Laboratório de Virologia

e de Micologia Clínica
Vírus e Diagnóstico Laboratorial das Infecções Virais

Responsável pelo Conteúdo:

Prof. Me. Elias da Rosa Hoffmann

Revisão Textual:
Prof. Me. Claudio Brites
 Vírus e Diagnóstico Laboratorial
das Infecções Virais

• Introdução;
• Aspectos Gerais 2;
• Vírus do Sistema Nervoso – Pólio/Raiva;
• Diagnóstico Laboratorial das Infecções Virais.

OBJETIVOS

DE APRENDIZADO
• Apresentar breve introdução com características e aspectos gerais dos vírus e diagnóstico
laboratorial das infecções causadas por diversos vírus;
• Aprender as características e propriedades gerais dos vírus e sua estrutura constitutiva, além
da replicação viral (ciclo lítico e ciclo lisogênico), nomenclatura e classificação dos vírus; tra-
tando de conceito de infecção latente e infecção persistente, resposta imune às infecções
virais, patogênese da infecção viral, terapêutica antiviral.
UNIDADE Vírus e Diagnóstico Laboratorial das Infecções Virais

Introdução
Estudos sobre os vírus começaram muito tempo antes de se ter ideia de como ocorriam
certas doenças. Em 1886, o químico Adolf Mayer mostrou a existência de uma ­doença
chamada Mosaico do Tabaco, que podia ser transmitida de uma planta para outra.

Os vírus eram caracterizados como partículas submicroscópicas no começo dos anos

1980. Com o início da biologia molecular para diagnóstico, foi possível compreender
que diversas doenças eram oriundas de vírus, começando assim a expansão na busca
de para entenderemos melhor as partículas virais e como elas interagem com as células
dos hospedeiros.

Figura 1
Fonte: Getty Images

Na virologia, existem dois ramos que diferem entre esse ser considerado um micror-
ganismo ou não um vírus, pois basicamente ele é constituído de material genético e
proteínas que formam seu envoltório, assim necessitando de uma célula para completar
seu ciclo de replicação. Durante o sistema de replicação viral, temos dois tipos de ciclo:
o ciclo lítico, no qual o vírus utiliza a célula e a destrói para suas replicações; e o ciclo
lisogênico, quando utiliza as células para produzir principalmente partículas virais.

No estudo da virologia, podemos classificá-los em famílias de acordo com suas carac­

terísticas virais, além de, dependendo do vírus, termos manifestações diferentes e infec­
ções que podem demorar anos para se manifestarem – como exemplo, infecções laten-
tes. Com os estudos moleculares, foram descobertos alguns fármacos que podem ser
utilizados para o combate desses tipos de agentes infecciosos e, algumas vezes, pode-
mos utilizar vacinas que nos auxiliam a desenvolver anticorpos para combater futuros
contatos com essa categoria de patógeno.

Para entender melhor as famílias virais, leia o Capitulo 13 e a Tabela 13.2, p. 375-376, do livro:
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017.

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Aspectos Gerais 2
Família Herpesviridae
Para simplificar a Família Herpesviridae, podemos acompanhar o Tabela 1.

Tabela 1
Nome Genoma Aspectos Clínicos
Infecção disseminada, encefalite, esofagite,
Herpes simplex vírus I (HSV-1) DNA
pneumonia, lesões cutâneas, faringite e cervicite.
Herpes simplex vírus 2 (HSV-2) DNA Meningite, sepse neonatal, lesões cutâneas.
Vírus da Varicela-Zoster (VZV) DNA Infecções disseminadas, zoster (cobreiro), catapora.
Hepatite, síndrome da mononucleose, pneumo-
Citomegalovírus (CMV) DNA
nia e infecções congênitas.
Herpes vírus humano 6 (HHV-6) DNA Exantema súbito e meningite.
Herpes vírus humano 7 (HHV-7) DNA Exantema súbito.
Vírus Epsten-Barr (EBV) DNA Hepatite, faringite e mononucleose.

Herpes vírus humano 8 (HHV-8) DNA Linfoma e sarcoma de Kaposi.

A família Herpesviridae tem em média de 120-300 nm com uma forma icosaedrica

com envelope lipídico, sendo seu habitat natural os seres humanos. A distribuição é
considerada cosmopolita e a transmissão pode ocorrer através de diversas formas: secre-
ções genitais e/ou orais, via placentária e através do sangue.

