Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Mecanismos de Transduo de Sinal Ativados por Purinas, Pirimidinas e Fatores de Crescimento em Culturas de Astrcitos

Guido Lenz

Orientador Dr. Richard Rodnight

Tese apresentada ao curso de PsGraduao em Cincias Biolgicas Bioqumica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como requisito parcial obteno do grau de Doutor em Bioqumica

Porto Alegre 2000

O que conhecemos finito, o desconhecido infinito; intelectualmente estamos parados numa ilha no meio de um oceano ilimitado da inexplicabilidade. Nosso objetivo a cada gerao conquistar um pouco mais terra.
Thomas Huxley
ii

Ao Dr. Heinrich Engelbert Lenz (in memorian) Por ter me ensinado a pescar

iii

Agradecimentos
Ao Dr. Rodnight, por to bem ter me orientado e incentivado pelos melhores caminhos; Aos colaboradores mais diretos, Dani, Cris, Carmem, Ju, Fram, Letcia, Silvana, Connie obrigado pelo colegismo e pela eficincia; Aos pacientes revisores, Osvaldo, Fernanda, Lauren, CA e Fabiana; Aos colegas do lab, obrigado por toda a ajuda e alegria; Carla Tasca e ao Diogo Souza, pelo auxlio com as dosagens de cAMP; Aos colegas do Departamento de Biofsica, especialemente Ana Lgia e ao Jorge; Maria del Mar e ao Prof. Zaha, pelo auxlio com as bactrias;

I would like to thank Dr. Neary for his pacient and wise orientation; Connie for teaching me so much in the lab; To my nice lab-mates in Nearys lab; Holly for welcoming me so nicely to Miami.

Mrcia, pelo amor e companheirismo comprensivo na longa ausncia e nas horas difceis necessrias para esta conquista; Aos meus pais, por terem me incentivado tanto por toda esta jornada; Aos meus irmos, amigos e a todos aqueles com os quais convivo.

iv

ndice
1. PRLOGO 1

2. 2.1.

INTRODUO PARTE 1. TRANSDUO DE SINAL

5 5 6 7 7 13 17 19 20 22 32 42 43

2.1.1. COMPONENTES 2.1.1.1. Receptores 2.1.1.2. Mensageiros 2.1.1.3. Efetores 2.1.1.4. Protenas de ancoramento ou adaptadoras 2.1.2. AS CASCATAS DAS MAPKS 2.1.2.1. Eventos celulares regulados pelas MAPKs 2.1.2.2. A cascata da ERK. 2.1.2.3. Isoformas das cascatas das MAPKs 2.1.3. INTEGRAO DA SINALIZAO NA CASCATA DAS MAPKS 2.1.3.1. Protenas G 2.1.3.2. Ca
2+

44 44

2.1.3.3. cAMP / PKA 2.1.3.4. PKCs 46 2.1.4. CARACTERSTICAS ESPECIAIS DE MECANISMOS DE SINALIZAO 2.1.4.1. Amplificao e digitalizao 2.1.4.2. Sinergismo e coincidncia 2.1.4.3. Sinalizaes Redundantes 2.1.4.4. Deteco de freqncia 2.1.4.5. Retroalimentao e ciclos 2.2. PARTE 2. PURINAS E PIRIMIDINAS COMO TRANSMISSORES.

47 47 48 50 51 52 54 55 57 57 57

2.2.1. LIGERAO E EFEITOS FISIOLGICOS 2.2.2. RECEPTORES P1 OU DE ADENOSINA 2.2.3. RECEPTORES P2 2.2.3.1. Ionotrpicos (P2X)

2.2.3.2. Metabotrpicos (P2Y) 2.2.4. MECANISMOS DE SINALIZAO ATIVADOS POR RECEPTORES P2Y 2.3. PARTE 3. ASTRCITOS

58 63 66 67 67 68 68 68 69 70 70 72

2.3.1. INTERRELAO GLIA-GLIA E GLIA-NEURNIO 2.3.2. RECEPTORES PURINRGICOS NOS ASTRCITOS 2.3.3. OUTROS GPCRS PRESENTES NOS ASTRCITOS 2.3.3.1. Receptores adrenrgicos 2.3.3.2. Receptores Serotoninrgicos 2.3.3.3. MAPK nos astrcitos 2.3.3.4. Proliferao induzida por ATP e FGF-2 2.3.3.5. Gliose reativa 3. OBJETIVOS

4. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 5. 5.1.

MATERIAIS E MTODOS AGONISTAS INIBIDORES E ATIVADORES CULTURA DE CLULAS, TRATAMENTO E LISE. ENSAIO ACOPLADO DA RAF E MAPKKKS ENSAIO DA MEK E DA ERK ENSAIO DO CAMP PRODUO DE PROTENAS ATRAVS DE E. COLI TRANSFORMADAS. RESULTADOS ATIVAO DA CASCATA POR AGONISTAS PURINRGICOS.

73 73 74 74 75 77 78 80 83 83 85 87

5.1.1. EFEITOS DOS AGONISTAS PURINRGICOS SOBRE DIVERSOS ATIVADORES DE MEK. 5.1.2. CINTICA DE ATIVAO DA CASCATA POR ATP E UTP. 5.1.3. ATP DIMINUI A CONCENTRAO BASAL DE CAMP, MAS SINERGISOU POSITIVAMENTE
COM FORSCOLINA.

89 90 91

5.2.

INTERAO ENTRE AS VIAS DE SINALIZAO ATIVADAS POR ATP E FGF-2.

5.2.1. ATP BLOQUEIA A ESTIMULAO DA CRAF-1 INDUZIDA POR FGF-2.

vi

5.2.2. CURVA DOSE-RESPOSTA DA INIBIO DE CRAF-1 POR ATP. 5.2.3. CURVA DE TEMPO DA INIBIO DE CRAF-1 POR ATP. 5.2.4. EFEITO DE INIBIDORES DE PKC NA INIBIO DE CRAF-1 POR ATP. 5.2.5. A ATIVAO DE CRAF-1 POR EGF E PDGF TAMBM FOI BLOQUEADA POR ATP. 5.2.6. EFEITO DO ATP SOBRE OUTROS ATIVADORES DE MEK1. 5.2.7. EFEITO DA NORADRENALINA (NA) E DA SEROTONINA (5-HT) SOBRE A ATIVIDADE DA
CRAF-1.

92 93 94 96 97

98 99 102

5.2.8. EFEITO DA INTERAO DAS VIAS DE SINALIZAO SOBRE MEK E ERK. 6. 6.1. DISCUSSO RECEPTORES PURINRGICOS ASSOCIADOS ATIVAO DA CASCATA DA ERK EM

ASTRCITOS.

102 102 103 103 104 106 106 108 108 109

6.1.1. RECEPTORES P2Y EXPRESSOS EM CULTURAS DE ASTRCITOS. 6.1.2. EFEITOS DA ATIVAO DE PURINOCEPTORES SOBRE A CASCATA DA ERK. 6.1.3. RECEPTOR P2Y ENVOLVIDO NA ATIVAO DE ERK POR UTP. 6.1.4. RECEPTOR P2Y ENVOLVIDO NA ATIVAO DE ERK POR ATP. 6.1.5. CURVAS DE TEMPO 6.1.6. SINERGISMO ENTRE FORSCOLINA E ATP NA PRODUO DE CAMP. 6.2. MECANISMO DE ATIVAO DA CASCATA DA ERK POR PURINOCEPTORES.

6.2.1. MECANISMO DE ATIVAO DA CASCATA DA ERK POR ATP. 6.2.2. MECANISMO DE ATIVAO DA CASCATA DA ERK POR UTP. 6.3. INTERAO ENTRE A SINALIZAO ATIVADA POR AGONISTAS PURINRGICOS E

FATORES DE CRESCIMENTO.

110 110 111 114 115 116 116

6.3.1. PURINOCEPTOR ENVOLVIDO NA INIBIO DE CRAF-1. 6.3.2. CINTICA DE ATIVAO E INIBIO DA CASCATA 6.3.3. MECANISMO DA INIBIO DE CRAF-1 POR ATP. 6.3.3.1. Efeito de inibidores de PKC. 6.3.3.2. O mecanismo de inibio no foi especfico para cRaf-1 ativada por FGF-2. 6.3.3.3. Evidncias de outros agonistas de GPCR

6.3.3.4. O mecanismo de sinalizao ativado por ATP no foi especfico para a inibio de cRaf1. 118 6.3.3.5. Provveis candidatos envolvidos no mecanismo de inibio 6.3.4. EFEITOS SOBRE ERK 119 120

vii

6.4.

EFEITOS DO ATP E FGF-2 SOBRE O CICLO CELULAR POSSVEL MECANISMO PARA 123 124

EXPLICAR O SINERGISMO NA PROLIFERAO.

6.5.

COMPLEXIDADE DOS MECANISMOS DE TRANSDUO DE SINAL

6.5.1. ESPERANAS METODOLGICAS PARA A OBTENO DE DADOS EM TRANSDUO DE

SINAL.

126 129 129 130 131 131 131 131

7. 7.1. 7.2. 8. 8.1.

CONCLUSES ESPECFICAS GERAIS PERSPECTIVAS MECANISMO DE SINALIZAO ATIVADOS POR PURINOCEPTORES

8.1.1. MECANISMO DE ATIVAO DA CASCATA DA ERK POR ATP E UTP. 8.1.2. MECANISMO DE INIBIO DA CRAF-1 POR ATP.

8.1.3. POSSIBILIDADE DO ENVOLVIMENTO DA INIBIO DE CRAF-1 POR ATP NA ATIVAO DA

CASCATA DA ERK POR AGONISTAS PURINRGICOS.

132 134 134 134 135

8.2.

EFEITOS REGULATRIOS DO CICLO CELULAR

8.2.1. MECANISMO DO SINERGISMO 8.2.2. ESTUDO DO SINERGISMO EM LINHAGENS DE ASTROCITOMAS. 9. REFERNCIAS

10. 10.1. 10.2.

ANEXOS MANUSCRITO DOS ARTIGOS REFERENTES TESE OUTROS TRABALHOS REALIZADOS DURANTE O DOUTORADO (NO ANEXADO)

163 163 164

viii

Resumo
A cascata da ERK (Extracellular Signal Regulated Protein Kinase) formada por trs quinases (cRaf-1, MEK1 e ERK) e est envolvida em inmeros processos celulares como proliferao e diferenciao. Esta cascata ativada por uma grande variedade de mecanismos e transmissores. ATP e UTP so importantes molculas sinalizadoras, atuando sobre purinoceptores, tanto ionotrpicos (P2X) como metabotrpicos (P2Y). Nos astrcitos, a ativao dos receptores P2Y leva ativao da ERK que est envolvida na induo da proliferao celular. No presente trabalho foram realizadas dosagens dos componentes da cascata em culturas primrias de astrcitos tratados com diversos agonistas purinrgicos e/ou fatores de crescimento. Baseados na atividade de cRaf-1, MEKK1, MEKK2, MEK e ERK e tambm na dosagem de cAMP, pode ser sugerido que astrcitos expressam pelo menos dois purinoceptores metabotrpicos (P2Y) funcionalmente ligados com a ativao da cascata da ERK. Um receptor P2Y preferencialmene ativado por ATP, ativou MEK e ERK de uma forma independente de cRaf-1, MEKK1 e MEKK2, enquanto que um segundo receptor, ativado preferencialmente por UTP, estimulou a atividade de cRaf-1, MEKK1, MEKK2, MEK e ERK. Alm de ativar ERK, ATP tambm inibe a ativao de cRaf-1 induzida por FGF-2 com caractersticas que indicam que esta inibio ocorre acima de cRaf-1 e abaixo do receptor do fator de crescimento, atravs de mecanismos que no envolvem PKC nem o aumento de cAMP. O presente estudo mostra a complexidade da sinalizao purinrgica nos astrcitos tanto a nvel dos receptores bem como a nvel das integraes entre as vias de sinalizao, com potenciais implicaes na compreenso de eventos celulares como a proliferao e eventos fisiopatolgicos como a astrogliose.

ix

Abstract
The trophic actions of extracellular nucleotides on astrocytes, which may be important in development as well as in brain injury and repair, appear to be mediated by extracellular signal regulated protein kinase (ERK), a member of a protein kinase cascade crucial for cellular proliferation and differentiation. Here we have investigated components of the ERK signaling pathway recruited by P2Y receptors. Rat astrocytes express several types of metabotropic P2Y nucleotide receptors. Stimulation of these astrocytic receptors by ATP or UTP leads to activation of ERK. We found that in primary cultures of rat cortical astrocytes UTP and 2MeSATP, as well as FGF-2, activated c-Raf whereas ATP did not, even though ATP, UTP, 2MeSATP and FGF-2 stimulated ERK to a similar extent. Furthermore, ATP did not activate B-Raf or MEKK1 but inhibited the activation of c-Raf induced by FGF-2. This inhibitory effect seems to act on a component between the growth factor and the MEK activates and was not mediated by PKC or cAMP. The differences in activation of c-Raf by ATP, UTP and 2MeSATP, together with the inhibitory effect on FGF-2-induced c-Raf and the lack of effect on cAMP synthesis, suggests the presence of a group of ERK-coupled, P2Y receptor subtypes on astrocytes which do not seem to match the characteristics described for cloned P2Y receptor subtypes. The present study shows the complexity of the purinergic signaling in astrocytes both at the receptor level as at the singnal transduction pathway level, with potential implications in the understanding of cellular events such as proliferation and physiopathological events like astrogliosis.

ndice de Figuras
Figura 1. Mecanismos de transduo de sinal intracelular. _____________________________ 6 Figura 2. Representao esquemtica de alguns mensageiros intracelulares. _______________ 8 Figura 3. Ciclo regulatrio da subunidade da protena G. ____________________________ 9 Figura 4. As diversas cascatas das MAPKs, seus ativadores e seus efeitos. ________________ 19 Figura 5. Modelo para a ativao de Ras por EGF (A) e por NGF (B). ___________________ 23 Figura 6. Vias de sinalizao ativadas por FGFR. ___________________________________ 33 Figura 7. Integrao da sinalizao proveniente de cAMP, Ca2+ e DAG no nvel das Rafs. ___ 42 Figura 8. Adenilil Ciclase como detector de coincidncia. _____________________________ 50 Figura 9. Dendograma representando a relao entre as seqncias dos subtipos de receptores P2Y, bem como a sua sensibilidade aos agonistas purinrgicos. ________ 59 Figura 10. Enquema do ensaio acoplado de ativadores de MEK. _______________________ 77 Figura 11. Expresso e purificao da RBD-GST e ERK. ______________________________ 82 Figura 12. Efeito dos agonistas purinrgicos e FGF-2 sobre cRaf-1 (A), MEK (B) e ERK (C) e quantificao destes resultados (D). _____________________________________ 84 Figura 13. Ensaio acoplado de B-Raf (A), MEKK1 (B) ativados por agonistas purinrgicos e FGF-2 e quantificao destes experimentos (C). _____________________________ 86 Figura 14. Curva de tempo para ativao de cRaf-1 (A) e ERK (B) por ATP, UTP, 2MeSATP e FGF-2. _____________________________________________________ 88 Figura 15. ATP inibiu a ativao de cRaf-1 por FGF-2 _______________________________ 91 Figura 16. Inibio de cRaf-1 ativada por FGF-2 por ATP (A) e a curva dose-resposta deste efeito e da ativao de ERK por ATP (B).___________________________________ 92 Figura 17. Curva de tempo de ativao de cRaf-1 por ATP, FGF-2 e A+F. ________________ 93 Figura 18. Efeito do ATP na atividade de cRaf-1 induzida por FGF-2, EGF e PDGF. _______ 96 Figura 19. Efeito do ATP e do FGF-2 sobre diferentes ativadores de MEK. _______________ 97 Figura 20. Curva de tempo de ativao de MEK e ERK por ATP e FGF-2. _______________ 100 Figura 21. Grficos da cintica de ativao (A) dos componentes da cascata e inibio da cRaf-1 (B). __________________________________________________________ 113 Figura 22. Esquema da interao entre as vias de sinalizao ativadas por ATP e FGF-2.___ 119 Figura 23. Atividade da ERK induzida por A+F (medida) e a soma da atividade de ERK induzida por ATP e FGF-2 isoladamente(calculada). ________________________ 121 Figura 24. Possvel envolvimento da inibio da cRaf-1 por ATP na ativao da cascata da ERK pelos agonistas purinrgicos. _______________________________________ 133

xi

ndice de Tabelas
Tabela 1. Stios de fosforilao da cRaf-1 e seus efeitos regulatrios. ____________________ 27 Tabela 2. Fosfatases que podem regular da atividade das cascatas MAPKs. _______________ 31 Tabela 3. Homologia da famlia das Rafs e MEKKs com a cRaf-1 de rato. ________________ 38 Tabela 4. Famlias de receptores para purinas e pirimidinas.___________________________ 55 Tabela 5. Sensibilidade dos receptores P2Y recombinantes aos agonistas purinrgicos em clulas transfectadas. __________________________________________________ 60 Tabela 6. Condies nas quais os agonistas foram utilizados.___________________________ 73 Tabela 7. Condies nas quais ativadores e inibidors foram utilizados. ___________________ 74 Tabela 8. Curva de calibrao para a dosagem de cAMP. _____________________________ 79 Tabela 9. Solues para a dosagem de cAMP._______________________________________ 80 Tabela 10. Meios para crescimento de E. Colis compententes. __________________________ 81 Tabela 11. Solues para o isolamento e purificao da ERK___________________________ 81 Tabela 12. Efeito do ATP e forscolina sobre os nveis de cAMP._________________________ 90 Tabela 13. Estudo do envolvimento da PKC na inibio de cRaf-1 por ATP. _______________ 95 Tabela 14. Efeito da noradrenalina e da serotonina na atividade da cRaf-1 induzida por FGF-2. ______________________________________________________________ 99 Tabela 15. Tempo no qual a atividade dos componentes da cascata atinge 50% da atividade mxima (t0,5) em segundos. _____________________________________________ 113

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Lista de Abreviaturas
AC Adenylyl Ciclase Enzima produtora de cAMP2 ATF Activating Transcription Factor ATP Adenosine Triphosphate ATPS adenosine 5-S-(3-thiotriphosphate);

AEBSF 4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonylfluoride Inibidor de proteases.

BAPTA-AM 1,2-bis(2-aminophenoxy)-ethane-N, N, N,N,-tetraacetic acid tetrakis (acetoxymethyl)ester Quelante de Ca2+ intracelular CaM Calmodulin CaMKII Ca2+/Calmodulin dependent kinase II cAMP 3,5-Cyclic Adenosinemonophosphate cGMP 3,5-Cyclic Guanosinemonophosphate CHO Chinese Hamster Ovary Linhagem Celular CK2 - Casein Kinase 2 CNS - Central Nervous Sistem cPLA2 Cytosolic Phospholipase A2 CR Conserved Region CREB - cAMP Responsive Element Binding Protein Fator de transcrio DAG Diacylglycerol Ativador endgeno das PKCs DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium - Meio de cultura de clulas. DMSO Dimethyl sulfoxide Solvente orgnico. DTT Dithiothreitol Redutor de pontes dissulfeto. EGF Epidermal Growth Factor EGFR EGF Receptor EGTA - Ethilene Glycol-bis(-Aminoethil Ether N, N, N, N, Tetraacetic Acid Quelante de Ca2+ ERK - Extracellular Signal-regulated Kinase

Abreviaturas citadas somente uma vez no esto listadas. Na primeira vez que uma abreviatura utilizada no texto aparece a sua traduo. 2 Quando aplicvel, a principal caracterstica ser citada.

xiii

FCS - Fetal Calf Serum soro utilizado em culturas de clulas. FGF - Fibroblast Growth Factor FGFR FGF Receptor FRS2 - FGF receptor substrate 2 GABA -aminobutiric Acid Neurotransmissor inibitrio GAP - GTPase activating proteins inibidores de G e Ras GDP Guanosine diphosphate GEF Guanine nucleotide exchange factors ativadores de G e Ras GFAP - Glial Fibrillary Acidic Protein Componentes do Filamento Intermedirios e marcador especfico de astrcitos. GPCR - G protein-coupled receptors GRK - G-protein coupled receptor kinases GST glutathione-S-transferase GTP Guanosine triphosphate Hsp Heat shock protein 5-HT 5-Hydroxytryptamine Neurotransmissor IP3 - Inositol-1,4,5-Triphosphate JNK c-Jun Kinase KO knockout Deleo de um gene. LTP - Long-Term Potentiation MAPK (KK)- Mitogen-Ativated Protein Kinase (Kinase Kinase) MAPKAPK - MAPK activated protein kinase MBP Mielin Basic Protein Substrato da ERK. , MeATP , -methylene ATP agonista P2Y MEK - Mitogen Activated, ERK-Activating Kinase 2-MeSATP 2-Methylthio ATP Agonista P2Y mGluR - Metabotropic Glutamate Receptor MKP MAPK Phosphatase mRNA Messenger RNA NA - Noradrenaline NMDA N-methyl-D-aspartate Neurotransmissor estimulatrio xiv

P2X Ionotropic purinergic receptor P2Y Metabotropic purinergic receptor p38 Um tipo de MAPK. PAGE - Polyacrylamide Gel Electrophoresis PC12 Pheochromocytoma Cells PC-PLC - Phosphatidylcholine-specific Phospholipase, PDE - Phosphodiesterase PDGF Platelet-derived Growth Factors PDGFR PDGF Receptor PH Pleckstrin Homology PI3K - Phosphatidyl inositol-3-OH Kinase PKA cAMP Dependent Protein Kinase PKC Protein Kinase C PKG cGMP Dependent Protein Kinase PLC - Phospholipase C PLD - Phospholipase D PMA - Phorbol 12-Myristate 13-Acetate Ativador das PKCs PMSF Phenylmethylsulfonyl Fluride Inibidor de proteases. PP1 Proten Phosphatase 1 PP2A Proten Phosphatase 2A PPADS Pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2, 4-disulfonic acid PTP Protein Tyrosine Phosphatase PTx Pertussis Toxin Inibidor da Protena Gi PY Phosphotyrosine Pyk2 - Proline-rich tyrosine kinase 2 Ras-GEF Ras-Guanine Exchange Factor (Esta protena tambm conhecida por Ras-GRF Ras-Guanine Release Factor ou Ras-GRP Ras-Guanine Release Protein. RBD Ras Binding Domain RGS - Regulators of G-protein signaling Rsk Ribosomal S6 kinase

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RTK Receptor Tyrosine Kinase RT-PCR Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction SDS - Sodium Dodecil Sulfate Sos Son of Sevenless Um tipo de GEF Src Sarcoma t0,5 - Tempo de Meia Vida STAT Signal transducer and activator of transcription Fator de transcrio. TC Tampo cAMP TCB Thrombin Cleavage Buffer TE Tampo de Ensaio TNF - Tumor Necrosis Factor UTP Uridine Triphosphate VSCC - Voltage Sensitive Ca2+-Channels

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1. Prlogo
Darwin, em sua obra que marcou o incio da biologia moderna, enfatizou as transformaes lentas sofridas pelos seres vivos e guiadas pela seleo natural, que produziram, ao longo de bilhes de anos, as mais variadas formas de vida. Embora este aspecto esteja correto e desempenhe um papel fundamental no processo evolutivo, a vida como a conhecemos tambm foi moldada por eventos muito mais drsticos, entre os quais se destacam as extines em massa, que podem ser considerados verdadeiras mudanas de direo no curso da vida. O exemplo mais estudado e divulgado a extino dos dinossauros, que liberou inmeros nichos ecolgicos, posteriormente ocupados pelos mamferos. Sem esta extino, muito provavelmente, os mamferos representariam um pequeno grupo de animais insignificantes. Mas as extines parecem no representarem as nicas mudanas profundas na histria da vida. Vrias evidncias apontam para eventos relativamente repentinos tambm no surgimento de novas formas de vida, seguidos por longos perodos nos quais as grandes modificaes foram lapidadas. Esta teoria, proposta por Eldredge e Gould (Gould, 1993) e denominada de equilbrio pontuado, tem se tornado uma parte importante da moderna teoria evolutiva. Com exceo das extines, que certamente representam as alteraes mais intensas na histria da vida, as mudanas mais inovativas provavelmente tiveram uma caracterstica em comum: a comunicao! O aparecimento da comunicao parece ter sido responsvel por, no mnimo, trs revolues biolgicas e uma quarta, no biolgica, mas sim tecnolgica, que est se desenrolando a todo vapor, transformando profundamente o comportamento do Homo sapiens. As comunicaes de massa, desde a inveno da prensa por Guttenberg h 500 anos e passando por todas as maravilhas comunicativas que se seguiram, transformou profundamente a vida de todos ns, da forma de pensar, agir, trabalhar, relacionar-se, enfim, esmigalhou praticamente todas as semelhanas entre a sociedade feudal e a aldeia global. A parafernlia comunicativa tomou conta de tal forma da nossa vida que passou a ser praticamente impossvel ima1

ginar o mundo no qual a nica forma de comunicao seria a palavra falada. Na histria da humanidade, a ampliao da comunicao falada para a escrita e todas as formas comunicativas que se seguiram, certamente representou uma revoluo, da qual temos a sorte de sermos parte integrante. Muito antes da atual revoluo, outra, talvez mais profunda e intrigante, aconteceu: o prprio aparecimento da linguagem. A comunicao lingstica prescinde de simbolismo, que, no Homo sapiens, representou muito mais do que comunicao, pois com ele tambm foi possvel o ato de pensar, imaginar, planejar com uma vantagem evolutiva considervel. Deacon, (1997) em seu livro The Symbolic Species afirma que Biologicamente, ns somos apenas mais um macaco. Mentalmente, ns somos um novo filo de organismos. Somos organismos especializados no simbolismo comunicativo. Esta especializao produziu o que denominamos cultura, isto , um conjunto de informaes transmitidas de uma gerao a outra de forma simblica e no mais, exclusivamente, de forma gentica. A grande maioria dos animais, seno todos, possuem formas de se comunicar, como por exemplo os macacos vervet, que possuem gritos distintos para comunicar a presena de leopardos, guias ou cobras e com isso podem escolher a forma de escape mais adequado. Este tipo de comunicao pode ser comparada com o sorriso, o grito de susto ou o choro nos humanos, geralmente inconscientemente produzidos e com um grande impacto comunicativo. Estas formas de comunicao so bem diferentes da comunicao que est sendo realizada na redao e leitura deste pargrafo, com a utilizao de smbolos (palavras escritas) que referem a simbolismos complexos que se, adequadamente integrados, levam compreenso de um conceito, completamente diferente da comunicao exercida por uma risada. Com um sorriso ou uma lgrima podemos entender que a pessoa est alegre ou triste, mas somente com a comunicao em forma de linguagem como a conhecemos que podemos compreender um conceito de porque aquela pessoa est alegre ou triste. O tamanho aumentado do crtex nos humanos em relao aos outros mamferos parece ter sido a modificao evolutiva mais importante para o apareci-

mento da linguagem humana, pois pode ter permitido a integrao de um conjunto de informaes capazes de formar um conceito complexo. Evidncias fsseis e genticas indicam que a revoluo acima aconteceu entre 2 a 5 milhes de anos atrs, muito provavelmente no continente africano, em um ambiente intermedirio entre a mata e a savana (Foley, 1993). Outras formas de comunicao, no entanto, tiveram que estar muito bem estabelecidas para que estas revolues pudessem ocorrer. Da mesma forma como a comunicao falada foi a base da revoluo comunicativa dos dias atuais, a comunicao entre as clulas foi fundamental para que a linguagem falada pudesse surgir. As clulas do sistema nervoso central se especializaram em comunicao e so a base para o simbolismo comunicativo. A comunicao celular parece ter surgido entre 1 bilho e 600 milhes de anos atrs e foi um dos ou o principal responsvel pela grande exploso no nmero e nas formas de vida ocorrida durante a exploso do cambriano, um perodo curtssimo, ocorrido h aproximadamente 550 milhes de anos (Erwin et al. 1997). Um dos argumentos para este aumento impressionante de formas de vida que os nichos ecolgicos para organismos unicelulares estavam ocupados e que organismos multicelulares, mais versteis, maiores e mais fortes, puderam ocupar nichos antes desocupados, permitindo uma grande ampliao dos nichos ecolgicos ocupveis (Gould, 1989). Uma sociedade celular integrada a base da existncia de um organismo multicelular, o que implica complexas formas de comunicao entre as clulas. Em outras palavras, as clulas passaram a se comunicar e formaram milhares de sociedades celulares, que apresentaram muitas vantagens evolutivas quando comparadas com as clulas isoladas. Todas estas revolues comunicativas esto baseadas no big-bang da biologia, ou seja, o surgimento da vida, o que tambm pode ser visto como uma revoluo comunicativa. Molecularmente falando, a vida pode ser descrita como molculas capazes de estocar, transmitir, compreender e utilizar informaes3. A

A semntica utilizada neste trabalho foi cunhada para a comunicao humana, mas, considerando a total ausncia de vocbulos para descrever especificamente a comunicao celular e que muitos conceitos entre comunicao humana e celular so semelhantes, eles so

linguagem molecular est baseada primeiramente na seqncia (DNA, RNA e protenas), mas tambm linguagens moleculares mais complexas como estrutura4 e atividade protica envolvidos na compreenso e utilizao da informao molecular. O aparecimento desta comunicao ocorreu h aproximadamente 3,5 bilhes de anos, muito provavelmente quando molculas de RNA atingiram uma complexidade capaz de catalisar a sua cpia, transmitindo informao de uma molcula a outra, o que a base da vida como a conhecemos (Orgel, 1998). Desta forma, a vida pode ser vista como sistemas comunicativos distribudos nos nveis molculares, clulares, indivduais e sociais. Compreender, ao invs de somente entender, uma parte fundamental da comunicao humana. Mas qual o correlato da compreenso para a comunicao celular. Clulas possuem sistemas comunicativos moleculares suficientemente complexos para compreender? Ou a comunicao celular uma comunicao simplria, com informaes do tipo sim ou no ou alegre ou triste? Como era de se esperar para uma sociedade altamente integrada composta por bilhes de indivduos, as clulas possuem comunicaes extremamente complexas, com caractersticas que indicam que as informaes celulares podem ser compreendidas e no somente entendidas

usados sem aspas. Neste caso, compreender a informao guardada no DNA possui semelhanas, mas tambm muitas diferenas, com a compreenso humana.
4

Informaes estas que podem at transmitir uma doena, como no caso do prion.

2. Introduo
O conceito de comunicao celular muito provavelmente nasceu com a teoria celular e a aceitao de que o sistema nervoso central (CNS Central Nervous System) no era um retculo, mas sim, composto por clulas interligadas, como proposto por Ramn y Cajal no final do sculo passado (Ramn y Cajal, 1937). O conceito de que o rgo cuja especialidade a comunicao composto de clulas separadas implicava em uma comunicao celular intensa. As descobertas de neurotransmissores, como a acetilcolina e de sinalizadores endcrinos, como a adrenalina ou a insulina, mostraram que a sinalizao celular era uma regra para as clulas dos organismos pluricelulares (Alberts et al. 1994).

