento com R- carvedilol resgatou problemas de aprendizagem e
memória mesmo em camundongos 5xFAD +/− (6–7 e 10–12 meses de idade) com acumulação
extensa de Aβ. Isso mostra que limitar o tempo de abertura do RyR2 pode restaurar os déficits
de AD, mesmo nos estágios finais da AD. Assim, o enantiômero R- carvedilol é um agente
terapêutico anti-DA não direcionado a Aβ, dirigido por hiperatividade, que garante estudos pré-
clínicos adicionais e até mesmo ensaios clínicos.
Métodos STAR ★
Tabela de Recursos Chave
  
REAGENTE ou
FONTE IDENTIFICADOR
RECURSO
Anticorpos
Anti-Kv4.2 policlonal de
Abcam Cat # ab16719; RRID: AB_443443
coelho
Anti-Rab4 policlonal de Tecnologia de

Cat # 2167; RRID: AB_2253579
coelho Sinalização Celular
Anti-β-Amilóide Tecnologia de
Cat # 8243; RRID: AB_2797642
monoclonal de coelho Sinalização Celular
Anti-β-Amilóide
monoclonal de Biolegend Cat # 803001; RRID: AB_2564653
camundongo
Anti-β-Actina
monoclonal de Sigma-Aldrich Cat # A5316; RRID: AB_476743
camundongo
HRP IgG anti-coelho de Thermo Fisher

Cat # 31460; RRID: AB_228341
b (H L) S i ifi
Abra a mesa em uma nova guia
Disponibilidade de recursos
Contato principal
Mais informações e solicitações de recursos e reagentes devem ser encaminhadas e atendidas

pelo contato principal, SR Wayne Chen ( swchen@ucalgary.ca ).
Disponibilidade de materiais
Todos os materiais serão disponibilizados mediante solicitação razoável.
Disponibilidade de dados e código
Todos os dados gerados neste estudo estarão disponíveis mediante solicitação razoável.
  
Modelo Experimental e Detalhes do Assunto

Modelos de mouse
Todos os estudos em animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso
de Animais da Universidade de Calgary e foram realizados de acordo com as diretrizes dos
Institutos Nacionais de Saúde dos EUA. Camundongos adultos geneticamente modificados,
5xFAD +/− (Oakley et al., 2006), RyR2-E4872Q +/− (EQ +/− ) (Chen et al., 2014), 5xFAD +/− /
RyR2-E4872Q +/− (5xFAD +/− / EQ +/− ) e irmãos de ninhada WT de ambos os sexos. Todos os
modelos animais foram alojados nas instalações de camundongos da Cumming School of
Medicine, University of Calgary. Os camundongos foram mantidos em um fundo 129E e
alojados em um ciclo claro / escuro de 12 horas com acesso ad libitum a comida e água. R-
carvedilol ( R -CV) (3,2 mg / kg / dia), carvedilol (mistura racêmica) (3,2 mg / kg / dia) e controle
de veículo (DMSO) foram entregues a 5xFAD +/− camundongos em água potável para um mês,
começando em diferentes idades antes (2-3 meses de idade) ou após (3-4 meses de idade) a
ocorrência de patologias de DA (Oakley et al., 2006) Para avaliar os efeitos do tempo aberto de
RyR2 geneticamente e farmacologicamente limitante na prevenção e resgate de déficits de AD
em diferentes estágios (precoce, moderado e tardio) da progressão da AD, foram usados
animais em diferentes idades (de 2-15 meses). Como reportado (Oakley et al., 2006), há uma
dependência da progressão da AD com a idade nos camundongos 5xFAD +/− . No entanto, não
observamos diferenças dependentes do sexo na progressão da AD nesses camundongos.
Como mostrado anteriormente, apenas os camundongos mutantes heterozigotos RyR2-E4872Q
+/− foram produzidos como homozigotos E4872Q + / + mutação é embrionária letal (Chen et al.,
2014) RyR2s funcionais são canais tetraméricos formados por 4 monômeros RyR2. Os
camundongos E4872Q +/− mutantes heterozigotos (abrigando um alelo WT e um alelo mutante
E4872Q) irão produzir uma mistura de canais homo e heterotetraméricos que contêm o WT, o
mutante E4872Q ou ambos os monômeros mutantes WT / E4872Q. Assim, a mutação RyR2-
E4872Q pode exercer seu impacto negativo não apenas na função dos homotetrâmeros
E4872Q, mas também na função do monômero WT nos canais heterotetraméricos WT /
E4872Q. Para experimentos de imagem de Ca 2+ de 2 fótons , camundongos mutantes 5xFAD,
RyR2 WT e RyR2 foram cruzados com os camundongos transgênicos Thy1 -GCaMP6f
heterozigotos (Chen et al., 2012, 2013) (GP5.17, JAX 025393) para expressar a sonda de
detecção GCaMP6f Ca 2+ (conduzida pelo promotor Thy1 ) em neurônios do hipocampo em
cada um dos genótipos usados.
Linhas de celular
A linha de células Flp-In T-REx HEK293 foi obtida da Invitrogen. Linhas celulares HEK293 que
expressam RyR2 WT ou a mutação RyR2 E4872Q foram geradas usando a linha celular Flp-In

T-Rex HEK293. Linhas celulares HEK293 foram cultivadas em meio Eagle modificado por
 
Dulbecco (GIBCO) suplementado com 10% de soro fetal bovino (GIBCO), 100 unidades / ml de
penicilina e 100 μg / ml de estreptomicina (GIBCO), 4 mM de L-glutamina (GIBCO) e 0,1 mM
Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (GIBCO). Todas as linhas celulares foram
cultivadas em uma incubadora umidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C e foram testadas como
negativas para contaminação por micoplasma.
Detalhes do Método
Preparação de fatia cerebral aguda
Fatias cerebrais agudas foram preparadas de acordo com os procedimentos publicados com
algumas modificações (Ting et al., 2014, 2018) Resumidamente, os camundongos foram
anestesiados com isoflurano (5%) e perfundidos através do coração com 20 mL de solução de
corte carbogenado (95% O 2 , 5% CO 2 ), N-metil-D-glucamina (NMDG) através do coração ,
contendo NMDG, 93 mM; KCl, 2,5 mM; NaH 2 PO 4 , 1,2 mM; De NaHCO 3 , 30 mM; HEPES, 20
mM; glicose, 25 mM; tioureia, 2 mM; Ascorbato de Na, 5 mM; Na-piruvato, 3 mM; CaCl 2 ∙ 2H 2
O, 0,5 mM e MgSO 4 ∙ 7H 2O, 10 mM, pH a 7,3-7,4 com HCl. Os cérebros foram rapidamente
removidos e colocados na solução de corte carbogenada gelada por 30 s. Fatias transversais
do hipocampo (260 ou 300 μm de espessura) foram preparadas em Vibratome (VT1200S,
Leica) e transferidas para uma câmara de incubação caseira a 32 ° C com a solução de corte
carbogenada. Em seguida, executamos o esquema de pico de Na + de acordo com a idade do
mouse. As fatias foram então mantidas em HEPES contendo aCSF (NaCl, 92 mM; KCl, 2,5 mM;
NaH 2 PO 4 , 1,25 mM; NaHCO 3 , 30 mM; HEPES, 20 mM; glicose, 25 mM; tioureia, 2 mM; Na -
ascorbato, 5 mM; Na-piruvato, 3 mM; CaCl 2 ∙ 2H 2 O, 2 mM, e MgSO 4 ∙ 7H 2O, 2 mM, pH a 7,3-
7,4 com NaOH) à temperatura ambiente por pelo menos 60 min antes do uso.
Gravações de patch-clamp de célula inteira
Para gravações de patch clamp de células inteiras, as fatias foram transferidas para uma
câmara de gravação submersa perfundida com soluções externas carbogenadas a uma taxa de
fluxo de 4-6 mL / min em temperatura ambiente (23 o C). Os potenciais de ação (APs) foram
medidos em neurônios piramidais CA1 do hipocampo em fatias transversais do hipocampo (260
μm) de todos os genótipos de camundongos de 3-4 meses usando patch-clamp de célula inteira
com um amplificador Axopatch 700B (Axon Instruments). Nós nos concentramos nos neurônios
piramidais CA1 hipocampais, pois eles desempenham um papel crítico na atividade neuronal,
aprendizagem e memória (Brager e Johnston, 2007; Kerrigan et al., 2014; Tamagnini et al.,
2015; Xu et al., 2005) Não medimos os potenciais de membrana em neurônios de 5-6 meses de
idade ou mais velhos, pois neurônios idosos são difíceis de remendar. A queima de AP foi
registrada em uma solução externa (NaCl, 124 mM; KCl, 2,5 mM; NaH 2 PO 4 , 1,25 mM;
NaHCO 3 , 24 mM; HEPES, 5 mM; glicose, 12,5 mM; MgCl 2 , 2 mM; e CaCl 2 , 2 mM; pH 7,4

