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3. REVISO BIBLIOGRFICA
3.1.Processos Fermentativos
Em termos gerais, a fermentao implica na utilizao de microrganismos
na transformao da matria orgnica catalisada por enzimas.
A humanidade convive com processos fermentativos desde 5.000 a.C na
sua utilizao para a obteno de vinho, queijos e outros derivados do leite.
Os egpcios j utilizavam a fermentao da cevada para a obteno de uma
espcie de cerveja e, em 4000 a .C, a levedura da cerveja j estava sendo
utilizada para a panificao. No Mxico, os astecas costumavam cultivar
algas do gnero Spirulina para consumo prprio (WARD,1991).
Hoje em dia, diversos produtos utilizados nas indstrias qumicas,
farmacuticas e de alimentos so obtidos por processos fermentativos. Estes
produtos podem ser gerados pelo metabolismo primrio (ex: Etanol) ou
secundrio (Ex: Antibiticos) do microrganismo cultivado e ao lado da
produo de biomassa, enzimas e protenas em geral, eles so os
responsveis pela evoluo tecnolgica e desenvolvimento das pesquisas na
rea (WARD,1991).
As fermentaes podem ser conduzidas por processos descontnuos,
descontnuo-alimentados ou contnuos, bem como, por variaes destes
processos. (WARD, 1991; BORZANI, 2001).
Independente do modo de operao utilizado, o desenvolvimento de
processos fermentativos para a produo de enzimas por microrganismos
tornou vivel a obteno de novos sistemas enzimticos (PARK, 1975).
Novos
processos
que
fossem
economicamente
viveis,
com
acompanhamento
do
processo.
Porm,
maiores
progressos
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foi
de
2,33
g/L,
implicando
num
aumento
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cerevisiae
recombinante
em
processo
descontnuo
alimentado.
Nutrientes como metanol, etanol, cido actico e compostos aromticos
inibem o crescimento celular, mesmo em concentraes baixas, porm,
sabe-se que qualquer nutriente pode se tornar inibitrio, mesmo que
somente em concentraes muito elevadas e esse efeito inibitrio
efetivamente reduzido pelo uso do processo descontnuo alimentado,
atravs do controle das concentraes destes nutrientes (BORZANI et al.,
2001). Outro grande problema minimizado seria o da formao de produtos
metablicos txicos, que crtica em processos onde exista a necessidade
de se trabalhar com altas densidades celulares, como no caso de
fermentaes de microrganismos modificados geneticamente, onde a
concentrao celular elevada implica num aumento significativo na
produo, j que o crescimento celular em microrganismos modificados
geneticamente sempre bem menor do que o microrganismo selvagem.
Problemas de transferncia de oxignio so acentuados em fermentaes
em alta concentrao celular, de forma que a velocidade de crescimento
celular passa a ser fator determinante para a eficincia do processo, de
forma que se mantenha a mesma em nveis desejveis e tenhamos, com
isso, a diminuio na produo de produtos txicos, possibilitando que se
consiga altas concentraes celulares e, tambm, aumento na quantidade
de produto formado. No processo descontnuo alimentado no existem
problemas comuns ao processo contnuo, como os problemas de mutao,
contaminao e instabilidade do plasmdeo, de forma que o processo
descontnuo alimentado se torna muitas vezes o mais vivel para a produo
de produtos recombinantes (YOON & KANG, 1994).
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Saccharomyces
atividade
da
cerevisiae
enzima
G6PDH
adquirida
muito
comercialmente
similar
quando
apresenta
comparado
Entretanto,
Saccharomyces
cerevisiae
modificada
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Portanto,
pH
utilizado
afeta
apenas
as
enzimas
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exerce um excelente papel na nutrio de microrganismos. Segundo RICCISILVA (1998), a composio do meio de cultivo exerceu grande influncia
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fermentativo
(REIFENBERGER
et
al.,1997;
DOES
&
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de
fundamental
importncia
abordar
problema
da
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Eltrons) e, com isso, gerar mais ATP; mas significa tambm, a necessidade
de existncia de oxignio dissolvido, a fim de que estes eltrons sejam
drenados para fora da clula ao final da cadeia.
Para que ocorra a oxidao de um mol de Glicose so necessrios seis
moles de oxignio a serem consumidos, o que torna bvio a necessidade de
se agitar e aerar um meio de cultura no caso de processos fermentativos
aerbios. Por ser muito pouco solvel em meio lquido, podendo atingir
apenas alguns miligramas por litro, em termos de concentrao de saturao,
existe a necessidade de estarmos suprindo a demanda de oxignio durante o
processo fermentativo para que as clulas encontrem a possibilidade de
converterem, de forma adequada, o substrato no produto desejado. Sendo
assim, de nada adianta dissolver centenas de gramas por litro de glicose,
alm das quantidades necessrias dos demais nutrientes, sem se imaginar
que se dever introduzir, ao longo do processo fermentativo, o oxignio
necessrio para suportar a condio de aerobiose, tendo em vista a limitada
capacidade de estocar O2 na soluo. Diante desta situao, pode-se afirmar
que a extenso de um processo descontnuo aerbio e, sua conseqente,
obteno de elevadas concentraes de bioprodutos de interesse, depende
totalmente da capacidade de se transferir oxignio para a fase lquida,
especialmente, nos instantes mais avanados do processo, onde a
concentrao celular deve ser elevada, existindo situaes onde as
condies de operao a serem empregadas sero definidas em funo da
capacidade de transferncia de oxignio. O transporte de oxignio desde a
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R2 :
R3 :
R4 :
R5 :
R6 :
R7 :
R8 :
R9 :
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Estas resistncias, por sua vez, podem ser agrupadas em trs grandes
grupos de resistncias:
1) Transferncia do oxignio da bolha para a soluo.