2.1. Parte 1. Transduo de sinal

Organismos multicelulares podem ser considerados sociedades celulares extremamente complexas, na qual cada indivduo (clula) possui funes especficas e dinmicas, objetivando o bem do organismo e no o de cada clula. Para que estas funes possam ser desempenhadas adequadamente, clulas recebem e emitem uma grande variedade de informaes, desde o contato com as clulas vizinhas at sinalizadores qumicos sintetizados por outras clulas. Inicialmente, as vias de transduo de sinal eram descritas como sendo lineares e compostas de poucos componentes: geralmente um receptor, um segundo mensageiro e um efetor, responsvel pela regulao (fosforilao) de um grupo restrito de substratos. Ou seja, desde o recebimento do sinal no receptor at a regulao dos substratos acreditava-se que existia uma ligao direta com a funo de transferncia de informao, como visto na Figura 1A. Porm, estudos posteriores revelaram vias de sinalizao extremamente complexas, com inmeros pontos de integrao, retroalimentao e redundncia. Esta complexidade tornou impossvel a viso de que estas vias possuam como nica funo a transmisso de sinais, tornando-as muito mais integradoras de informaes envolvidas na compreenso de uma informao qumica composta de concentra5

es variadas de uma grande quantidade de sinais (Figura 1B) (Bhalla, Iyengar, 1999).

A
R SM E

Figura 1. Mecanismos de transduo de sinal intracelular.

Mecanismos de transduo de sinal como mensageiros de sinais simples (A), ou integradores, capazes de compreender informaes de vrios sinais simultaneamente (B). Ativao: Inibio: R: Receptor, SM: Segundo Mensageiro, E: Efetor, S: Substratos.

2.1.1. Componentes
Os componentes celulares responsveis pela transduo de sinal so basicamente constitudos de molculas pequenas (como o cAMP), ons (como o Ca2+) e protenas (como canais inicos, protenas de reconhecimento e enzimas). Como mostrado na Figura 1A, o mecanismo de sinalizao bsico constitudo de pelo menos trs componentes, quais sejam, o receptor, o segundo mensageiro e o efetor. Atualmente, principalmente considerando a complexidades das vias de sinalizao (Figura 1B) esta classificao funcional foi deixada de lado, sendo que, com exceo dos receptores, muito difcil classificar os outros componentes das vias de sinalizao como segundo, terceiro, quarto mensageiros ou efetores, principalmente porque o papel de um determinado sinalizador pode desempenhar papis distintos em duas via de sinalizao.

2.1.1.1. Receptores
Receptores so protenas de membrana capazes de se ligar a um transmissor na parte extracelular e permitir a modificao de algum componente intracelular. Isto , os receptores so os pontos de entrada da informao na clula. Existem trs grandes grupos de receptores (Alberts et al. 1994): F Ionotrpicos: receptores ligados a canais inicos que, quando ativados, permitem a passagem de ons como o Na+, Ca2+ ou Cl-. So exemplos destes receptores os subtipos de receptores glutamatrgicos AMPA (DL - -Amino3-hydroxy-5-Methylisoxazolepropionic Acid) cos P2X (permeveis a Na+ e Ca2+). F Metabotrpicos: ligados protena G, uma protena de membrana que pode regular a atividade de vrias protenas, como adenilil ciclase (AC - Adenylyl Ciclase), fosfolipase C (PLC - Phospholipase C) e canais inicos. Nesta classe esto includos os receptores de serotonina, -adrenrgicos, purinrgico P2Y, glutamatrgico metabotrpicos (mGluR Metabotropic Glutamate Receptor), entre outros; F Receptores com atividade enzimtica: nestes, a ligao do transmissor induz a uma atividade enzimtica intracelular, geralmente a fosforilao em resduos de tirosina. So exemplo os receptores para fatores de crescimento, como o EGFR, FGFR (Epidermal Growth Factor Receptor, Fibroblast Growth Factor Receptor respectivamente). (permevel a Na+), NMDA (permevel a Na+ e Ca2+), GABA (permevel a Cl-) e os receptores purinrgi-

2.1.1.2. Mensageiros
A funo dos mensageiros intracelulares transmitir o sinal do receptor da membrana a diversas protenas, que faro com que um determinado sinal possa ser sentido pela clula. Historicamente, estes mensageiros foram denominados segundos mensageiros, pois eram produzidos em resposta a primeiros mensageiros (como a adrenalina), sendo que os segundos mensageiros clssicos, Ca2+ e cAMP, ativam diretamente quinases (os efetores). Um esquema com alguns mensageiros intracelulares como o Ca2+, inositol-1-4-5-trifosfato (IP3 7

Inositol-1,4,5-Triphosphate) diacilglicerol (DAG Diacylglycerol ), juntamente com alguns efetores ativados por estes mostrado na Figura 2.

Receptor Metabotrpico com protena G

Receptor com atividade enzimtica VSCC

Receptor Ionotrpico

PLC

AC

cAMP IP3 DAG

PKA Ca2+ Na+

CaMK
Retculo Endoplasmtico

PKC

Figura 2. Representao esquemtica de alguns mensageiros intracelulares.

PLC: Phospholipase C; AC: Adenylyl Clyclase; cAMP: Cyclic Adenosine Monophosphate; PKA: Protein Kinase A; PKC: Protein Kinase C; CaMK: Ca2+/CaM dependent Kinase; VSCC: Voltage-sensitive Ca2+-channel.

2.1.1.2.1. Protena G
As protenas G so compostas por trs subunidades proticas, (, e ) e transmitem a informao dos receptores metabotrpicos para diversos componentes de vias de sinalizao como ACs, fosfolipases (como a PLC), canais de Ca2+ e canais de K+, entre outros. A ligao do transmissor ao receptor faz com que a subunidade da protena G troque GDP por GTP, produzindo a dissociao da subunidade do dmero (Figura 3). Desta forma, estes dois componentes podem-se difundir livremente pela superfcie interna da membrana regulando a atividade das protenas citadas anteriormente. A subunidade possui uma atividade GTPsica intrnseca, catalisando a quebra do GTP em GDP, levando, desta forma, a sua autodesativao. A ativao e desativao das pro-

tenas G pode ser intensamente regulada, tanto por protenas que catalisam a troca de GTP por GDP, ou protenas que alteram a velocidade de hidrlise do GTP (Fisher, Agranoff, 1999) (Figura 3). GEFs

Inativa G-GDP G-GTP Ativa

GAPs

GIPs

Figura 3. Ciclo regulatrio da subunidade da protena G.

Fatores de troca de nucleotdeos de guanina (GEF Guanine nucleotide exchange factors) catalisam a troca de GDP por GTP, levando a ativao da protenas G enquanto que as protenas ativadoras de GTPase (GAPs GTPase activating proteins) e as GIPs (GTPase-inhibiting proteins) regulam a velocidade de hidrlise do GTP (Adaptado de Nestler, Duman, 1999).

At recentemente, 23 subtipos de subunidades das protenas G foram descritos (Gudermann et al. 1997). Estes subtipos podem ser divididos em Gs, Gi, Gq e G12 baseado nas semelhanas na seqncia, seletividade de efetores e sensibilidade a inibidores. Os subtipos Gs e Gi foram tradicionalmente descritos como ativadores e inibidores da AC, respectivamente. Duas toxinas bacterianas se mostraram ferramentas fundamentais para o estudo das protenas G. A toxina da clera, inibe a atividade GTPsica da famlia da protena Gs, mantendo-a na forma ativa, enquanto que a toxina pertussis (PTx Pertussis Toxin) inibe a troca de GTP por GDP na famlia da protena Gi, mantendo esta protena G na sua forma inativa (Nestler, Duman, 1999).

Inicialmente, acreditava-se que a nica funo das subunidades era a de regular a subunidade , que era responsvel pela regulao de enzimas como a AC e a PLC. No entanto, as subunidades se mostraram sinalizadores extremamente dinmicos. Por exemplo: G pode inibir canais de Ca2+ dependentes de voltagem, inibir calmodulina (CaM Calmodulin), levando ao bloqueio da CaMKII, ativar AC2 e 4 (na presena de G), PLC3, canais de K+ e inibir a AC1 (Zamponi et al. 1997 e Chen et al. 1995a).

2.1.1.2.2. Ca2+
O Ca2+ um importante sinalizador celular, que foi historicamente classificado como segundo mensageiro. A concentrao de Ca2+ intracelular em condies basais muito reduzida (na faixa de nM) enquanto a concentrao externa est na faixa de mM, possibilitando um rpido aumento da concentrao intracelular com a abertura de canais na membrana celular. Estes canais podem ser tanto abertos por transmissores, como o caso do receptor purinrgico P2X, como pelo potencial, como o caso dos canais de Ca2+-dependentes de voltagem (VSCC Voltage Sensitive Ca2+-Channels), ou por ambos, como o caso do receptor glutamatrgico do tipo NMDA, que por ser regulado tanto pela presena de glutamato como pelo potencial, funcionando como um detector de freqncia da sinalizao sinptica (Alberts et al. 1994). Outra forma de aumento de Ca2+ intracelular a liberao de Ca2+ dos estoques intracelulares. Uma das principais via de liberao de Ca2+ dos estoques intracelulares a clivagem de fosfatidil inositol, com a produo de IP3, que pode se ligar a receptores do retculo endoplasmtico liberando Ca2+ destes compartimentos, permitindo que um receptor metabotrpico ligado a PLCs possa elevar a concentrao intracelular de Ca2+ (Putney, 1999). Ca2+ possui inmeros efetores intracelulares, como as CaMKs, a fosfatase CaN (Calcineurin), ACs e GEFs, sendo que a maioria destes efeitores so regulados pela protena ligadora de Ca2+ denominada calmodulina (CaM), que sofre uma mudana conformacional ao se ligar ao Ca2+, expondo um domnio hi-

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drofbico que pode interagir com vrios domnios presentes em protenas reguladas por Ca2+/CaM. A sinalizao mediada por Ca2+ bastante complexa na maioria da clulas, considerando o grande nmero de protenas reguladas por este on e as diversas formas de aumento na concentrao intracelular. Finkbeiner, Greenberg, (1997) revisaram os diferentes efeitos do aumento de Ca2+ em diversas regies de neurnios, sendo que o efeito que o Ca2+ induz sobre a expresso gnica dependente tanto da intensidade como do local no qual seu aumento na concentrao ocorre, sendo a cascata da ERK uma das vias responsveis pela integrao destes sinais (Bito et al. 1997 e Rusanescu et al. 1996). interessante mencionar que a sinalizao mediada pelo Ca2+ possui uma particularidade nos astrcitos, que a capacidade de se difundir por uma grande quantidade de clulas atravs das junes gap (Verjhratsky, Kettenmann, 1996).

2.1.1.2.3. ACs/cAMP
O cAMP o outro segundo mensageiro clssico, sendo responsvel pelos efeitos de muitos transmissores que ativam receptores metabotrpicos ligados protena Gs, como por exemplo, vrios receptores 5-hidroxitriptamina (5-HT - 5Hydroxytryptamine) (subtipos 5-HT5 e 5-HT6 - item 2.3.3.2) e -adrenrgicos (item 2.3.3.1). Esta via de sinalizao tem uma importncia muito grande, pois alm de ser a primeira sinalizao metabotrpica a ser identificada, tambm foi responsvel pela descoberta das protenas G (a partir da qual foi desenvolvida a tradicional viso de protenas Gs e Gi, estimulatrias e inibitrias da AC, respectivamente) (Alberts et al.1994). A regulao das AC bastante varivel, representando um importante ponto de integrao de sinalizao (Cooper et al. 1995). cAMP produzido pelas ACs e degradado por fosfodiesterases (PDE Phosphodiesterase). So conhecidos nove genes diferentes para ACs e sete famlias de PDEs, sendo que em cada caso ainda existem diversas variantes de processamento (splice variants) indicando a complexidade e importncia destes mecanismos de sinalizao (Xia, Storm, 1997, Cooper et al. 1995 e Burns et al. 1996).

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O diterpeno forscolina (forskolin) uma poderosa ferramenta no estudo da sinalizao do cAMP, pois esta molcula permevel membrana, estimula todos os subtipos de ACs (com exceo da ACIX, recentemente clonada, Cooper et al. 1995). Estudos estruturais da AC ligada forscolina mostraram que esta molcula promove a ligao de monmeros de AC formando o tetrmero ativo. A ligao da forscolina ocorre bem prximo ao stio cataltico, no sendo excluda uma participao efetiva da forscolina da catlise, alm da promoo da tetramerizao (Cooper et al. 1995).

2.1.1.2.4. Fosfolipdio e Inositol Fosfato

Os lipdios so os principais componentes das membranas celulares, possuindo as mais diversas funes. Muitos lipdios assimetricamente concentrados na parte citoplasmtica da membrana celular, possuem importantes funes na sinalizao celular. Vrios grupos polares ligados a lipdios esto envolvidos em vias de sinalizao, entre os quais podem ser destacados a serina, a colina e o inositol e seus derivados fosfatados. Um dos principais mecanismos de sinalizao envolvendo lipdios a clivagem de fosfatidil inositis de membrana para a formao de DAG e IP3 por PLCs. IP3 pode se ligar a receptores do retculo endoplasmtico, liberando Ca2+ destes estoques, como visto anteriormente, enquanto que DAG pode ativar diversas isoformas de PKCs (Toker, 1998). At o momento foram caracterizadas trs famlias de PI-PLCs, isto , fosfolipases C que clivam fosfatidil inositis (PI-PLC, e ). Estes trs subtipos possuem domnios homlogos de plecstrina (PH Pleckstrin Homology), provavelmente para poder se ligar a membranas ricas em fosfatidil inositis. A PLC, alm do domnio PH, possui domnios SH2 e SH3 (Src Homology), podendo conseqentemente ligar-se a fosfotirosinas e a domnios ricos em prolina. Vrios receptores de fatores de crescimento, como por exemplo PDGFR, (Platelet Growth Factor Receptor) e FGFR possuem stios de ligao para a PLC (Huang et al. 1995 e Pawson, Saxton, 1999). As PLC so principalmente ativadas pela famlia de protenas Gq (q, 11, 14, 16). Subunidades e tambm podem ativar as PLC, o que provavel12

mente o mecanismo pelo qual receptores ligados protena Gi ativam as PLC. Interessantemente, a PLC funciona como uma GAP para a Gq, representando um mecanismo de dessensibilizao desta via de sinalizao (Singer et al. 1997). PI-PLC possui 4 motivos EF hand ligadores de Ca2+, sendo que a deleo deste domnios inibe a atividade cataltica, indicando uma regulao desta PLC por Ca2+(Singer et al. 1997). Outro tipo de PLC reconhece especificamente fosfatidilcolina (PC-PLC Phosphatidylcholine-specific Phospholipase), podendo transformar5 linhagens de fibroblastos sendo esta transformao revertida por transfeco com dominantes negativos de PKC e cRaf-1, indicando que a PC-PLC pode ativar estas duas enzimas e com isto levando transformao celular (Bjorkoy et al. 1995). Fosfolipase D (PLD Phospholipase D) cliva fosfolipdios produzindo PA (phosphatidic acid), que pode ativar vrias enzimas, como PKC e , PLC e cRaf-1 (Singer et al. 1997).

2.1.1.3. Efetores
As modificaes ps-traducionais mais freqentes nas protenas a fosforilao de resduos de serina, treonina e tirosina. Protenas quinases catalisam a transferncia de grupos fosfato do ATP para o substrato protico, enquanto que protenas fosfatases catalisam a reao de hidrlise do fosfato. Estas duas classes de enzimas podem ser consideradas os efetores das vias de sinalizao, ou seja, os componentes que produzem o efeito final na clula6.

2.1.1.3.1. Quinases
Considerando o grande nmero de protenas quinases identificadas (Hunter et al. 1995) sero discutidos aqui somente as quinases mais bem estudadas e as que so relevantes para o presente trabalho. A PKA, PKC e CaMK foram as primeiras quinases identificadas, justamente por serem ativadas pelos
5

Crescimento independente de acoramento, o que uma transformao utilizada para determinar a potencialidade de induo de transformao oncognica. 6 Geralmente as vias de sinalizao so considerados at a ativao de quinases, fosfatases ou fatores de transcrio, sendo muito difcil determinar o efetor final real.

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segundos mensageiros tradicionais. Atualmente, foram identificadas inmeras isoformas de cada uma destas quinases, em alguns casos com particularidades bastante acentuadas entre estas isoformas. 2.1.1.3.1.1. Protena Quinase C (PKC) As protenas quinases C (PKCs) so uma famlia heterognea de quinases dependentes de fosfolipdios que podem ser divididas em trs grandes grupos, baseadas no mecanismo de ativao e na estrutura (Nishizuka, 1995 e Jaken, 1996). As PKCs convencionais (, , , ) requerem a presena de fosfatidil serina, DAG e Ca2+, sendo as PI-PLC as principais responsveis pela sua ativao. As PKCs novas (novel) (, , , , ) so independentes de Ca2+ e ativadas somente por DAG, sendo que a fosfolipase envolvida na ativao deste subtipo parece ser a PLD. Os mecanismos de ativao das PKCs atpicas ( e ) ainda no esto bem estabelecidos, mas no envolvem DAG e/ou Ca2+, sendo que alguns trabalhos descreveram que podem ser ativadas por fosfatidil serina (Toker, 1998 e Nishizuka, 1995). steres de forbol (phorbol esters) como o PMA (4- phorbol 12-myristate13-acetate) so fortes ativadores das PKCs ativadas por DAG, ou seja, os subtipos convencionais e novos. Os steres de forbol so conhecidos por sua capacidade de induzir a proliferao e transformao de clulas (Weinstein, 1985), sendo a maioria dos seus efeitos mediados pelas PKCs (Nishizuka, 1995), embora stios de ligao funcionais dos steres de forbol tambm tenham sido descritos em outras protenas, como por exemplo a Ras-GRP (Guanine-releasing protein) (Tognon et al. 1998). Os steres de forbol so muito utilizados em estudos de transduo de sinal, pois, alm de ativarem as PKCs, podem ser utilizados para induzir a degradao e desativao (down regulation) das PKCs. Tratamentos longos (normalmente 16 horas) com steres de forbol fazem com que as PKC reguladas por DAG sejam levadas para a membrana, na qual, depois de um certo tempo, so defosforiladas e degradadas por fosfatases e proteases envolvidas no trmino da sinalizao mediada por PKC (Borner et al. 1989 e Millward et al. 1999). Por 14

exemplo, tratamento com 100nM de PMA por dois dias levou a completa degradao dos subtipos PKC , , (Johnson et al. 1995). Desta forma, tratamentos curtos com steres de forbol ativam as PKCs, enquanto que tratamentos longos bloqueiam as sinalizaes mediadas pelas PKCs. Vrios inibidores de PKC so disponveis comercialmente, sendo que muitos parecem apresentar uma especificidade questionvel. O alcalide microbiano estaurosporina serviu como base para diversos compostos utilizados atualmente, entre os quais se encontram o GF109203X (Toullec et al. 1991) e o Ro 31-8220 (Davis et al. 1989). 2.1.1.3.1.2. PIKs Fosfatidil inositol-3-OH quinases (PI3K Phosphatidyl inositol-3-OH Kinase) so quinases que fosforilam a posio 3 de fosfatidil inositis de membrana, produzindo principalmente fosfatidil inositol-3,4-P2 e fosfatidil inositol3,4,5-P3, que so ligantes para os domnios PH de protenas como PLC, certos tipos de GEFs e alguns subtipos de PKCs (Leevers et al. 1999). Toker et al. (1994) mostraram que os fosfatidil inositis mencionados anteriormente so fortes ativadores dos subtipos de PKC , e . Considerando que as PI3Ks podem ser ativadas por Ras (Rodriguez-Viviana et al. 1994) e pelas subunidades da protena G (Lopez-Ilasaca et al. 1997) estas enzimas representam um importante ponto de ligao entre as sinalizaes ativadoras da protena G, Ras e a PKC e seus inmeros substratos (Fruman et al. 1998). 2.1.1.3.1.3. CaMKs As CaMKs so uma famlia de quinases ativadas pela ligao de Ca2+/CaM. Alm desta ativao, a CaMKII possui uma forma regulatria peculiar, que consiste da sua autofosforilao quando na presena de Ca2+/CaM, tornando a sua atividade independente da presena deste mensageiro, o que parece estar envolvido no processo molecular de memria (Dosemesi, Albers, 1996 e Lisman, Goldring, 1988).

15

2.1.1.3.1.4. PKA A protena quinase regulada por cAMP formada por quatro subunidades, duas catalticas e duas regulatrias, sendo que as subunidades regulatrias possuem um pseudosubstrato, que se liga alostericamente s subunidades c atalticas, inibindo-as. Com a ligao de cAMP s subunidades regulatrias, estas se desligam do tetrmero, permitindo com que as subunidades catalticas fosforilem os seus substratos em seqncias consenso do tipo R-R/K-X-S*/T*, no qual XX qualquer aminocido, enquanto que o asterisco indica a posio de fosforilao (Walaas, Greengard, 1991 e Kennelly, Krebs, 1991).

2.1.1.3.2. Fosfatases
Protenas fosfatases hidrolisam fosfato de substratos proticos, tendo portanto uma funo fundamental na reversibilidade dos sinais ativados pelas quinases, o que certamente no implica que as fosfatases no possam ter funes ativadoras. Funcionalmente, as fosfatases podem ser divididas em serina/treonina fosfatases e tirosina fosfatases, sendo que at recentemente foram identificados aproximadamente 200 protenas serina/treonina fosfatases e 100 tirosina fosfatases (Oliver, Shenolikar, 1998). 2.1.1.3.2.1. Protenas Ser/Thr Fosfatases As protenas Ser/Thr fosfatases foram classificadas de acordo com suas caractersticas bioqumicas em tipo 1 e 2, sendo que o tipo 2 foi subseqentemente dividido em PP2A, PP2B e PP2C, sendo que clonagem destas protenas revelaram que elas possuem seqncias conservadas (Oliver, Shenolikar, 1998). Baseado em semelhanas nas seqncias, vrias fosfatases foram identificadas, como por exemplo PP4 e PP5. No entanto, estimativas indicam que fosfatase 1 (PP1 - Protein Phosphatase 1) e fosfatase 2A (PP2A Protein Phosphatase 2A) so responsveis por at 90% da atividade fosfatsica em clulas de mamferos (Oliver, Shenolikar, 1998). Embora diversas formas de regulao possam atuar sobre as fosfatases, como expresso, localizao subcelular, fosforilao e mensageiros intracelula-

16

res, as principais formas de regulao parecem ser mediadas por inibidores proticos, cujo efeito regulado por expresso e fosforilao. Inibidor-1, inibidor2, DARPP-32 so reguladores de PP1, enquanto que inibidor-12A e inibidor-22A so inibidores especficos da PP2A (Oliver, Shenolikar, 1998). 2.1.1.3.2.2. Protenas Tyr Fosfatases (PTPs) As protenas Tyr fosfatases (PTP Phosphotyrosine Phosphatase) possuem uma alta atividade basal, em torno de 10 a 1000 vezes maior do que a atividade basal das tirosinas quinases, fazendo com que os nveis de fosfotirosina permaneam bastante reduzidos em clulas em condies basais. Esta grande diferena tambm faz como que a ativao das quinases e a inibio das fosfatases seja uma excelente forma de ampliao da sinalizao (Lau et al. 1999). Estas fosfatases podem ser transmembrana, isto , receptores com atividade fosfatsica e tambm protenas no-transmembrana. As PTPs so reguladas principalmente atravs da fosforilao e da localizao celular. Por exemplo, muitas PTPs possuem domnios SH2 (item 2.1.1.4) que localizam estas fosfatases em complexos proticos ricos em fosfotirosinas. Parece que estas ligaes, alm deste efeito de aproximarem as fosfatases dos seus substratos, tambm podem funcionar como ativadores alostricos. 2.1.1.3.2.3. Protena Ser/Thr/Tyr Fosfatases Estas fosfatases defosforilam tanto tirosina como treonina e serina, denominadas tambm de fosfatases duplo-especficas (Dual-specific

phosphatases). Os principais substratos destas fosfatases so quinases ativadas por fosforilao em tirosina e treonina, como as quinases envolvidas na regulao do ciclo celular cdc2, ou as MAPKs (item 2.1.2.2.8 e Neel, Tonks, 1997).

2.1.1.4. Protenas de ancoramento ou adaptadoras

Para o funcionamento e principalmente para a especificidade das vias de sinalizao, protenas de ancoramento ou adaptadoras, capazes de formar, transitoriamente, imensos complexos proticos, so fundamentais. As interaes entre protenas envolvidas na transduo de sinal so geralmente mediadas por 17

domnios ligadores, que formam unidades compactas, com os N e C terminais prximos, possibilitando a sua insero em protenas sem interferir muito na sua estrutura. Estes domnios so encontradas nas mais diversas protenas, como por exemplo quinases, fosfatases, fatores de transcrio e protenas do citoesqueleto (Pawson, Scott, 1997). Um dos domnios ligadores mais descritos foi encontrado primeiramente no oncogene Src (Rous sarcoma virus). O protooncogene correspondente uma tirosina quinase que possui dois domnios ligadores, que foram denominados SH2 e SH3. Domnios SH2 so formados de 100 aminocidos, e tm a caracterstica de se ligar a resduos de fosfotirosina (pY Phosphotyrosine). Domnios SH2 foram encontrados nas mais diversas protenas, como as enzimas GTPases, fosfolipases, quinases e fosfatases ou protenas adaptadoras. Considerando isto, necessrio que a ligao dos domnios SH2 nas pY sejam especficos para uma determinada seqncia. Os trs aminocidos localizados aps (direo C-terminal) da pY desempenham um papel fundamental para esta especificidade. Um outro domnio importante na sinalizao celular o SH3, que se liga a seqncias ricas em prolinas, constitudas geralmente de uma seqncia de 9 aminocidos nas quais as posies 4, 5 e 7 so invariavelmente ocupadas por prolinas (Pawson, Scott, 1997). As protenas de ligao regulam protenas envolvidas em vias de sinalizao principalmente de duas formas: 1. Atravs da localizao em um local especfico na clula, co-localizando-as com seus reguladores ou substratos; 2. Atravs da induo de mudanas conformacionais. Provavelmente o mecanismo de regulao mediado por protenas de ligao/adaptao mais estudado a ativao de Ras por receptores de fatores de crescimento, no qual os domnios SH2 e SH3 da Grb2 e Sos trazem Ras para a membrana na qual esta pode ativar cRaf-1 (ver item 2.1.2.2.2). Muitos outros domnios ligadores foram descritos at o momento, como PH, PTB, EH, PDZ, EVH1 e WW com seqncias de reconhecimento distintas, mas com caractersticas funcionais semelhantes (Sudol, 1998).

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2.1.2. As cascatas das MAPKs

MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases ou Microtubule Associated Protein Kinases) so formadas por trs famlias de quinase, MAPK, MAPKK e MAPKKK. Embora vrias quinases possam regular as MAPKKK e inmeras outras possam ser reguladas pelas MAPKs, produzindo cascatas de 5 ou mais quinases, estes trs nveis de quinases so conhecidos como cascata das MAPKs. Em cada um dos nveis existem vrios subtipos, sendo que trs cascatas razoavelmente independentes tm sido denominadas ERK, c-jun quinase (JNK - cJun Kinase) e p38, como visto na Figura 4.
Ativadores Fatores de Crescimento Agonistas GPCR Fatores de Crescimento, Estresse. Estresse

MAPKKK

cRaf-1, B-Raf, A-Raf, Mos

MEKK1, 2, 3, Tpl-2

MEKK4-5 DLK

TAK1, ASK1, MLK3

PAK

MAPKK

MEK1 MEK2

MEK5

MEK 4 MEK7

MEK3 MEK6

MAPK

ERK1 ERK2

ERK3 ERK4 ?

ERK5

JNK1, JNK2 JNK3

p38, p38 p38, p38

Substratos

Sos, Elk1, Rsk PLA2, EGFR STATS, Ets1, Sap1a, c-Myc, CREB

MEF2C

c-jun, ATF-2, Elk1, p53, DPC4

MAPKAPK2,

ATF2 Elk1, Chop Max.

c-jun

Hsp27

Efeitos Celulares

Crescimento, sobrevivncia diferenciao

Crescimento, diferenciao Produo de citocinas sobrevivncia, apoptose apoptose

Figura 4. As diversas cascatas das MAPKs, seus ativadores e seus efeitos. Adaptado de Garrington, Johnson, (1999).

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Um caracterstica interessante destas cascatas a alta especificidade e baixa variabilidade na parte intermediria (MAPKK), sendo que para cada cascata existem somente duas MAPKKs, que por sua vez so totalmente especficos para as MAPK da sua cascata. Por exemplo, os dois nicos substratos identificados at o momento para a MEK1 so ERK1 e 2. Por outro lado, as duas extremidades da cascata possuem inmeras formas de integrao dos sinais, tanto devido ao grande nmero de componentes, ou as diversas formas de regulao. Pelo menos oito quinases podem ativar MEK1, com a mais variada regulao e distribuio. No nvel dos substratos de ERK, tambm existe uma grande variedade de protenas e quinases (Schlessinger et al. 1998). Garrington, Johnson (1999) revisaram estudos que mostram que as protenas que compem uma cascata especfica possuem vrias protenas de ligao e ancoramento que as mantm em proximidade fsica, mantendo distantes as protenas de outras cascatas. Estas protenas parecem ser, em parte, responsveis pela especificidade de cada uma das cascatas. A Figura 4 mostra as cascatas das MAPKs. Considerando a grande variabilidade da nomenclatura utilizada na literatura importante enfatizar que neste trabalho o termo MAPK refere-se famlia de protenas que envolve as ERKs, JNKs, p38s. Da mesma forma, as cascatas das MAPKs referem-se a todas as cascatas mostradas anteriormente, enquanto que a cascata da ERK indica somente Raf (ou MEKK1/2/3), MEK1/2 e ERK1/2.

2.1.2.1. Eventos celulares regulados pelas MAPKs

As cascatas das MAPKs esto envolvidas em diversos eventos celulares, entre os quais podem ser destacados: F Proliferao celular: o mecanismo parece envolver expresso da ciclina D1 e a represso do inibidor de ciclo celular p27Kip mediada pela ERK (Lavoie et al. 1996 e Kerkhoff, Rapp, 1998). As MAPKs tambm esto envolvidas na sinalizao que inibe a proliferao celular, sendo que a ativao da p38 e atividades muito elevadas da cRaf-1 (e provavelmente ERK) aumentam a expresso de protenas inibidoras do ciclo celular como p21cip1 (Sewing et al. 1997, Kerkhoff, Rapp, 1998 e Lavoie et al. 1996).