ajustado com NaOH) e pipetas de gravação de vidro macio (Sutter Instruments; Novato CA)  
preenchidas com uma solução interna (gluconato de potássio, 135 mM, KCl, 10 mM, HEPES, 10
mM, CaCl 2 , 1 mM, MgCl 2, 1 mM, EGTA, 10 mM, ATP, 1 mM, GTP, 0,1 mM e pH 7,3 ajustado
com KOH). A resistência da pipeta era de 4–6 MΩ após o enchimento com solução interna.
Para gravação AP espontânea, as células foram mantidas em -70 mV e registradas por 3 min.
Para a medição de APs desencadeados por injeção de corrente, 0,05 mM de ácido 2-amino-5-
fosfonovalérico (APV), 0,02 mM de 6,7-dinitroquinoxalina-2,3-diona (DNQX) e 0,1 mM de
picrotoxina foram adicionados à solução externa para bloquear a atividade sináptica. Os APs
foram iniciados pela injeção de corrente de 0 a 300 pA por 1 s em etapas de 10 pA em
intervalos de 10 s. Para testar o agonista do canal Kv4 NS5806, os APs foram medidos antes e
15 minutos após a perfusão de 10 μM NS5806 na solução externa. Para o registro das
correntes pós-sinápticas excitatórias espontâneas (sEPSCs), foram utilizadas as mesmas
soluções externas e internas para o registro do PA. Picrotoxina (0, 1 mM) foi adicionado à
solução externa para bloquear a corrente inibitória. O neurônio CA1 foi mantido a -70 mV por 2
min.
Estudos anteriores usaram gravações de patch clamp de células inteiras na soma das células
piramidais CA1 para medir a corrente K + de tipo A de células inteiras (Chen, 2005; Good et al.,
1996; Hall et al., 2015; Scala et al., 2015) Para fazer comparações com estudos anteriores,
empregamos a mesma abordagem. Resumidamente, a corrente K + de tipo A de célula inteira ( I
A ) foi induzida por pulsos de despolarização a +40 mV a partir de um potencial de retenção de
-100 mV na presença de tetraetilamônio 20 mM (TEA) e tetrodotoxina 100 nM (TTX). Em
experimentos de ativação em estado estacionário, o potencial de membrana foi mantido em
−100 mV, e I A foi evocado por um pulso de despolarização de 200 ms de um primeiro potencial
de pulso de −80 mV a +80 mV em etapas de 10 mV em intervalos de 10 s . Os dados foram
analisados usando a equação G K = I K / ( V m - V rev ), onde G Ké a condutância do K + da
membrana , V m é o potencial da membrana e V rev é o potencial de reversão do K + . Para
estudar a inativação em estado estacionário de I A , as correntes foram eliciadas usando pré-
pulsos de condicionamento de 1 s de -110 mV a 0 mV antes de um pulso de teste de 200 ms de
+50 mV. Após normalizar cada amplitude de corrente para a corrente máxima, a amplitude
obtida do pré-pulso de -110 mV foi usada como uma função do potencial de pré-pulso de
condicionamento e ajustada com a função I A / I A - max = 1 / (1 + exp (( V m1 / 2 - V m) / k)), a
partir do qual foi obtida uma curva de inativação I A e calculado o valor V H (tensão na qual a
amplitude da corrente foi meia-inativada). Observe que em outros estudos e no nosso, a
corrente de K + tipo A foi medida realizando registros de corrente de célula inteira no soma de
neurônios piramidais CA1 para avaliar o papel da corrente K + de tipo A de célula inteira
somática na excitabilidade somática e saída de pico. Dado o conhecido gradiente
somatodendrítico de distribuição de densidade de corrente K + tipo A (Hoffman et al., 1997), o
uso de registros somáticos de células inteiras limitaria nossa capacidade de identificar

mudanças na distribuição de densidade de corrente K + tipo A ao longo do eixo soma-dendrítico.  
Mais estudos serão necessários para definir a contribuição da corrente dendrítica do tipo A K +
para a hiperatividade neuronal associada à AD e o controle da excitabilidade neuronal mediado
pelo RyR2. No entanto, registros somáticos de células inteiras ainda fornecem informações
valiosas sobre a magnitude da corrente somática de K + do tipo A , um importante determinante
da excitabilidade somática.
Para experimentos de células HEK293, as linhas de células HEK293 foram mantidas conforme
descrito anteriormente (Jiang et al., 2004) e transfectadas transitoriamente com cDNAs de
Kv4.2 e KChIP4 juntamente com cDNA que codifica para GFP para identificar células
transfectadas com sucesso. 12-16 h antes da gravação, tetraciclina foi adicionada ao meio de
cultura para induzir a expressão de RyR2 WT ou RyR2 E4872Q mutante. I A foi gravado com os
mesmos protocolos descritos acima. Antes da gravação I A , o meio de cultura foi substituído por
uma solução de banho (NaCl, 125 mM; KCl, 2,5 mM; HEPES, 10 mM; MgCl 2 , 1 mM; glicose,
10 mM; TEA, 20 mM; pH 7,4 ajustado com NaOH).
Para registrar a corrente de pós-hiperpolarização ( I AHP ), fatias do cérebro foram perfundidas