Hepatite viral: HAV, HBV, HCV, HDV, HEV

O grupo de vírus que causa o quadro de hepatite é vasto. Alguns estão mais associa-
dos diretamente pelo tropismo e outros têm como material genético o RNA e somente
o HBV com DNA. Além disso, existem coinfecções entre eles para que consigam sobre-
viver de forma parasitária.
• Hepatite A (HAV): Picornavírus, RNA linear simples e positivo, sem envelope.
Transmissão ocorre via fecal-oral e prognostico favorável;
• Hepatite B (HBV): Hepadnavírus, único com o genoma DNA e envelopado.
O vírus está presente em fluidos biológicos de pacientes infectados;
• Hepatite C (HCV): Flaviviridae, genoma de RNA, fita simples e positivo com
envelope. Transmitido sexualmente, por meio de drogas injetáveis e vertical;
• Hepatite D (HDV): Também chamado de Delta, o genoma é RNA circular, fita
simples negativa e o envelopo oriundo do HBV;
• Hepatite E (HEV): Calcivírus, com genoma de RNA fita simples, negativo, linear e
não envelopado, transmitida entericamente pela água de países em desenvolvimento.

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UNIDADE Vírus e Diagnóstico Laboratorial das Infecções Virais

Doenças virais do trato respiratório superior e inferior –

Rhinovírus, Coronavírus, Influenza, Vírus sincicial
respiratório (VSR), adenovírus
Existem diversos vírus que têm uma sintomatologia semelhante e quadros clínicos
parecidos. Por isso, abordaremos sucintamente, dos citados, os que englobam a maioria
das infecções respiratórias.
• Rhinovírus: pertencente à família Picornaviridae. Contém RNA fita simples e positi-
vo, não possui envelope lipídico, são divididos em três espécies com mais 100 soroti-
pos já descritos. O rinovírus é um dos mais comuns associados ao resfriado comum;
• Coronavírus: o gênero coronavírus tem em torno de 80-130 nm, com RNA de
filamento único, não segmentado e positivo, e tem formato helicoidal e envelope
lipídico. Normalmente encontrado em animais ou humanos e de distribuição mun-
dial, sua via de infecção é respiratória, podendo ser desde um resfriado comum
até evoluir para uma síndrome respiratória aguda grave. A transmissão ocorre de
pessoa para pessoa por meio de aerossóis;
• Influenza: família Orthomyxoviridae, com aproximadamente 100 nm de tamanho,
RNA fragmentado, polaridade negativa e formato helicoidal. Tem envelope lipídico
e antígenos de superfície característicos, os quais são responsáveis por sua ligação
celular e pelo nome (Hemaglutinina e Neuraminidae). Seu habitat natural são seres
humanos e animais, sendo de característica cosmopolita. Sua disseminação ocorre
por aerossóis de pessoa para pessoa e pode desenvolver um resfriado comum,
traqueobronquite e pneumonia; manifestações extrapulmonares são raras, mas já
descritas como miocardite;
• Vírus sincicial respiratório (VSR): o vírus pertence à família Paramyxoviridae
e, assim como outros vírus dessa família, tem tropismo pelo sistema respirató-
rio. Apresenta RNA de filamento único não segmentado e entre 150-300 nm de
­tamanho com envelope lipídico. O VRS é responsável pela maioria das infecções
do trato respiratório inferior;
• Adenovírus: pertencente à família Adenoviridae, composto de DNA linear de fita
dupla, não envelopado em formato icosaédrico. Está associado a três tipos de enfer­
midades, doenças do trato respiratório, oculares e gastrointestinais. A síndrome
clínica geralmente está associada ao seu modo de transmissão.

Rotavírus
Pertence à família Reoviridea, RNA de fita dupla com a aparência semelhante a uma
roda e são classificados sorologicamente A, B, C, D, E, F, G e H. Está ligado a gastro-
enterites com diarreia, é grave em lactantes e crianças jovens.

Família Retroviridae: HIV-1, HIV-2, HTLV-I e HTLV-II

A família Retroviridae tem uma grande variedade de vírus que podem infectar
­humanos e animais. Diferente dos outros vírus, essa família produz uma enzima chamada­

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trascriptase reversa, a qual converte uma fita de RNA simples em DNA viral. Tem fita de
RNA simples com sentido positivo, envelopado e formato icosaédrico.