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F Apoptose: A ativao da JNK induz apoptose, enquanto que a ativao da ERK bloqueia o processo apopttico em linhagens feocromocitoma (PC12 Pheochromocytoma Cells) (Xia et al. 1995), o que foi confirmado pelo efeito supressor da ativao da ERK por FGF-2 da apoptose induzida por fator de necrose tumoral (TNF - Tumor Necrosis Factor ) (Gardner, Johnson, 1996). A p38 tambm parece ser uma das responsveis pela apoptose induzida pela retirada de fatores de crescimento (Kummer et al. 1997); F Transcrio de genes: Vrios fatores de transcrio podem ser regulados pelas MAPKs, como a protena ligadora ao elemento regulado por cAMP (CREB cAMP Regulated Element Binding Protein), atravs de uma quinase ativada pela ERK denominada Rsk2 (Xing et al. 1996). ERK e JNK podem fosforilar diretamente a Elk1, podendo levar induo da expresso da cfos, integrando desta forma os sinais destas duas cascatas (Karin, 1995 e Whitmarsh et al. 1995). JNK tambm pode fosforilar e ativar cjun, que forma, juntamente com cfos, o ativador transcripcional AP1 (Gupta et al. 1995); F Integrao de sinais: as MAPK, por serem ativadas pelos mais diversos mecanismos de transduo de sinal, so importantes integradoras de sinal, como por exemplo a mediao de muitos efeitos do Ca2+ em neurnios (Finkbeiner, Greenberg, 1996); F Diferenciao celular: ativaes com cinticas de desativao lenta podem induzir diferenciao em PC12 (Marshall, 1995 e 1998) e megacaricitos (Rache et al. 1997); F Plasticidade neuronal: Tanto estudos com deleo de genes (KO knockout) bem como utilizando inibidores mostraram o envolvimento das MAPKs em eventos de plasticidade como potenciao de longa durao (LTP long-term potentiation) e memria (Impey et al. 1999 e Walz et al. 1998).

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2.1.2.2. A cascata da ERK.

Embora a cascata da ERK seja ativada por uma grande variedade de sinais, a ativao por fatores de crescimento tem sido melhor caracterizada, sendo portanto utilizada a seguir para a descrio dos mecanismos envolvidos na sua regulao.

2.1.2.2.1. Receptores com atividade tirosina quinsica (RTKs)

RTKs so protenas transmembrana que possuem um stio de ligao para o fator de crescimento no lado extracelular e uma atividade quinsica (geralmente tirosina quinsica) na parte intracelular. O fator de crescimento induz a dimerizao de RTKs, permitindo a autofosforilao intermolecular em resduos de tirosina especficos. Estas fosfotirosinas podem ser reconhecidas por vrias protenas, ativando com isto outros componentes de sinalizao (Alberts et al. 1994). A Figura 5 mostra o EGFR fosforilado ligado a protenas adaptadoras. Por motivos didticos, somente uma fosfotirosina mostrada no EGFR, mas normalmente os resduos de tirosina fosforilveis so inmeros, como por exemplo o PDGFR, que possui 7 tirosinas fosforilveis nas quais podem se ligar entre outros Grb2, Gap, Shc, PI3K e PLC (Pawson, Saxton, 1999).

2.1.2.2.2. Protenas adaptadoras.

A localizao de uma determinada protena ou molcula sinalizadora fundamental para a sua funo. Existem muitas protenas cuja nica funo ligarse a duas ou mais protenas para prend-las em um certo local da clula, ou simplesmente uni-las. A autofosforilao dos RTKs possibilita a ligao de protenas com domnios SH2 ou PTB (phosphotyrosine binding). Por exemplo, a ativao de EGFR leva fosforilao de resduos que so reconhecidos por uma protena adaptadora denominada Grb2.

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Esta protena possui dois domnios

EGF

SH3, que possuem grande afinidade por

#

A
-P * Sos
# GDP

seqncias de prolinas, presente entre outros, na protena Sos. Estes domnios proticos com afinidades especficas fa-

Ras

EGFR

Grb2
GTP

zem com que a fosforilao do EGFR seja o sinal para a montagem de um complexo protico responsvel por trazer Ras membrana celular ativando-a atravs da catlise da troca de GDP por GTP (item 2.1.1.2.1). Outros RTKs utilizam outras protenas adaptadoras,
TrkA
GF

NGF

B
#

-P

-P *
#

Sos
GDP

Ras

Shc Grb2
GTP

Figura 5. Modelo para a ativao de Ras por EGF (A) e por NGF (B).
* Domnios ligadores de fosfotirosina do tipo SH2 e; # domnios ligadores de seqncias de prolina do tipo SH3.

como no caso da TrkA (receptor de NGF), que utiliza uma molcula adaptadora denominada Shc, que por sua vez pode ligar-se Grb2 com isto levando ativao de Sos por Ras (Denhardt, 1996), ou o FGFR que utiliza a FRS-2 (Kouhara et al. 1997 e Figura 5B).

Adaptado de Denhardt, (1996).

2.1.2.2.3. Ras
Ras faz parte de uma superfamlia de protenas ligadoras de nucleotdeos de guanina de 20-25 kDa, semelhantes s subunidades das protenas G. A Ras foi descoberta primeiramente como genes transformantes nos vrus sarcomas, sendo considerada um marco na oncologia molecular. O oncogene, uma Ras sem atividade GTPsica, isto , permanentemente ativa, encontrado em aproximadamente 30% de tumores (Alberts et al. 1994). Uma amostra da importncia da sinalizao mediada pelas Ras o impressionante grau de conservao ao longo da evoluo, mostrado pela total igualdade entre a Ras humana e de camundogo e pela funcionalidade da Ras humana em leveduras e viceversa (Malumbres, Pellicer, 1998).

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A famlia da Ras possui um domnio CAAX (sendo A = resduo aliftico e X = qualquer aminocido) na sua parte C-terminal, que pode ser farnesilado na cistena. Alm disto, algumas Ras tambm so transformados com grupos palmitoil, permitindo com que estas protenas sejam reversivelmente translocadas para a membrana. O mecanismo bsico da regulao de atividade das Ras similar ao das subunidades da protena G (Figura 3) e envolve pelo menos dois tipos de protenas, as GEFs e as GAPs. A Ras inativa se encontra ligada GDP, sendo que GEFs catalisam a troca de GDP por GTP, levando a uma modificao conformacional que expe alguns domnios que podem interagir com vrios efetores, trazendo-os membrana, e/ou regulando a sua atividade alostericamente. Protenas Ras possuem atividade GTPsica intrnseca, que pode ser aumentada pelas GAPs, reguladores negativos da Ras. interessante mencionar que as formas oncognicas da Ras no aparesentam atividade GTPsica intrnseca, e/ou se tornaram inertes regulao das GAPs, fazendo com que esta Ras no possa mais ser inativada (Malumbres, Pellicer, 1998). Segundo Marshall (1996), existem trs principais mecanismos pelos quais Ras regula a atividade de seus efetores: 1. Ativao direta: A interao da Ras-GTP transloca o efetor para a membrana, ativando-o. Exemplos B-Raf e PI3K; 2. Translocao membrana e associao com um ativador: Idem ao a nterior, sendo necessria ainda uma segunda protena que ativa o efetor, como o caso da cRaf-1 que, ao ser levada para a membrana, pode ser fosforilada pela Src e ativada; 3. Translocao membrana e associao com o(s) substrato(s): Neste caso, a ativao se d pela proximidade fsica entre o efetor e seus substratos, obtida com a translocao membrana. 2.1.2.2.3.1. GEFs Considerando a importncia da sinalizao mediada por Ras no surpresa que os mecanismos de regulao sejam vastos e complexos. Uma das prin-

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cipais Ras-GEFs envolvidas na ativao da Ras por RTKs so as Sos. Este conjunto de protenas possuem domnios SH3 com os quais elas se ligam a Grb2, translocando-a desta forma membrana e concentrando-a em relao Ras. O CNS expressa duas Ras-GEFs importantes para a integrao de sinais. A Ras-GRF (Guanyl Nucleotide-Releasing Factor) uma GEF que possui um motivo ligador de calmodulina do tipo IQ, desta forma podendo ser ativada pelo aumento de Ca2+ intracelular (Farnsworth et al. 1995), estando envolvida em processos como LTP e memria (Brambilla et al. 1997). Um terceiro tipo de Ras-GEF amplia ainda mais o potencial de sinalizao e integrao da Ras, pois pode ser ativada pela ligao de DAG e Ca2+, o que parecia ser prerrogativa das PKCs. A Ras-GRP (Guanyl Nucleotide-Releasing Protein) possui um motivo ligador da Ca2+ do tipo EF hand e um stio de ligao de DAG do tipo C1 sendo efetivamente ativada por steres de forbol, indicando que muitos dos efeitos creditados s PKCs podem, na verdade, ser dev ido ativao da Ras atravs da Ras-GRP. Esta protena foi encontrada no timo e no CNS, mais especificamente nas reas CA1 e CA3 do hipocampo (Ebinu et al. 1998 e Togon et al. 1998). 2.1.2.2.3.2. GAPs A atividade GTPsica da Ras muito baixa e GAPs so necessrias para acelerar esta atividade. Seis famlias de GAPs foram caracterizadas at recentemente (Malumbres, Pellicer, 1998), sendo que a sua regulao tambm bastante variada. A principal GAP da Ras a p120GAP, sendo esta tambm regulada pela ligao de SH2 a RTK, desta forma representando uma ligao negativa entre RTK e Ras (Denhardt, 1996). A SynGAP especificamente expressa em densidades ps-sinpticas, possui domnios PH (regulao por PI3K) e C1 (similar ao encontrado nas PKCs) (Kim et al. 1998) e sua atividade inibida por fosforilao pela CaMKII (Chen et al. 1998).

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2.1.2.2.4. Rafs e MEKKs

Em vertebrados foram identificados trs genes de Raf, A-Raf, B-Raf e cRaf1. Estas enzimas possuem trs regies conservadas (CR1-3 Conserved Region), sendo que a CR1 est envolvida na interao com Ras, CR2 possui um dedo de zinco, provavelmente responsvel por ligar a protena ativa me mbrana, enquanto que CR3 responsvel pela atividade enzimtica (Daum et al. 1994). cRaf-1 foi identificada como o primeiro componente de uma cascata de quinases ativada por fatores de crescimento (Kyriakis et al. 1992 e 1993), posteriormente indentificada como a cascata da ERK. Ao contrrio das outras quinases da cascata (MEK e ERK), cuja ativao ocorre pela fosforilao em dois stios, o mecanismo de ativao da cRaf-1 (e das outras MAPKKK) ainda no foi completamente esclarecido, tendo inmeros stios de fosforilao e interaes com outras protenas, como Ras e membros da famlia das protenas 14-3-3. De forma anloga s PKCs, a translocao membrana parece ser uma etapa fundamental para a ativao das Rafs e MEKKs (Morrison, Cutler, 1997). A adio de uma seqncia de ligao membrana na cRaf-1 produziu uma enzima com atividade constitutiva, indicando que a translocao um evento fundamental para a sua ativao. Na ativao fisiolgica, acredita-se que esta translocao mediada pela Ras ativa, que se localiza na membrana e possui uma alta afinidade pela CR1 da cRaf-1 (Leevers et al. 1994 e Stokoe et al. 1994). Outro evento importante na ativao da cRaf-1 a sua oligomerizao, sendo que a oligomerizao induzida por molculas ponte tambm levam a sua ativao (Luo et al. 1996 e Farrar et al. 1996). A cRaf-1 regulada atravs da fosforilao em diversos stios. At recentemente, foram identificados nove stios de fosforilao na cRaf-1, tendo as fosforilaes nestes stios os mais variados efeitos sobre a sua atividade e localizao (Tabela 1), indicando para o papel fundamental da cRaf-1 (e das suas isoformas) na integrao de sinais (Morrison, Cutler, 1997).

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Tabela 1. Stios de fosforilao da cRaf-1 e seus efeitos regulatrios.

Stio Ser43 Ser 259 Ser 259 Thr268/269 Efeito na atividade Inibidor Dessensibilizador Ativador Ativador Quinase PKA, PKG PKC PKC CPK Pak3 Src Ref. ou item Item 2.1.3.3 Schnwasser et al. (1998). Item 2.1.3.3 Yao et al. (1995). King et al. (1998), Diaz et al. (1997). Jelinek et al. (1996), Marais et al. (1995).

Ser338/339 Ativador/Permitir a fosforilao de Tyr340 e 341 Tyr340/341 Necessrio para a ativao por Ras e PKC Ser 497 Ser499 Ser 621 Desconhecido Ativador Inibidor

PKCs PKA

Item 2.1.3.3 Mischak et al. (1996).

CPK - Ceramide-activated protein kinase; Pak3 - p21-activated kinase 3, PKG cGMP-dependent protein kinase.

Um dos passos fundamentais para a ativao da cRaf-1 parece ser a fosforilao dos resduos Tyr 340 ou 341 pela tirosina quinase Src, evento que ocorre na membrana. Marais et al. (1997) observaram que a transfeco de Src oncognica produziu um aumento de 5 vezes na atividade da cRaf-1, enquanto que a transfeco de Src e Ras oncognicas produziu um aumento de 25 vezes na atividade da cRaf-1, indicando a existncia de um sinergismo entre estes dois componentes na ativao da cRaf-1. Quanto a inativao de cRaf-1, existem alguns estudos que mostram a defosforilao dos stios envolvidos na sua ativao. A fosforilao das Tyr340 e 341 pode ser revertida pela tirosina fosfatase PTP-1B sendo que um mecanismo da estabilizao da cRaf-1 ativa parece ser atravs do bloqueio da atividade da PTP-1B sobre Tyr340 e 341 (Jelinek et al. 1996). Parece que cRaf-1, como muitas outras protenas, funciona como parte de um enorme complexo protico funcional de 300 a 500 kDa, formado por duas protenas de choque trmico (Hsp Heat chock protein) (Hsp90 e Hsp50), MEK e 14-3-3 (Wartmann, Davis, 1997). Um importante cofator para o perfeito

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funcionamento da cRaf-1 parece ser a protena 14-3-3, que pode ligar-se tanto cRaf-1 inativa, mantendo-a desta forma, como cRaf-1 ativada, tambm estab ilizando a sua atividade (Tzivion et al. 1998). Alm deste papel na sinalizao e integrao de sinais que levam ativ ao da cascata da ERK, cRaf-1 parece estar envolvida em funes diferentes das desempenhadas na sinalizao ativada por fatores de crescimento. Ziogas et al. (1998) mostraram que durante a mitose, cRaf-1 ativada por um mecanismo independente de Ras, mas dependente da fosforilao nas tirosinas 340 e 341 por Src. Surpreendentemente, a cRaf-1 ativada desta forma est principalmente no citoplasma, contrariando as observaes de que a translocao membrana um passo fundamental para a sua ativao. Alm disto, Ziogas et al. (1998) mostraram que cRaf-1 ativada durante a mitose no ativa MEK e ERK, indicando a existncia de outros substratos regulados por cRaf-1.

2.1.2.2.5. MEK
MEKs so quinases que fosforilam resduos de treonina e tirosina nas MAPKs, possuindo uma grande especificidade pelo substrato, isto , uma determinada MEK ativa somente uma MAPK especfica. A ativao da MEK tambm ocorre pela dupla fosforilao, em resduos de serina pelas Rafs ou MEKKs (Zheng, Guan, 1994). PD098059 uma importante ferramenta para o estudo da cascata das MAPKs pois inibe especificamente MEK1 (Dudley et al. 1995), bloqueando tambm alteraes celulares mediadas pelas MAPKs, como por exemplo diferenciao de PC12 (Alessi et al. 1995 e Pang et al. 1995).

2.1.2.2.6. ERK
ERK fosforilada por MEK nos resduos Thr183 e Tyr 185 (da ERK de 42kDa), sendo a dupla fosforilao necessria para a ativao desta enzima. A atividade da ERK fosforilada em somente um resduo em torno de 1% em relao enzima fosforilada nos dois stios. Estudos com difrao de raio X mostr a-

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ram que a fosforilao, principalmente da Tyr185 retira o domnio inibitrio do stio cataltico, desta forma, ativando a enzima (Zhang et al. 1994). ERK fosforila substratos que possuem uma serina ou treonina seguida de uma prolina. Uma grande quantidade de substratos citoslicos e nucleares da ERK foram identificados at o momento, entre os quais podem ser destacados fosfolipase A2 citoslica (cPLA2 Cytosolic Phospholipase A2) (Lin et al. 1993), protena associada ao microtbulo e os fatores de transcrio Elk, Ets1, Sap1, cMyc, Tal, STAT, Myb e c-Jun (Garrington, Johnson, 1999). Normalmente a ativao da ERK leva a sua translocao ao ncleo sendo esta translocao regulada por outras vias de sinalizao, como por exemplo cAMP/PKA, neste caso podendo levar a um aumento sinergstico da fosforilao de CREB (Impey et al. 1998).

2.1.2.2.7. Quinases ativadas pelas MAPKs

At o momento foram identificadas diversas quinases que podem ser ativadas por ERK, sendo, em muitos casos, aquelas responsveis pelos efeitos destas. Um dos grupos de quinases ativadas pelas ERK mais estudadas so as Rsks (Ras/ERK/pp90 ribosomal S6 kinases) sendo que at o momento foram identificadas 3 isoformas. Foi demonstrado que Rsk responsvel pela fosforilao de SRF, Fos, CREB em resposta a fatores de crescimento como NGF e BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) e em resposta ao aumento de Ca2+ intracelular, sendo que o subtipo Rsk2 parece ser o principal envolvido na fosforilao de CREB-Ser133 (Ginty et al. 1994 e Xing et al. 1996, Finkbeiner et al. 1997, Impey et al. 1998).

2.1.2.2.8. Fosfatases e a desativao da cascata das MAPKs.

Considerando que todos os componentes das cascatas das MAPK so fosforilados e que as fosforilaes desempenham um papel fundamental na regulao da atividade, mecanismos de defosforilao representam importantes formas de regulao da cascata.

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A cascata da ERK regulada por fosfatases especficas, que atuam somente sobre componentes da cascata, como o caso das MAPK fosfatases (MKP - MAPK Phosphatase), ou por fosfatases que possuem muitos outros substratos celulares, como a PP2A e a PP1 (Tabela 2). Como na grande maioria dos casos, as fosfatases envolvidas em um sistema de fosforilao so muito menos estudadas do que as quinases envolvidas, sendo que a cascata das MAPKs no exceo. Embora existam vrios estudos, muitos deles foram realizados in vitro, dificultando a sua utilizao na interpretao de dados obtidos em clulas intactas. A PP2A parece ser uma das principais fosfatases da cascata da ERK, podendo defosforilar e desativar as trs quinases cRaf-1, MEK e ERK, in vitro (Millward et al. 1999 e referncias neste). A PP1 tambm apresentou atividade fosfatsica quando cRaf-1 foi utilizada como substrato, indicando para um possvel envolvimento desta enzima (Dent et al. 1995). Dois estudos indicam que PP2A realmente est envolvida na regulao da cascata da ERK in vivo. Hrich et al. (1997) mostraram que tanto a expresso como a atividade da PP2A podem ser ativadas pela casena quinase 2 (CK2 Casein Kinase 2) levando a inibio da atividade da cascata da ERK e a reverso da transformao celular induzida por Ras ativada (Baharians, Schonthal 1999). interessante observar que a ativao de PP2A por CK2 inibida pelo tratamento com fator de crescimento de plaqueta (PDGF Platelet-derived Growth Factor), indicando que fatores de crescimento tambm podem regular a desativao e no somente a ativao da cascata da ERK (Hrich et al. 1997). As principais fosfatases da ERK (e das outras MAPKs) so as MKPs, que so um grupo de fosfatases capazes de defosforilar tirosina e treonina de diversos componentes das MAPKs, inativando-os. As MKPs, da mesma forma como os outros componentes da cascata das MAPKs, so um grupo relativamente grande de enzimas (9 subtipos, Camps et al. 1998), com uma especificidade variada, formas e locais de expresso diferenciados (Tabela 4). A principal forma de regulao parece ser a expresso, ativada, entre outros, pelas prprias MAPKs, caracterizando mecanismos de retroalimentao negativa, embora cer30

tas MKPs, como a MKP3, que especfica para ERK, tambm possam ser ativadas pela ligao com o substrato, no caso a prpria ERK (Camps et al. 1998). Estas retroalimentaes negativas que so ativadas no nvel da expresso, necessitam de pelo menos 1 hora, no caso da MKP1 ou 3 horas, no caso da MKP2 (Brondello et al. 1997). A contribuio das MKPs e da PP2A para a inativao da cascata da ERK depende tanto do agonista quanto do tipo celular. Por exemplo, em fibroblastos tratados com EGF, MKP1 parece ser a principal fosfatase envolvida na defosforilao da ERK, enquanto que em clulas PC12 tratadas com EGF, a PP2A, juntamente com uma tirosina fosfatase no identificada, parecem ser os responsveis pela defosforilao dos componentes da cascata (Millward et al. 1999). Vrios inibidores de fosfatases ativam a cascata da ERK, como o inibidor da PP2A, cido ocadico, o inibidor inespecfico de tirosina fosfatases, vanadato (Sonoda et al. 1997) e o inibidor de PP1 e PP2A caliculina A, sendo que um inibidor de PP2B, ciclosporina A, no tem efeito sobre a atividade da ERK (Wo-

etmann et al. 1999). O decaimento da atividade da cRaf-1 foi inibida somente quando as fosfatases PP1 e PTP1 foram inibidas, indicando que defosforilao tanto em serina/treonina como em tirosina so fundamentais para desativao da cRaf-1 (Dent et al. 1995).

Tabela 2. Fosfatases que podem regular da atividade das cascatas MAPKs.

Regulao Fosfatase MKP1-4 PP2A PP1 PTP1B Substrato(s) ERK, JNK e p38 (a) cRaf-1, MEK, ERK (d,e) cRaf-1 (e) cRaf-1 (e) Atividade ERK, JNK, p38(b) Inibidor 1 e 2 2a Inibidor 1 e 2 Desconhecido Expresso JNK, ERK(c)

a: as 4 isoformas possuem especificidades diferenciadas pelas isoformas das MAPKs, sendo que MKP3 defosforila somente ERK enquanto que MKP1 defosforila as 3 isoformas. b: a atividade dos subtipos MKP3 e 4 regulada por estas quinases (Camps et al. 1998); c: regulao da expresso da MKP1, que considerado um IEG (Bokemeyer et al. 1996), d: Testes realizados in vivo (Millward et al. 1999); e: Testes realizados in vitro Dent et al. (1995).

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2.1.2.3. Isoformas das cascatas das MAPKs

Como visto na Figura 4, em cada nvel da cascata existem vrias isoformas, o que aumenta em muito a complexidade destas vias de transduo de sinal. Neste item, sero discutidas algumas diferenas importantes entre as isoformas das protenas que constituem a cascata das MAPKs e seus ativadores.

2.1.2.3.1. RTKs e fatores de crescimento

2.1.2.3.1.1. FGF-2 A famlia do FGF (Fibroblast Growth Factor) engloba em torno de 20 fatores, que possuem de 30 a 70 % de identidade na seqncia primria e pelo menos quatro receptores, que so muito semelhantes entre si e que podem ligar-se a praticamente todas as isoformas de FGF, possibilitando uma grande redundncia de sinalizao. Os receptores de FGF so expressos em praticamente todos os tipos de cultura e na maioria dos tecidos, embora estudos in vivo ainda sejam precrios (Klint, Claesson-Welsh, 1999). Yayon et al. (1991) demonstraram que a ligao de FGF ao seu receptor necessita de heparam sulfato. Este glicosaminoglicano complexo normalmente encontra-se ligado a protenas formando os proteoglicanos, que se localizam tanto na membrana como na matriz extracelular. O mecanismo de ao do heparam sulfato ainda no est bem definido, mas acredita-se que ele esteja envolvido na dimerizao do receptor, pois oligosacardeos longos com um padro de sulfatao especfico so necessrios, sendo que oligosacardeos curtos, embora sejam capazes de ligar ao FGF-2, no so capazes de mediar a sua interao com o receptor. Portanto, parece que o heparam sulfato est envolvido na formao de um complexo ternrio de heparam sulfato/FGF/FGFRs interagindo tanto com o fator de crescimento como com os seus receptores. (Klint, Claesson-Welsh, 1999). O mecanismo de ativao dos receptores de FGF-2 (FGFRs) no parece ser muito diferente dos descritos para outros RTKs. A ligao de FGF leva a homoou hetero-dimerizao dos receptores, estimulando a atividade tirosina quinsica

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do receptor, que por sua vez, autofosforila-se em resduos de tirosina especficos, que incluem os resduos Y463, Y583, Y585 e Y766 (Mohammadi et al. 1996), formando vrios stios de ligao para protenas reconhecedoras de fosfotirosina. FGFRs podem interagir com uma molcula adaptadora denominada substrato 2 do receptor de FGF (FRS2 - FGF receptor substrate 2). FRS2 possui um domnio ligador de fosfotirosina denominado PTB que pode interagir com o FGFR1 fosforilado em tirosina, levando com isto a fosforilao de vrias tirosinas do FRS2, que por sua vez pode se ligar Grb2, conseqentemente ativando Ras atravs de Sos. No foi possvel detectar nenhuma ligao direta entre Grb2 e FGFR1, indicando que FRS2 fundamental para a ativao de Ras pelos FGFRs. FRS2 ativado por FGF e NGF, mas no por EGF ou PDGF (Klint et al. 1995 e Kouhara et al. 1997). A ausncia de ligao direta entre o FGFR e Grb2 foi confirmada com a utilizao de peptdeos mimetizadores do stio de ligao de Grb2 ao receptor de EGF, que bloqueou a ativao de ERK e o efeito mitognico tanto de EGF como de PDGF, mas no o efeito de FGF-2 (Williams et al. 1997 e Figura 6).
FGF

FGFR

P-

-P -P
FRS2

.
Grb2

PKC
PLC

Sos

Ras

Raf

Crescimento Axonal
Clulas PC12

Proliferao
Mioblastos A1

Figura 6. Vias de sinalizao ativadas por FGFR.

Baseado nas referncias citadas no item 2.1.2.3.1.1.

Portanto, FRS2 desempenha o papel de regular especificamente a sinalizao mediada pelo FGFR, isto , a sua ausncia pode bloquear especificamente a sinalizao mediada pelas FGFRs, uma vez que os receptores de NGF 33

possuem, alm da FRS2, outras protenas adaptadoras, como a Shc, como visto abaixo. Alm da ativao de Ras atravs de FRS2, outras vias sinalizadoras tambm podem ser ativadas pelos FGFRs. A fosforilao no resduo Y766 permite a ligao de fosfolipase C. Estudos utilizando mutagnse stio dirigida indicaram que esta fosfotirosina fundamental para a ativao de PKC por FGF e que pode estar envolvida na ativao da ERK, embora a atividade de Ras no tenha sofrido nenhuma mudana com a retirada deste resduo de tirosina (Huang et al. 1995). A mutao Y766F no afetou a proliferao induzida por FGF, indicando que o bloqueio da via PLC/PKC no influencia a sinalizao que induz a proliferao. Peptdeos bloqueadores da ativao de PLC por FGFR1 inibiram o crescimento axonal induzido por FGF e CaMs em PC12 (Saffell et al. 1997), mas no a ativao de ERK e a proliferao em mioblastos A1 (Williams et al. 1997). Os receptores de FGF tambm podem ser regulados por outras vias de sinalizao, com por exemplo PKC. Gillespie et al. (1995) mostraram que esteres de forbol, atravs da ativao PKC, inibiram o efeito do FGF atravs da fosforilao do receptor na Thr424 e que variantes de processamento que no possuem esta parte do receptor no foram afetados pela ativao de PKC. A sinalizao mediada por FGF est envolvida em diversas situaes fisiolgicas e patolgicas. Entre as principais respostas biolgicas sinalizadas por FGF esto a proliferao, diferenciao e migrao celular, sendo fundamental durante o desenvolvimento, pois KOs de FGFRS se mostrarram inviveis. Interessantemente, apesar da grande redundncia entre a ligao de FGFs aos seus receptores, KOs dos quatro FGFRs produziram diferentes anomalias durante o desenvolvimento, indicando que as sinalizaes no so totalmente redundantes (Klint, Claesson-Welsh, 1999). A sinalizao mediada por FGF tambm muito importante em processos patolgicos. Na tumorignese, os FGFs tm sido ligados a migrao, proliferao, diferenciao endotelial e angiognese, processos fundamentais para a progresso de tumores e metstase (Klint, Claesson-Welsh, 1999). Tambm existem muitas evidncias que ligam os FGFs a leses no CNS. Um grande au34

mento de RNA mensageiro (mRNA Messenger RNA) de FGF aps a injeo de cido canico (Riva et al. 1994) e de leses provenientes de convulses induzidas (Gall et al. 1994) foram observadas principalmente em reas sensveis a estas leses, tanto nos neurnios como nos astrcitos. FGF-2 tambm pode potencializar a induo de gliose reativa de leses mecnicas e eletrolticas, pois a injeo de FGF-2 no local da leso produz um aumento no nmero de astrcitos reativos, processos celulares aumentados e uma intensa marcao para protena fibrilar glial cida (GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein) (Eclancher et al. 1996). 2.1.2.3.1.2. EGF Os receptores de EGF possuem trs principais tirosinas fosforilveis, nas quais podem ligar-se Grb2, Shc e p85 (subunidade da PI3K), podendo desta forma ativar PI3K e a cascata da ERK atravs de Sos (Moghal, Sternberg, 1999). 2.1.2.3.1.3. PDGF Duckworth, Cantley, (1997) mostraram evidncias para a existncia de duas vias sinalizadoras entre o receptor de PDGF e Raf, uma dependente de PI3K e a outra dependente de PLC/PKC. Montmayeur et al. (1997), utilizando mutaes em tirosinas especficas, mostraram que somente a ativao da PLC fundamental para a ativao de ERK pelos receptores de PDGF. 2.1.2.3.1.4. NGF NGF age principalmente em dois receptores, TrkA e p75. O receptor TrkA possui tirosinas que, quando fosforiladas, podem ligar a Shc e PLC, sendo que estudos com mutagnese stio dirigida mostraram que estas duas protenas levam ativao da ERK de forma redundante, isto , somente a mutao das duas tirosinas do receptor TrkA bloqueia totalmente a ativao de ERK e o crescimento de neuritos em clulas PC12 induzida por NGF (Stephens et al. 1994).