com o aCSF carbogenado e as pipetas foram preenchidas com solução interna I AHP (KMeSO 3
, 130 mM; EGTA, 0,1 mM; HEPES, 10 mM; NaCl, 7 mM; MgCl 2 , 0,3 mM; di-tris-creatina, 5 mM;
Tris-ATP, 2 mM e Na-GTP, 0,5 mM, pH 7,3 com KOH). I AHP foi evocado por uma etapa de
tensão despolarizante de 100 ms para +60 mV de um potencial de retenção de -85 mV. Médio (
I mAHP ) e lento ( I sAHP) as amplitudes foram medidas no pico da corrente e 1 s após o fim do
pulso de despolarização, respectivamente. Todas as células tinham um potencial de membrana
em repouso mais hiperpolarizado que -60 mV, corrente de fuga menor que 100 pA e uma
resistência de entrada de 150-350 MΩ. A resistência de entrada foi determinada a partir de um
pulso de hiperpolarização de −5 mV (100 ms) aplicado no início de cada varredura. A
resistência de acesso foi compensada eletronicamente em 80% e estável a <20 MΩ.
Imagem de Ca 2+ de 2 fótons in vivo de neurônios CA1
Para avaliar o impacto do tempo aberto de RyR2 geneticamente limitado na progressão da AD,
cruzamos camundongos heterozigotos 5xFAD +/− que superexpressam 5 mutações familiares
humanas de AD (Oakley et al., 2006) com camundongos mutantes RyR2 heterozigotos que
abrigam a mutação RyR2 E4872Q +/− que encurta significativamente o tempo de abertura do
RyR2 (Chen et al., 2014) Este cruzamento gerou quatro genótipos: 5xFAD +/− , 5xFAD +/− /
E4872Q +/− (5xFAD +/− / EQ +/− ), E4872Q +/− (EQ +/− ) e tipo selvagem (WT) . Para determinar
se a limitação do tempo de abertura do RyR2 pode suprimir a hiperatividade neuronal associada
à AD in vivo, conforme relatado anteriormente (Busche et al., 2008, 2012; Delekate et al., 2014;
Eichhoff e Garaschuk, 2011; Kim et al., 2016; Takano et al., 2007; Zott et al., 2019), cruzamos
então os camundongos 5xFAD +/− / E4872Q +/− heterozigotos duplos com os camundongos

transgênicos Thy-1 GCaMP6f +/− heterozigotos (GP5.17, JAX 025393) para introduzir o  
transgene GCaMP6f +/− em cada um dos quatro genótipos (impulsionados pelo promotor Thy1 ).
Nota GCaMP6f é uma proteína rápida e ultrassensível de detecção de Ca 2+ que é capaz de
detectar potenciais de ação individuais em neurônios com alta confiabilidade (Chen et al., 2013;
Dana et al., 2014; Peron et al., 2015) Além disso, na região CA1 do hipocampo dos
camundongos transgênicos Thy-1 GCaMP6f +/− , GCaMP6f é predominantemente expresso em
neurônios piramidais (não em neurônios GABAérgicos ou células gliais). Realizamos imagens
de dois fótons in vivo de neurônios piramidais CA1 expressando GCaMP6f em cada um dos
quatro genótipos para monitorar transientes espontâneos de Ca 2+ . Esses transientes
espontâneos de Ca 2+ são amplamente usados para avaliar a atividade neuronal espontânea de
populações de células (Busche et al., 2008, 2012; Chen et al., 2013; Dana et al., 2014; Kerr et
al., 2005; Peron et al., 2015; Sato et al., 2007; Zott et al., 2019)
A hiperatividade neuronal foi relatada em camundongos modelo AD anestesiados in vivo

usando imagens de Ca 2+ de dois fótons (Busche et al., 2008, 2012, 2019; Lerdkrai et al., 2018)
Para poder comparar nossos dados com esse considerável corpo de literatura existente,
empregamos a mesma abordagem descrita originalmente por Busche et al. e usado por outros
no campo (Busche et al., 2008, 2012; Delekate et al., 2014; Eichhoff e Garaschuk, 2011; Kim et
al., 2016; Takano et al., 2007; Zott et al., 2019) A craniotomia foi realizada de acordo com o
protocolo relatado anteriormente (Busche, 2018; Busche et al., 2008, 2012) com algumas
modificações. Resumidamente, camundongos em diferentes idades foram anestesiados com
1% –2% de isoflurano (vol / vol em oxigênio puro) e colocados em uma placa de aquecimento
(Homeothermic Monitor, Harvard Apparatus). A temperatura corporal foi monitorada e
controlada em 36,5-37,5 ° C durante toda a cirurgia e procedimento de imagem. Após a
remoção da pele, o crânio foi enxaguado com líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF: NaCl,
125 mM; KCl, 4,5 mM; NaH 2 PO 4 , 1,25 mM; NaHCO 3 , 26 mM; glicose, 20 mM; CaCl 2 ∙ 2H 2
O, 2 mM e MgCl 2, 1 mM, pH a 7,3-7,4 com NaOH) e seco com pontas de algodão. Uma
câmara de registro de plástico feita sob medida foi colada ao crânio com cimento dental. A
câmara foi preenchida e mantida em perfusão com aCSF quente (37 ° C). As coordenadas
estereotáxicas do hipocampo foram localizadas de acordo com o atlas do cérebro do
camundongo. Uma janela craniana de 1-2 mm de largura centrada 2,5 mm posterior ao bregma
e 2,2 mm lateral à linha média foi aberta no crânio com uma broca dentária. A dura-máter foi
removida com uma pinça fina e o tecido cortical acima do hipocampo foi cuidadosamente
removido por aspiração. Quando a superfície dorsal do hipocampo foi vista, a aspiração foi
interrompida e a área de imagem foi completamente irrigada com aCSF quente por cerca de 30
minutos para garantir que não houvesse sangramento e o sangue fosse removido o máximo
possível. A craniotomia foi preenchida com agarose (2% –3%) e estabilizada com lamínula. Em
seguida, o animal foi movido para a plataforma de registro, e o isoflurano foi gradualmente
reduzido para 0,5% -0,8%. Além da temperatura corporal central, a frequência respiratória e a

pulsação foram monitoradas continuamente (MouseOx plus. STARR Life Science Corp.).  
Registros de dois fótons in vivo foram feitos usando um microscópio de dois fótons customizado
alimentado por um laser Ti: Sapph (Ultra II, potência média de ∼4W, 670-1080 nm, Coerente),
usando uma lente objetiva Nikon de imersão em água (16x , NA 0.8) e detectores Hamamatsu
GaAsP PMT. Os dados de imagem foram adquiridos usando MATLAB, rodando em um software
de controle de microscópio de varredura de código aberto chamado ScanImage (versão 3.8.1,
Howard Hughes Medical Institute / Janelia Farms, RRID: SCR_014307) (Pologruto et al., 2003)
A imagem foi realizada em um comprimento de onda de excitação de 920 nm para GCaMP6f e
a fluorescência foi capturada usando um dicróico secundário de 560 nm e um filtro de emissão
passa-banda de 525-40 nm (Chroma Technologies). Imagens de série temporal foram
adquiridas em 15,63 Hz com uma densidade de pixel de 256 × 256 e um campo de visão de
-110 μm. Para cada visualização, os transientes espontâneos de Ca 2+ de neurônios CA1 do
hipocampo foram registrados por 5-10 min.
As análises de imagens foram realizadas offline usando ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij ) e um

