UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

Disciplina: Bioengenharia II
Professora: Sharline Florentino de Melo Santos

ROTEIRO AULA PRÁTICA: Cinética de produção de etanol

O termo fermentação vem do latim "fervere", que significa ferver. Foi Pasteur, há pouco mais
de um século, quem demonstrou ser a fermentação alcoólica realizada por microrganismos na
ausência de oxigênio. Atualmente, por fermentação alcoólica se entende um conjunto de reações
bioquímicas provocadas por microrganismos chamados leveduras, que atacam fundamentalmente os
açúcares transformando-os principalmente em álcool etílico e gás carbônico.
As leveduras mais utilizadas no processo de fermentação alcoólica são espécies originárias do
gênero Saccharomyces sendo uma das principais a Saccharomycescerevisiae. A fermentação
alcoólica ocorre devido ao fato de que as células de levedo produzem a energia que lhes é necessária
para sobreviver, através de dois fenômenos de degradação da matéria orgânica: a respiração que
necessita do oxigênio do ar ou a fermentação que ocorre na ausência de oxigênio do ar. A fermentação
alcoólica corresponde a uma má utilização de energia. Assim, a levedura necessita transformar muito
açúcar em álcool, para assegurar suas necessidades energéticas. Nessas condições a multiplicação da
levedura é pequena; ao contrário, o rendimento da transformação do açúcar em álcool é grande, em
relação ao peso da levedura. A composição exata do açúcar foi determinada por Gay-Lussac. É ainda
de sua autoria a equação que descreve a fermentação alcoólica:
C6H12O6 = 2C2H5OH + 2CO2
Glicose álcool etílico dióxido de carbono

Ou seja, 180g de glicose, resulta em 92g de álcool etílico e 88g de CO 2. Esta reação,
apesar de representar a parte fundamental do processo não é, porém, completa, pois outras substâncias
se formam além do álcool etílico e CO2. A proporção de álcool contida em um vinho é medida em
graus alcoólicos, segundo o princípio de Gay-Lussac. Assim, por exemplo, quando se diz que um
vinho tem 11ºG.L. significa que este conta com 11% do seu volume em álcool, ou seja, que em 100
ml do vinho considerado, 11 ml são de álcool puro (anidro).

O processo de fermentação alcoólica pode ser dividido em três fases: fermentação preliminar
ou pré-fermentação, fermentação principal ou tumultuosa e fermentação complementar ou pós-
fermentação.
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A fermentação preliminar inicia-se com a adição da leveda ao mosto. Quando o inóculo é

pequeno, esta fase caracteriza-se pela multiplicação das leveduras, com consequente consumo de
açúcares e lenta produção de álcool. Portanto, deve-se utilizar uma quantidade maior de leveduras de
rápida multiplicação, já que o processo de produção de álcool requer alta produtividade. Ocorrendo
o aumento da produção de álcool, evidenciado pela produção de gás carbônico, tem-se o final desta
fase e o início da fase de fermentação principal ou tumultuosa.
As principais características da fase de fermentação principal são: intensa produção de álcool
e liberação de CO2; aumento da temperatura, a qual deve ser controlada por resfriamento; progressivo
aumento de espumas e elevação da acidez do mosto. A fermentação principal cessa quando diminui
a liberação de gás e, consequentemente, a turbulência característica do mosto. Na pós-fermentação
verifica-se a diminuição da temperatura do vinho, elevação da acidez e a diminuição da atividade de
fermentação da levedura pela ação do acúmulo de determinadas substâncias, do esgotamento dos
carboidratos e das toxinas dos contaminantes.
Durante a fermentação alcoólica, alguns fatores influenciam no processo, tais como:

▪ A concentração de carboidratos (glicose);

▪ O pH do meio;
▪ A concentração de levedura;
▪ A temperatura de fermentação.
A temperatura de fermentação é extremamente importante: a temperatura entre 25 e 33°C
permite obter alto rendimento em álcool, não somente pela fermentação mais completa, mas também
por minimizar a perda por evaporação.
O controle de pH é importante durante o processo de fermentação alcoólica pois, os valores de
pH inicias podem variar de 3,8 a 4,0, esta faixa de pH utilizada pode ser suficiente para permitir uma
rápida fermentação alcoólica e inibir bactérias indesejáveis.
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Procedimento experimental:

1.Higienizar os equipamentos que serão utilizados durante a prática, Erlenmeyer de 1000 mL com
700 mL de caldo.
2.Preparo do mosto: verificar o °Brix do caldo de cana e fazer as devidas diluições para ter um valor
inicial de °Brix de 12.
3. Adicionar os seguintes nutrientes (g.L-1): KH2PO41,0 e(NH4)2SO42,0.
4. Verificar o pH do meio que deve ser entre 4-5. Se necessário ajustar o pH para 4,50 ± 0,2utilizando
HCl 1N.
5.Adicionar ao mosto a levedura na concentração de 5 e 10 g/L. (usar levedura fresca, a liofilizada é
difícil de dissolver)
6. Incubar em temperatura de 35 °C.
7. Anotar a hora inicial do processo e retirar amostra com aproximadamente 20 mL.
8. Verificar temperatura, pH e o °Brix.
9. Fazer análise em duplicata da biomassa por peso seco.
10. Com intervalo de uma hora, coletar amostras e fazer as análises descritas acima, até o final do
cultivo, quando o °Brix for próximo a zero ou em 7 horas de cultivo.
11. Na amostra do final do cultivo, fazer análise da concentração de etanol.
12. Preencher a tabela abaixo e elaborar relatório da prática, em grupo de 3 pessoas.
13. No relatório fazer:
- As curvas de consumo de substrato, crescimento celular e variação de pH
- Produtividade em biomassa e produtividade em etanol
- Calcular os valores de 𝑟𝑥 e𝑟𝑠 para o tempo final do processo
- Calcular a velocidade específica máxima de crescimento celular e o tempo de geração
- Calcular o YX/S e o YP/S
- Concluir sobre qual a melhor concentração de inicial de células para o processo.

Métodos analíticos
Concentração de substrato
A concentração de substrato (sacarose) será avaliada, pela medida dos sólidos solúveis totais,
realizado utilizando o refratômetro digital que mede o grau Brix, na temperatura de 20 °C. No
cálculoda concentração de sacarose (g/L), será utilizada a Equação 1, queapresenta a correlação entre
o grau Brix e a concentração desacarose (Torres Neto, Quim. Nova,Vol. 29, No. 3, 489-492, 2006).
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Concentração de sacarose (g/L) = grau Brix x 10,13 + 1,445

Determinação da Concentração de Etanol

A determinação da concentração de etanol (% de etanol em volume, a20 °C) no fermentado é

realizada utilizando o ebuliômetro. Este é composto de: uma caldeira, onde fica a amostra a ser
analisada; um condensador, que é acoplado à caldeira, onde são condensados vapores provenientes
do líquido contido na caldeira; e uma lamparina, que fornece aquecimento à caldeira do ebuliômetro.
Primeiro é feita a calibração do equipamento determinando a temperatura de ebulição da água.
Transferir 50 mL de água para a caldeira, conectar o termômetro, em seguida acender a lamparina e
a conectar a caldeira. Observar até que a temperatura fique estabilizada, anotar o seu valor. Escoar a
água existente na caldeira para seguir com a determinação.
A determinação da graduação alcoólica em ºGL (graus Gay Lussac) se procede de forma
similar à calibração. Pelo orifício da caldeira colocar um pouco da amostra a ser analisada, a fim de
realizar uma lavagem na caldeira evitando assim contaminações ou possíveis diluições. O resíduo da
lavagem deve escoar pela torneira da caldeira. Em seguida adicionar, 50 mL da amostra a ser
analisada. Encher o condensador com água fria, acender a lamparina bem centrada sob a caldeira e
no orifício da caldeira colocar o termômetro para medir e anotar o valor da temperatura de ebulição
da amostra. Aguardar a temperatura se estabilizar.
Com a temperatura de ebulição da água e da amostra, prosseguir com a determinação da
concentração alcoólica da amostra, utilizando a régua de conversão. Alinhar a temperatura de
ebulição da água com a marca zero da escala Gay Lussac (ºGL), em seguida visualizar diretamente a
graduação alcoólica comparando a temperatura de ebulição da amostra analisada.
A partir da graduação alcoólica na escala Gay Lussac (ºGL), obter a concentração de etanol
expressa em g/L, pela a equação. Partindo do princípio que 1ºGL equivale a 1% de etanol, que por
sua vez equivale a 1mL/100mL, tem-se:

 g  º GL 1000  mL 
P ( g / l ) =  alcool  x x  
 mL  100 1  L 
onde:
P = Concentração de etanol (g/L);
álcool = Densidade específica do etanol (0,7895 g/mL)
Massa de Células (X)
A concentração de biomassa das amostras deve ser determinada, em duplicata, por medida do
peso seco da amostra após centrifugação.
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Colocar os tubos, onde será realizada a análise, em estufa para secar (80ºC) por um período
de no mínimo 2 horas. Retirar os tubos e colocar em dessecador para esfriar. Pesa cada tubo e anotar
o valor.
Colocar nos tubos preparados, 2mL da amostra do cultivo e centrifugar por 8 minutos em
centrífuga minispin, na velocidade de 9.000 rpm. Secar os tubos com a massa de células na estufa à
80 ºC por 24 horas. Anotar o peso e fazer cálculo:
X (g/L) = peso do tubo seco e com biomassa – peso do tubo seco
Volume de meio analisado

Hora Temp. pH Brix Ident. Peso tubo Peso tubo Obs.

tubo +biomassa