No caso do vírus da imunodeficiência humana (HIV), temos presente em seu genoma

três principais genes: gag, pol e env. O gene gag é responsável por proteínas centrais
da matriz; o gene pol codifica atrasncritase reversa, protease, integrasse e ribonuclease;
e o gene env codifica proteínas transmembranas. A transmissão do vírus pode ser via
contato sexual, transfusões, agulhas contaminadas e transmissão perinatal. O HIV é
dividido em 1 e 2, sabendo que dentro do HIV-1 temos grupos e subgrupos e a principal
consequência é o desenvolvimento da imunodeficiência adquirida (AIDS).

HIV-1 HIV-2

Grupo M Grupo N Grupo O Grupo P

A B C D F G H J K CRFs URFs

A1 A2 A3 A4 A5 F1 F2

Figura 2
Fonte: Adaptado de PIMENTEL, 2016

O HTLV é o vírus da leucemia de células T humanas e dividido em 1 e 2, a diferença

entre eles é muito pouca, aproximadamente 65% de homologia entre eles. A trans-
missão ocorre igual à do vírus do HIV – transfusões, sexual, agulhas contaminadas e
transmissão vertical. Muitas pessoas podem passar a vida toda com ele latente e nunca
manifestarem sintomas. Em cerca de 10% dos pacientes pode ocorrer manifestações em
decorrência do vírus, como neoplasias hematológicas, patologias neurológicas, oftalmo-
lógicas, urológicas e dermatológicas.

Vírus do Sistema Nervoso – Pólio/Raiva

Existem diversos vírus que podem atingir o sistema nervoso central e periférico. Podem
causar desde meningites virais, encefalopatias, paralisias, entre outros sinais e sintomas.

O vírus da poliomielite pertence à família Picornaviridae. Tem 3 sorotipos e com o

tamanho em torno de 22-30 nm, RNA de fita não segmentado positivo, não tem enve-
lope lipídico e com formato icosaédrico. Suas manifestações são variadas, em cerca de
3% dos pacientes o vírus alcança o Sistema Nervoso Central (SNC), podendo causar
meningite viral asséptica, encefalite e/ou paralisia flácida aguda. A transmissão do vírus
da poliomielite é via fecal-oral ou oral-oral.

Pertencente à família Rhabdoviridae, o vírus da raiva tem o tamanho em torno de

50-95 nm por 130-139 nm em formato de bala. Sua composição genômica é RNA de

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UNIDADE Vírus e Diagnóstico Laboratorial das Infecções Virais

filamento simples, não segmentado e de polaridade negativa. Com envelope lipídico e

conformação helicoidal, a transmissão do vírus da raiva se dá por contato com secreções
infectadas de animais.

Vírus da dengue
O vírus da dengue é um arbovírus e sua disseminação ocorre por mosquitos hema-
tófagos do gênero Aedes e pertence à família Flaviviridae. Pode ser classificado em 4
sorotipos: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Seu tamanho é em meia de 40-60
nm, com RNA de filamento único, não segmentado e polaridade positiva, tem envelope
lipídico e em formato icosaédrico. Sua distribuição é mundial, dependendo do seu vetor
e podem desencadear diversas patologias: hepatite, meningite, doença febril, encefalite
e febre hemorrágica.

Família Papillomaviridae: papilomavírus humanos

O papiloma vírus humano (HPV) é composto por mais de 120 tipos de papiloma-
vírus, ele é composto por DNA de fita dupla não envelopado em formato icosaédrico.
Está associado a lesões epiteliais hiperplásicas e, alguns deles, ao carcinoma cervical.
A transmissão ocorre por meio de contato com a lesão onde se encontra o HPV; como
o vírus tem tropismo por tecido escamoso, a pele acaba sendo seu principal contato.

Diagnóstico Laboratorial
das Infecções Virais
Considerações gerais sobre coleta, seleção de amostras,
conservação e transporte de amostras de vírus
Para um melhor entendimento sobre a coleta do material a ser utilizado, devemos
buscar maneiras alternativas para obter essas amostras. Todas as buscas devem ter um
objetivo específico de identificar o vírus ou se as pessoas já tiveram contato com ele.
Partindo dessa ideia, podemos separá-lo em dois setores: imunologia/sorologia e bio-
logia molecular. Quando buscamos o material genético com o objetivo de encontrar o
RNA ou DNA, podemos utilizar principalmente a Reação em Cadeia da Polimerase, já
que buscamos algum ponto especifico, proteínas de superfície ou mesmo se a pessoa já
teve alguma vez na vida contato; buscamos testes imunológicos.