programa de código aberto MATLAB NeuroSeg (Guan et al., 2018) Primeiro, as imagens foram
estabilizadas com ImageJ para reduzir a vibração xy, em seguida, as regiões de interesse (ROI)
foram desenhadas em torno dos corpos individuais e a mudança de fluorescência relativa (ΔF /
F) versus traços de tempo para cada ROI foi gerada usando NeuroSeg. Os transientes de Ca 2+
foram identificados como mudanças em ΔF / F três vezes maiores que o desvio padrão da
banda de ruído. Classificamos todos os neurônios registrados com base em suas taxas de
atividade como neurônios silenciosos (0-0,2 transientes / min), normais (0,2-20 transientes /
min) e hiperativos (≥20 transientes / min) seguindo as definições de Busche e colegas (Busche,
2018; Busche et al., 2008, 2012) Observe que as análises de distribuições de frequência foram
realizadas usando células reunidas de todos os animais, enquanto as análises de frequência
média e fração de células silenciosas, normais e hiperativas foram baseadas em dados de
animais individuais.
Imagem ex vivo de 2 fótons de Ca 2+ de neurônios CA1
A imagem de Ca 2+ de dois fótons ex vivo foi realizada conforme descrito anteriormente com
algumas modificações (Chen-Engerer et al., 2019) Camundongos mutantes 5xFAD, RyR2 WT e
RyR2 foram cruzados com os camundongos transgênicos Thy 1-GCaMP6f heterozigotos (Chen
et al., 2012, 2013) (GP5.17, JAX 025393) para expressar a sonda de detecção GCaMP6f Ca 2+
(conduzida pelo promotor Thy 1) em neurônios do hipocampo em cada um dos genótipos
usados. Fatias transversais do hipocampo (260 μm) foram preparadas conforme descrito acima
e mantidas no HEPES carbogenado contendo aCSF por pelo menos 60 min antes da gravação.
As fatias foram então movidas para uma câmara de registro contendo solução externa
carbogenada (NaCl, 124 mM; KCl, 2,5 mM; NaH 2 PO 4 , 1,25 mM; NaHCO 3 , 24 mM; HEPES,
5 mM; glicose, 12,5 mM; MgCl 2 , 2 mM; e CaCl 2, 2 mM; pH 7,4 ajustado com NaOH) e
  
colocado sob um sistema de imagem de dois fótons para cima à direita (SP8 DIVE, Leica,
Alemanha) com CHAMELEON HEAD / PSU: ULTRA (II): 80 MHz (RoHS) laser (Coherent, Reino
Unido). Uma objetiva de imersão em água de 25x com NA 0,95 (Leica, Alemanha) foi usada
para a imagem. O comprimento de onda do laser foi fixado em 920 nm. As imagens foram
gravadas com uma resolução de 296 × 296 pixels a 16,77 fps. Durante a gravação, 0,5 μM de
tetrodoxina (TTX), 0,03 mM de ácido 2-amino-5-fosfonovalérico (APV), 0,02 mM de 6,7-
dinitroquinoxalina-2,3-diona (DNQX) e 0,1 mM de picrotoxina foram adicionados à solução
externa . A aplicação local do medicamento foi realizada por meio de pipeta de vidro com
resistência ∼8 M which, que foi conectada a um sistema de perfusão pressurizado modificado
(ALA Scientific Instruments, Inc., EUA). A pipeta foi preenchida com solução de cafeína ringer
(cafeína, 40 mM; CaCl2 , 2 mM; HEPES, 10 mM; KCl, 2,5 mM; MgCl 2 , 1 mM; NaCl, 120 mM;
NaH 2 PO 4 , 1,25 mM; pH 7,4 ajustado com NaOH). A ponta da pipeta foi colocada a 15-20 μm
da soma do neurônio CA1. Cafeína (40 mM) foi aplicada por 3 s para induzir a liberação de Ca
2+
. A intensidade de fluorescência em cada ROI somática foi corrigida por subtração de fundo.
Uma ROI imediatamente fora do neurônio foi tomada como pano de fundo. As alterações de
intensidade de fluorescência temporal em ROIs foram expressas como alterações relativas na
intensidade de fluorescência: ΔF / F = ((F - F 0 ) / F 0 ). F 0é definida como fluorescência de linha
de base, que é a intensidade de fluorescência antes de um determinado estímulo, e F é a
fluorescência registrada ao longo do tempo. Os valores de ΔF / F foram calculados e plotados
usando NeuroSeg.
Registro de potenciação de longo prazo
As fibras colaterais de Schaffer foram estimuladas no subcampo CA3 para registrar potenciais
pós-sinápticos excitatórios de campo (fEPSPs) no estrato radiado CA1 de fatias transversais do
hipocampo (300 μm) de todos os genótipos e camundongos tratados com drogas em diferentes
idades. Após a recuperação em temperatura ambiente por 1 h (ou 2 h para fatias de cérebro de
camundongos tratados com droga), as fatias de hipocampo foram permitidas se recuperar na
câmara de registro por mais 10 min. Para avaliar a transmissão sináptica basal, aplicamos
diferentes intensidades de estimulação (0 μA a 200 μA em etapas de 20 μA) e traçamos as
inclinações de fEPSP versus a entrada de corrente para comparar a inclinação das curvas de
entrada / saída (I / O) de fEPSP. Nos experimentos que se seguiram, a corrente de estímulo foi
ajustada de modo que a fEPSP estabilizou em 40% –50% do máximo. A linha de base foi
registrada por pelo menos 20 min até que as diferenças entre as inclinações de fEPSP
estivessem dentro de 10%. A potenciação de longo prazo (LTP) foi induzida usando uma
estimulação tetânica de alta frequência (HFS; 4 trens de 100 pulsos a 100 Hz, com intervalos de
20 s). As respostas sinápticas foram registradas por pelo menos 60 minutos após a tetanização
e quantificadas como a inclinação do fEPSP evocado como porcentagem da linha de base.
  
Testes de aprendizagem e memória
O aprendizado e a memória de camundongos com todos os genótipos foram avaliados usando