2) Transferncia do oxignio dissolvido atravs do meio de cultivo.
3) Utilizao do oxignio pela clula.
Considerando que ocorra simples difuso na transferncia de oxignio
dissolvido pelo meio de cultivo (devido a uma agitao adequada), o segundo
grupo de resistncia pode ser considerado desprezvel, restando somente
duas grandes resistncias interferindo no transporte da molcula de oxignio:
A transferncia da Fase Gasosa para a Fase Lquida e a prpria reao
bioqumica no interior da clula.
A demanda de oxignio no incio do processo fermentativo descontnuo
padro bastante baixa devido baixa concentrao celular. Porm, com o
crescimento celular, esta demanda aumenta com o tempo, tornando
obrigatrio o fornecimento contnuo de oxignio.
Uma clula consome mais oxignio, por unidade de tempo, quanto maior
for a velocidade de crescimento existindo um limite, ou seja, uma velocidade
dita mxima, a qual nada mais do que a capacidade mxima de sntese das
enzimas que participam do processo. Esta velocidade depende das
condies de cultivo (pH, temperatura, etc) e do meio de cultura.
ABRAHO-NETO et al., (1997) estudaram a influncia de vrios fatores
na produo de G6PDH por S. cerevisiae e verificaram que a maior atividade
da enzima ocorria com uma taxa de oxignio dissolvido de 4,0 mg ar.L-1 ,
sendo que a diminuio da atividade enzimtica observada com valores
superiores e inferiores de oxignio dissolvido tiveram como causa a reduzida
taxa de crescimento sob estas concentraes de oxignio. Essa observao
deve-se ao fato da G6PDH participar da via das pentoses, caminho pelo qual
as clulas sintetizam ribose-6-fosfato, um dos constituintes chave dos cidos
nuclicos e nucleotdeos. Dado que a demanda por cidos nuclicos durante
a fase de crescimento mximo acentuada, a atividade especfica da G6PDH
tambm aumenta. Porm, segundo OURA (1976), a contribuio do ciclo das
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dos
genes
HXK1
HXK2
(Hexoquinases)
GLK1
multienzimtico
formado
por
trs
componentes
(Piruvato
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mais cadeias
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6-Fosfogliconato
classificada
bioquimicamente
como
uma
oxidorredutase.
A
G6PDH
vem
sendo
extensivamente
purificada
obtida,
Pseudomonas
aeruginosa)
apresentar
dois
cofatores
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A perda do plasmdeo pode ocorrer pela competio entre as duas subpopulaes presentes (com e sem plasmdeo) e pode ser estimulada pela
menor velocidade de crescimento obtida pelas clulas recombinantes. A
menor velocidade de crescimento gerada pelo aumento da carga
metablica, como um resultado direto da necessidade de replicao do
plasmdeo e da expresso do gene recombinante.
O uso de S.cerevisiae como hospedeiro recombinante apresenta diversas
vantagens sobre outros microrganismos por no ser patognica, no
produzir endotoxinas, por ter sido muito estudada e ter grande aplicao em
processos industriais (KINGSMAN et al, 1987 apud CHUNG et al., 1997).
Segundo LANG et al. (1997), S.cerevisiae um hospedeiro muito atrativo
pois pode excretar protenas recombinantes para o meio sem excretar
conjuntamente protenas homlogas de forma que quase a totalidade das
protenas secretadas ser constituda pela protena de interesse, com isso,
facilitando o processo de purificao e resultando numa significativa reduo
nos custos do processo.
Uma grande variedade de trechos de genes de expresso contendo
promotores constitutivos ou induzidos tem sido definidos e construdos para
uma superproduo de protenas heterlogas em S.cerevisiae (CHUNG et
al., 1997).
As indstrias nos EUA geram mais que 300 milhes de toneladas de lixo
perigoso e 600 milhes de toneladas de lixo no perigoso por ano. A
Biotecnologia tem dado uma pequena contribuio no tratamento desse lixo,
porm apresenta um potencial ainda maior. O desenvolvimento de rvores
geneticamente modificadas para auxiliar na separao da lignina de celulose
tem economizado US$ 100 milhes/ano na produo do papel. As indstrias
qumicas esto interessadas na aplicao de biocatlise e microrganismos
modificados geneticamente para minimizar a formao de lixo txico sem
aumentar o consumo de energia. Indstrias farmacuticas e de alimentos j
aplicam em grande escala tcnicas de fermentao com tecnologia gentica.
Alguns exemplos incluem enzimas utilizadas a frio e a quente visando
otimizar o uso de energia e reduzir a quantidade de lixo. Os usos da
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