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2.1.2.3.2. Ras
As Ras servem como prottipos para um grupo de protenas ligadoras de nucleotdeos de guanina que compartilham seqncia primria, homologia estrutural e atividade biolgica. At recentemente, foram identificados mais do que 60 componentes das superfamlia da Ras, que podem ser divididas em vrias subfamlias, entre as quais podem ser destacados: Ras, Rho, Rab, Arf, Ran e Rad/Gem, sendo que cada uma destas subfamlias possui um conjunto variado de componentes (Malumbres, Pellicer, 1998). A subfamlia da Ras pode ser dividida em sete subgrupos, com as mais diversas funes e distribuio no organismo. Enquanto a famlia das Ras (H-, Ke N-Ras) est principalmente envolvida com a sinalizao que ativa a cascata das MAPKs em resposta a fatores de crescimento, os outros componentes da famlia das Ras esto envolvidas na integrao de sinais, como o caso das Rap, Rheb e TC21, como visto no item 2.1.3.3. Um exemplo interessante a ativao de ERK por NGF em linhagens PC12. Esta ativao permanece por vrias horas e est envolvida na induo da diferenciao, enquanto que a ativao da ERK induzida por EGF rpida e transitria, produzindo a proliferao celular (Marshall, 1995 e 1998). York et al. (1998) mostraram que os receptores de NGF, TrkA, possuem duas vias para ativar MEK e ERK, uma envolvendo Ras e sendo responsvel pela parte inicial da ativao e a outra dependente de Rap e B-Raf (item 2.1.2.3.3.1) e sendo responsvel por manter a cascata ativa por mais tempo.

2.1.2.3.3. MAPKKK (Rafs e MEKKs)

2.1.2.3.3.1. Isoformas da cRaf-1 B-Raf e A-Raf B-Raf a principal isoforma da Raf no CNS (Catling et al. 1994), apresentando uma alta atividade basal (item 5.2.4), muito provavelmente devido ao fato de que os stios de fosforilao em tirosina da cRaf-1 (resduos 340 e 341) so

36

substitudos por dois resduos de aspartato na B-Raf7 (Jelinek et al. 1996). Pelo mesmo motivo, a B-Raf no parece ser regulada pela Src, sendo que o seu principal mecanismo de ativao mediado pela Ras e Rap (Marais et al. 1997 e York et al. 1998). A B-Raf um componente fundamental na integrao da sinalizao, pois ela no inibida por PKA, ao contrrio de cRaf-1 (item 2.1.3.3) e tambm possui um importante papel nas ativaes duradouras da cascata da ERK, como visto anteriormente. A-Raf possui muitas semelhanas com cRaf-1, tambm sendo ativada por fatores de crescimento, como EGF atravs de Ras e Src e podendo ativar MEK (Storm et al. 1990, Marais et al. 1997 e Wu et al. 1996). A principal diferena entre A-Raf e cRaf-1 que a primeira expressa principalmente na epiderme, ovrio, rins e bexiga, no sendo encontrada nos pulmes e no CNS enquanto que a segunda expressa em todos os tecidos (Morice et al. 1999). 2.1.2.3.3.2. As MEKKs As cinco isoformas de MEKK (MEK Kinase), ao contrrio das Rafs, podem ativar mais do que uma cascata, sendo que as MEKK1 - 4 ativam as cascata da ERK e/ou da JNK com intensidades diversas. MEKK1, 2 e 3, mas no MEKK4, ativam a cascata da ERK enquanto todas as 4 isoformas ativam a cascata da JNK. Em estudos com transfeco utilizando clulas HEK293 ou COS, nenhuma destas isoformas ativou p38. MEKK2 ativa preferencialmente a cascata da JNK em relao cascata da ERK, enquanto o MEKK3 possui uma e specificidade inversa (Blank et al. 1996 e Ellinger-Ziegelbauer et al. 1997) A especificidade de MEKK1 por uma das duas cascatas varia conforme o tipo celular e se o estudo envolve transfeco ou no (Yan et al. 1994 e Schlessinger et al. 1998). A MEKK1 pode ser ativada por sinais indicadores de estresse celular, como TNF, radiao ionizante e cisplatina (Widmann et al. 1998), estando envolvida na induo da apoptose (Johnson et al. 1996). Ativadores que

Aminocidos com carga negativa como o aspartato ou o glutamato podem desempenhar um papel semelhante ao de um resduo fosforilado, provavelmente devido carga. A protena na qual o AA fosforilvel trocado por um AA negativo geralmente apresenta uma atividade semelhante ao da protena fosforilada naquele stio.

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estimulam as Raf tambm podem ativar as MEKKs, como por exemplo EGF e insulina (Haystead et al. 1994). As MEKKs apresentam uma alta similaridade entre os seus domnios catalticos C-terminais, enquanto que as partes N-terminais destas enzimas so bastante distintas. Por exemplo, MEKK2 (619aa) e MEKK3 (626aa) possuem 94% dos aminocidos conservados na parte cataltica C-terminal, enquanto que a parte regulatria N-terminal possui somente 64% dos aa conservados, indicando uma alta sobreposio dos substratos, mas uma baixa sobreposio das formas de regulao (Blank et al. 1995). MEKK1 (1486aa) possui uma parte Nterminal imensa quando comparada com MEKK2 e 3, possuindo muitos domnios potencialmente envolvidos em diversas formas de regulao (Xu, Cobb, 1997), sendo que o domnio cataltico possui somente 32% de aminocidos idnticos com o domnio cataltico da MEKK2 (FASTA-Swissprot). As semelhanas entre as sequncias das isoformas dos ativadores de MEK mostrado na Tabela 3. Tabela 3. Homologia da famlia das Rafs e MEKKs com a cRaf-1 de rato.
Enzima A-Raf B-Raf MEKK1b MEKK2b MEKK3b Animala Rato Humano Rato Camundongo Humano Nmero de ami- % de aminoci- Nm. de aminocinocidos dos idnticos dos analisados 604 765 1493 619 626 61,5 57,5 24,6 26,0 25,4 608 653 435 442 444

Estes dados foram produzidos pela programa FASTA utilizando como banco de dados a Swissprot e obtidos do endereo: http://src.ebi.ac.uk da Sequence Retrieval System. a: as seqncias para rato no esto disponveis para todas as enzimas, sendo que, nos casos de comparao com a seqncia em humanos e camundongos, a homologia apresentada muito provavelmente menor do que seria se a seqncia de rato fosse utilizada; b: somente o domnio cataltico foi comparado OBS: cRaf-1 possui 648 aminocidos.

Outra observao importante que seqncias presentes nos stios catalticos destas enzimas consideradas fundamentais para a regulao, como por exemplo a seqncia RDSSYY de cRaf-1, que parece mediar a ativao pela tirosina quinase Src, so conservadas nas outras Rafs, total ou parcialmente, 38

mas no esto presentes nas MEKKs (Jelinek et al. 1996, Marais et al. 1995 e FASTA/Swissprot). A MEKK1 possui um domnio ligador de Ras, podendo ser ativado pela Ras/GTP, mas este domnio no possui similaridade de seqncia com o domnio ligador de Ras das Rafs (Russell et al. 1995). Muito pouco conhecido quanto regulao das outras MEKKs. Fanger et al. (1998) mostraram que MEKK1, 2 e 3, da mesma forma como as Rafs, podem interagir com as protenas da famlia das 14-3-3, sendo estas interaes importantes para a localizao da cRaf-1 na membrana. Contudo, a importncia destas interaes para o mecanismo de ativao das MEKKs permanece obscuro. Estas diferenas na regulao e especificidade relativa pelas cascatas da ERK e da JNK faz das MEKKs excelentes candidatas para a distribuio e integrao de sinais entre estas duas cascatas, as quais muitas vezes possuem efeitos antagnicos (Xia et al. 1995 e Lavoie et al. 1996). 2.1.2.3.3.3. Outras MAPKKK At recentemente foram identificados 10 diferentes grupos de ativadores de MEK, abrangendo 22 genes diferentes, com as mais variadas especificidades, tornando a identificao de um ativador de MEK um trabalho bastante rduo. Entre estes ativadores de MEKs podem ser citadas GCK (germinal center kinases), DLK (Dual leucine zipper bearing kinase), PAK1-3 (p21-activated kinase 1-3), KSR (Kinase supressor of ras), MST1-3 (Mammalian sterile twenty-like kinase 1-3), SOK-1 (Ste20/oxidant stress response kinase-1), HPK1 (Hematopoetic progenitor kinase 1), GLK (GCK-like kinase), KHS (Kinase homologous to Sps1/Ste20), NIK (Nck interacting kinase) e ASK1 (Apoptosissignal regulating kinase 1) (Schlessinger et al. 1998).

2.1.2.3.4. MAPKK (MEKs)

Sete MEKs foram identificadas at recentemente (Foltz et al. 1998), sendo que existe uma grande especificidade das MEKs em relao s MAPKs. MEK1 e 2 so especficos para ERK1 e 2, MEK 4 e 7 para JNK, MEK3 e 6 para p38 e MEK5 para ERK5 (Zhou et al.1995, Stein et al. 1996, Schlessinger et al. 1998). 39

A nica exceo parece ser a MEK4 que pode ativar p38 e JNK in vitro, embora esta observao no tenha sido confirmada in vivo (Deacon, Blank, 1997).

2.1.2.3.5. MAPKs
As isoformas das MAPKs possuem em comum o mecanismo de ativao: a dupla fosforilao em treonina e tirosina. A diferena entre as trs principais isoformas e que permitem a deteco da forma fosforilada/ativada, so os aminocidos que esto entre a treonina e a tirosina fosforilveis: o glutamato no caso da ERK, a prolina na JNK e a glicina na p38 (Kyriakis, Avruch, 1996). 2.1.2.3.5.1. JNK As JNKs possuem um importante papel na transduo de sinal que envolve estresse celular, sendo ativadas por vrias formas ou indicadores de estresse, como o TNF, a exposio da radiao ultravioleta, a inibio da sntese de protenas, entre outros (Davis, 1994 e Ip, Davis, 1998). Esta quinase, juntamente com a p38, parece desempenhar importantes funes na apoptose (Xia et al. 1995). Entre os substratos encontram-se vrios fatores de transcrio, como ATF2, cjun, junD, Elk1 e Sap1. JNK1 e JNK2 so expressas em todos os tecidos, enquanto que JNK3 expressa predominantemente no corao, testculos e crebro, sendo mais elevado no hipocampo (Ip, Davis, 1998 e item 2.1.4.3). 2.1.2.3.5.2. p38 Quatro quinases da p38 foram identificadas at o momento, p38 e p38, p38 e p38 (Garrington, Johnson, 1999). Como no caso das outras MAPKs, no existem muitas diferenas entre estas isoformas, o que indica que as p38 tambm fazem parte de sinalizaes redundantes (item 2.1.4.3). Por exemplo, a p38 e p38 possuem os mesmos substratos, so ativadas pelas mesmas quinases e possuem uma distribuio semelhante (mais concentradas no crebro e no corao) (Jiang et al. 1996). As p38 agem sobre vrios fatores de transcrio, como ATF2 e CHOP (Wang, Ron, 1996). De forma semelhante s JNKs, as p38 so ativadas por diversos tipos de estresse celular como isquemia (Walton et al. 1998), estresse oxidativo (Clerk et 40

al. 1998) e retirada de fatores de crescimento em culturas de PC12 (Xia et al. 1995) e fibroblastos (Kummer et al. 1997) e glutamato em culturas de clulas granulares do cerebelo (Kawasaki et al. 1997). Alguns destes sinais so inducores de apoptose, sendo que neste caso, p38 parece desempenhar um papel importante, uma vez que que o bloqueio da p38 tambm bloqueia a apoptose. 2.1.2.3.5.3. ERK5 Esta MAPK possui uma segunda seqncia rica em prolina quando comparada como a ERK1/2, tendo 89kDa, por isso sendo tambm denominada de Bmk1 (Big MAPK 1) (Lee et al. 1995). Embora a ativao da ERK5 tambm seja por fosforilao na seqncia TEY, as MEK1/2 no ativam esta enzima, sendo que ela especificamente ativada por MEK5 (Zhou et al. 1995). A cascata da ERK5 ainda no est bem caracterizada, sendo que a sua MAPKKK ainda no foi identificada. Em relao s funes desempenhadas por esta cascata tambm existem poucos trabalhos na literatura. Recentemente, Kato et al. (1998) descreveram que ERK5 necessria para a proliferao induzida por EGF, em um mecanismo independente de Ras.

2.1.2.3.6. Quinases ativadas por MAPK

Existem vrias quinases ativadas pelas MAPKs. A ERK ativa principalmente a famlia das Rsks (item 2.1.2.2.7), enquanto que muitos dos efeitos da p38 parecem ser mediados pela quinase ativada pela MAPK (MAPKAPK2 MAPK activated protein kinase), que pode fosforilar substratos como CREB, Hsp27 e ATF2 (Tan et al. 1996 e Larsen et al. 1997) Outras quinases so ativadas pelas trs MAPKs, representando importantes pontos de integrao entre as sinalizaes mediadas pelas trs cascatas. Ludwig et al. (1996) identificaram e caracterizaram uma enzima denominada 3pK que ativada pelas 3 cascatas (ERK, JNK e p38), tendo a protena de choque trmico Hsp27 entre os seus substratos. As quinases Mnk1 e 2 (MAPKinteracting kinase) so ativadas por ERK e p38, sendo responsveis pela regulao do fator de iniciao de traduo eIF-4E (Waskiewicz et al. 1997).

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2.1.3. Integrao da sinalizao na cascata das MAPKs

Alm da ativao da cascata das MAPKs por Ras, outras formas de ativao, envolvendo mecanismos de sinalizao bem conhecidos como Ca2+, protenas G, PKC, entre outros podem regular as MAPKs. Parece que uma via de sinalizao central foi mantida durante a evoluo, sendo que as formas de ativao e os componentes ativados foram sendo diversificados, isto , muitos receptores sinalizam atravs das MAPKs e muitos efetores podem ser regulados por elas (Murray, 1998). A Figura 7 mostra os principais mecanismos de ativao e inibio da cascata da ERK.

Ca2+
G

DAG
Pyk2

cAMP

GRF GRP Rhe GEF Sos PKC Ras PKA Rap1

Shc

Src Grb2

PKC

cRaf-1

B-Raf

MEK

ERK

Figura 7. Integrao da sinalizao proveniente de cAMP, Ca2+ e DAG no nvel das Rafs.
Abreviaturas utilizadas somente para a figura acima: GEF: cAMP-GEF; GRF: Ras-GRF; GRP: Ras-GRP. Referncias citadas no texto do presente item.

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Esta multiplicidade e complexidade dos mecanismos permite com que a expresso de um determinado componente em uma clula produza respostas completamente diferentes para um certo conjunto de sinais extracelulares (Weng et al. 1999). importante enfatizar, no entanto, que componentes mostrados na figura acima no so expressos em todos os tipos celulares. Por outro lado, a figura certamente no engloba todas as formas de interao descritas sobre a cascata da ERK, sem mencionar as que ainda no foram descritas.

2.1.3.1. Protenas G
Inmeros receptores acoplados protena G so capazes de ativar a ca scata da ERK. Crespo et al. (1994) e Van Bieses et al. (1995) mostraram que a ativao de Ras por GPCR necessita das subunidades da protena G. LopesIlasaca et al. (1997) demonstraram que a ativao da ERK induzida por protena G pode ser bloqueada com inibidores de PI3K (wortmanina), tirosina quinases (genistena incluindo a inibio da Src) e dominantes negativos para Shc, caracterizando a via de sinalizao como sendo: G PI3K Src Shc Grb2 Sos Ras Raf. Sinalizaes negativas da protena G para a cascata da ERK foram descritas para os subtipos de protena G12 e G13. Voyno-Yasenetskaya et al. (1996) mostraram que clulas COS-7 transfectadas com protena G12 ou G13 constitutivamente ativas inibiram a ativao de ERK induzida por EGF. Esta inibio parece ser aps cRaf-1 provavelmente no nvel da MEK. Outros subtipos de protena G, como Gs ou Gq aumentaram a atividade basal de ERK. Recentemente, Jiang et al. (1998), demonstraram que G12 ativa a Gap1m, que um estimulador da atividade GTPsica da Ras, inibindo esta enzima. A ativao do receptor tromboxano A2, conhecido por estimular G12, levou a uma inibio da atividade de Ras induzida por EGF.

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2.1.3.2. Ca2+
Vrios mecanismos de ativao de Ras por Ca2+ foram descritos (Finkbeiner, Greenberg, 1996), embora ainda no esteja totalmente definido se estas vias de ativao funcionam isoladamente ou de forma integrada. Uma ligao muito importante entre Ca2+ e Ras envolve uma protena denominada Pyk2 (Proline-rich tyrosine kinase 2), que pode ser fosforilada em resduos de tirosina induzida por Ca2+ ou PKC, com isso acomplando-se Src e Grb2 e conseqentemente ativando Sos/Ras. A Pyk2 est concentrada no CNS e em linhagens de precursores neuronais, como PC12 (Lev et al. 1995). Em um mecanismo alternativo, mas tambm envolvendo Pyk2, Rosen, Greenberg, (1996) mostraram que Ca2+ pode levar fosforilao de EGFRs, o que por sua vez ativa Ras atravs de Grb2 e Sos (item 2.1.2.3.1). Um outro mecanismo de ativao de Ras por Ca2+ envolve uma GEF denominada Ras-GRF, que expressa exclusivamente em neurnios do CNS e possui um motivo ligador de Ca2+/CaM, podendo ser ativado por estes sinalizadores (Figura 7 e Farnsworth et al. 1995). Estas vias de ativao de ERK em resposta ao aumento de Ca2+ intracelular esto envolvidas em vrios processos fisiolgicos importantes, como por exemplo a induo de crescimento de neuritos mediado por Pyk2, Src e Ras em linhagens PC12 (Rusanescu et al. 1996).

2.1.3.3. cAMP / PKA

Um dos pontos de integrao entre vias de sinalizao mais complexos parece ser a interao entre a via cAMP/PKA e a cascata das MAPKs. Os efeitos do cAMP sobre a proliferao indicavam para uma ao inibitria sobre sinalizaes envolvidas no progresso atravs do ciclo celular. O efeito inibitrio do cAMP sobre a ERK foi descrito quase simultaneamente por quatro grupos (Graves et al. 1993, Sevetson et al. 1993, Wu et al. 1993 e Cook, McCormick, 1993). Wu et al. (1993) mostraram que o efeito do cAMP era mediado pela fosforilao da Ser43 pela PKA no domnio da cRaf-1 responsvel pela ligao Ras, inibindo esta ligao e, conseqentemente, levando inibio de cRaf-1. PKA 44

tambm pode fosforilar outros stios na cRaf-1, como a Ser621 no domnio cataltico, reduzindo a sua atividade (Whitehurst et al. 1995 e Mischak et al. 1996). Suhasini et al. (1998) mostraram que Ser43 da cRaf-1 tambm pode ser fosforilada por PKG, integrando assim tambm os efeitos da sinalizao envolvendo cGMP e xido ntrico (NO Nitric Oxyde). Estudos posteriores sobre a interao destas cAMP/PKA e a cascata da ERK mostraram muitas nuances. B-Raf, a isoforma da Raf expressa principalmente no CNS, no possui a Ser43 conservada. Em clulas que no expressam B-Raf, o cAMP teve um efeito inibitrio sobre a atividade da ERK e a proliferao celular, enquanto que, quando B-Raf foi transfectada para estas clulas, o cAMP no inibiu ERK e nem a proliferao (Ehrhard et al. 1995). Posteriormente, foi demonstrado que cAMP pode ativar uma isoforma da Ras denominada Rap1, tanto pela fosforilao mediada pela PKA no resduo Ser179 da Rap1 (Vossler et al. 1997) quanto por ativao de uma cAMP-GEF, sem o envolvimento da PKA (Hawasaki et al. 1998). Desta forma, cAMP/PKA ativam B-Raf atravs de Rap1 enquanto que inibem cRaf-1. Um outro membro deste ponto de integrao foi descrito por Yee, Worley, (1997) e denominado Rhe. Esta protena tambm faz parte da famlia das Ras e possui a capacidade de ligar cRaf-1 quando esta est fosforilada no resduo Ser43. Como Rhe tambm possui a capacidade de se ligar Ras, esta protena restabelece a ligao cRaf-1/Ras quebrada pela fosforilao na Ser43, bloqueando desta forma o efeito inibitrio desta fosforilao. Estes estudos indicam que o efeito do cAMP sobre a cascata da ERK pode ser tanto negativo como positivo, dependendo da quantidade relativa de Rhe, Rap1, B-Raf e cRaf-1 disponvel em um determinado momento, fornecendo clula, atravs da regulao de cada um destes genes, um poderoso sistema regulatrio de integrao entre os sinais provenientes do cAMP (e cGMP) sobre cRaf-1, B-Raf e, conseqentemente, sobre MEK e ERK e todos os seus substratos (Figura 7).

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2.1.3.4. PKCs
steres de forbol so agentes mitognicos e tumorignicos, sendo os seus efeitos principalmente mediados pela ativao de PKC, que por sua vez fosforila inmeros substratos, entre eles alguns componentes da cascata das MAPK. Vrios efeitos da ativao da PKC so mediados pelas MAPKs, como por exemplo a induo da proliferao de linhagens de gliomas humanos (da Rocha et al. Submetido). Schnwasser et al. (1998) mostraram que representantes das trs famlias das PKCs ativam a cascata da ERK de diferentes maneiras. O subtipo de PKC (nova) ativou cRaf-1, enquanto que PKC (convencional) tambm ativou cRaf-1, mas esta ativao inibiu futuras ativaes por soro. J a PKC (atpica) ativa MEK1 de forma indireta e independente de cRaf-1. Marais et al. (1998) mostraram que Ras necessria para a ativao de cRaf-1 por PKC, enquanto que Kolch et al. (1993) e Carrol et al. (1994) mostraram que PKC pode fosforilar diretamente cRaf-1, embora mutagnese stio direcionada dos aminocidos identificados como sendo os stios de fosforilao da PKC no inibiram o seu efeito sobre a atividade de cRaf-1 (Schnwasser et al. 1998), o que talvez possa ser explicado pela possibilidade de steres de forbol tambm ativarem uma GEF (RasGRP), levando com isso ativao da Ras de forma indepe ndente de PKC (Ebinu et al. 1998). Outras evidncias apontam para a fosforilao da Shc em resduos de serina e um conseqente aumento da associao ShcGRB2 como o mecanismo pela qual PKC ativa Ras e a cascata da ERK (ElShemerly et al. 1997). A PKC parece ser o principal subtipo de PKC envolvido na ativao da cascata da ERK mediada por PI3K (van Dijk et al. 1997 e Toker et al. 1994).

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2.1.4. Caractersticas especiais de mecanismos de sinalizao

Os conceitos desenvolvidos na dcada de 80 indicavam que as vias de sinalizao eram simples transmissores do sinal do receptor para o seu efetor com o segundo mensageiro desempenhando este papel. No entanto, como j discutido anteriormente, as vias de sinalizao possuem uma capacidade computacional muito elevada, sendo que muitas caractersticas, alm da simples transmisso da informao, foram descobertas. Este item dedicado a descrever algumas destas caractersticas complexas que podem ser encontradas em vias de sinalizao.

2.1.4.1. Amplificao e digitalizao

Sinais normalmente so reduzidos ao longo do espao e do tempo, sendo que no caso de sinais qumicos, a difuso responsvel por distribuir o sinal por todo o volume atingvel, com isto, diluindo-o. Para que estes sinais possam ser transmitidos de forma eficiente, mecanismos de amplificao so fundamentais. Um dos exemplos mais estudados de amplificao a deteco de luz pela retina, que capaz de responder a alguns poucos ftons. O principal mecanismo utilizado neste caso e em todos os casos nos quais a amplificao necessria, a sinalizao atravs de vrias etapas. No caso da captao do fton pela retina, existem 6 etapas, sendo que na maioria destas, a ativao de um componente em uma determinada etapa leva a ativao de vrios componentes na etapa seguinte, o que, no final do processo, fornece uma amplificao exponencialmente relacionada com o nmero de etapas (Alberts et al. 1994). Em muitas respostas celulares, como por exemplo proliferao e diferenciao, no existem respostas intermedirias sendo que a sinalizao indutora destas respostas deve ser do tipo tudo ou nada8. Nestes casos, os mecanismos de sinalizao so responsveis por transformar um sinal linear (um aumento linear na concentrao de um transmissor) em uma resposta digital, isto , em

O que pode ser denominado digitalizao, isto , sinais de 1 ou 0.

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um determinado limiar de concentrao do transmissor no qual o evento celular ativado abruptamente. Uma cascata de enzimas como as MAPK apresenta tanto amplificao como digitalizao. A amplificao bastante bvia e facilmente demonstrvel na prtica pelo ensaio enzimtico acoplado, utilizando a cascata reconstituda in vitro, muito mais sensvel do que o ensaio no acoplado (item 4.4). J a digitalizao da sinalizao mediada pelas MAPKs depende principalmente da fosforilao em dois stios. Ferrell, Bhatt, (1997) demonstraram que a dupla fosforilao da MAPK acontece por um mecanismo no qual a MEK fosforila um stio e se desliga da MAPK antes de fosforilar o outro stio. Como a fosforilao nos dois stios necessria para a ativao, a atividade da MAPK varia com o quadrado da atividade da MEK. Considerando que MEK tambm ativada por dupla fosforilao, a combinao destas etapas produz um efeito cooperativo com um coeficiente de Hill de praticamente 5 9. Isto foi demonstrado na prtica, tratando-se ocitos com uma determinada concentrao de progesterona, que induziu a ativao de alguns, mas no todos os ocitos, em uma determinada populao. Quando a atividade de MAPK (ERK) foi determinado em ocitos individuais, a resposta foi quantizada, isto , eles apresentavam somente duas situaes, atividade extremamente elevada ou atividade ausente, mostrando a funcionalidade desta digitalizao de sinal (Huang, Ferrel, 1996 e Ferrell, 1996).

2.1.4.2. Sinergismo e coincidncia

Nos mecanismos de transduo de sinal existem inmeros pontos de integrao. Estes pontos so responsveis por todas as transformaes matemticas que este intrincado sistema computacional pode operar. Os pontos de ligao de duas ou mais vias de sinalizao podem produzir funes algbricas como soma, subtrao, multiplicao (nas interaes sinergsticas) e tambm funes booleanas, como a deteco de coincidncia. Um interessante exemplo de sinergismo foi observado na ativao do fator de transcrio CREB, que pode ser ativado tanto pela cascata da ERK (atravs

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da Rsk2) como pela PKA. Agentes que ativam tanto ERK como PKA induzem a uma ativao muito maior do que a soma da ativao induzida por cada um dos sinais independentemente. Um indcio para o mecanismo molecular de funcionamento deste sinergismo est na observao de que a PKA aumenta a translocao da ERK para o ncleo, no qual ela pode fosforilar e ativar a CREB via Rsk2, ou seja, alm das vias individuais de ativao, estas duas vias tambm interagem positivamente (Impey et al. 1998). Entre os detectores de coincidncia presentes nos mecanismo de transduo de sinal, pode ser destacado um subtipo de PI3K, que ativado pelas subunidades da protena G somente quando o receptor de PDGF estiver ativado (Tang, Downes, 1997). Outro grupo de detectores de coincidncias so as ACs pois como recebem sinais de protenas G (tanto subunidades como ), CaM e PKC, so importantes pontos de integrao de sinais, isto sem considerar a complexidade decorrente da existncia de vrios subtipos de AC. A ACII e ACIV so reguladas por Gs, G e fosforilao por PKC de forma variada, como visto na Figura 8. ACII pode ser ativada tanto por Gs como por Gi, de forma isolada e conjunta. A fosforilao por PKC intensifica o efeito das subunidades G e G isoladamente, mas inibe o efeito destes dois componentes quando presentes ao mesmo tempo, isto , se estes trs sinais estiverem presentes, a produo de cAMP ser inibida, enquanto que, se somente dois componentes estiverem ativos ao mesmo tempo, haver um aumento da produo de cAMP, sendo que a intensidade deste aumento depende de quais componentes esto presentes (Figura 8A e Zimmermann, Taussig, 1996). As subunidades Gs e G praticamente no afetam a atividade da ACIV isoladamente, mas estimulam a atividade da ACIV quando presentes conjuntamente. A ativao de PKC torna o efeito da subunidade Gs negativo, enquanto que bloqueia completamente a atividade estimulada por Gs e G. Isto um exemplo de como duas isoformas de protenas podem ter caractersticas de re-

O coificiente de Hill para a ligao de O2 hemoglobina de 2,8.

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gulao variadas de tal forma que tenham a capacidade de detectar a coincidncia de forma diferente (Zimmermann, Taussig, 1996).

A Gs Gi Gs ++ Gi +

B Gs Gi ++ Gs Gi

ACII

PKC

ACII

ACIV

PKC

ACIV

Figura 8. Adenilil Ciclase como detector de coincidncia.

Estimulao, bloqueio e sinais de + e significam estimulao e inibio, respectivamente. Adaptado de (Zimmermann, Taussig, 1996).

As vias de sinalizao da protena Gs e Ca2+ tambm podem ser integradas por uma AC. Tanto Ca2+ como Gs estimulam a ACI
10

, sendo que a presen-

a dos dois sinalizadores estimula a ACI sinergisticamente (Nielsen et al. 1996).

2.1.4.3. Sinalizaes Redundantes

Considerando a importncia dos mecanismos de transduo de sinal, era de se esperar que animais KO dos genes dos componentes destes mecanismos no fossem viveis, ou apresentassem srios problemas, principalmente durante o desenvolvimento, no qual muitos destes mecanismos so absolutamente fundamentais e pequenos erros de comunicao podem produzir grandes mudanas no feto11. Para a grande surpresa de muitos pesquisadores, animais KO para muitos componentes dos mecanismos de transduo de sinal no apresentaram nenhum problema aparente. Estes resultados surpreendentes foram interpretados como sendo devido a mecanismos de compensao de outros geEmbora a sensibilidade da ACI protena Gs acontea somente in vitro, no sendo observado in vivo.
10

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nes, que poderiam substituir os genes retirados. Um exemplo disto foi dado pelo estudo de Kuan et al. (1999), que observaram que a retirada dos genes da JNK1, JNK2 e JNK3, separadamente, no tinha nenhum efeito sobre o desenvolvimento de camundongos. Quando foram realizados KOs para a combinao destes genes, surpreendentemente, somente a retirada dos genes da JNK1 e JNK2 produziu camundongos inviveis, com srios defeitos no controle da apoptose neuronal, enquanto que KOs para JNK1 e JNK3 e tambm JNK2 e JNK3 no apresentaram problemas aparentes. Na ativao das MAPK existem vrias vias redundantes. Por exemplo, EGFR pode ativar cRaf-1 atravs de Ras (Grb2, Sos), PLC/PKC e PI3K. O bloqueio de uma destas vias produz somente uma inibio parcial da ERK (Soler et al. 1994). Muitos outros casos de redundncia, principalmente baseado na observao de que KOs no produzem nenhum efeito claro no animal, indicaram a importncia desta caracterstica (Nowak et al. 1997). Evolutivamente falando, a redundncia observada em muitos componentes dos mecanismos de transduo de sinal parece indicar a enorme importncia destes, fazendo com que os organismos mantivessem vrios genes para a mesma funo, para que, caso um deles falhasse, pudesse ser substitudo pelo outro. Evidncias tericas mostraram que estas redundncias so evolutivamente estveis quando estiverem envolvidas em funes como a formao de padres espao-temporais durante o desenvolvimento, mas no em genes considerados housekeeping, como os envolvidos no metabolismo (Nowak et al. 1997).