o teste do labirinto aquático de Morris (MWM), o teste do labirinto de Barnes (BM) e / ou o teste
de reconhecimento de objeto novo (NOR). Os experimentos foram realizados às cegas. Para o
teste MWM, camundongos em diferentes idades foram treinados para localizar uma plataforma
de escape oculta (10 × 10 cm) em uma piscina circular (116,84 cm de diâmetro, 50 cm de
profundidade) (San Diego Instruments, CA) por meio de uma sugestão visual distal. A
plataforma foi submersa 1-2 cm abaixo da superfície em água (22-24 ° C), que se tornou opaca
pela adição de leite em pó. A localização da piscina em relação às pistas visuais foi mantida
constantemente durante toda a tarefa. As pistas eram distintas em cor e forma. A divisão digital
da área de rastreamento (piscina) em quatro quadrantes foi realizada pelo sistema de
rastreamento de vídeo SMART, Smart 3. 0 (Panlab Harvard Apparatus; Barcelona Espanha). A
plataforma de fuga foi colocada no centro do quadrante sudoeste durante toda a fase de
aprendizagem (4 dias de treinamento) e definida digitalmente como alvo. O treinamento
espacial consistiu em 4 dias com 5 tentativas por camundongo por dia. Os camundongos foram
soltos com as cabeças voltadas para a parede da piscina em um dos quatro locais de entrada
(norte, leste, sul e oeste) em uma ordem aleatória não repetitiva. A natação foi automaticamente
monitorada por vídeo até que o sujeito encontrasse a plataforma de fuga e permanecesse nela
(≥5seg), ou até um máximo de 60s. Os camundongos que não localizaram a plataforma oculta
dentro do limite de tempo de 60 s foram guiados para a plataforma de escape até passarem ≥
10 s nela. Entre os ensaios (intervalo entre os ensaios ≥ 10 min), os camundongos foram
alojados em gaiolas aquecidas para evitar déficits de desempenho devido à exaustão ou
hipotermia. A latência e a velocidade de nado para alcançar a plataforma de escape foram
registradas para comparação. Após a fase de aprendizagem, a retenção da memória foi
avaliada por um teste de sondagem 24 horas após a última sessão de treinamento. A
plataforma de fuga foi removida antes que os ratos fossem liberados do ponto de entrada norte
para a piscina. A natação deles foi monitorada por vídeo por 60 s. A área no local da plataforma
oculta removida foi definida como o alvo e o quadrante sudoeste o quadrante alvo. A
porcentagem de tempo que os ratos passaram no quadrante alvo (incluindo o alvo) foram
medidos para comparação. A plataforma de fuga foi removida antes dos ratos serem liberados
do ponto de entrada norte para a piscina. A natação deles foi monitorada por vídeo por 60 s. A
área no local da plataforma oculta removida foi definida como o alvo e o quadrante sudoeste o
quadrante alvo. A porcentagem de tempo que os ratos passaram no quadrante alvo (incluindo o
alvo) foram medidos para comparação. A plataforma de fuga foi removida antes dos ratos
serem liberados do ponto de entrada norte para a piscina. A natação deles foi monitorada por
vídeo por 60 s. A área no local da plataforma oculta removida foi definida como o alvo e o
quadrante sudoeste o quadrante alvo. A porcentagem de tempo que os ratos passaram no

quadrante alvo (incluindo o alvo) foram medidos para comparação.  
Para o teste BM, o tamanho e as características do dispositivo são os seguintes: plataforma de

92 cm de diâmetro; a plataforma contém 20 orifícios, cada um com 5 cm de diâmetro,
igualmente distribuídos em torno da plataforma e separados por 7,5 cm; o dispositivo fica 105
cm acima do chão. Num orifício existe uma caixa de escape comunicada com a plataforma
através de túneis de plástico transparente dispostos de forma a não serem vistos da plataforma.
Semelhante ao teste MWM, o uso simultâneo de um sistema de monitoramento de vídeo é
usado para obter gravações comportamentais automatizadas. Cada tentativa dura 3 minutos por
camundongo, com um intervalo entre tentativas de 15 minutos, com quatro tentativas por dia
durante a fase de aquisição. A primeira fase (habituação), consistia em posicionar o mouse no
centro da plataforma e, em seguida, acender a luz forte como estímulo aversivo. Em seguida, o
rato foi gentilmente levado para o buraco de fuga; uma vez na câmara de fuga, a luz foi
desligada e o rato foi mantido dentro por mais dois minutos. Durante a aquisição, os
camundongos foram colocados no centro da plataforma e a luz foi ligada por 3 min, a latência
para encontrar o orifício de escape foi registrada. Se o rato não alcançou o orifício de escape
em 3 min, o experimentador colocou-o na entrada do orifício de escape por 1 min, e então o
levou de volta para sua gaiola. Este protocolo continuou por 4 dias. No dia 5, 24 h após o último
dia de treinamento, o teste da sonda foi conduzido. O buraco alvo foi fechado. O labirinto foi
girado para que o buraco alvo fosse fechado e o labirinto foi reajustado para que os buracos
ficassem na mesma posição que durante os dias de treinamento. O mouse foi então colocado
no meio do labirinto e permitiu explorar o labirinto como antes. O mouse foi removido após 90 s.
O teste da sonda foi feito a fim de determinar se o animal se lembrava de onde o orifício alvo
estava localizado. O número de cutucadas no nariz para cada buraco foi medido.
Para o teste NOR, os camundongos foram habituados por 10 min por camundongo em uma
caixa de plástico branca, igualmente iluminada, sem odores (40 × 40 × 50 cm 3) incorporado
com aparas e fragmentos de álamo tremedor. Entre cada ensaio com camundongos, a caixa foi
limpa com etanol para evitar estresse induzido por odor. 24 horas após a habituação, dois
objetos idênticos foram colocados a uma distância igual um do outro e dos cantos da caixa.
Cada rato foi colocado no centro e movido livremente por 10 min. Os camundongos foram
gravados em vídeo durante essa fase de familiarização. As preferências laterais foram
avaliadas dividindo o tempo que um mouse passou explorando um objeto pelo tempo que
passou no outro objeto. Vinte e quatro horas depois, um dos objetos foi substituído por um novo
objeto. O outro objeto permaneceu constante. A seleção de um objeto familiar a ser substituído
foi aleatória. Cada rato foi colocado novamente no centro da caixa e permitiu-se mover-se
livremente por mais 10 minutos enquanto era gravado em vídeo. A exploração geral foi avaliada
determinando o tempo gasto explorando os objetos. A taxa de discriminação descreve o tempo
que um rato explorou o novo objeto dividido pelo tempo total gasto na exploração (objetos
novos e familiares). Os experimentos acima foram realizados às cegas.
  
Ensaios de biotinilação
Os ensaios de biotinilação foram realizados de acordo com o protocolo descrito anteriormente