Sobre a conservação e o transporte das amostras, essas podem ser inúmeras, dependen-
do do material que estamos buscando. Em temperatura ambiente, temos diversas e­ nzimas
que estão envolvidas na destruição de partículas virais, celulares e genômicas; por esse
motivo, e a maioria das amostras deve ser refrigerada ou congelada para não ocorrer de,
no momento da análise, acusarmos um falso negativo para o material do paciente.

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Princípios de técnicas e métodos
amplamenteaplicados no diagnóstico viral
Com os avanços da tecnologia, foram desenvolvidas diversas metodologias para iden-
tificação do vírus ou para ter contato antecedente com o mesmo. A reação em cadeia
da polimerase (PCR), utilizamos para a identificação do vírus, amplificando e copian-
do a região de interesse, podendo ser DNA ou RNA; além disso, podemos identificar
mutações capazes de gerar resistência a fármacos antivirais e até mesmo mutações que
reclassificam o subtipo do vírus encontrado.

Os testes imunológicos/sorológicos são mais utilizados para identificar partículas de

superfícies dos vírus e marcação, dependendo do procedimento de identificação. Além
disso, podemos identificar e quantificar a presença de anticorpos que mostram se o
paciente teve contato ou fez vacinação para um determinado vírus.

Figura 3
Fonte: Wikimedia Commons

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UNIDADE Vírus e Diagnóstico Laboratorial das Infecções Virais

Exames diretos (detecção da

presença do vírus na amostra clínica)
Cultivo de vírus: aplicações e limitações
Diversos são os tipos de cultivos celulares para identificação de efeitos citopáticos
que podem ser utilizados. Existem diferentes células as quais podemos trabalhar in vitro
com o objetivo de infectá-las com vírus para a identificação de seus efeitos citopáticos e,
muitas vezes, para gerar proteínas de interesse.

Podemos ter algumas limitações nessas metodologias, principalmente nas questões

que envolvem laboratórios e custos. Os laboratórios para cultivo celular são de nível de
biossegurança N3, sendo seu custo muito elevado. Além disso, podemos também usar
microscópio óptico normal para visualizar os efeitos e as alterações celulares causadas
por infecções virais; contudo, para uma melhor visualização, há a necessidade de um
microscópio eletrônico para visualização mais minuciosa dos efeitos que os vírus causam
na célula.

Microscopia óptica: morfologia das células

(efeito citopático) e corpos de inclusão
Para alguns tipos de infecções podemos ver os efeitos em microscópios ópticos,
como, por exemplo, no caso de infecções por Herpesvírus, nas quais podemos observar
a fusão do núcleo e as células com aspecto de vidro opaco; já no HPV, podemos ver
células mais queratinizadas, algumas com o núcleo bilobulado e a presença de uma área
mais esbranquiçada em volta do núcleo, chamada coilócito, associado à replicação das
proteínas virais.

Microscopia eletrônica: detecção da partícula viral.

Morfologia das partículas virais – Imunomicroscopia eletrônica
Para a detecção de partículas virais, falaremos nos testes utilizados a seguir.

A microscopia eletrônica na prática clínica é pouco usada, mais em pesquisas para

entender os mecanismos do processo e patogênese viral. A técnica de imunomicrosco-
pia eletrônica é utilizada para aumentar a acurácia na varredura da lâmina. Nessa meto­
dologia, são utilizados anticorpos marcados para identificar uma proteína específica
que o vírus produz, sendo assim, pode-se ter uma estimativa de onde esse se encontra
durante sua replicação.

Detecção do antígeno (detecção de componente viral) –

Imunofluorescência direta, hemaglutinação e aglutinação passiva
Existem algumas metodologias utilizadas para a detecção e determinação quantitativa
de partículas virais:
• Imunofluorescência direta: São usados anticorpos marcados com fluorófos para
a identificação de alguma partícula viral. Muitas vezes é utilizado o microscópio de
campo escuro para a conseguir ver a visualização dos anticorpos;

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 • Hemaglutinação: Principalmente em laboratórios de imunologia/sorologia são usa-
dos esses testes. Baseia-se na utilização de hemácias e imunoglobulinas IgM e IgG
para formar aglutinações e determinar a presença de uma partícula viral ou não;
• Aglutinação passiva: Existem proteínas que podem ser adsorvidas e tratadas com
ácido tânico, podendo ser aglutinadas por imunoglobulinas específicas. Para esses
testes, costuma-se visualizar a aglutinação como um ponto ou a formação de um
tapete de aglutinina em uma placa com fundo côncavo.