2.1.4.4. Deteco de freqncia

Muitas sinalizaes so codificadas na forma de freqncias de um determinado sinal e no a simples presena ou ausncia do sinal. Esta forma de sinalizao muito abundante no CNS, sendo que freqncias distintas podem at mesmo ter significados celulares antagnicos, como o caso da induo de

Muitas drogas teratognicas atuam sobre mecanismo de sinalizao, como por exemplo cido retinico (Helms et al., 1997).

11

51

depresso de longa durao (LTD - long-term depression) por freqncias baixas (aprox. 1Hz) e LTP por freqncias mais elevadas (100Hz). A CaMKII um dos detectores de freqncia mais bem descrito e parece ter um papel fundamental na decodificao de freqncias na ps-sinapse. Em um estudo terico, Dosemesi, Albers, (1996), mostraram que esta enzima, principalmente devido a seus stios de autofosforilao, pode diferenciar freqncias de aumento de Ca2+ intracelular, sendo ativada por freqncias altas e bloqueada quando exposta a freqncias baixas de picos de Ca2+. Estudos com a CaMKII imobilizada confirmaram a sua capacidade de reconhecimento de freqncias (Koninch, Schulman, 1998). Recentemente, Oancea, Meyer (1998), mostraram que PKC tambm possui a caracterstica de decodificador de freqncias, com uma complexidade adicional em relao a CaMKII, pois a atividade da PKC altamente estimulada por DAG. Desta forma, os sinais em forma de freqncia de picos de Ca2+ podem ser sinergizados pela presena do DAG.

2.1.4.5. Retroalimentao e ciclos

Retroalimentaes, tanto negativas como positivas, so mecanismos de regulao encontrados nos mais diversos processos, entre os quais inmeros exemplos podem ser encontrados no metabolismo. Na sinalizao celular, mecanismos de retroalimentao so fundamentais retroalimentaes negativas so importantes mecanismos de terminao da sinalizao, enquanto retroalimentaes positivas podem guardar informao em forma de ciclos autoativveis, que so resistentes ao turnover normal dos seus componentes, sendo, por enquanto, os principais candidatos moleculares da memria celular e do organismo.

2.1.4.5.1. Retroalimentaes negativas e a terminao da sinalizao

Cherniack et al. (1995) mostraram que a rpida dessensibilizao da sinalizao ativada pela insulina acontece pela dissociao de Grb2 e Sos e atravs

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da fosforilao por ERK, desacoplando esta protena da Grb2, levando inibio deste complexo de sinalizao, tendo como conseqncia a inativao dos componentes da cascata das MAPKs. Esta inibio tambm afeta as demais isoformas de cascata da MAPKs ativadas por Ras, caracterizando uma retroalimentao negativa no somente para a cascata da ERK, mas tambm para outras sinalizaes dependentes da ativao da Ras, como a cascata das JNKs (Waters et al. 1995 e Chen et al. 1995b).

2.1.4.5.2. Retroalimentaes positivas e memria celular

Um dos principais argumentos contrrios sugesto da memria ser gua rdada em protenas, a sua rpida sntese e degradao, em um turnover que raramente ultrapassa alguns meses, sendo que memrias podem e precisam ser guardadas por muito mais tempo. Lisman e Goldring, (1988) primeiramente sugeriram que a memria pudesse ser guardada em um ciclo de retroalimentao positiva da CaMKII. Esta quinase ativada por Ca2+/CaM, o que possibilita que subunidades adjacentes de um complexo multienzimtico da CaMKII possam se fosforilar mutuamente (autofosforilao intermolecular), tornando a CaMKII ativa e independente da presena de Ca2+/CaM. Isto faz com que, teoricamente, a CaMKII permanea ativa por tempo indeterminado, mesmo que algumas unidades da enzima sejam degradadas e outras sejam sintetizadas e prontamente ativadas atravs da fosforilao mediada pela grande quantidade de CaMKII ativa em uma determinada holoenzima. Recentemente, Bhalla e Yengar, (1999), sugeriram que tal ciclo de retroalimentao positiva tambm pudesse ocorrer envolvendo as MAPKs. ERK pode fosforilar e ativar a cPLA2 (Lin et al. 1993), que por sua vez, atravs da produo de cido araquidnico, pode ativar PKC, (Muller et al. 1995) que pode ativar a cascata da ERK atravs da ativao de cRaf-1 ou MEK. Estudos tericos demonstraram que este ciclo de retroalimentao positiva perfeitamente habilitado para a estocagem de informao. interessante mencionar tambm que, devido a alta integrao da cascata da ERK, este mecanismo teria uma possibilidade de regulao imensa e complexa.

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2.2. Parte 2. Purinas e pirimidinas como transmissores.

Purinas (ATP, ADP e adenosina) e pirimidinas (UTP e UDP) extracelulares so importantes molculas sinalizadoras, mediando efeitos biolgicos diversos, atravs de receptores denominados purinoceptores (Ralevic, Burnstock, 1998). Estas molculas sinalizadoras possuem muitas caractersticas em comum com outros sinalizadores, pois tambm possuem um tamanho relativamente reduzido e provm de molculas extremamente abundantes dentro da clula, facilitando a sua biodisponibilidade, mas exigindo mecanismos de liberao e degradao bastante eficientes. Purinas e pirimidinas extracelulares possuem efeitos importantes e diversificados sobre muitos processos biolgicos, incluindo neurotransmisso, contrao do msculo liso, secreo, resposta imune, inflamao, agregao plaquetria, dor, modulao da funo cardaca, entre outros. Historicamente, o conceito de sinalizao mediada por purinas foi proposto nos primrdios da pesquisa em bioqumica por Drury e Szent-Gyrgyi, (1929). Gillespie, (1934) foi o primeiro a descrever uma relao entre a atividade das purinas e a sua estrutura, demonstrando que a deaminao reduzia enormemente a atividade e que a defosforilao influenciava no somente a potncia, mas tambm o tipo de resposta, sendo que ATP induzia a um aumento da presso sangnea, enquanto adenosina produzia hipotenso, indicando, pela primeira vez, a existncia de diversos receptores purinrgicos, com efeitos at antagnicos. Existem duas grandes famlias de purinoceptores, os receptores do tipo P1, ou de adenosina e os receptores do tipo P2, que reconhecem principalmente ATP e UTP e seus anlogos difosfatados, sendo que estes tambm so subdivididos, como mostrado na Tabela 4.

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Tabela 4. Famlias de receptores para purinas e pirimidinas.

Receptores Adenosina / P1 Ligante Natural Tipo Subgrupo Subtipos
a

Receptores P2 ATP, ADP, UTP, UDP Canal Inico P2X P2X1-7, P2Xna Acoplado Protena G P2Y P2Y1, 2, 4, 6, 11

Adenosina Acoplado Protena G A1, A2A, A2B, A3,

Receptores heteromricos, como por exemplo P2X2P2X3.

2.2.1. Liberao e efeitos fisiolgicos

O ATP citoslico pode alcanar o meio extracelular atravs da lise celular ou do transporte atravs da membrana. Alm destes mecanismos, o ATP tambm foi encontrado em vesculas, geralmente juntamente com outros neurotransmissores como a serotonina, a acetilcolina e a noradrenalina (Boarder, Hourani, 1999). Surpreendentemente, Maienshein et al. (1999) mostraram que ATP pode ser liberado atravs da secreo de vesculas em culturas de astrcitos, atravs de mecanismos que envolvem as mesmas protenas envolvidas na liberao de neurotransmissores nos neurnios, como sinaptobrevina, sinaptofisina entre outros. Contudo, o envolvimento destas protenas na liberao fisiolgica de ATP ainda no foi determinado. Lazarowski et al. (1997) demonstraram que ATP e UTP podem ser liberados de clulas epiteliais e astrocitomas por estimulao mecnica, mas novamente, as implicncias fisiolgicas so discutveis. Considerando que a concentrao intracelular de ATP est em torno de 4-5 mM (Marks et al. 1996), enquanto que os EC50 da maioria dos receptores para o ATP esto na faixa de nM-M, demonstra o grande potencial do ATP como sinalizador de lise celular. Esta grande diferena entre concentrao intracelular e o EC50 indica que a transmisso purinrgica perfeitamente capaz de detectar a quebra de uma quantidade muito pequena de clulas e, considerando o tamanho reduzido desta molcula, com uma velocidade de difuso comparvel a dos neurotransmissores.

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Estudos eletrofisiolgicos indicaram que o ATP pode mediar correntes sinpticas no CNS, muito provavelmente atravs dos receptores acoplados a canais inicos P2X (Edwards, Gibbs, 1993). O ATP tambm pode atuar como neuromodulador, por exemplo, potencializando as correntes induzidas por glutamato em fatias de corda espinhal (Li, Perl, 1995), ou modulando a liberao de noradrenalina de gnglios simpticos, tanto positivamente, atravs de receptores P2X, como negativamente, atravs de receptores P2Y (Boehm, 1999). ATP ativa a ERK e mitognico em astrcitos (Neary et al. 1994) e clulas da tireide (Trnquist et al. 1996) e aumenta de forma sinergstica a proliferao induzida por diversos agentes mitognicos, como FGF-2 em astrcitos (Neary

et al. 1994), PDGF, TGF e EGF em fibroblastos e queratincitos (Wang et al. 1990) e PMA, EGF, PDGF, insulina e adenosina em linhagens Swiss 3T3 (Huang et al. 1989). O principal produto da degradao de ATP, a adenosina, tambm um importante neuromodulador, por exemplo, diminuindo a liberao de GABA e aumentando a liberao de acetilcolina induzida por despolarizao em terminais nervosos do caudato putamen (Kurokawa et al. 1994). Na sinalizao purinrgica, existe um eficiente mecanismo de terminao da sinalizao, na qual o ATP e ADP so hidrolisados a adenosina por uma cascata de enzimas. As ecto-ATPase hidrolisam ATP a ADP, enquanto que ectodifosfohidrolases (ecto-apirases) hidrolisam ATP e ADP a AMP, que por sua vez hidrolisado a adenosina por ecto-5-nucleotidases (Zimmermann, 1996). A adenosina o principal agonistas dos receptores P1, sendo que recaptada por transportadores de nucleosdeos (Linden, 1999). Os receptores P1 e P2Y so acoplados a protenas G e compartilham alguns mecanismos de dessensibilizao. A dessensibilizao rpida (alguns minutos) parece ser mediada pela fosforilao de stios especficos no receptor por quinases especficas para receptores acoplados protena G (GRKs) ou outras quinases, como a PKA. Esta fosforilao promove a ligao a protenas denominadas arrestinas, que desacoplam os receptores da protena G. Outro mecanis-

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mo de dessensibilizao envolve o sequestro dos receptores em compartimentos intracelulares (Ralevic, Burnstock, 1998).

2.2.2. Receptores P1 ou de Adenosina

Os receptores P1 respondem principalmente a adenosina e so divididos em quatro subtipos, A1, A2A, A2B, A3, todos acoplados protena G e classific ados desta forma baseados em evidncias moleculares, bioqumicas e farmacolgicas. Os receptores P1 esto acoplados aos principais efetores regulados por protenas G, como a AC, a fosfodiesterase, fosfolipases, canais de K+ e Ca2+. A ativao dos subtipos A2A, A2B induzem um aumento de cAMP, sendo que o subtipo A2B tambm aumenta os nveis de IP3. Os subtipos A1, A3 esto ligados ao aumento de IP3 e diminuio de cAMP, sendo que o subtipo A tambm 1 pode estimular a permeabilidade das membranas ao on K+ e diminuir a entrada de Ca2+ (para reviso ver Ralevic, Burnstock, 1998). Adenosina ativa as trs isoformas de MAPK (ERK, JNK e p38) em corao reperfundido (Haq et al. 1998) e ERK em clulas endoteliais (Sexl et al. 1997). Em culturas de astrcitos, receptores de adenosina esto acoplados ao aumento de cAMP e de Ca2+ intracelular (Peakman, Hill, 1994 e 1995), mas no ERK (Neary, Zhu, 1994).

2.2.3. Receptores P2
Os receptores P2 so divididos em dois grupos bem distintos, baseado tanto em caractersticas estruturais como funcionais, em ionotrpicos (P2X) e metabotrpicos (P2Y). At o momento sete receptores P2X e cinco receptores P2Y de mamferos foram clonados, caracterizados e aceitos com membros vlidos de suas respectivas famlias.

2.2.3.1. Ionotrpicos (P2X)

Estes receptores foram identificados primeiramente pela preferncia a anlogos estveis de ATP, como ,-MeATP ou ,-MeATP (,(,)-methyl-

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ATP), em contraste 2-metiltio ATP (2-MeSATP - 2-Methylthio ATP), que inicialmente foi considerado um agonistas especfico para os receptores P2Y. At recentemente foram clonados sete receptores (P2X1-7), sendo que um receptor funcional formado por 3 subunidades, possibilitando a formao de receptores homomricos ou heteromricos. Considerando que muitos destes receptores so expressos na mesma clula, a formao de receptores heterotrimricos pode produzir um grande nmero de receptores com caractersticas farmacolgicas e funcionais diferenciados (Ralevic, Burnstock, 1998). Os receptores P2X so acoplados a canais inicos, com a seguinte permeabilidade inica: Ca2+>>Na+>K+. Desta forma, a principal via de sinalizao ativada por estes receptores o aumento da concentrao intracelular de Ca2+, tanto pela via direta como atravs de canais de Ca2+ dependentes de voltagem. Estes receptores so os responsveis pela sinalizao rpida (em aproximadamente 10ms) em comparao sinalizao lenta mediada pelos receptores P2Y, que ativam sinalizaes em torno de 100ms (Ralevic, Burnstock, 1998). O principal agonistas destes receptores o ATP, sendo que os outros nucleotdeos (ADP, UTP, UDP) no possuem afinidade, ou uma afinidade muito reduzida (Boarder, Hourani, 1998).

2.2.3.2. Metabotrpicos (P2Y)

Receptores purinrgicos do tipo P2Y so caracterizados por serem receptores acoplados protena G, tendo portanto a estrutura caracterstica dos receptores metabotrpicos. Levando em conta as diferenas considerveis que foram encontradas quando receptores de animais diferentes foram comparados, principalmente na resposta aos agonistas, sero enfatizados nesta reviso somente os receptores clonados de rato, quando disponveis. Como no existem agonistas seletivos para os subtipos de P2Y, muitas caractersticas so baseadas nas semelhanas entre o efeito de um conjunto de agonistas em receptores clonados comparado com os efeitos observados em culturas de clulas. Devido a isto, Ralevic e Burnstock (1998) sugeriram que receptores identificados por intermdio de estudos farmacolgicos em clulas no

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transfectadas, isto , o receptor endgeno, fossem acrescidos do sufixo like, isto , as caractersticas deste receptor parecido com um determinado receptor clonado. Esta classificao substitui a anterior, baseada somente em caractersticas farmacolgicas. Por exemplo, o que era conhecido como purinoceptor P2U corresponde ao receptor P2Y2-like. A seguir, cada um dos receptores P2Y sero descritos em maiores detalhes12. A Figura 9 mostra as relaes entre as seqncias destes receptores, bem como um resumo das sensibilidades aos agonistas. Receptor P2Y6 Rato P2Y4 Rato P2Y2 Rato P2Y1 Rato P2Y11 Humano Sensibilidade aos agonistas* UTP = 2-MeSATP > ATP ATP = UTP ATP = UTP 2-MeSAD(T)P > AD(T)Pa ATP > 2-MeSATP

Figura 9. Dendograma representando a relao entre as seqncias dos subtipos de receptores P2Y, bem como a sua sensibilidade aos agonistas purinrgicos.
Adaptado de Communi et al. (1997) sendo as comparaes das seqncias de ratos realizadas com Fasta/Swissprot. a) a sensibilidade ao ATP e ao 2MeSATP parece depender da concentrao do receptor (Palmer et al. 1998). *Somente agonistas utilizados no presente estudo. As referncias utilizadas nesta figura esto na legenda da Tabela 5.

Embora 11 subtipos de receptores tenham sido inicialmente classificados como P2Y, somente os subtipos P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, so aceitos pela literatura como P2Y funcionalmente expressos em mamferos. Dentre estes, somente o P2Y11 no foi clonado em ratos (Ralevic, Burnstock, 1998). As caracterizaes dos receptores P2Y foram realizadas em diversas clulas e avaliando diversos efeitos, como corrente de membrana (Imembrana),

12

Para reviso de todos os artigos com as clonagens, ver Ralevic e Burnstock, (1998).

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[Ca2+]i, IP3 ou cAMP. A Tabela 5 mostra as potncias dos agonistas observados nestes estudos, bem como as clulas e os efeitos utilizados.

Tabela 5. Sensibilidade dos receptores P2Y recombinantes aos agonistas purinrgicos em clulas transfectadas.
Receptor rP2Y1 rP2Y2 rP2Y4(c) rP2Y4 (d) rP2Y6 hP2Y11 Potncia dos agonistas 2-MeSAD(T)P>AD(T)P (no UTP) ATP=UTP>UDP>GTP ATP=UTP (no ADP, UDP e 2-MeSATP) ATP= UTP= 2-MeSATP=ADP>UDP(b) UTP>ADP=2-MeSATP>>ATP ATP>2-MeSATP (no UTP e UDP)
(a)

Clulas Endoteliais 1321N1 Glioma Jurkat Xenopus oocytes C6-15 glioma

Efeito [Ca2+]i [Ca2+]i [Ca2+]i Imembrana [Ca2+]i

1321N1 e CHO-K1 IP3 e cAMP

r rato e h - humano a A resposta a ATP e 2-MeSATP parece depender da concentrao do receptor (Palmer et al. 1998). A clonagem foi realizada por Tokuyama et al. (1995). b ADP, UDP e 2-MeSATP so agonistas parciais, ativando somente 25% da atividade mxima induzida por UTP, mas com potncias similares ao ATP e UTP. Referncias esto organizadas por subtipo de P2Y: 1. Hechler et al. (1998) 2. Chen et al. (1996), 4. (c) Webb et al. (1998) e (d) Bogdanov et al. (1998), 6. Chang et al. (1995), 11 Communi et al. (1997).

Outros receptores foram clonados e identificados como fazendo parte da famlia dos receptores P2Y, mas evidncias convincentes tem demonstrado que estes receptores somente possuem alguma homologia com os receptores P2Y, mas no apresentam as caractersticas farmacolgicas e estruturais destes. Os falsos P2Y so: P2Y5, P2Y7, P2Y9, P2Y10 (Ralevic, Burnstock, 1998). Um outro receptor foi clonado da placa neural de Xenopus e identificado como P2Y8 (Bogdanov et al. 1997), mas o seu homlogo ainda no foi clonado em mamferos.

2.2.3.2.1. Receptor P2Y1

Este receptor foi clonado de vrios tipos celulares em pelo menos seis animais, sendo que foi observado uma certa variao entre estes clones. Tokuyama et al. (1995) e Simon et al. (1995) mostraram que, em clones prove-

60

nientes de rato e pinto, 2-MeSATP foi o agonista mais potente, seguido de ATP, sendo que UTP foi inativo. Em clones de humanos (Lon et al. 1997) e bovinos (Henderson et al. 1995), ADP e 2-MeSADP se mostraram os agonistas mais potentes, enquanto que ATP e 2-MeSATP se mostraram antagonistas. Posteriormente, estudos que consideraram a pureza dos nucleotdeos, indicaram que o receptor de rato na realidade tambm tem como principais agonistas ADP e 2-MeSADP, com ATP e 2-MeSATP sendo antagonistas (Hechler et al. 1998). De acordo com estes estudos, em diversos casos, receptores endgenos P2Y1-like foram mostrados como sendo insensveis a ATP (Dixon et al. 1995; Ralevic, Burnstock, 1996; Webb et al. 1996). Por outro lado, Palmer et al. (1998) mostraram que em condies de transfeco na qual altas concentraes do receptor foram atingidas, ATP e 2MeSATP foram agonistas potentes. Somente quando este receptor foi downregulado, que o efeito destes agonistas foi muito reduzido e neste caso, ADP e 2-MeSADP foram os agonistas mais potentes. Desta forma, o receptor P2Y1 pode ser considerado responsivo tanto a ADP e 2-MeSADP bem como aos seus homlogos trifosfatados, sendo a intensidade da resposta dependente da concentrao do receptor. Os principais mecanismos de sinalizao ativados pelo receptor recombinante P2Y1 a ativao de PLC e a conseqente formao de IP3 e o aumento no Ca2+ intracelular (Simon et al. 1995). A protena G envolvida parece ser a Gq11, que ativa a PLC atravs da subunidade , sendo insensvel PTx (Waldo et al. 1991; Maurice et al. 1993). Em contrapartida, os receptores P2Y1-like acoplados a inibio da AC so bloqueados pela PTx, indicando o envolvimento da protena Gi (Boyer et al. 1995; Berti-Mattera et al. 1996).

2.2.3.2.2. Receptor P2Y2

O receptor P2Y2, previamente conhecido como P2U, responde igualmente a ATP e a UTP, sendo insensvel, ou somente pouco sensvel a 2MeSATP e nucleotdeos difosfato. Este receptor foi clonado primeiramente em camundongos (Lustig et al. 1993), posteriormente em ratos (Chen et al. 1996a),

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sendo que a sensibilidade aos diferentes agonistas semelhante entre as espcies, ao contrrio do que acontece com o receptor P2Y1 e P2Y4. Suramina e PPADS (Pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2, 4-disulfonic acid) so antagonistas no seletivos para subpopulaes de receptores P2Y2-like, sendo que astrcitos de rato foram descritos como possuindo receptores sensveis a suramina e ao PPADS (Ho et al. 1995). Este receptor parece bastante distribudo pelo organismo, como demonstrado por estudos nos quais mRNA de receptor P2Y2 foi encontrado no bao, testculos, rins, fgado, pulmo, corao e crebro de camundongo (Lustig et al. 1993).

2.2.3.2.3. Receptor P2Y4

O receptor P2Y4 foi clonado de humanos (Communi et al. 1996 e Nguyen et al. 1996) e de ratos (Bogdanov et al. 1998 e Webb et al. 1998). Este receptor um bom exemplo das diferenas observadas entre receptores clonados de animais diferentes. Enquanto o receptor P2Y4 de humanos seletivo para nucleotdeos da uridina (UTP e UDP) com ATP sendo somente um agonista parcial na estimulao da produo de IP3 (Communi et al. 1996) e no possuindo nenhum efeito no aumento do Ca2+ intracelular (Nguyen et al. 1996), o receptor P2Y4 de rato responde de forma similar ao ATP e UTP, sendo portanto bastante parecido com o receptor P2Y2, tanto farmacologica quanto estruturalmente (47% semelhana - Swiss Prot, Bogdanov et al. 1998 e Webb et al. 1998). A melhor forma de diferenciar os receptores P2Y2 de P2Y4 em ratos parece ser a utilizao do antagonista suramina, que inibe aquele mas no este receptor (Bogdanov et al. 1998).

2.2.3.2.4. Receptor P2Y6

O receptor P2Y6 especfico para nucleotdeos da uridina, tendo sido clonado de rato (Chang et al. 1995) e de humano (Communi et al. 1996). A sensibilidade do receptor de rato para os agonistas purinrgicos UTP>ADP=2MeSATP>>ATP. Este receptor foi encontrado no pulmo, estmago, intestino e bao, no sendo encontrado no crebro (Chang et al. 1995).

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Os mecanismos de transduo de sinal ativados pelo receptor P2Y6 de rato expresso em linhagens de gliomas do tipo C6-15 so a formao de IP3, atravs de uma protena G independente de PTx, aumento do Ca2+ intracelular e a ausncia de efeito sobre a AC (Chang et al. 1995).

2.2.3.2.5. Receptor P2Y11

Este receptor foi clonado de humano e embora apresente uma homologia relativamente baixa com o receptor P2Y1 (33% segundo Communi et al. 1997), possui os quatro aminocidos fundamentais para a ligao de nucleotdeos, caracterizando a sua incluso na famlia de P2Y (Erb et al. 1995). Este o nico receptor P2Y que responde exclusivamente ao ATP (e ao seu anlogo no fisiolgico 2-MeSATP), sendo que ADP muito pouco ativo e UTP e UDP no ativam este receptor. O mRNA deste receptor foi encontrado principalmente no bao, sendo que a sua presena no CNS no foi avaliada. O receptor P2Y11 ativa a AC, de forma peculiar entre os P2Y. Alm disto tambm induz o aumento do Ca2+ intracelular e a produo de IP3 (Communi et al. 1997).

2.2.4. Mecanismos de sinalizao ativados por receptores P2Y

Os receptores metabotrpicos P2Y ativam principalmente as fosfolipases,
2+ que levam produo de DAG e ao aumento do Ca intracelular com a conse-

qente ativao de vrias quinases e fosfatases, como a PKC. Tambm foram descritos vrios outros mecanismos de sinalizao regulados por receptores P2Y, entre as quais podem ser destacados a cascata das MAPK, AC, cPLA2, canais de K+ dependentes de Ca2+, PLD e produo de fosfatidilcolina (Ralevic, Burnstock, 1998). Todos os receptores P2Y caracterizados at o momento so acoplados produo de fosfoinositdeos, mediados por Gi/o e/ou Gq11 dependendo do tipo celular ou subtipo de receptor P2Y estudado (Chang et al. 1995, Lazarowski et al. 1997). O ATP induz um aumento caracterstico de Ca2+ intracelular em astrcitos (Neary et al. 1991) e clulas endoteliais de capilares cerebrais (Albert et al. 1997), com um pico inicial, que depende da liberao de Ca2+ dos estoques in-

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tracelulares e uma fase duradoura, dependente do Ca2+ externo, sendo esta entrada de Ca2+ externo provavelmente mediada pelos receptores P2X. A ativao dos receptores P2Y1, P2Y2, P2Y4, inibe a produo de cAMP atravs da protena Gi (Boyer et al. 1995, Webb et al. 1996), rP2Y6 no altera cAMP (Chang et al. 1995), enquanto que o receptor hP2Y11, de forma peculiar entre os P2Y, estimula a produo de cAMP (Communi et al. 1997). Os estudos acima so referentes a receptores transfectados. J os purinoceptores expressos em culturas apresentam algumas diferenas quando comparados com os transfectados, tanto na resposta aos agonistas como em relao aos mecanismos de sinalizao ativados. Por exemplo, na regulao da AC induzida por ATP e UTP, e provavelmente mediada pelo receptor P2Y2-like, tambm foi encontrada uma variabilidade considervel entre os diferentes tipos celulares. A ativao do receptor P2Y2-like inibe a AC em gliomas C6-2B e clulas renais mesangiais atravs de um mecanismo sensvel PTx e acompanhado do aumento de Ca2+ intracelular (Munshi et al. 1993 e Schulze-Lohoff et al. 1995), enquanto que em uma linhagem celular de epitlio renal, MDCK-D1, o receptor P2Y2-like induz o aumento de cAMP (Post et al. 1996). Um aumento de cGMP dependente do aumento de Ca2+ intracelular tambm foi observado e creditado aos receptores P2Y2-like em clulas hbridas de gliomas de rato e neuroblastomas de camundongo (Reiser, 1995). Neary, Zhu, (1994) mostraram que ATP ativa MAPK (ERK) em cultura primria de astrcitos, sendo este efeito mediado pelo prprio ATP e no por um dos seus produtos de degradao. Agonistas de receptores P1, como a adenosina, ou os anlogos resistentes recaptao, 2-cloroadenosina e ciclohesilad enosina, no tiveram nenhum efeito sobre a atividade da ERK enquanto que ATPS, um agonista de receptores P2 resistente degradao, ativou ERK de forma semelhante ao ATP. Estudos com antagonistas comprovaram esta observao, pois um antagonista especfico de receptores P1, 8-(p-sulfonfenil)teofilina, no teve influncia na ativao da ERK por ATP, enquanto que suramina bloqueou este efeito em aproximadamente 60%. A ativao de ERK em cultura de astrcitos tambm foi descrita por Munsch et al. (1998). 64

A ativao de ERK por agonistas purinrgicos tambm foi observada em outros tipos celulares, como em culturas de clulas endoteliais de capilares do CNS (Albert et al.. 1997) e PC12 (Sotthoff et al. 1998). Neste estudo, ATP e UTP tiveram um EC50 similar, levando os autores a concluir que os receptores P2Y2 esto envolvidos. Esta ativao foi inibida pelo bloqueio da PKC, de protenas Gi (PTx) e Ca2+ intracelular (BAPTA-AM). Um estudo subseqente (Soltoff, 1998) mostrou que UTP ativa ERK por um mecanismo de transativao do receptor de EGF em linhagens PC12, sendo este mecanismo dependente do aumento de Ca2+ intracelular, PKC e Pyk2. Embora neste trabalho seja argumentado que esta ativao seja mediada pelo receptor P2Y2, a fosforilao do EGFR induzida por ATP foi muito menor do que a induzida por UTP, indicando diferenas entre as sinalizaes ativadas por estes dois agonistas purinrgicos tambm nestas clulas. Utilizando clulas de msculo liso, Wilden et al. (1998) mostraram que ATP e UTP ativam ERK com uma potncia e uma curva de tempo bastante similares. Interessantemente, enquanto a inibio de MEK (com PD098059) inibiu tanto a ativao de ERK como a induo de proliferao por ATP, a inibio de PI3K (com Ly294002) inibiu a proliferao mas no ativao de ERK. A ativao da ERK em resposta a agonistas purinrgicos est envolvida em diversos papis fisiolgicos, como a produo de prostaciclinas mediada pela ativao dos receptores P2Y1-like e P2Y2-like em clulas endoteliais, em um mecanismo que envolve a produo de IP3, aumento de Ca2+ intracelular e ativao da PKC (Bowden et al. 1995 e Patel et al. 1996). A ativao da ERK fundamental para a induo da proliferao celular em astrcitos, (Neary et al. 1999) e em culturas de clulas do msculo liso de aorta atravs do receptor P2Y1-like (Yu et al. 1996).