(Lin et al., 2010) com algumas modificações. Resumidamente, após 24-48 h de transfecção com
os cDNAs Kv4.2 e KChIP4, as linhas celulares HEK293 transfectadas expressando RyR2 WT
ou mutação RyR2 E4872Q foram enxaguadas com PBS gelado por três vezes, as proteínas de
superfície foram biotiniladas com sulfo de 1,5 mg / ml Reagente de biotina -NHS-SS (Pierce, Cat
# PG82077) em PBS por 30 min em gelo. Biotina não ligada foi extinta com glicina 50 mM
gelada em PBS. As células foram lisadas com tampão de lise gelado: 150 mM NaCl, 20 mM
Tris-HCl, 1% NP40 e coquetel de inibidor de protease (Roche, Cat # 4693159001), sonicadas e
centrifugadas a 12.000 g por 10 min. Os lisados celulares foram incubados durante a noite a 4 °
C com contas de agarose de estreptavidina imobilizadas (Pierce, Cat # 20349), as proteínas
não ligadas foram removidas das contas com 3 lavagens em tampão de lise. As proteínas
ligadas foram eluídas com tampão de amostra 2 × SDS. As proteínas expressas na superfície
foram separadas por eletroforese em 12% Tris-glicina SDS-PAGE e transferidas para
membranas de PVDF. Western blots foram sondados com os seguintes anticorpos: coelho anti-
Kv4.2 (1: 1000, abcam, Cat # ab 16719), coelho anti-Rab4 (1: 1000, Cell Signaling Technology,
Cat # 2167), cabra anti-coelho Anticorpos IgG secundários conjugados com peroxidase de
rábano (1: 10000, ThermoFisher, Cat # 31460). Os anticorpos ligados foram detectados usando
um kit de quimioluminescência aprimorado da Pierce. anticorpos secundários IgG anti-coelho de
cabra conjugados com peroxidase de rábano (1: 10000, ThermoFisher, Cat # 31460). Os
anticorpos ligados foram detectados usando um kit de quimioluminescência aprimorado da
Pierce. anticorpos secundários IgG anti-coelho de cabra conjugados com peroxidase de rábano
(1: 10000, ThermoFisher, Cat # 31460). Os anticorpos ligados foram detectados usando um kit
de quimioluminescência aprimorado da Pierce.
Immunoblotting
A análise de imunoblotting foi realizada usando o método descrito anteriormente (Rosen et al.,
2010) Resumidamente, o cérebro de camundongo congelado foi homogeneizado com tampão
gelado, contendo 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) mais 4 μM de leupeptina, 1 mM de benzamidina, 0,1
mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) e 0,5 mM de ditiotreitol (DTT). Os homogenatos
foram sonicados 3 vezes e centrifugados a 3000xg durante 5 min. Os sobrenadantes foram
misturados com tampão de amostra (dodecil sulfato de sódio (SDS), 12%; β-merceptoetanol,
6%; DTT, 200 mM; Tris-HCl, 150 mM; e glicerol, 30%; pH 7,0) e aquecido a 95 ° C por 15min.
As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de tricina / SDS poliacrilamida (15%), e
foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,2 μm (Bio-Rad)
a 100 V por 1h a 4 ° C. A membrana foi bloqueada com leite em pó desnatado a 5% por 30min.
A membrana bloqueada foi incubada com um anticorpo primário (anticorpo anti-Aβ (total) (Cell

Signaling Technology, Cat # 8243), anticorpo anti-Aβ (1-42) (Biolegend, Cat # 803001) ou anti-β-  
actina (Sigma, Cat # A5316)) e, em seguida, o IgG anti-coelho de cabra (ThermoFisher, Cat #
31460) ou o anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo (ThermoFisher, Cat #
31430) conjugado com peroxidase de rábano (diluição 1: 20000). Após lavar 3 vezes, 10 min
cada, os anticorpos ligados foram detectados usando um kit de quimioluminescência
aprimorado da Pierce. As intensidades das bandas foram determinadas a partir do seu perfil de
intensidade obtido por ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences), analisadas com o
software Image-J e normalizadas para β-actina. Observe que a limitação genética ou
farmacológica do tempo de abertura do RyR2 evita déficits relacionados à AD sem alterar o
acúmulo de Aβ. Isso difere de estudos anteriores, mostrando que o dantroleno (um potente
RyR1) reduziu significativamente a carga de Aβ ( anticorpo anti-Aβ (1-42) (Biolegend, Cat #
803001), ou anti-β-actina (Sigma, Cat # A5316)), e então o IgG anti-coelho de cabra
(ThermoFisher, Cat # 31460) ou a cabra anti-IgG de camundongo (ThermoFisher, Cat # 31430)
anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (diluição 1: 20000). Após lavar 3
vezes, 10 min cada, os anticorpos ligados foram detectados usando um kit de
quimioluminescência aprimorado da Pierce. As intensidades das bandas foram determinadas a
partir do seu perfil de intensidade obtido por ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life
Sciences), analisadas com o software Image-J e normalizadas para β-actina. Observe que a
limitação genética ou farmacológica do tempo de abertura do RyR2 evita déficits relacionados à
AD sem alterar o acúmulo de Aβ. Isso difere de estudos anteriores, mostrando que o dantroleno
(um potente RyR1) reduziu significativamente a carga de Aβ ( anticorpo anti-Aβ (1-42)
(Biolegend, Cat # 803001), ou anti-β-actina (Sigma, Cat # A5316)), e então o IgG anti-coelho de
cabra (ThermoFisher, Cat # 31460) ou a cabra anti-IgG de camundongo (ThermoFisher, Cat #
31430) anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (diluição 1: 20000). Após
lavar 3 vezes, 10 min cada, os anticorpos ligados foram detectados usando um kit de
quimioluminescência aprimorado da Pierce. As intensidades das bandas foram determinadas a
partir do seu perfil de intensidade obtido por ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life
Sciences), analisadas com o software Image-J e normalizadas para β-actina. Observe que a
limitação genética ou farmacológica do tempo de abertura do RyR2 evita déficits relacionados à
AD sem alterar o acúmulo de Aβ. Isso difere de estudos anteriores, mostrando que o dantroleno
(um potente RyR1) reduziu significativamente a carga de Aβ (Chakroborty et al., 2012a; Oulès
et al., 2012; Peng et al., 2012; Wu et al., 2015) O motivo dessa diferença ainda não foi
determinado. O tratamento com dantrolene foi associado à hepatotoxicidade em humanos
(Chan, 1990; Utili et al., 1977) e agravamento das patologias da DA em camundongos (Zhang et
al., 2010) O cérebro expressa todas as três isoformas RyR. RyR1 e RyR3 são prontamente
inibidos pelo dantrolene (Zhao et al., 2001), mas a inibição do dantroleno do RyR2 é sutil e varia
com os estados oxidativo e modulado do RyR2 (Maxwell et al., 2012; Oda et al., 2015; Zhao et
al., 2001) Portanto, não está claro se o dantrolene pode suprimir efetivamente o RyR2 no
  
cérebro. Dantrolene interagindo com vários alvos (Oo et al., 2015; Zhao et al., 2001, 2006) pode
afetar o metabolismo de Aβ de forma diferente de limitar o tempo aberto do RyR2.
Imuno-histoquímica e coloração de Nissl
Camundongos de diferentes idades e genótipos foram anestesiados e perfundidos