Para entender melhor sobre os tipos de aglutinação,.. acesse o site 2.5 no material
complementar.

Detecção do genoma viral (detecção de

componente viral): técnicas de hibridização, PCR
Hoje a PCR é muito utilizada em grandes laboratórios. Com seu advento no começo
dos anos 1980, pode-se amplificar o material genético, facilitando assim a visualização
desse, usando moléculas fluorescentes que se intercalam às duplas fitas de DNA ou son-
das marcadas com fluorófos específicos.

Entre outras técnicas de biologia molecular temos a hibridização utilizando um anti-

corpo com um fluorófos marcado, que faz sua ligação em pontos específicos, facilitando
assim a visualização no microscópio óptico e eletrônico.

Exames indiretos (presença de anticorpos

contra esse vírus no soro do paciente – sorologia)
Explicar sobre a detecção de aumento nos títulos de anticorpos específicos
entre as fases aguda e convalescente da infecção. Detecção de IgM na
infecção primária. Relembrar noções de imunologia
Para identificar se um paciente teve contato com uma infecção em fase aguda (logo
no começo), pode ser utilizada a avalição e quantificação de anticorpos IgM. Esses anti-
corpos são em formato pentamérico e são os marcadores utilizados para fase aguda
e começo da infecção, por serem os primeiros anticorpos gerados com o objetivo de
iniciar a via do complemento. Logo em seguida, temos a síntese de anticorpos IgG, que
são conhecidos como memória imunológica de longo prazo, pois ficam circulantes por
um período ou para o resto da vida do paciente – assim, podemos ter a noção de um
quadro clínico em que o paciente teve uma apresentação de antígeno ou não.

Imunofluorescência indireta
Uma metodologia muito utilizada para a identificação de anticorpos presentes no
soro do paciente. Baseia-se no princípio de recobrir antígenos em uma lâmina e uti-
lizar o soro do paciente onde estão diluídos os anticorpos para se fixarem. Após, é
utilizado um anticorpo marcado para fazer ligação anticorpo-anticorpo do paciente com
o marcado, assim pode-se quantificar, qualificar e identificar o paciente que já tenha tido
contato com o patógeno procurado.

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Inibição da Hemaglutinação
O princípio baseia-se na capacidade do vírus de aglutinar hemácias. Para fazer o teste,
são utilizados anticorpos específicos contra o vírus; caso ele não aglutine, temos que as
imunoglobulinas opsonizaram o vírus.

Partículas virais Hemácias

Ausência de interação Interação vírus-hemácia

vírus-hemácia

Ausência de
Hemaglutinação
hemaglutinação

Figura 4
Fonte: Adaptado de SANTOS; ROMANOS; WIGG, 2002

Western Blot
A técnica de Western Blot é utilizada para identificação de separação de proteínas
pelo tamanho. O método se baseia em um gel de eletroforese no qual são colocadas
amostras e utilizada uma corrente elétrica para migração; logo após, são utilizados mar-
cadores para a visualização das proteínas.

Técnica de Western Blot, disponível em: https://bit.ly/38ZTtjh

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Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:

Vídeos
Na lousa #23: Hepatite viral – considerações gerais
https://youtu.be/nthxCD-KoPw
WebPalestra: Hepatites Virais – Interpretação de marcadores/Triagem
https://youtu.be/-5BUs7nzk88

Leitura
Infecções Respiratórias de Importância Clínica: uma Revisão Sistemática
https://bit.ly/2Pq32RK
Dengue
https://bit.ly/2OSZmIk
Dengue – vírus e vetor
https://bit.ly/3sjKDVg
Imunoensaios: Ensaios de Aglutinação
https://bit.ly/31eaLox
Testes sorológicos utilizados em virologia
https://bit.ly/2NKALVj

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Referências
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. H. I. V. Imunologia celular e molecular.
7. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2012.

KUMAR, V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N.; MITCHELL, R. N. R. Bases patológicas

das doenças. 7. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C.  Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre:
­Artmed, 2017.

TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 6. ed. São Paulo: Atheneu, 2015.

TROHL, W. A.; ROUSE, H.; FISHER, B. D. Microbiologia Ilustrada. Porto Alegre:

Artmed, 2004.

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