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2.3. Parte 3. Astrcitos

Na ltima dcada, as clulas gliais passaram de meras clulas de suporte neuronal para componentes ativos do sistema nervoso central. Crucial para esta mudana de viso foi a descoberta de receptores adrenrgicos nos astrcitos (Kimelberg, Norenberg, 1989), o que mostrou que estas clulas, apesar de no serem excitveis, podem responder s mudanas do meio extracelular. Nestes dez anos foram identificados representantes de praticamente todas as famlias de receptores nos astrcitos (Verjhratsky, Kettenmann, 1996). As clulas gliais encontradas no CNS so astrcitos, oligodendrcitos e microglias, classificadas desta forma segundo a sua origem ontogentica e segundo o tamanho do pericrio glial, sendo os astrcitos as clulas mais abundantes e os maiores representantes das clulas gliais. Muitas funes tem sido atribudas aos astrcitos, incluindo transporte celular durante o desenvolvimento, homeostase inica, captao de neurotransmissores, contribuies para o sistema imune do CNS e neuromodulao (Ridet et al. 1997). Outro importante papel dos astrcitos atuar na preservao e recuperao do tecido cerebral aps injria cerebral, em um processo denominado astrogliose reativa. Nesta, os astrcitos hipertrofiam e proliferam, em um complexo processo para prevenir que a leso atinja outras partes do CNS e tambm que a parte afetada possa ser adequadamente recuperada. Astrcitos reativos apresentam variaes na expresso de diversos genes, como os componentes do citoesqueleto GFAP e vimentina, normalmente utilizados como marcadores de gliose reativa. A expresso de diversas enzimas, gangliosdeos, fatores de transcrio, protenas de choque trmico, molculas de reconhecimento, fatores de crescimento e citocinas tambm so alteradas (revisado por Ridet et al. 1997). Dentre os fatores de crescimento que apresentam sua expresso aumentada na gliose reativa esto o NGF e seu receptor p75NGF, (Junier et al. 1994) e o FGF-2 e seu receptor (Riva et al. 1994 e Gall et al. 1994).

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2.3.1. Interrelao Glia-glia e Glia-neurnio

Parece bvio que para desempenhar e orquestrar todas estas funes, os astrcitos devem estar em comunicao constante com os neurnios e com os outros astrcitos. Para tal, os astrcitos expressam em sua superfcie uma grande variedade de receptores (Glowinski et al. 1994) e canais inicos (Sontheimer, 1994), conectados a suas devidas respostas por mecanismos de transduo de sinal semelhantes aos que ocorrem em outras clulas. Um dos principais candidatos para mediar esta comunicao entre neurnios e astrcitos o glutamato (Dani et al. 1992 e Steinhuser, Gallo, 1996) sendo que estudos em nosso laboratrio demonstraram a existncia de receptores metabotrpicos em clulas gliais que podem regular a fosforilao da GFAP (Wofchuk, Rodnight, 1994). Outros neurotransmissores tambm agem sobre os astrcitos, como por exemplo a noradrenalina, que pode alterar a morfologia glial (Shao, McCarthy, 1994). Defendendo uma interao muito grande entre neurnios e astrcitos, Araque et al. (1999) sugerem a existncia funcional de sinapses tripartite composta da pr e ps-sinapse e da glia que envolve estes (astrcito no CNS e clula de Schwann na placa motora).

2.3.2. Receptores purinrgicos nos astrcitos

O ATP possui inmeros efeitos sobre astrcitos em culturas, como proliferao (Neary et al. 1994) e aumento de Ca2+ intracelular, com um pico inicial mediado pela liberao de Ca2+ dos estoques intracelulares e depois um aumento sustentado, dependente de Ca2+ externo, e provavelmente mediado por receptores P2X (Neary et al. 1991, Walz et al. 1994 e Ballerini et al. 1996). Contudo, quelantes de Ca2+ externo (EGTA) e interno (BAPTA-AM) no tiveram efeito sobre a estimulao de ERK induzida por ATP, indicando que a via de sinalizao usada pelo ATP para ativar ERK dispensa o aumento de Ca2+ intracelular (Neary et al. 1999). Estudos com RT-PCR usando primers designados para amplificar as regies do cDNA que codificam os subtipos de receptores P2Y clonados de rato, P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, demonstraram a presena de P2Y1, P2Y2, P2Y4 em 67

astrcitos, sendo que o subtipo P2Y6 no foi encontrado, embora com os mesmos primers foi possvel encontrar este subtipo de receptor em tecido de corao de rato (Nie, Neary em Lenz et al. 2000). Em astrcitos da corda espinhal, Ho et al. (1995), mostraram que UTP produz um aumento de Ca2+ intracelular, inibido por tapsigargina, no afetado pela retirada de Ca2+ extracelular, ou por PTx. Estudos com dessensibilizao indicaram a existncia funcional de dois receptores, ou grupos de receptores, ativados por 2-MeSATP e UTP.

2.3.3. Outros GPCRs presentes nos astrcitos

Alm dos purinoceptores, os astrcitos expressam uma grande variedade de GPCR. A seguir sero discutidos os receptores ativados por agonistas utilizados no presente trabalho.

2.3.3.1. Receptores adrenrgicos

Os receptores adrenrgicos so subdivididos em dois grandes grupos: e . Os receptores -adrenrgicos so acoplados a protenas Gq/11 (1 subtipos AC) ou Gi/o (2 subtipos A-C). J os receptores -adrenrgicos (subtipos 1-4) so ligados protena Gs (Alexander, Peters, 1999). Inmeras evidncias indicam que em culturas de astrcitos, os principais receptores adrenrgicos so os subtipos , pois agonistas -adrenrgicos induzem aumento de cAMP (Balzs et al. 1998). Feinstein et al. (1993) mostraram que os efeitos da noradrenalina (NA noradrenaline) so bloqueveis por um antagonista -adrenrgico, mas no -adrenrgico. Em concordncia com estes estudos, Enkvist et al. (1996) mostraram que em culturas de astrcitos corticais os principais receptores adrenrgicos so do tipo , sendo que existe um nmero muito reduzido de receptores 2-adrenrgicos.

2.3.3.2. Receptores Serotoninrgicos

Sete tipos de receptores serotoninrgicos (5-HT) foram descritos at o momento (Alexander, Peters, 1999). Receptores 5-HT1 (subtipos A-F) so aco68

plados protena Gi/o, receptores 5-HT (subtipos A-C) so acoplados prote 2 na Gq/11 e os subtipos 5-HT4, 5-HT6 e 5-HT7 so acoplados protena Gs. O acoplamento do receptor 5-HT5 ainda no est bem estabelecido e o receptor 5HT3 ionotrpico (Alexander, Peters, 1999). Culturas primrias de astrcitos corticais expressam uma grande variedade de receptores 5-HT, sendo que estudos com RT-PCR detectaram a expresso dos receptores 5-HT1 (subtipos A, B, D, F), 5-HT2 (subtipos A, B, C), 5-HT5B, 5HT6 e 5-HT7 (Hirst et al. 1998). Contudo, estudos funcionais indicaram que agonistas seletivos aos receptores 5-HT1 no inibiram a produo de cAMP, indicando que, apesar da presena do mRNA, os receptores no so funcionais. Os receptores 5-HT2 atuando atravs de PLC/IP3, parecem mediar o aumento de Ca2+ intracelular observado em culturas de astrcitos tratados com serotonina (Hagberg et al. 1998 e Jalonen et al. 1997). O subtipo 5-HT2B foi descrito como estando envolvido na ativao da cascata da ERK (Launay et al. 1996). Em relao a presena de receptores 5-HT acoplados a AC, Carson et al. (1996) mostraram que o receptor 5-HT5A expresso em astrcitos e est ligado negativamente com a produo de cAMP, enquanto que Shimizu et al. (1998) demonstraram a presena de receptores 5-HT7 acoplados positivamente com a AC em culturas de astrcitos do crtex frontal de ratos.

2.3.3.3. MAPK nos astrcitos

Tournier et al. (1994) mostraram que fatores de crescimento podem ativar ERK em culturas de astrcitos, como FGF-2, PDGF e EGF. Vrios trabalhos mostraram que ERK em astrcitos pode ser ativada por hipo-osmolaridade (Sinning et al. 1997), glutamato (Peavy, Conn, 1998), lipopolisacardeos bacterianos (Willis, Nisen, 1996) e trombina (Bhat et al. 1995). Neary, Zhu, (1994) mostraram pela primeira vez que ATP ativa MAPK (ERK) em cultura primria de astrcitos agindo em um receptor P2Y atravs de um mecanismo dependente de Protena G sensvel PTx, isto , protena Gi ou Go, fosfolipase D e uma isoforma PKC independente de Ca2+, provavelmente

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PKC (Neary et al. 1999). Outros estudos tambm tm demonstrado o envolvimento de PKC na sinalizao ativada por P2Y, como por exemplo atravs da liberao de cido araquidnico mediada pelo receptor P2Y2 (Stella et al. 1997). importante mencionar que a ativao de ERK por ATP em astrcitos no foi inibida por cAMP, ao contrrio do que aconteceu com a ativao induzida por FGF-2 (Neary, Zhu, 1994), indicando mecanismos diferentes de ativao, principalmente no nvel de cRaf-1, uma vez que esta enzima inibida pela ativao de PKA (ver item 2.1.3.3).

2.3.3.4. Proliferao induzida por ATP e FGF-2

Neary et al. (1994), observaram que o tratamento de culturas primrias de astrcitos com ATP e FGF-2 induz um significativo aumento na incorporao de [3H]-timidina (2 e 14 vezes, respectivamente). Interessantemente, o cotratamento destes dois fatores, induz um aumento de 52 vezes, isto , um expressivo sinergismo entre os efeitos do ATP e FGF-2. Este sinergismo no parece ser mediado pela liberao de fatores de crescimento por microglias, pois estas clulas contaminantes estavam presentes em uma quantidade muito pequena nas culturas de astrcitos (Neary et al. 1994). interessante observar que outros fatores de crescimento como o PDGF e o EGF, apesar de induzirem proliferao isoladamente, no apresentam o sinergismo com o ATP. Tanto NGF como TSH (Thyrotropin) no induziram proliferao, nem quando aplicado isoladamente, nem alteraram a proliferao quando cotratados com FGF-2 (Tournier et al. 1995). Tanto a ativao da ERK quanto a incorporao de [3H]-timidina induzida por ATP foi bloqueada por um inibidor especfico da MEK, o PD098059 (Neary et al. 1999).

2.3.3.5. Gliose reativa

A resposta adequada s leses um fator importantssimo para a sobr evivncia dos seres vivos. Assim, ao longo da evoluo, foram selecionados mecanismos muito complexos e eficientes visando recompor o tecido ou rgo afetado. No CNS existem agravantes, pois a sua funo somente se justifica na

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complexidade de conexes estabelecidas entre os neurnios, no bastando restabelecer a forma macroscpica, mas sendo necessrio reestabelecer tambm a complexidade microscpica formada durante inmeras etapas seqenciais na ontogenia e, portanto, de difcil recuperao. O estudo das leses no CNS possui uma enorme importncia clnica, pois em vrias doenas existe morte neuronal e conseqente reao glial, como: doenas degenerativas, como o mal de Alzheimer, doenas neoplsicas, isquemia e certos tipos de epilepsia, entre outros (Lenz, 1996). A gliose reativa parece ter duas principais funes, quais so, isolar e ocupar o local lesionado e assim permitir o crescimento e o estabelecimento funcional das sinapses. Vrios estudos tm descrito que cicatrizes gliais no so permissveis para o crescimento axonal (Hatten et al. 1991 e Giulian, 1993), embora durante o desenvolvimento os astrcitos sejam excelentes substratos para a migrao neuronal e a guia axonal (Shao, McCarthy, 1994). As respostas gliais a leses parecem ser bastante heterogneas, dependendo da rea afetada e do tipo e intensidade da leso. Astrcitos podem apresentar alteraes morfolgicas, como aumento no tamanho e na quantidade de processos. Niquet et al. (1994) mostraram que astrcitos presentes em regies que apresentam alta morte neuronal apresentaram proliferao e hipertrofia, enquanto que astrcitos presentes em regies de pouca morte neuronal somente apresentaram alteraes hipertrficas. Amat et al. (1996) confirmaram esta observao utilizando leses mecnicas. Considerando que a produo de FGF-2 aumentada aps a leso (Riva et al. 1994) parecendo possuir um papel fundamental na induo da gliose reativa (Eclancher et al. 1996) e que ATP, liberado principalmente por lise celular, tambm possui um importante papel na gliose (Neary et al. 1996), de fundamental importncia o estudo dos efeitos destes dois compostos sobre os astrcitos, no s individualmente, mas tambm concomitantemente. ATP foi descrito como mitgeno nos astrcitos, atuando atravs da cascata das ERK (Neary et al. 1999) e comitgeno com o FGF-2, estimulando sinergisticamente proliferao de astrcitos (Neary et al. 1994).

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3. Objetivos
Considerando que ATP foi descrito como mitgeno nos astrcitos, atuando atravs da cascata das ERK (Neary et al. 1999) e comitgeno com o FGF-2, estimulando sinergisticamente proliferao de astrcitos (Neary et al. 1994), tivemos como principais objetivos: 1. Estudar o mecanismo de ativao da cascata da ERK por ATP; 2. Avaliar os receptores envolvidos na ativao de ERK por ATP e outros agonistas purinrgicos, como UTP e ADP; 3. Estudar o efeito do co-tratamento do ATP e FGF-2 sobre a atividade dos componentes da cascata da ERK.

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4. Materiais e Mtodos
Anti-cRaf-1 foi produzido como descrito por Kyriakis et al. (1992). A ERK-2 (sc- 4024; Santa Cruz Biotechnology) foi utilizada em alguns experimentos com resultados similares aos obtidos com ERK produzida por E. coli (item 4.7). AntiB-Raf (sc- 166-G), MEKK1 (sc- 252), MEKK2 (sc-1089), anti-MEKK2 que tambm reconhece MEKK3 (sc-1089) e proteina A/G-Agarose (sc 2003) foram da Santa Cruz Biotechnology (SCBT). [-32P] ATP e [3H]cAMP foram obtidos da Amersham. Tris-HCl, EDTA, -glicerolfosfato, Triton X-100, glicerol, ortovanadato de sdio, 4-(2-Aminoethil)benzenesulfonilfluoreto) (AEBSF 4-(2-

Aminoethyl) benzenesulfonylfluoride), EGTA, ditiotreitol (DTT - Dithiothreitol), protena de mielina bsica (MBP Myelin Basic Protein), aprotinina, leupeptina e pepstatina A foram obtidas da Sigma.

4.1. Agonistas
Para o tratamento, foi preparado uma soluo 100x dos agonistas (por exemplo, 10mM de ATP) em meio de cultura (o mesmo meio nas quais as clulas se encontravam). O volume adicionado s culturas foi sempre inferior a 1%. Tabela 6. Condies nas quais os agonistas foram utilizados.
Composto ATP UTP 2-MeSATP FGF-2 EGF PDGF NA 5-HT Concentrao 100M 100M 10M 25ng/ml 10ng/ml 2,5ng/ml 10M 10M Fonte Sigma Sigma RBI R, D Systems Sigma Amgen Sigma Sigma Referncia Neary et al. (1994). Neary, Zhu, (1994). Neary, Zhu, (1994). Neary, Zhu, (1994). Neary et al. (1994). Neary et al. (1994). Hildebrand et al. (1996) Saucier, Albert, (1997)

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4.2. Inibidores e ativadores

Da mesma forma os inibidores e ativadores eram preparados em uma soluo 100x em meio de cultura, quando as drogas eram solveis em gua. Para o GF109203X, PD098059 e forscolina, as solues utilizadas tiveram uma concentrao de 1000x, isto , foi adicionado somente 0,1% de dimetilsulfxido (DMSO - Dimethyl sulfoxide ) no meio de cultura, o que por si s no interferiu na atividade da ERK (Neary, comunicao pessoal). Tabela 7. Condies nas quais ativadores e inibidors foram utilizados.
Composto PMA PMA GF109203X Ro 31-8220 PD098059 Forscolina Concentrao 100nM(a) 100nM 5M
(a) (b)

Solvente Meio(f) Meio DMSO Meio DMSO DMSO

Tempo Tratamento 16 h Pr-t. 20 min Pr-t. 20 min Pr-t. 20 min Pr-t. Tratamento

Efeito Ativador das PKCs Degradao (DR) das PKCs Inibidor da PKC Inibidor da PKC Inibidor da MEK Ativador de AC

5M(c) 50M
(d)

10M(e)

a: Johnson et al, (1995) e Borner et al. (1989); b: Toullec et al. (1991); c: Davis et al. (1989); d: Alessi et al. (1995) e Dudley et el., 1995). e: Pucat et al. (1998) f: Foi utilizado o mesmo meio de cultura nos quais as clulas se encontravam no momento do tratamento. PMA e forscolina foram obtidos da Sigma, PD098059 e GF109203X e Ro 31-8220 foram obtidos da Calbiochem.

4.3. Cultura de clulas, tratamento e lise.

As culturas de astrcitos primrias foram obtidas de crtices de ratos neonatos (1 a 2 dias ps-natal), como previamente descrito (Neary et al. 1994 e Vinad et al. 1997). Noventa e nove porcento das clulas foram marcadas com o marcador especfico de astrcitos GFAP (Neary et al. 1994 e Vinad et al. 1997). Os experimentos foram realizados com culturas confluentes de 3 a 5 semanas de idade. Antes do tratamento, as clulas, que tinham sido mantidas meio de Eagle modificado por Dulbeco (DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium) contendo 10% de soro fetal bovino (FCS Fetal Calf Serum), foram colocados em um meio DMEM contendo 0,5% de FCS por 48 hr. Este trata-

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mento teve como objetivo tornar as clulas quiescentes, isto , fazer com que elas estejam na fase G1 do ciclo celular. Aps este tratamento, as clulas tinham aparncia igual s clulas mantidas em 10% de SFB ao microscpio ptico e tambm no foi observado nenhum aumento na quantidade de clulas soltas. Os tratamentos foram realizados pelos tempos e nas concentraes indicadas nas legendas das figuras, sendo que durante o tratamento as clulas foram mantidas na estufa. Aps o tempo de tratamento, o meio foi aspirado e as clulas lavadas duas vezes com PBS13 (NaCl, 120mM, KCl, 2,7mM e H3PO4 10mM, pH 7,4) e lisadas com o tampo de lise (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 50 mM -glicerolfosfato, 1% (w/v) Triton X-100, 10% (v/v) glicerol, 1 mM ortovanadato de sdio, 0,1 mg/ml AEBSF, 50 g/ml aprotinina, 2 M leupeptina, 2 M pepstatina A). As placas foram mantidas sobre o gelo por no m nimo 15 min, sendo em seguida raspadas e o lisado transferido para eppendorfs. Estes foram centrifugados em centrfuga de bancada (ou a 10000 rpm) por 5 min a 4oC. O sobrenadante foi utilizado para a dosagem de protenas e para os ensaios enzimticos. A dosagem de protenas foi realizada pelo mtodo de Peterson, (Peterson, 1979) ou pelo mtodo de Bradford, que baseado na ligao do corante Coomassie brilliant blue G-250 obtido da Bio-Rad (Bradford, 1976).

4.4. Ensaio acoplado da Raf e MAPKKKs

A ativao de cRaf-1 e outras MAPKKKs foi medida utilizando-se um ensaio acoplado no qual GST-MEK e ERK inativas, expressas em bactrias, so usadas em imunoprecipitados de cRaf-1 e das outras MAPKKK como descrito por Kyriakis et al. (1993) e Luo et al. (1996), com pequenas modificaes (veja Figura 10). Sobrenadantes contendo as mesmas quantidades de protenas (80-

Aproximadamente o mesmo volume do meio (4 ml para as placas de 60 mm e 500l para os poos com um dimetro de 15 mm).

13

75

120 ) foram incubados com anticorpos anti-cRaf-1 14 (ou anti-B-Raf, antig MEKK1, anti-MEKK2, dependendo de qual enzima for estudada) por 30 min a 4oC, perodo aps o qual 20 l de protena A/G agarose foram adicionados e incubados a 4oC com agitao durante a noite. As esferas de agarose foram precipitadas por centrifugao (10000rpm por 5 min), o sobrenadante foi desprezado e as esferas de protenas A/G agarose lavadas duas vezes com o tampo de lavagem de Li (100 mM Tris-HCl, pH 7,6, 500 mM LiCl, 1 mM DTT) e duas vezes com tampo de ensaio (TE) (50 mM -glicerolfosfato, pH 7,3, 1,5 mM EGTA, 1 mM DTT, 0,03% Brij 35). Aps secar bem o imunoprecipitado (IP) com o auxlio de papel filtro, 45l de TE foram adicionados e divididos em duas fraes de 25l cada. Amostras foram incubadas com 0,2 Ci [ -32P]-ATP, 10 mM MgCl2, 0,1 mM de ATP por 20 min, a 30oC, na presena (frao 1) ou ausncia (frao 2, veja Figura 10) de 0,2 (5 l) de GST-MEK1 recombinante inativa, seguido g de 0,5 (5 l) ERK-1 inativa por 20 min, aps o qual 13 (5 l) de MBP foram g g adicionados por mais 20 min (tempo de incubao total, 60 min). As reaes foram paradas com a adio de 33 l de 2,5x tampo de amostra de sdio duodecil sulfato (SDS Sodium Dodecil Sulfate) (Laemmli, 1970) e protenas foram separadas por SDS/PAGE (11%). A incorporao de 32P na MBP foi quantificada pelo Packard InstantImager (ou PhosphoImager). Para corrigir os valores da contaminao por ativadores de MEK e ERK nos IPs, os ensaios controles, aos quais GST-MEK no foi adicionada, foram subtrados dos ensaios contendo todos os componentes da cascata (Jelinek et al. 1996). A ativao das MAPKKK em clulas tratadas foi comparada com a atividade de clulas no tratadas e os resultados foram expressos como estimulao relativa. Como, segundo o fabricante, SCBT, o anticorpo anti-MEKK2 possui uma reatividade cruzada com MEKK3, neste trabalho mencionaremos o resultado ob-

As concentraes dos anticorpos utilizados foram as indicadas pelo fabricante. Foi utilizado 2l de Anti-cRaf-1, enquanto que dos outros anticorpos foi utilizado o volume de 10l.

14

76

tido com este AC como MEKK2/3, isto , provavelmente uma mistura, em propores deconhecidas, da atividade destas duas enzimas.

Nenhum tratamento

Astrcitos 3-5sem

...
Mesma quantidade de protena
R R R R R

2x com LiCl 2x com TE

AC 30 min 4 oC

R R

R R R

FGF-2

Astrcitos 3-5sem

Prot. A/G ON 4 oC Agitao

R R

R R R

Lavar

Adicionar 45 l TE ao IP

MEK [32P]-ATP
20 min 30 oC

ERK
20 min 30 oC

MBP
20 min 30 oC

SDS-SB

Secar Contar

TE [32P]-ATP
25 l para cada

ERK
20 min 30 oC

MBP
20 min 30 oC

SDS-SB

C
MEK

FGF
+ +

20 min 30 oC

2110

4291

8238

22997

2181

14759

6.77

Figura 10. Enquema do ensaio acoplado de ativadores de MEK.

AC: Anticorpo (neste caso foram utilizados quatro tipos diferentes de ACs, cRaf-1, B-Raf, MEKK1 e MEKK2/3); Prot. A/G: Protena A/G agarose; TE: Tampo de ensaio; IP; imunoprecipitado; SDS-SB: Tampo de amostra de SDS.

4.5. Ensaio da MEK e da ERK

Para o ensaio da MEK, aos sobrenadantes contendo as mesmas quantidades de protenas (3-8 ) foram adicionados 0,5 (5 l) ERK1 inativa, 0,1 i [ g g C
32

P]-ATP, 10 mM MgCl2, 0,1 mM de ATP por 20 min, a 30oC. As reaes foram

paradas com a adio de 23 l de 2,5x tampo de amostra de SDS (Laemmli, 1970) e as protenas foram separadas por SDS/PAGE (11%). A incorporao de

77

32

P na ERK1 foi quantificada e considerada como atividade da MEK1/2, pois

MEK1/2 a nica quinase conhecida por fosforilar ERK1 (item 2.1.2.2). O ensaio da ERK foi realizado da mesma forma ao ensaio da MEK, com exceo do substrato, que foi MBP. Este substrato tambm pode ser fosforilado por PKC e por p38, sendo que a especificidade conseguida pelo meio de incubao que no favorvel atividade da PKC. Isto foi confirmado em estudos nos quais as PKCs foram ativadas por PMA, mas a MEK inibida por PD098059, isto , as PKCs estavam ativas (como previamente medido) enquanto que a atividade de MEK e ERK estavam inibidas (da Rocha et al. submetido). Isto indica a especificidade deste ensaio para a ERK em relao PKC, j que nenhuma fosforilao da MBP foi encontrada nestas condies. Quanto possibilidade de p38 ser responsvel pela fosforilao da MBP, pode ser argumentado que a atividade obtida com o presente mtodo foi extensivamente comparado com dois outros mtodos reconhecidamente especficos, o ensaio enzimtico da ERK imunoprecipitada e imunodeteco utilizando anticorpos para a ERK fosforilada em T e Y, sendo que nas condies utilizadas no neste trabalho (tratamento com agonistas purinrgicos e fatores de crescimento) as correlaes foram excelentes. Para a publicao do presente trabalho, foram realizados por Neary et al. imunodeteces utilizando o anticorpo contra a dupla fosforilao da ERK e os resultados correlacionaram perfeitamente com os observados utilizando o ensaio acima descrito. Um outro argumento que indica a especificidade deste ensaio a correlao entre os resultados obtidos com o ensaio da ERK e o ensaio da MEK. Contudo, a especificidade desta tcnica deve ser avaliada para cada tipo de estudo, pois muito provavelmente em estudos que envolvem estresse celular, ou ativadores de p38, os resultados possam ser ambguos.

4.6. Ensaio do cAMP

As clulas foram tratadas por 10 min como descrito anteriormente (4.3), exceto que o meio de cultura permanecia com DMEM/10%FCS. As clulas foram lisadas com 200 l de Tris/HCl 50 mM, EDTA 4 mM , pH 7,4 e os lisados foram centrifugados por 5 min a 14,000 rpm. Duas alquotas de 40 l foram retiradas 78

do sobrenadante para dosar protena (Lowry). 50l do mesmo sobrenadante foram colocados em um eppendorf, sobre o qual foram adicionados 50 l de [3H] cAMP e 100 l da protena ligadora (binding protein)15 (PKA - Protena Quinase A, Sigma) no gelo. Os tubos foram imediatamente agitados aps a adio da protena ligadora. Em seguida os tubos foram incubados em gelo de 4 a 16 horas (Tasca et al. 1995). A reao foi parada com a adio de 100 l de carvo ativado16, agitada e centrifugada por 2 min a 14,000 rpm a 4oC. Aps a centrifugao foi retirada uma alquota de 120 l da amostra sobrenadante, sem ressuspender o carvo precipitado, colocada em um vial, sobre o qual foram adicionados 3 ml de lquido de cintilao (Tolueno-Triton- PPO- POPOP) e sendo posteriormente contado no cintilador. A curva de calibrao foi montada como mostrado na Tabela 8.

Tabela 8. Curva de calibrao para a dosagem de cAMP.

Tampo Branco 100 % 2 pmol 4 pmol 8 pmol 12 pmol Amostras 150 l 50 l ---------------Padres ----50 l 50 l 50 l 50 l --Amostras ------------50 l [3H] cAMP Protena LIgadora 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l --100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l

A concentrao de cAMP foi calculada subtraindo-se o valor do branco da amostra (ou a curva, sendo os valores utilizado 100% = 0 pmoles) e extrapolado na curva de calibrao. O valor obtido foi dividido pela protena, para fornecer o valor final de [cAMP] em nmoles/mg protena.

Antes de pipetar a BP com os demais reagentes para o ensaio do cAMP, ela deve ser agitada muito gentilmente e no em agitador de tubos. 16 O carvo deve ficar em um bequer com gua e gelo, enquanto ele pipetado. importante tambm cortar a ponta da ponteira, para facilitar a pipetagem do carvo. No aconselhvel que o carvo permanea em contato com a amostra por mais de 6 min, por isso, prefervel pipetar o carvo em 12 tubos por vez.

15

79

Tabela 9. Solues para a dosagem de cAMP.

Binding Protein Tampo cAMP (TC) Tris/HCl 50mM EDTA 4mM, pH 7,4. [3H] cAMP: [3H] cAMP 10l TC 20ml Soluo Me PKA 10mg TC 10 ml Soluo de uso: Soluo me 1ml Albumina17 160mg TC 15ml

Carvo Carvo ativado 1,3g Albumina 1g TC 50 ml

18

Lquido de Cintilao: 2 l Tolueno 1 l Triton (comum) 16,5 g PPO 250 mg POPOP19

4.7. Produo de protenas atravs de E. Coli transformadas.

Clulas compententes JM109 transformadas com o vetor pGEX contendo o gene da ERK ligada a glutationa-S-transferase (GST glutathione-Stransferase) foram gentilmente fornecidas pelo laboratrio do Dr. J. Avruch da Harvard University. 25 l do estoque destas clulas foram crescidas durante a noite em 5 ml de meio LB/Amp (Tabela 10) a 37oC com agitao a 225 rpm. No dia seguinte foi feito uma diluio de 1:100 em meio 2x YT1 (Tabela 10) (4,5ml/450ml) e crescidos a 37oC at que a densidade ptica em 600nm atingisse 0,5 (aproximadamente 2 a 3 horas). A temperatura das culturas foi reduzida a 25oC por 1 hora sob agitao, aps o qual foi adicionado 0,2mM de IPTG (Isopropyl -D-Thiogalacto-pyranoside) durante a noite.
17

Dissolver bem a albumina no tampo em bequer e em agitador magntico e s depois adicionar a soluo me da protena binding, agitando gentilmente. 18 Dissolver bem a albumina no Tampo e s ento adicionar o carvo, agitar sempre em agitador magntico, mas evitar a formao de muita espuma 19 Agitar bem em agitador magntico por aproximadamente 3 h.

80

Tabela 10. Meios para crescimento de E. Colis compententes.