transcardialmente com formalina tamponada neutra a 10% (NBF). Cérebros inteiros foram
removidos e pós-fixados em NBF por pelo menos 24 horas. Os cérebros fixos foram então
incluídos em parafina após desidratação e diafanização. Para a coloração IHC, seções de
tecido cerebral embebidas em parafina (5 μm) foram imersas em xileno (5 min, 3 vezes),
reidratadas em etanol absoluto (5 min, 3 vezes) seguido por imersão em 95%, 80% e 70%
soluções de etanol (em água) (5 min cada). Os antígenos foram reativados por tratamento com
tampão citrato 0,01 M (pH 6,0) por 2 min em microondas. As lâminas foram lavadas em solução
salina tamponada com fosfato (PBS: NaCl, 137 mM; KCl, 2,7 mM; Na 2 HPO 4 , 10 mM; KH 2
PO 4, 2 mM, pH 7,4) e bloqueado com soro de cavalo normal a 10% em PBS por 10 min, depois
incubado com o anticorpo primário, o anticorpo de peptídeo anti-β-amilóide (total) (Cell
Signaling Technology, Cat # 8243), para 12–16 h a 2–8 ° C. Após lavagem com PBS, as lâminas
foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado (Vector Laboratories, Cat # BA-1000) por
10 min, lavadas duas vezes com PBS e incubadas com 3% de H 2 O 2 por 25 min para
inativação de peroxidase endógena. As lâminas foram incubadas com estreptavidina-biotina-
peroxidase por 30 min. As lâminas foram cobertas com 3, 3'-diaminobenzidina solução (DAB)
(0,06% em PBS contendo 0,018% de H 2 O 2) por 1 a 5 min ou até que um precipitado marrom
pudesse ser observado. Condições e tempos de reação idênticos foram usados para lâminas de
diferentes amostras para permitir a comparação entre as densidades de imunorreatividade. A
reação foi interrompida pela imersão das lâminas em água destilada. A contracoloração foi
realizada com hematoxilina de Harris. As lamelas foram montadas com meio de montagem
resinoso.
Para a coloração de Nissl, seções de tecido cerebral embebidas em parafina (5 μm) foram
imersas em xileno (5 min, 2 vezes), reidratado em etanol absoluto (5 min, 2 vezes) seguido por
soluções de 95%, 75% e 50% de etanol em água (5 min cada), depois lavado em água
destilada por 2 vezes, 5 min cada. As lâminas foram coradas em solução de violeta cresil FD
(FD Neurotechnologies, Baltimore, MD, USA) por 10 min, em seguida, enxaguadas brevemente
em etanol 100% e diferenciadas em etanol 100% contendo ácido glaciático 0,1% por 1 min. As
lâminas foram então desidratadas em etanol absoluto (2 min, 4 vezes) seguido por depuração
em xileno (3 min, 2 vezes). A lamínula foi montada com meio de montagem resinoso.
Imagem única de Ca 2+ de células HEK293
  
As alterações citosólicas intracelulares de Ca 2+ em células HEK293 estáveis e induzíveis que

expressam RyR2 WT ou RyR2 E4872Q mutante, transfectadas com presenilina 1 (PS1) WT,
PS1-M146L, PS1-L286V ou plasmídeo de controle (pcDNA3) foram monitoradas usando Ca 2 de
célula única + imagem e o corante indicador fluorescente de Ca 2+ Fura-2 AM, conforme descrito
anteriormente (Chen et al., 2014; Jiang et al., 2004, 2005) Resumidamente, as células
transfectadas cultivadas em lamelas de vidro por 18-22 h após a indução por 1 μg / ml de
tetraciclina foram carregadas com 5 μM de Fura-2 AM em tampão KRH (Krebs-Ringer-HEPES)
(NaCl, 125 mM; KCl, 5 mM ; KH 2 PO 4 , 1,2 mM; glicose, 6 mM; MgCl 2 , 1,2 mM; HEPES, 25
mM; pH 7,4) mais 0,02% de Pluronic F-127 e 0,1 mg / ml BSA por 20 min à temperatura
ambiente (23 ° C). As lamelas foram então montadas em uma câmara de perfusão (Warner
Instruments) em um microscópio invertido (TE2000-S, Nikon, Japão). As células foram
continuamente perfundidas com tampão KRH contendo concentrações crescentes de Ca 2+
extracelular (0–2,0 mM). O aumento da concentração extracelular de Ca 2+ levará ao aumento
de Ca 2+entrada e subsequente carregamento de Ca 2+ nos depósitos internos; quando o
conteúdo de Ca 2+ da loja atinge um nível limite, o RyR2 abre, resultando em um evento de
liberação espontânea de Ca 2+ . Cafeína (10 mM) foi aplicada ao final de cada experimento para
confirmar a expressão dos canais de RyR2 ativos. Imagens de lapso de tempo (0,5 fps) foram
capturadas e analisadas com o software Compix Simple PCI 6 (Compix Inc.). As intensidades
de fluorescência foram medidas a partir de regiões de interesse centradas em células
individuais. Apenas as células que responderam à cafeína foram usadas nas análises.
Análise da densidade da coluna dendrítica
Um kit FD Rapid GolgiStain (FD Neurotechnologies, Baltimore, MD, EUA) foi usado para a
análise histológica da coluna dendrítica seguindo as instruções do fabricante conforme descrito
anteriormente (Zhao et al., 2015) Resumidamente, cérebros de camundongos foram removidos,
colocados em uma solução de impregnação apropriada e armazenados no escuro por 14 dias
em temperatura ambiente. Os cérebros foram então transferidos para uma solução contendo
sacarose e incubados a 4 ° C até que a água residual fosse removida dos tecidos (2–7 dias).
Finalmente, um vibratome (VT-1200, Leica, Alemanha) foi usado para obter fatias transversais
do hipocampo de 100μm de espessura. As fatias foram então montadas em lâminas revestidas
de gelatina e deixadas secar ao ar em temperatura ambiente por cerca de dois dias. Depois de
suficientemente secas, as fatias foram enxaguadas com água destilada e incubadas por dez
minutos em solução contendo nitrato de prata. As fatias foram então enxaguadas com água
destilada antes de serem desidratadas em álcool absoluto, depuradas com xilol e cobertas com
bálsamo sintético não ácido e lamelas. Três fatias independentes por rato foram fotografadas.
Pilhas Z de dendritos apicais neuronais CA1 corados por Golgi (até 80 μm no total no eixo Z;
espessura da seção óptica = 0,5 μm) foram tomadas com ampliação de 100x em um Zeiss

AxioImager (Zeiss, Alemanha).
 
Os dendritos secundários que estavam 100-250 μm de distância do soma foram usados para
análise. Os segmentos dendríticos foram identificados e medidos com ImageJ e
RECONSTRUCT conforme descrito anteriormente (Risher et al., 2014) Os espinhos dendríticos
foram identificados como "Filópodes", "Longos e finos", "Finos", "Atarracados", "Cogumelo" e
"Ramificados". Foram analisadas as densidades de protrusão total e cada tipo de espinha. A
densidade da coluna foi calculada quantificando o número de espinhas por segmento dendrítico
e normalizada para 10 μm de comprimento dendrítico.
Quantificação e Análise Estatística

Todos os experimentos foram realizados às cegas quanto ao genótipo, idade e tratamento.
Todos os dados mostrados são medianas e intervalo (mínimo e máximo), a menos que indicado
de outra forma. Para conjuntos de dados pequenos (número n menor que 15) ou dados
distribuídos não gaussianos, foram usados métodos não paramétricos. Para grandes conjuntos
de dados e dados normalmente distribuídos, testes paramétricos foram realizados. Com relação
às análises não paramétricas, para experimentos com dois grupos, Mann-Whitney Uteste foi
usado para amostras desemparelhadas. O teste de classificação sinalizada de pares
combinados de Wilcoxon foi usado para amostras emparelhadas. Para experimentos com 3 ou
mais grupos, o teste de Kruskal-Wallis com teste post hoc de Dunn-Bonferroni e o teste de
Friedman com teste post hoc de Dunn-Bonferroni foram usados para amostras independentes
ou medições repetidas, respectivamente. Com relação às análises paramétricas, para
experimentos com dois grupos, o teste t de Student foi usado para amostras desemparelhadas.
O teste t pareado foi usado para amostras pareadas. Para experimentos com 3 ou mais grupos,
ANOVA de uma via ou ANOVA de duas vias seguido por teste post hoc de Bonferroni e teste
ANOVA de medida repetida com teste post hoc de Bonferroni foram usados para amostras
independentes ou medições repetidas, respectivamente. Tamanhos de amostra e valores de p
podem ser encontrados nas legendas das figuras. Valores de p menores que 0,05 foram
considerados estatisticamente significativos.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por bolsas de pesquisa dos Institutos Canadenses de Pesquisa em
Saúde para RJT (PJT-169174; PJT-168968), RWT (PJT-156153), GRG (FDN-148471) e SRWC
(PJT-152914), o National Institutes of Health to MF (R01 HL057832; R01 GM111397), e Heart
and Stroke Foundation Chair em Cardiovascular Research para SRWC Agradecemos
generosas doações da Alvin and Mona Libin Foundation, Canadian Pacific Railway Company
(CP), a família Mozell, e o Instituto Cardiovascular Libin. Agradecemos ao Dr. Xiaowei Chen

(Universidade Médica do Exército, China) pelos conselhos e discussões inestimáveis.
 
Contribuições do autor
JY, BS, AI, XZ, HtK, TGB, MF, RJT, RWT, GRG e SRWC elaboraram a pesquisa. JY, BS, AI, XZ,
WG, ZS, YL, FH, AKJB, MK e RW realizaram a pesquisa. JY, BS, XZ, WG, ZS, MN, RW e
SRWC analisaram os dados, JY, BS, HtK, TGB, MF, RJT, RWT, GRG e SRWC escreveram o
artigo.
Declaração de Interesses
Estamos planejando apresentar um Pedido Provisório de Patente, intitulado "MÉTODOS DE
TRATAMENTO DA DOENÇA DE ALZHEIMER OU ATRASO DA SUA PROGRESSÃO
LIMITANDO O TEMPO DE ABERTURA DO RECEPTOR DE RIANODINA."
Informação complementar

Baixe .pdf (1,96 MB)
Ajuda com arquivos pdf
Documento S1. Figuras S1-S7
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através de uma calexcitina, receptor de rianodina, cascata de canais de K +.
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Informação do artigo
História da Publicação
Publicado: 22 de setembro de 2020
Aceito: 27 de agosto de 2020
Recebido na forma revisada: 23 de julho de 2020
Recebido: 28 de outubro de 2019
Identificação
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.108169
direito autoral
© 2020 os autores.
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  
Figuras
Resumo Gráfico Figura 1 A mutação RyR… Figura 2 RyR2-E4872Q +…
Figura 3 A mutação E48… Figura 4 R- carvedilol Pr… Figura 5 R -CV impede e…
Figura 6 E4872Q +/− não t… Figura 7 O tratamento R-…
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Limitar O Tempo De Abertura Do Ryr2 Evita A Hiperatividade Neuronal Relacionada À Doença De Alzheimer E A Perda De Memória, Mas Não O Acúmulo De Β-Amilóide

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02/11/2020 Limitar o tempo de abertura do RyR2 evita a hiperatividade neuronal relacionada à doença de Alzheimer e a perda de memória, m…

Ciência que inspira Um jornal da Cell Press

ARTIGO | VOLUME 32, ISSUE 12 , 108169 ,22 DE SETEMBRO DE 2020

Limitar o tempo de abertura do RyR2 evita a hiperatividade

S.R. Wayne Chen  8  • Show all authors • Show footnotes

• Limitar o tempo aberto do RyR2 aumenta a corrente K + do tipo A para restringir a

• R- carvedilol resgata hiperatividade neuronal relacionada à DA, perda de memória e morte

• Os déficits de AD podem ser evitados em face do acúmulo contínuo de β-amiloide

Ver imagem grande | Baixar imagem de alta resolução | Baixar (PPT)

receptor de rianodina • Canal K + tipo A • Kv4.2 e KChIP4 •

O receptor 2 de Ryanodine (RyR2) é um canal de liberação de Ca 2+ intracelular . RyR2 é

 Mostrar legenda completa

(E) Traces of action potential (AP) firing.

(I) Normalized IA traces.

(J) Steady-state activation curves of IA.

Ver imagem grande | Baixar imagem de alta resolução | Baixar (PPT)

Realizamos gravações de patch-clamp de células inteiras de neurônios piramidais CA1 de 3 a 4

Limitar o tempo de abertura do RyR2 regula positivamente a corrente K +

A regulação negativa da corrente de K + do tipo A do hipocampo foi implicada na hiperatividade

Os neurônios CA1 do hipocampo expressam o complexo do canal Kv4.2 / KChIP4, que se

A liberação intracelular de Ca 2+ através dos RyRs demonstrou modular a atividade pré-

Limitar o tempo de abertura do RyR2 impede a hiperatividade neuronal

WT ( Figuras S2 D-S2F). Notavelmente, a mutação E4872Q +/− evitou o aumento do disparo AP

RyR2 em camundongos 5xFAD +/− evita a hiperatividade neuronal associada a AD de neurônios

 Mostrar legenda completa

(E–H) Ca2+ traces of the five neurons circled in (A)–(D), respectively.

Ver imagem grande | Baixar imagem de alta resolução | Baixar (PPT)

Limitar o tempo de abertura do RyR2 impede a função RyR2 aprimorada

Também avaliamos o efeito da presenilina 1 (PS1) WT e as mutações PS1 M146L e L286V na

Limitar o tempo de abertura do RyR2 evita a perda de memória associada

 Mostrar legenda completa

(B) The time spent in the target quadrant.

(G) The averaged normalized fEPSP slope.

(I) The averaged normalized fEPSP slope.

Ver imagem grande | Baixar imagem de alta resolução | Baixar (PPT)

R- carvedilol previne e resgata hiperatividade neuronal e perda de memória

Mostrar legenda completa

Ver imagem grande | Baixar imagem de alta resolução | Baixar (PPT)

O pré-tratamento com R -carvedilol de camundongos 5xFAD +/− de 2 a 3 meses de idade (antes

 Mostrar legenda completa

(B and G) The time spent in the target quadrant.

Ver imagem grande | Baixar imagem de alta resolução | Baixar (PPT)

Limitar o tempo de abertura do RyR2 não afeta o acúmulo de Aβ, mas

Realizamos coloração imuno-histoquímica e análises de imunoblotting para avaliar o efeito da

camundongos 5xFAD +/−

Mostrar legenda completa

(C) Percentage of the hippocampal area showing positive Aβ staining.

Ver imagem grande | Baixar imagem de alta resolução | Baixar (PPT)

neurônio em camundongos 5xFAD +/− de 6 a 7 meses de idade

 Mostrar legenda completa

(A) Aβ deposition in 6- to 7-month-old 5xFAD+/− mice treated with DMSO or R-CV.

(C) Percentage of the hippocampal area showing positive Aβ staining.

Ver imagem grande | Baixar imagem de alta resolução | Baixar (PPT)

A corrente K + tipo A desempenha um papel importante no controle da excitabilidade neuronal

neurônios pode afetar o tráfego de Kv4.2 e, consequentemente, a corrente de K + tipo A . De

Função e expressão aprimoradas de RyR2 foram implicadas na patogênese da DA (Bruno et

lado, o pré-tratamento com a mistura racêmica de carvedilol não evitou déficits de

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Todos os materiais serão disponibilizados mediante solicitação razoável.

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