Meio LB Bacto-triptona 10g 5g 2xYT Bacto-triptone 16g Extrato bacto-levedura 10g NaCl 5g

Extrato bacto-levedura NaCl pH 7,0 10g

Vol. Final: 1 litro

Autoclave por 20 min. a 15 lb/sq in. no ciclo lquido

As clulas foram centrifugadas a 4500rpm por 15 min (rotor GSA da Sorval), o precipitado foi resuspenso em 3 volumes (25ml) de Binding Buffer (Tabela 11) e 1mg/ml de lisozima foi adicionada por 15 min no gelo, seguindo de 25g/ml de DNAse por 15 min20. Clulas foram sonicadas em gelo (1 min. sonicao / 1 min. resfriamento, 200-300 wats, por duas vezes). Para o isolamento da GST-ERK, o lisado foi centrifugado a 15.000rpm por 20 min (rotor SS34 da Sorval) e a GST-ERK foi precipitada com a ajuda de glutationa(GSH)-agarose. Para tal, 4ml de uma soluo 50% de GSH-agarose (SCBT) foi adicionada e a soluo foi agitada por 1h a 4oC. A GSH-agarose ligada GST-ERK foi precipitada a 10000rpm por 15 min e as esferas de agarose foram lavadas 5 vezes com 10 ml de TCB (Thrombin Cleavage Buffer).

Tabela 11. Solues para o isolamento e purificao da ERK

Binding buffer Tris-Cl, 20 mM pH 7,9 MgCl 5mM EDTA 0,1 mM NaCl 50mM ME 5mM Triton X100 0,5% PMSF 1 mM Leupeptin 2 uM Pepstatin 2uM Aprotinin 2 ug/ml Imidazol 0,8 mM Buffer B Tris-Cl 20mM, pH 7,9 MgCl 5mM EDTA 1 mM NaCL 50mM DTT 1mM PMSF 0,2 mM TCB Tris HCl 20 mM pH 7,8 CaCl2 10 mM

Estes passos parecem no ser fundamentais, pois numa repetio deste procedimento, resultados similares foram obtidos sem a utilizao de lisozima e DNAse.

20

81

Para que ERK pura pudesse ser obtida, o fragmento GST da ERK foi clivado com 10U/ml de trombina a temperatura ambiente em 4 ml de TCB. Aps 1 h, a trombina foi inativada pela adio de 20 mM de EDTA, 0,2 mM PMSF. Para uma maior purificao da ERK, a amostra acima foi dialisada em no mnimo 1 litro de tampo B durante a noite a 4oC. Este passo foi repetido mais duas vezes por 1 h. O dialisado foi recolhido e 50% de glicerol foi adicionado (Luo et al. 1996). A figura abaixo um exemplo da potencialidade das protenas ligadas a GST expressas em bactria, principalmente considerando a sua rpida purificao. A ERK foi utilizada em ensaios acoplados e ensaios da atividade da ERK. Um outra protena que pode ser utilizada no ensaio da Ras foi expressa, mas no foi utilizada devido a problemas no anticorpo, portanto impossibilitando o teste funcional do domnio ligador de Ras (RBD - Ras-binding domain).

ERK-GST

ERK RBD-GST

Figura 11. Expresso e purificao da RBD-GST e ERK.

Gel de eletroforese corada com azul de comassie. A: lisado contendo GST-ERK, B e C: GST-ERK (banda superior) e ERK (banda inferior) de dois experimentos separados; D: marcadores de peso molecular (150, 100, 75, 50, 35, 25, kDa); F: lisado contendo RBD-GST, G, H, I: RBD-GST purificada de trs experimentos diferentes.

82

5. Resultados
5.1. Ativao da cascata por agonistas purinrgicos.
Vrios trabalhos tm demonstrado a ativao de ERK por agonistas purinrgicos em diversos tipos celulares, como em clulas endoteliais (Patel et al. 1996 e Albert et al. 1997), linhagens PC12 (Solthoff et al. 1998), cultura de astrcitos (Neary et al. 1994 e 1999 e Munsch et al. 1998) e em clulas musculares lisas (Wilden et al. 1998). Estes trabalhos mediram a atividade da ERK e algumas outras enzimas envolvidas na transduo de sinal, como PI3K (Solthoff et al. 1998 e Wilden et al. 1998), ou PKC (Neary et al. 1999), mas nenhum estudo levou em considerao os outros componentes da cascata, isto , MEK e ativadores de MEK. O estudo das quinases envolvidas nestes dois nveis, principalmente no nvel dos ativadores de MEK, geralmente fornece valiosas informaes, principalmente porque os ativadores de MEK so os principais integradores de sinalizao que atuam sobre as cascatas das MAPKs. A intensidade da ativao da cascata da ERK muito similar em resposta inmeros agonistas, mas o mecanismo utilizado para esta ativao que difere em muitos destes casos. Por exemplo, a avaliao da atividade da ERK demonstrou que NGF induzia uma ativao rpida e sustentada, sendo que quando foram avaliadas as atividades das Rafs envolvidas foi demonstrado que a fase inicial e a fase sustentada eram mediadas por ativadores de MEK diferentes, isto cRaf-1 e B-Raf, respectivamente (York et al. 1998). Pelo menos 3 isoformas da Raf e 3 isoformas de MEKK podem fosforilar e ativar MEK1/2 (item 2.1.2.2.8), sendo que estas enzimas apresentam muitas formas de ativao e inibio como por exemplo mediadas por PKA, PKC, Ca2+ e protenas G entre outras (item 2.1.3 e Figura 7). A Figura 12 mostra o efeito de agonistas purinrgicos e FGF-2 sobre a atividade dos componentes da cascata da ERK.

83

Tratamento MEK -

C
+ -

ATP
+ -

UTP
+

2-MeS
+

FGF-2
+

A (cRaf-1) Tratamento B (MEK) C (ERK) C ATP UTP 2MeS FGF P-ERK P-MBP

P-MBP

D 5

Atividade Relativa

4 3 2 1 0 ATP UTP 2MeS FGF-2 cRaf-1 MEK ERK

Figura 12. Efeito dos agonistas purinrgicos e FGF-2 sobre cRaf-1 (A), MEK (B) e ERK (C) e quantificao destes resultados (D).
Astrcitos foram tratados com ATP(100M), UTP (100M), 2-MeSATP (2MeS) (10M) e FGF-2 (25ngml-1) por 2 min e ensaios acoplados para cRaf-1 (bandas P-MBP)(A), MEK (bandas P-ERK) (B) e ERK (bandas P-MBP) (C) foram realizados. Em D, astrcitos foram tratados por 5 min e ensaios para cRaf-1, MEK e ERK foram realizados. Todos os valores foram significativos em p<0,05 em teste T pareado de student de duas vias, exceto para a ativao de cRaf-1 por ATP. n > 4 experimentos independentes, exceto para a ativao de MEK por 2-MeSATP, no qual n = 2.

Neary et al. (1994) mostraram que ATP e UTP ativam ERK com a mesma intensidade, levando concluso de que o receptor P2Y poderia estar envolvi2 84

do neste processo, pois este receptor era considerado o nico P2Y ativado igualmente por ATP e UTP21. Como visto na Figura 12, no presente estudo ATP e UTP tambm ativaram ERK com uma intensidade semelhante, mas a quantificao de cRaf-1 mostrou que existe uma diferena nos mecanismos de sinalizao ativados por estes dois agonistas. Enquanto UTP induziu uma ativao de cRaf-1, ATP no induziu nenhuma atividade nesta enzima. Tanto 2-MeSATP com ADP ativaram cRaf-1 significativamente aos 2 min. ADP induziu um aumento pequeno na atividade da cRaf-1 (1,44) mas um aumento de MEK (2,10) e ERK (2,03) comparvel ativao obtida com ATP ou UTP. O FGF-2 foi usado como controle positivo, pois ele ativa a cascata pelo mecanismo clssico dos RTKs, envolvendo FRS2, Grb2, Sos, Ras, cRaf-1, MEK1 e ERK. FGF-2 induz a uma forte ativao de cRaf-1 e MEK1 e ERK (Figura 12). interessante mencionar que ATP produziu um aumento na intensidade das bandas em relao ao controle (vide Figura 12A), mas que no representa uma ativao, pois com a correo dos ativadores de MEK (banda MEK) os valores da atividade corrigida foram muito prximos aos do controle.

5.1.1. Efeitos dos agonistas purinrgicos sobre diversos ativadores de MEK.

Considerando que tanto B-Raf como MEKK1, 2 e/ou 3 poderiam estar envolvidos na ativao de MEK em resposta a ATP, foram feitos ensaios para medir as atividades destes ativadores de MEK. Como mostrado na Figura 13, ATP no ativou nenhuma destas quinases, enquanto que UTP e FGF-2 ativaram MEKK1 e MEKK2/3. B-Raf apresentou uma alta atividade basal no sendo ativada nem pelos agonistas purinrgicos nem por FGF-2. Resultados preliminares indicaram que NGF, um tradicional ativador de B-Raf em clulas PC12 (Erhardt et al. 1995 e Peraldi et al. 1995), tambm no ativou esta enzima, embora NGF tambm no tenha ativado ERK, provavelmente devido a ausncia de receptores para NGF nas culturas astrcitos utilizadas no presente estudo. importante
21

Posteriormente, Bogdanov et al. (1998) mostraram que o receptor P2Y4 de rato tambm ativado igualmente por ATP e UTP.

85

enfatizar que B-Raf apresentou uma alta atividade basal quando comparada com a atidade induzida por cRaf-1 e esta enzima foi detectada atravs de imunodeteco no imunoprecipitado usado no ensaio (dados no mostrados).

A (B-Raf)
Agonista MEK -

C
+ -

ATP
+ -

UTP
+ -

2-MeS
+

FGF-2
+

P-MBP

B (MEKK1)
Agonista MEK -

C
+ -

ATP
+ -

UTP
+

2-MeS
+

FGF-2
+

P-MBP

C
4 5 # * 3 2 1 0 ATP UTP 2MeS FGF-2 * * * **
c-Raf B-Raf MEKK1 MEKK2/3

Figura 13. Ensaio acoplado de B-Raf (A), MEKK1 (B) ativados por agonistas purinrgicos e FGF-2 e quantificao destes experimentos (C).
Os astrcitos foram tratados como descrito na legenda da Figura 12 e ensaios acoplados foram realizados utilizando-se Anti-B-Raf (sc-166-G) (A) e AntiMEKK1 (sc-252) (B) para a imunoprecipitao. Em C, a quantificao da ativao dos diferentes ativadores de MEK. * p<0,05, **p<0,01 e #P<0,001 no teste T. O n foi de no mnimo trs experimentos independentes.

Atividade Relativa

86

5.1.2. Cintica de ativao da cascata por ATP e UTP.

Considerando que ATP induz a translocao de PKC para a membrana em 5s com um pico em 15s (Neary et al. 1999), consideramos a possibilidade de ATP estar ativando cRaf-1 muito rapidamente. A Figura 14A mostra que cRaf-1 no foi ativada significativamente em nenhum tempo estudado. Resultados preliminares indicaram que cRaf-1 tambm no ativada com 30 segundos de tratamento com ATP. Os outros agonistas purinrgicos estudados, UTP e 2MeSATP, ativaram cRaf-1, mas com uma intensidade muito menor do que FGF2. A cintica de ativao de ERK foi semelhante para os agonistas purinrgicos, enquanto que FGF-2 induziu uma ativao mais lenta. Outro aspecto importante a ser mencionado que a ativao de ERK pelos agonistas purinrgicos voltou ao nvel do controle em 60 min, enquanto que a atividade de ERK induzida por FGF-2 continuou elevada aos 60 min. (Figura 14B).

87

5.0 4.0 4.5 3.5

ATP UTP 2MeSATP FGF-2

Atividade Relativa

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1 2 3 4 5

Tempo / min B Atvidade Relativa

2.5
ATP UTP 2MeSATP FGF-2

2.0

1.5

1.0 0 5 10 15 60 20

Tempo / min
Figura 14. Curva de tempo para ativao de cRaf-1 (A) e ERK (B) por ATP, UTP, 2-MeSATP e FGF-2.
Clulas foram tratadas pelos tempos indicados e ensaios para cRaf-1 e ERK foram realizados, como descrito na legenda da Figura 12. # p<0,001, ** p<0,01. Na Figura 14B p<0.05, exceto para UTP e FGF-2 1min e 2-MeSATP 60 min.

88

5.1.3. ATP diminui a concentrao basal de cAMP, mas sinergisou positivamente com forscolina.
Muitos trabalhos tm ligado P2Y ao aumento ou inibio da produo de cAMP (Webb et al. 1996, Boyer et al. 1994, Schachter et al. 1996, Communi et al. 1997). Recentemente foi clonado e identificado o subtipo de receptor purinrgico P2Y11 que, ao contrrio dos outros receptores P2Y, estimula a produo cAMP (Communi et al. 1997 e item 2.2.3.2.5). Uma das formas de caracterizao de GPCRs acoplados a protenas Gi o cotratamento de um ativador de AC com o agonista do GPCR. Vrios ativadores de AC foram utilizados na literatura, como forscolina (Berti-Mattera et al. 1996, Albert et al. 1997, Murayama et al. 1998), agonistas -adrenrgicos, como a isoprenalina (Boyer et al. 1994) e o ativador da protena Gs, toxina da clera (Webb et al. 1996). Se o receptor estiver acoplado protena Gi, haver uma inibio na produo de cAMP ativada por forscolina, sendo esta metodologia muito utilizada para a caracterizao de receptores purinrgicos ligados negativamente a AC (Berti-Mattera et al. 1996). Assim sendo, o efeito do ATP sobre a concentrao de cAMP, basal e estimulada por forscolina, pode ser uma informao importante em relao ao envolvimento do receptor P2Y11 como tambm referente ao tipo de protena G envolvida na transduo de sinal ativada por ATP em astrcitos. Culturas de astrcitos foram tratadas com forscolina e ATP por 10 min e a concentrao de cAMP foi medida. O tratamento de astrcitos com ATP reduziu significantemente a concentrao basal de cAMP (Tabela 12). Surpreendentemente, o cotratamento de ATP e forscolina produziu um aumento muito acima do observado somente com forscolina.

89

Tabela 12. Efeito do ATP e forscolina sobre os nveis de cAMP. Basal Basal ATP 0,101(0,045) 0,032 (0,01) Forscolina 1,28 (0,42) 4,76 (1,24)

Culturas de astrcitos foram tratadas com 10M de forscolina, 100M de ATP ou forscolina + ATP por 10 min. Os dados so em nmol/mg de protena, mdia erro padro de um mnimo de cinco experimentos. Forscolina e ATP + forscolina foram diferentes do controle p< 0,05 no teste T pareado. ATP tambm foi significantemente diferente do controle com um p<0,01 (valores normalizados). ATP + forscolina foram diferentes de ATP ou forscolina isoladamente com um p<0,001 e p<0,01 respectivamente com ANOVA.

Resultados preliminares indicam que outros agonistas purinrgicos, como UTP e 2-MeSATP, tambm no estimularam a produo de cAMP enquanto que NA aumentou consideravelmente a concentrao de cAMP (2,450,2 n=2). 5-HT parece possuir uma tendncia inibitria sobre a concentrao de cAMP.

5.2. Interao entre as vias de sinalizao ativadas por ATP e FGF-2.

Muitos componentes da cascata da ERK foram descobertos como oncogenes relacionados, entre outras coisas, com proliferao celular (Lavoie et al. 1996, Weber et al. 1997a e b. Greulich, Erikson, 1998). Tanto ATP como FGF-2 induzem a proliferao de astrcitos por um mecanismo dependente de MEK (Neary et al. 1999). Considerando que ATP e FGF-2 interagem sinergisticamente na induo da proliferao de astrcitos (Neary et al. 1994), foi estudado, no presente trabalho, a ativao da cascata da ERK com o cotratamento de ATP e FGF-2, com o objetivo de verificar se a cascata da ERK est envolvida na interao sinergstica entre os mecanismo de sinalizao ativados por estes dois sinalizadores.

90

5.2.1. ATP bloqueia a estimulao da cRaf-1 induzida por FGF-2.

Tanto ATP como FGF-2 ativaram a cascata da ERK com intensidades e mecanismos diferentes, como visto no item 5.1. Surpreendentemente, quando astrcitos foram tratados com ATP e FGF-2 concomitantemente (doravante denominado A+F), foi observada uma inibio da cRaf-1, praticamente total j aos 5 min de tratamento (Figura 15A). A ativao de MEK e ERK por A+F apresentou uma intensidade similar apresentada por FGF-2 ( Figura 15B).

A
Tempo ATP FGF-2 MEK 1 min 5 min

+ -

+ + -

+
+ -

+ +
+ -

+ + -

+
+ -

+ +
+

P-MBP

B
Tempo ATP FGF-2 + 1 min + + + + 5min + + +

P-ERK P-MBP

Figura 15. ATP inibiu a ativao de cRaf-1 por FGF-2

Culturas primrias de astrcitos de crtex de rato foram tratadas por 1 ou 5 min com 100M ATP, 25 ngml-1 de FGF-2, ou ATP + FGF-2, clulas foram lisadas e os lisados contendo quantidades equivalentes de protenas foram imunoprecipitadas com um anticorpo policlonal de cRaf-1. Os IPs foram usados em um ensaio acoplado, usando GST-MEK, ERK, MBP e [-32P]-ATP. A: ensaio acoplado de cRaf-1 (P-MBP) e B: ensaio da atividade de MEK usando ERK como substrato (P-ERK) e para a atividade da ERK, usando MBP como substrato (P-MBP).

91

5.2.2. Curva dose-resposta da inibio de cRaf-1 por ATP.

Com o objetivo de esclarecer se o efeito do ATP mediado por um receptor e se este receptor possui caractersticas similares ao que est envolvido na ativao de ERK, foram realizadas curvas de dose-resposta para a ativao de ERK e para a inibio da atividade de cRaf-1 por ATP. A inibio de cRaf-1 induzida por ATP apresentou uma curva dose resposta com um IC50 da inibio de cRaf-1 por ATP de 1,2M, enquanto que a ativao de ERK por ATP apresentou um EC50 de 2,1M (Figura 16).

[ATP]/M Controle MEK + -

0
+ -

0,1
+ -

1
+ -

10
+

100
+

P-MBP

B
Estimulao Relativa
2.0

1.5

ERK cRaf-1

1.0

0.5

0.0 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3

Log [ATP]/M Figura 16. Inibio de cRaf-1 ativada por FGF-2 por ATP (A) e a curva doseresposta deste efeito e da ativao de ERK por ATP (B).
Clulas foram tratadas com FGF-2 (que foi considerado 1 e relativo ao qual foram calculados os valores de estimulao relativa) ou FGF-2 mais as concentraes indicadas de ATP por 5 min e ensaios acoplados para cRaf-1 foram realizados. Em A, um resultado da incorporao de 32P na MBP no ensaio acoplado e em B, curva dose-resposta para a inibio de cRaf-1 (s) e a ativao de ERK (m) por ATP. Dados (mdia erro padro) foram coletados de no mnimo dois experimentos independentes e ajustados a uma curva sigmide de dose-resposta por Prism v2.0 (GraphPad).

92

5.2.3. Curva de tempo da inibio de cRaf-1 por ATP.

Existem muitos mecanismos pelos quais a atividade dos componentes da cascata pode ser inibida, como por exemplo pela fosforilao direta da cRaf-1 ou pela defosforilao dos componentes da cascata, como por exemplo cRaf-1 e MEK pela PP2A (Hrich et al. 1997 e item 2.1.2.2.8). Considerando esta multiplicidade de regulaes, informaes cinticas podem ser utilizadas para descartar ou confirmar um certo conjunto de mecanismos. A Figura 17 mostra a curva de tempo da ativao de cRaf-1 por ATP, FGF-2 e A+F. Astrcitos tratados com A+F mostraram uma atividade de cRaf-1 semelhante a astrcitos tratados com FGF-2 em 1 min, mas significativamente diferente aps 1 min. interessante mencionar que a inibio ainda foi observada, na sua intensidade mxima, aos 60 minutos.

A
ATP

Atividade da cRaf-1

6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 60

FGF-2 A+F

Tempo (min)
Figura 17. Curva de tempo de ativao de cRaf-1 por ATP, FGF-2 e A+F.
Culturas de astrcitos foram tratadas como na Figura 15. Testes ANOVA (Post-hoc Turkey) mostraram que a ativao de cRaf-1 em clulas estimuladas com FGF-2 foi diferente da atividade estimulada por A+F em todos os tempos, exceto em 1 min.

93

5.2.4. Efeito de inibidores de PKC na inibio de cRaf-1 por ATP.

As PKCs so uma famlia de quinases com uma vasta variabilidade de mecanismos de regulao e de substratos (item 2.1.1.3.1.1), possuindo vrias possibilidades de tanto ativar como inibir componentes das sinalizaes que ativam a cascata da ERK (item 2.1.3.3), entre as quais podem ser destacados a ativao de cRaf-1 e a inibio de RTKs, como o FGFR1 (item 2.1.2.3.1.1). Para avaliar o envolvimento de PKC no mecanismo de inibio de cRaf-1 induzido por ATP, foram utilizados vrios tratamentos com o objetivo de inibir as PKCs. Estaurosporina foi um dos primeiros inibidores de PKC identificados, sendo que a maioria dos inibidores utilizados atualmente so derivados da estaurosporina. Ro 31-8220, apesar de ser mais especfico do que estaurosporina (Davis et al. 1989), apresenta alguns efeitos inespecficos, principalmente associado s cascatas das MAPKs, pois inibe a expresso da MKP1 (item 2.1.2.2.8) e estimula a atividade da JNK (item 2.1.2.3.5.1), efeitos no apresentados pelo GF109203X (Beltman et al. 1996). O GF109203X um inibidor competitivo do stio de ligao do ATP dos subtipos , e de PKC. O IC50 deste inibidor para a PKC <20nM, enquanto que o IC50 para outras protenas quinases esta na faixa de M, como por exemplo para a PKA (2M). GF109203X no interfere na vitalidade das clulas, pois tratamentos de at 40 horas com 1M deste inibidor no tiveram efeito sobre a incorporao de timidina basal. A incorporao de timidina induzida por fatores de crescimento, como o EGF, tambm no inibida enquanto que a incorporao de timidina induzida por vias que envolvem PKC, como vasopressina ou forbol-12,13-dibutirato (PDBuPhorbol-12,13-Dibutyra-te) foi inibida pelo

GF109203X, ao contrrio da estaurosporina, que inibiu a incorporao de timidina ativada por EGF, mostrando a maior especificidade do GF109203X em relao estaurosporina (Toullec et al. 1991). No presente estudo foram utilizadas trs formas diferentes de inibir PKC para que os efeitos dos diferentes inibidores pudessem ser comparados, principalmente considerando os efeitos inespecficos discutidos acima

94

A Tabela 13 mostra a atividade de ERK e cRaf-1 induzida por ATP, FGF-2 e A+F na ausncia e na presena de inibidores de PKC. Inibidores de PKC no afetaram a atividade de cRaf-1 induzida por FGF-2, tornando assim este estudo possvel. Quando os astrcitos foram tratados com inibidores de PKC, como GF109203X, Ro31-8220 ou downregulation com PMA, a ativao de cRaf-1 por PMA foi bloqueada, bem como a ativao de ERK por ATP, como j foi descrito por Neary et al. (1999). Contudo, a inibio de PKC no afetou significativamente a atividade de cRaf-1 induzida por A+F (Tabela 13).

Tabela 13. Estudo do envolvimento da PKC na inibio de cRaf-1 por ATP. Quinase
Inibidor\ Trat.

ERK ATP 2,19 (0,09) 1,16 (0,08) 1,29 (0,28) 1,33 (0,25) ATP 0,84 (0,26) 1,00 (0,06) 0,73 (0,42) 1,12 (0,16)

cRaf-1 FGF-2 4,11 (0,71) 4,45 (0,85) 3,63 (0,40) 3,52 (1,36) ATP+FGF-2 0,98 (0,23) 1,54 (0,64) 1,05 (0,24) 0,52 (0,19) 0,92 PMA 1,92 (0,87) 0,91

Nenhum GF102903x Ro31-8220 PMA 16hr

Cultura de astrcitos foram pr-incubadas com 5 M dos inibidores de PKC GF102903x ou Ro 31-8220 por 20 min ou com 100nM de PMA por 16 horas (PMA 16hr) e incubados com PMA (100nM), ATP e/ou FGF-2 por 5 min. Ensaio da atividade de ERK e ensaio acoplado de cRaf-1 foram realizados. Resultados de cRaf-1 ativado por PMA foram preliminares, sendo que a inibio de ERK ativada por ATP foram os principais testes da funcionalidade destes inibidores.

95

5.2.5. A ativao de cRaf-1 por EGF e PDGF tambm foi bloqueada por ATP.
RTKs possuem um conjunto de tirosinas passveis de fosforilao e os diferentes stios de fosforilao em diferentes receptores fazem com que estes induzam s sinalizaes caractersticas de cada receptor (Huang et al. 1995 Pawson, Saxton, 1999 e item 2.1.2.3.1). Alm destes stios de fosforilao, muitos RTKs tambm possuem outros stios que podem ter efeitos reguladores sobre a atividade destes receptores. Para identificar se a inibio induzida por ATP atua em um ponto comum das sinalizaes ativadas pelas RTKs, ou se esta inibio especfica para a via de sinalizao ativada por um determinado RTK, foi medida a atividade de cRaf-1 aps o tratamento com EGF e PDGF, isoladamente ou juntamente com ATP. A Figura 18 mostra que ATP tambm bloqueia a atividade de cRaf-1 induzida por EGF e por PDGF.

Atividade da c-Raf-1

5
#

# # #

ATP GF A+GF

4 3 2 1 0

FGF-2

EGF

PDFG

Figura 18. Efeito do ATP na atividade de cRaf-1 induzida por FGF-2, EGF e PDGF.
Culturas de astrcitos foram tratadas com ATP e/ou os fatores de crescimento (GF) indicados: FGF-2 (25ng/ml), EGF (10ng/ml) ou PDGF (2,5ng/ml), por 5 min e ensaios acoplados para cRaf-1 foram realizados. Dados (mdia erro padro) foram obtidos de no mnimo trs experimentos independentes. Testes ANOVA (Post-hoc Turkey) # p < 0,001, ** p < 0,01 e * p < 0,05.

96

5.2.6. Efeito do ATP sobre outros ativadores de MEK1.

Muitos mecanismos de regulao so especficos para um determinado ativador de MEK, como por exemplo, a inibio causada por cAMP/PKA que no afeta B-Raf, mas somente cRaf-1 (item 2.1.3.3). Outros ativadores de MEK, como MEKK1, 2 e 3, possuem uma baixa homologia na parte cataltica e praticamente nenhuma homologia na parte regulatria, indicando que estas enzimas, apesar de possurem uma sobreposio de substratos, pois tanto as Rafs como as MEKKs 1, 2 e 3 podem fosforilar e ativar MEK, possuem mecanismos de regulao distintos (item 2.1.2.3.3.2). Portanto, considerando tais diferenas, o estudo do efeito da inibio do ATP sobre a atividade destes pode diferenciar entre um mecanismo especfico para um ativador de MEK (ou uma famlia de ativadores), ou um mecanismo regulatrio comum para estes componentes, como por exemplo Ras. A Figura 19 mostra que ATP, alm de provocar a inibio da atividade de cRaf-1 induzida por FGF-2, tambm inibe a ativao de MEKK1 e MEKK2/3 ativadas por FGF-2.

Atividade das MEK-1 Quinases

5
#

ATP
* ** **
#

4 3 2 1 0

bFGF A+F

c-Raf

MEKK1

MEKK2

Figura 19. Efeito do ATP e do FGF-2 sobre diferentes ativadores de MEK.

Culturas de astrcitos foram tratadas com ATP, FGF-2 ou A + F por 5 min e ensaios acoplados foram realizados usando-se os anticorpos de cRaf-1, MEKK1 e MEKK2/3 para o IP. Dados (mdia erro padro) foram obtidos, no mnimo, de trs experimentos independentes. Testes ANOVA (Post-hoc Turkey) # p < 0,001, ** p < 0,01 e * p < 0,05.

97

5.2.7. Efeito da noradrenalina (NA) e da serotonina (5-HT) sobre a atividade da cRaf-1.

Outra estratgia utilizada para identificar o mecanismo de inibio do ATP o estudo do efeito de outros agonistas de GPCR sobre a atividade de cRaf-1. Para tal, foram escolhidos dois agonistas que eram conhecidos como ativadores de ERK em astrcitos, mas que usavam diferentes protenas G acoplados aos seus respectivos GPCR. NA ativa receptores -adrenrgicos em astrcitos, levando a um aumento na produo de cAMP, como mostrado no item 4.6. Por outro lado, serotonina, de forma semelhante ao ATP, no aumentou a produo de cAMP. Diversas concentraes de NA tm sido utilizadas na literatura (Feinstein et al. 1993 e Hildebrand et al. 1996). Uma curva dose resposta preliminar para ativao de ERK por NA indicou um EC50 na faixa de 2M, sendo que subseqentemente foi utilizada a concentrao de 10M, de acordo com Hildebrand et al. (1996). Considerando que as concentraes de 5-HT utilizadas na literatura no apresentavam uma grande variao, foi utilizado o valor indicado de 10M (Saucier, Albert, 1997). O tratamento de astrcitos com NA e 5-HT ativou ERK, mostrando a sua funcionalidade. interessante mencionar que estes dois agonistas ativaram ERK por um mecanismo independente de cRaf-1. NA inibiu a atividade de cRaf-1 com uma intensidade comparvel com a inibio induzida por ATP. Serotonina, no entanto, no teve nenhum efeito sobre a atividade de cRaf-1 (Tabela 14).

98

Tabela 14. Efeito da noradrenalina e da serotonina na atividade da cRaf-1 induzida por FGF-2. cRaf Basal Basal NA 5-HT 1,00 0,87 (0,25) 1,24 (0,50) FGF-2 4,11 (0,71) 1,37 (0,46) 3,56 (0,13) Basal 1,00 1,79 (0,16) 2,22 (0,19) ERK FGF-2 2,28 (0,11) 2,36 (0,24) 2,63 (0,18)

Astrcitos foram tratados por 5 min com os agonistas, separada ou simultaneamente e ensaios para cRaf-1 e ERK foram realizados. Mdia ( Erro padro)

5.2.8. Efeito da interao das vias de sinalizao sobre MEK e ERK.

A principal funo da Raf parece ser a de integrar sinais e transmit-los cascata da ERK, sendo esta, juntamente com as quinases ativadas por ela, os principais efetores finais. Recentemente, alguns trabalhos tm demostrado que Raf pode atuar de forma independente de MEK e ERK como um regulador do ciclo celular (Ziogas et al. 1998), ou um sinalizador anti-apopttico, atravs da fosforilao da BAD (Wang et al., 1999). Apesar destes casos, a grande maioria das funes descritas at o momento para a Raf depende dos outros componentes da cascata da ERK. Portanto, a enzima que mais afeta a clula no a cRaf-1 por si s, mas sim a ERK, o que torna fundamental estudar como esta enzima afetada pela interao entre as vias de sinalizao ativada por ATP e FGF-2. Para tanto foram medidas as curvas de tempo da atividade da MEK e da ERK em resposta a ATP e FGF-2 isoladamente e em conjunto. importante mencionar que estas atividades foram dosadas nos mesmos lisados utilizados para dosar cRaf-1.

99

A
5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0 5 10 15 20 25 60 ATP FGF-2 A+F

Atividade Relativa

Tempo (min) B
ATP FGF-2 A+F 2.5

Atividade Relativa

1.5

1 0 5 10 15 20 60 25

Tempo / min
Figura 20. Curva de tempo de ativao de MEK e ERK por ATP e FGF-2.
Culturas de astrcitos foram tratadas como na Figura 15.A pelos tempos indicados e as atividades de MEK(A) e ERK(B) foram medidas. Testes ANOVA (Post-hoc Turkey) mostraram que a ativao de MEK por FGF-2 no foi diferente da atividade induzida por A+F em nenhum tempo. A ativao de ERK por FGF-2 foi diferente da atividade induzida por A + F em 1 (p < 0,05) e 2 min (p < 0,01) e ATP foi diferente de A + F em 15 (p<0,05) e 60 min (p<0,001).

100

A Figura 20 mostra as curvas de tempo de MEK e ERK ativadas por ATP, FGF-2 e A+F. As seguintes observaes podem ser tecidas sobre as curvas de tempo de MEK e ERK: 1. A cintica de ativao de MEK e ERK foi mais rpida para ATP quando comparada com FGF-2, sendo que a atividade estimulada por ATP rapidamente retornou aos valores de controle, enquanto que com FGF-2 a atividade permaneceu elevada; 2. A atividade mxima de MEK e ERK induzida por A+F foi praticamente igual ou somente um pouco superior atividade induzida por FGF-2; 3. A curva de tempo da ativao de MEK e ERK ativada por A+F foi muito semelhante curva induzida por ATP at os 2 min enquanto que aps este tempo, se tornou muito semelhante ativao induzida por FGF-2 e; 4. As atividades de MEK e ERK ativadas por A+F permanecem elevadas aos 60 min, apesar da total ausncia de atividade da cRaf-1 j aos 5 min (Figura 17).

101

6. Discusso
6.1. Receptores purinrgicos associados ativao da cascata da ERK em astrcitos.
Com o objetivo de caracterizar farmacologicamente os subtipos de receptores purinrgicos envolvidos na ativao de ERK em cultura de astrcitos, foram avaliadas as atividades dos principais componentes da cascata da ERK em resposta a agonistas purinrgicos. Especial ateno foi dada s MAPKKK, isto , aos ativadores de MEK envolvidos na ativao das cascata, uma vez que existe uma grande variao e integrao de sinais neste nvel, como visto nos itens 2.1.2.2.1 e 2.1.3. Por exemplo, como observado neste estudo e por Neary, Zhu, (1994), ATP e UTP ativam ERK com igual intensidade, o que poderia levar e rrnea concluso de que estes dois agonistas utilizam um receptor no qual as suas potncias e estimulaes mximas so iguais, como o caso para os receptores P2Y2 e P2Y4. A anlise das vias pelas quais estes dois agonistas ativaram ERK, no entanto, mostrou que mecanismos distintos parecem estar envolvidos, principalmente considerando que UTP ativou cRaf-1 e MEKK1 enquanto ATP no ativou nenhuma destas MAPKKK.

6.1.1. Receptores P2Y expressos em culturas de astrcitos.

Para confirmar quais receptores so expressos em culturas de astrcitos, foram realizados estudos com RT-PCR utilizando primers para as seqncias dos quatro subtipos de P2Y conhecidas em ratos, (P2Y1, P2Y2, P2Y4 e P2Y6). Estes estudos mostraram que P2Y1 P2Y2 e P2Y4 so os principais mRNAs de receptores expressos em culturas de astrcitos (Nie, Neary, em Lenz et al. 2000), enquanto que o mRNA do receptor P2Y6 no foi encontrado, de acordo com Chang et al. (1995), que no encontraram mRNA para este receptor no CNS. Uma vez que a seqncia do receptor P2Y11 de rato ainda no foi descrito,

102

no foi possvel avaliar a sua expresso atravs de RT-PCR, sendo que a presena do receptor P2Y11 foi avaliada utilizando-se de estudos funcionais. Communi et al. (1997) mostraram que tanto ATP como 2-MeSATP ativam a produo de cAMP quando linhagens de astrocitomas ou CHO foram transfectadas com o receptor P2Y11 de humano. importante ressaltar que os outros receptores P2Y conhecidos no esto positivamente acoplados a AC (Tabela 5). Considerando que ATP no induziu nenhum aumento na concentrao de cAMP (Tabela 12), pode ser sugerido que o receptor P2Y11 no est presente em astrcitos de rato, ou o seu acoplamento a AC diferente do observado para os receptores de origem humana transfectados em astrocitomas (1321N1) ou clulas CHO (Communi et al. 1997 e item 2.2.3.2.5).

6.1.2. Efeitos da ativao de purinoceptores sobre a cascata da ERK.

Com a identificao dos receptores expressos em astrcitos e conhecendo as suas caractersticas farmacolgicas (Tabela 5) parece uma tarefa simples identificar quais receptores esto envolvidos na ativao da cascata da ERK por ATP e UTP. No entanto, quando os efeitos destes agonistas sobre a cascata da ERK so confrontados com os efeitos esperados baseados em estudos com receptores recombinantes, nota-se que esta tarefa no to simples assim, como visto a seguir.

6.1.3. Receptor P2Y envolvido na ativao de ERK por UTP.

ATP e UTP ativaram ERK com potncias (EC50: ATP: 5,4 M; UTP: 3,0 M, Kang, Neary, em Lenz et al. 2000) e intensidades semelhantes (Figura 12). No entanto, UTP ativou, enquanto que ATP no ativou cRaf-1, indicando que existe um receptor ativado por UTP que no ativado por ATP. Entre os receptores P2Y, trs subtipos so ativados por UTP: P2Y2, P2Y4 e P2Y6. Dentre estes, somente o receptor P2Y6 no ativado por ATP, sendo portanto o candidato ideal para mediar o efeito do UTP. Mas, como visto anteriormente, este receptor no foi encontrado em culturas de astrcitos utilizando RT-PCR, embora os mesmos 103

primers tenham sido capazes de identific-lo em tecido cardaco (Nie, Neary, em Lenz et al. 2000), com isto, excluindo-o. O receptor P2Y2 bem descrito como um receptor que pode ser ativado tanto por ATP como UTP. J o receptor P2Y4 ativado por ATP e UTP em ratos (Bogdanov et al. 1998), embora seja ativado exclusivamente por UTP em humanos (Communi et al. 1996). Considerando que os dados apresentados neste trabalho claramente indicam que a ativao de cRaf-1 por UTP no compartilhada por ATP e que o receptor P2Y6 no expresso em astrcitos, pode ser sugerido que: 1. Culturas de astrcitos expressam um receptor ainda no identificado e que seja ativado por UTP, mas no por ATP; 2. As caractersticas dos receptores expressos em culturas de astrcitos so diferentes das caractersticas dos receptores recombinantes de rato, fazendo com que P2Y2 e/ou P2Y4 responda(m) somente ao UTP.

6.1.4. Receptor P2Y envolvido na ativao de ERK por ATP.

O ATP pode ativar todos os receptores P2Y com exceo do receptor P2Y6. Como a presena funcional do receptor P2Y11 foi eliminada pela ausncia da ativao da AC, restam os receptores P2Y1, P2Y2 e P2Y4 como candidatos para mediar o efeito do ATP. O receptor P2Y1 foi inicialmente caracterizado como sendo ativado por ATP e 2-MeSATP (Tokuyama et al. 1995) e estudos posteriores mostraram que este receptor possui maior afinidade por ADP e 2-MeSADP, sendo que ATP e 2MeSATP parecem agir como antagonistas (Hechler et al. 1998). Palmer et al. (1998) mostraram evidncias que estas discrepncias entre as potncias dos agonistas podem ser explicadas quando a concentrao do receptor for levada em considerao, que pode variar consideravelmente de um experimento para outro devido eficincia de transfeco. Em condies nos quais as concentr aes dos receptores P2Y1 eram reduzidas, a resposta ao ATP foi muito fraca. Por outro lado, com altas concentraes do receptor, o ATP e o 2-MeSATP foram agonistas potentes. Portanto, o receptor P2Y1 pode ser ativado tanto por ATP e 2-MeSATP como por seus similares difosfatados.

104

Primeiramente importante enfatisar que no presente estudo, o efeito do ATP no parece envolver antagonismo, pois ele ativou MEK e ERK. Entre os agonistas de receptor P2Y1, 2-MeSATP e ADP ativaram cRaf-1 enquanto que ATP no ativou, indicando que este receptor no est envolvido, ou as caractersticas farmacolgicas so diferentes do que apresetandos em estudos envolvendo clonagem. Estes resultados foram confirmados uma vez que adenosina 3-fosfato 5-fosfosulfato, um antagonista que inibe P2Y1, (Boyer et al. 1996) no afetou a ativao de ERK por ATP (Kang, Neary, em Lenz et al. 2000). Portanto, os dados apresentados neste trabalho indicam que existam pelo menos dois subtipos de receptores P2Y-like acoplados ativao de MEK e ERK, um mediando o efeito do UTP de forma dependente de cRaf-1 e o outro mediando o efeito do ATP, independentemente de cRaf-1. A identidade molecular destes receptores no est clara, sendo que o envolvimento dos receptores P2Y6 e P2Y11 foi excludo por RT-PCR e estudos funcionais. importante ressaltar tambm que os efeitos farmacolgicos observados sobre a cascata da ERK podem ser devido a uma combinao dos efeitos dos receptores P2Y1-like, P2Y2-like e P2Y4-like, principalmente considerando a alta integrabilidade dos mecanismos envolvidos na regulao das MAPKs. Uma possibilidade do envolvimento dos trs receptores agindo conjuntamente proposta como hiptese de trabalho para experimentos futuros (Figura 24). No entanto, a possibilidade de um receptor no identificado, ativado exclusivamente por UTP (e no por ATP) ser expresso em astrcitos no deve ser descartada. Outros trabalhos tambm tm obtido dados condizentes com a presena de mais de um subtipo de receptor P2Y em cultura de astrcitos corticais e uma consequente complexidade na resposta aos diversos agonistas. Pearce, Langley, (1994) observaram que a produo de IP3 aditiva para ATP e UTP, indicando o envolvimento de receptores distintos para estes dois agonistas, enquanto que 2-MeSATP e ATP no foram aditivos, indicando a ao em um mesmo receptor. Ho et al. (1995), utilizando astrcitos de corda espinhal, apre-

105

sentaram evidncias para a existncia de receptores responsivos a 2-MeSATP e UTP utilizando medidas de aumento de Ca2+ intracelular, enquanto que Jimnez et al. (1999) encontraram os subtipos P2Y1, P2Y2, P2Y4 e P2Y6 em cultura de astrcitos de cerebelo envolvidos no aumento de Ca2+ intracelular, igualmente com padres farmacolgicos complexos.

6.1.5. Curvas de tempo

As curvas de tempo mostraram uma ativao e uma desativao rpida da ERK em resposta a agonistas purinrgicos, principalmente quando comparada com a ativao e desativao lenta induzida por FGF-2. ATP, embora sendo capaz de ativar PKC em 5s (Neary et al. 1999), no foi capaz de ativar cRaf-1 e nenhum tempo estudado, nem mesmo 30s, indicando que cRaf-1 no faz parte da via de sinalizao entre o receptor purinrgico ativado por ATP e a cascata da ERK. Estas cinticas de ativao e desativao rpidas parecem ser caractersticas de muitos GPCR. Por exemplo, glutamato ativa ERK em cultura de astrcitos com um pico em 5 min, e esta atividade volta ao nvel do controle aps 60 min (Peary, Conn, 1998). UTP, atuando por um receptor P2Y, tambm mostrou uma cintica rpida de ativao e desativao (Soltoff, 1998). Com um protocolo no qual UTP era adicionado s clulas em intervalos definidos, Soltoff, (1998) mostrou que esta dessensibilizao parece ser devido tanto degradao do agonista por ectonucleotidases como por um processo de dessensibilizao do receptor. Por outro lado, vrios fatores de crescimento so capazes de induzir ativaes bastante persistentes. Tournier et al. (1994) observaram que ERK ativada por FGF-2 permaneceu ativa por pelo menos 12 horas, em concordncia com o presente trabalho.

6.1.6. Sinergismo entre forscolina e ATP na produo de cAMP.

O sinergismo entre sinais na produo de cAMP tambm foi observado em outros trabalhos. Puncat et al. (1998) observaram que clulas tratadas com isoproterenol e forscolina, induziram a uma ativao sinergstica na produo de

106

cAMP. O sinergismo de ATP com forscolina tambm foi observado por Albert et al. (1997) em clulas endoteliais do crebro de rato. Em cultura de astrcitos corticais, Balzs et al. (1998) observaram um efeito sinergstico semelhante ao observado no presente trabalho com o cotratamento de ACPD (1-aminocyclopentane-1S,3R-dicarboxylic acid), (um agonista de mGluR) com isoproterenol (um agonista -adrenrgico), ou forscolina, sendo que ACPD reduz a concentrao de cAMP basal em culturas na presena de soro, um resultado semelhante ao obtido no presente estudo com estimulao com ATP. Balzs et al. (1998) observaram que o efeito do ACPD foi resis2+ tente inibio por PTx, quelantes de Ca intracelular, inibio da PLC e inibi-

o da PKC, sendo sugerido neste estudo que as subunidades e liberados com a ativao do receptor metabotrpico poderiam ser responsveis pelo efeito sinergstico sobre a produo de cAMP induzida por forscolina ou agonistas adrenrgicos, indicando o envolvimento do subtipo II da AC. Considerando as semelhanas entre os resultados do presente estudo e os de Balzs et al. (1998), provvel que os mecanismos de transduo de sinal ativados pelos receptores purinrgicos ligados inibio da atividade basal de AC e a estimul a o sinergstica com forscolina sejam idnticos, isto , protena G atuando sobre ACII. Por outro lado, a reduo da concentrao basal de cAMP induzida pelo ATP indica uma ligao negativa entre o receptor purinrgico ativado por ATP e AC, embora esta ligao no parece ser mediado pela protena Gi, uma vez que GPCR ligados a esta protena G so capazes de inibir a ativao da AC induzida por forscolina (Boyer et al. 1994, Murayama et al. 1998).

107

6.2. Mecanismo de ativao da cascata da ERK por purinoceptores.

A cascata das MAPK possui os mais variados mecanismos de ativao, sendo que MEK pode ser ativada por vrias MAPKKK, como as Rafs, as MEKKs, enquanto que estes ativadores de MEK podem ser regulados por componentes de diversos mecanismos de sinalizao, como cAMP/PKA, Ca2+/CaM, protenas G, PKC, entre outros (item 2.1.3).

6.2.1. Mecanismo de ativao da cascata da ERK por ATP.

Recentemente, Neary et al. (1999) identificaram algumas caractersticas da ativao da cascata da ERK por ATP, como o envolvimento de protenas G sensveis a PTx (subtipo Gi e Go), PLD, um subtipo de PKC independente de Ca2+ (PKC), sendo que estas enzimas foram ativadas em tempos menores do que 1 min. Por outro lado, a ativao de ERK por ATP no envolve o aumento de Ca2+ intracelular ou a ativao de PI-PLCs. Anteriormente a este trabalho, Neary e Zhu, (1994) demonstraram que a ativao de ERK por ATP, ao contrrio da ativao por FGF-2, no inibida pelo aumento de cAMP. Yu et al. (1996) demonstraram que ATP ativa cRaf-1 em clulas de msculo vascular liso, mas este artigo foi retratado (Wu et al. 1998). A principal contribuio do presente trabalho para o estudo do mecanismo de ativao de ERK por ATP foi a observao de que ATP no ativa cRaf-1, confirmando a insensibilidade da ativao da ERK por ATP ao cAMP, pois PKA pode fosforilar e inibir cRaf-1. Adicionalmente, a rpida cintica de ativao da de MEK e ERK por ATP est de acordo com as rpidas ativaes de PLD e PKC observadas por Neary et al. (1999). O ativador de MEK que est envolvido na ativao da cascata por ATP foi estudado atravs do ensaio acoplado de cRaf-1, B-Raf, MEKK1, MEKK2/3. Nenhum destes ativadores de MEK foi ativado pelo tratamento com ATP, embora outros tratamentos, como fatores de crescimento, tenham ativadas estas enzimas, com exceo da B-Raf. Esta enzima apresentou uma alta atividade basal, 108

quando comparada com a atividade basal de cRaf-1, observao descrita em vrios trabalhos e provavelmente devido a presena de dois aminocidos negativos no local de aminocidos fosforilveis das outras Rafs (Jenilek et al. 1996 e item 2.1.2.3.3.1). Interessantemente, nenhuma ativao de B-Raf foi observada com NGF, um ativador de B-Raf em clulas PC12 (Erhardt et al. 1995 e Peraldi et al. 1995). NGF tambm no ativou ERK, o que pode indicar que este fator de crescimento no est expresso em culturas de astrcitos, de acordo com a ausncia de efeito na proliferao (Neary et al. 1994). Contudo, considerando que nenhum teste funcional foi realizado com a amostra de NGF utilizada no presente estudo, estes dados devem ser considerados inconclusivos. Portanto, BRaf parece estar envolvido na manuteno de uma atividade basal da cascata, sem estar envolvido na sua ativao. No presente trabalho foram medidas as atividades de 5 ativadores de MEK, sendo que nenhum destes ativadores estimulado por ATP. Como mencionado no item 2.1.2.3.3, foram identificados at o momento 10 grupos diferentes de ativadores de MEK, num total de 22 genes distintos. Muitas destas enzimas foram caracterizadas somente superficialmente, tornando muito difcil o estudo do seu envolvimento em vias de sinalizao. Portanto, atravs do presente estudo foi possvel excluir 5 ativadores de MEK como no envolvidos na ativao da cascata por ATP, mas a identidade do ativador ainda permanece desconhecida (vide item 8.1.1 para experimentos futuros).

6.2.2. Mecanismo de ativao da cascata da ERK por UTP.

Soltoff, (1998) mostrou que UTP ativa ERK em linhagens PC12 atravs de um mecanismo envolvendo transativao de EGFRs, atravs da Ca2+ /Pyk2, sendo que aps a transativao do EGFR, os mecanismos de ativao da cascata provavelmente sejam similares aos observados com a ativao com EGF, isto , Grb2/Sos/Ras, atravs de cRaf-1. Embora a ativao de cRaf-1 seja um indcio de que o mecanismo encontrado em PC12 tambm seja encontrado em astrcitos, mais estudos precisam ser realizados para confirmar esta possibilidade.

109

 interessante mencionar que Soltoff, (1998) encontrou um aumento da fosforilao do EGFR por ATP muito menor do que por UTP, indicando que estes dois agonistas tambm apresentam diferenas na sinalizao em PC12, embora o autor argumente que os efeitos do UTP sejam mediados pelo receptor P2Y2 e sejam iguais aos do ATP. No entanto, comparaes entre tipos celulares devem ser feitos com muito cuidado uma vez que neurnios (e PC12) possuem padres de expresso gnica bastante distintas de astrcitos. Estudos utilizando quelantes de Ca2+ intracelular, como BAPTA-AM, ou a quantificao de fosforilao de RTKs em cultura de astrcitos podero esclarecer se os mecanismo da ativao de ERK por UTP so semelhantes em PC12 e culturas de astrcitos.

6.3. Interao entre a sinalizao ativada por agonistas purinrgicos e fatores de crescimento.
Como visto anteriormente, ATP ativa a cascata da ERK por um mecanismo independente de cRaf-1, enquanto que FGF-2 ativa a cascata atravs do tradicional mecanismo que envolve FRS2/GRB2/Sos/Ras/cRaf-1 (Kouhara et al. 1997). O cotratamento de culturas de astrcitos com ATP e FGF-2 produziu uma total inibio da atividade da cRaf-1 sendo que o efeito desta inibio foi parcialmente notado tambm no nvel de MEK e ERK. Este resultado particularmente intrigante se for considerado que ERK necessrio para o efeito mittico destes dois sinais e que o cotratamento com ATP e FGF-2 produz um aumento sinergstico na proliferao (Neary et al. 1994 e Neary et al. 1999).

6.3.1. Purinoceptor envolvido na inibio de cRaf-1.

Em cotratamentos podem existir vrias possibilidades de interaes, distintas de interaes entre os mecanismo de sinalizao, como por exemplo, interaes qumicas entre os transmissores ou competio por um mesmo stio de ligao. Por exemplo, ATP poderia ligar-se diretamente ao FGF-2, ao FGFR ou 110

at ao heparam sulfato, substrato necessrio para a ligao do FGF-2 ao seu receptor. Evidncias boas podem ser obtidas com a utilizao de antagonistas de um dos receptores, o que no presente caso no foi possvel, pois um dos agonistas descritos para os receptores P2Y, a suramina, alm de ser muito inespecfico, tambm inibe a ligao de fatores de crescimento aos seus receptores (Ralevic, Burnstock, 1998), sendo que resultados preliminares indicaram que este agonista interferiu com a ativao da cascata da ERK por FGF-2. Estas inespecificidades tambm foram observadas no estudo de Kuratsu et al. (1995), no qual suramina ativa a MAPK mas possui um efeito inibitrio na proliferao de gliomas. Um outro antagonista descrito para os receptores P2Y o RB2 (Ralevic, Burnstock, 1998), que tambm interferiu na ativao da cascata da ERK ativada por FGF-2, impedindo a utilizao deste antagonista. Um outra forma de estudar o envolvimento de um determinado receptor determinar a sua curva de dose-resposta e procurar estabelecer alguma correlao com outros efeitos mediados pelo mesmo receptor. A Figura 16 mostra que ATP inibe cRaf-1 com um IC50 muito semelhante ao EC50 da ativao de ERK, indicando que os dois efeitos so muito provavelmente mediados por um mesmo receptor. Existe a possibilidade de que esta inibio seja mediada pela adenosina, produzida pela degradao de ATP. No entanto, a correspondncia do EC50 de ativao de ERK, que no envolve adenosina (Neary, Zhu, 1994), com o IC50 e a rpida cintica de inibio torna o envolvimento de receptores P1 na inibio da cRaf-1 pouco provvel.

6.3.2. Cintica de ativao e inibio da cascata

Inmeros estudos tm demonstrado que os mecanismos de transduo de sinal que atuam sobre as cascatas das MAPKs so extremamente complexos, com diversos componentes interligados em que a atividade em um determinado momento mantida por complexos sistemas de retroalimentaes positivas e negativas (Bhalla, Yengar, 1999). Inmeros mecanismos de inibio e de retroalimentao negativa tm sido descrito para a cascata da ERK, entre os quais

111

podem ser citadas as inibies sobre a cRaf-1 induzida por cAMP/PKA (item 2.1.3.3), a retroalimentao negativa da ERK sobre Sos e a expresso de fosfatases, como as MKPs, que defosforilam ERK (item 2.1.2.2.8) e as GAPs que inibem Ras, como a GRS16 (De Vries, Farquhar, 1999). Uma forma de diferenciar estes sinais inibitrios a sua cintica, pois, retroalimentaes que envolvem a expresso de protenas, como o caso da MKP, necessitam de pelo menos uma hora para serem ativadas (item 2.1.2.2.8), enquanto a inibio que envolve a fosforilao da Sos pode ocorrer em alguns minutos, mas obrigatoriamente aps a ativao da ERK. Outros mecanismos, como a inibio por cAMP/PKA podem ocorrer com velocidades comparveis ativao da prpria cascata, isto , antes mesmo da ativao da ERK. Considerando isto, foram realizadas curvas de tempo tanto da ativao da cascata por ATP e FGF-2 bem como do efeito inibitrio do ATP sobre a cRaf-1 estimulada por FGF-2 (Figura 17). Embora as velocidades de ativao de cRaf-1 por FGF-2 e de inibio por ATP possam ser visualizados nos grficos de curva de tempo (Figura 17), valores de tempos de meia vida (t0,5)22 podem ser teis para melhor visualizar estas curvas de tempo. Para tal, foram feitos grficos de logaritmo natural da atividade versos o tempo (Atkins, 1994), fornecendo um traado em forma de reta, com coeficientes de correlao (r2) acima de 0,98 (Figura 21) confirmando a possibilidade de utilizao desta forma de anlise.

O conceito de tempo de meia vida (t0,5) utilizado no decaimento radioativo e em cinticas qumicas e em transduo de sinal (Ng et al., p1999), sendo que neste estudo representa o tempo necessrio para uma certa enzima atingir a metade da sua atividade mxima.

22

112

2.0

A
Raf

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

B
Inibio

ln(Atividade)

1.5 1.0 0.5 0.0 0

MEK

ERK

- ln (A+F/AF)

Tempo (min)
ta e inibio da cRaf-1 (B).

Tempo (min)

Figura 21. Grficos da cintica de ativao (A) dos componentes da casca-

Ativao de cRaf-1, MEK e ERK induzida por FGF-2 (A) e a inibio de cRaf-1 por ATP (B). Neste caso foi usado o clculo de percentual de inibio, que corresponde atividade que seria esperado se no tivesse a inibio, isto , a atividade somada de ATP e FGF-2 (A+F), dividida pela atividade da cRaf-1 observada com o cotratamenteo de ATP e FGF-2 (AF). Somente dois pontos puderam ser utilizados pois a inibio atinge um plateau em 5 min. Grficos entre a ln(atividade) x tempo apresentaram r2 > 0,98.

interessante observar que a Figura 21A mostra claramente a seqncia de ativao dos componentes da cascata, sendo que os tempos necessrios para a ativao de cada uma das trs quinases e da inibio de cRaf-1 podem ser vistos na Tabela 15. Tabela 15. Tempo no qual a atividade dos componentes da cascata atinge 50% da atividade mxima (t0,5) em segundos. FGF-2 cRaf-1 / Inibio MEK ERK 51 (Raf) 135 284 ATP 73 (Inib) 100 123

T1/2 foi calculado como ln(2)/(inclinao da reta), considerando cintica de primeira ordem.

113

Os valores dos t0,5 mostram que ATP ativou a cascata mais rapidamente do que FGF-2 (t0,5 de 123s contra 284s - Tabela 15). A inibio que ATP induz sobre a cRaf-1 bastante rpida (t0,5 = 73s) e comparvel com a velocidade de ativao de cRaf-1 por FGF-2 (t0,5 = 51s) indicando um mecanismo direto entre a ativao de receptores purinrgicos e a inibio da atividade de cRaf-1 e com isto excluindo inibies do tipo retroalimentao negativa envolvendo ERK (Waters et al. 1995 e item 2.1.4.5.1) ou expresso gnica (item 2.1.2.2.8).

6.3.3. Mecanismo da inibio de cRaf-1 por ATP.

Uma vez excludas inibies com cinticas lentas como a fosforilao da Sos por ERK ou expresso das fosfatases como as MKPs, os esforos para a identificao dos mecanismos puderam ser concentrados na parte superior das vias de sinalizao ativados por ATP e FGF-2. Vrios mecanismos de inibio da cascata das MAPK que se enquadram na cintica discutida acima tm sido descritos na literatura, entre os quais podem ser destacados: 1. Inibio da cRaf-1 por cAMP, tanto via fosforilao da cRaf-1 pela PKA (Wu et al. 1993) como pela ativao de Rap1 atravs da ativao da cAMP-GEF (Hawasaki et al. 1998). Ver item 2.1.3.3; 2. Inibio da cRaf-1 atravs da fosforilao pela cGMP/PKG (Suhasini et al. 1998); 3. Ativao de fosfatases, como a PP2A e a PP1; 4. Inibio do FGFR1 atravs da fosforilao pela PKC (Gillespie et al. 1995). O envolvimento do cAMP pde ser excludo baseado na observao de que o tratamento de cultura de astrcitos com ATP inibiu a concentrao de cAMP ( Tabela 12). Em relao ao envolvimento da cGMP/PKG, existem alguns estudos indicando que, dependendo do tipo celular, ATP pode induzir um aumento, uma diminuio ou at mesmo no afetar a concentrao intracelular de cGMP (Vuorinen et al. 1992, Okajima, Kondo, 1990 e Chen et al. 1996). No foi encontrado nenhum trabalho referente a culturas de astrcitos. No entanto, da

114

mesma forma como a inibio mediada por PKA, a inibio mediada por PKG pouco provvel considerando que o stio de fosforilao desta quinase na cRaf-1 no conservado nas MEKKs, sendo que estas tambm foram inibidas pelo tratamento com ATP (vide item 6.3.3.4). As fosfatases reguladas por expresso puderam ser excludas devido r pida cintica de inibio. Contudo, as fosfatases que podem ser ativadas rapidamente, como a PP1 e a PP2A so fortes candidatos para estarem envolvidos na inibio da cRaf-1. A PP1 regulada pelo inibidor 1, que ativado pela PKA e desativado pela PP2B (CaN). Desta forma, Ca2+, atravs da ativao da PP2B o ativador indireto da PP1 sendo PKA o inibidor indireto. A possibilidade de Ca2+ estar envolvido no mecanismo de inibio, embora evidncias indiretas indiquem o contrrio (item 6.3.3.3) deve ser considerada em trabalhos posteriores (item 8). Por sua vez, a regulao da PP2A ainda no foi claramente estabelecida (item 2.1.1.3.2.1). O envolvimento destas duas fosfatases necessita ser estudado utilizando inibidores especficos e quelantes de Ca2+ intra e extracelulares. Para avaliar se a fosforilao do FGFR pela PKC est envolvido no mecanismo de inibio foram utilizadas duas estratgias: utilizao de inibidores de PKC e outros fatores de crescimento que no possuam os stios de fosforilao nos quais PKC fosforila o FGFR. Estas duas estratgias so discutidas separadamente abaixo:

6.3.3.1. Efeito de inibidores de PKC.

PKC um forte candidato para mediar este efeito inibitrio pois o subtipo PKC ativado por ATP em culturas de astrcitos (Neary et al. 1999) e FGFR1 pode ser fosforilado e inibido por PKC (Gillespie et al. 1995). Se este mecanismo fosse responsvel pela inibio de cRaf-1 por ATP, inibidores de PKC deveriam ser capazes de bloquear o efeito inibitrio do ATP sobre cRaf-1 fazendo com que as atividades de cRaf-1 observadas com FGF-2 e com A+F fossem semelhantes. No entanto, a Tabela 13 mostra que a atividade de cRaf-1 estimulada por A+F no foi significativamente afetada por nenhum dos inibidores de PKC utilizados. importante mencionar que estes inibidores bloquearam a ativao

115

de cRaf-1 por PMA, a ativao de ERK por ATP, no apresentando nenhum efeito ou um efeito muito reduzido sobre a ativao de cRaf-1 por FGF-2, o que os torna ferramentas teis para este tipo de estudo. Estes dados indicam que os mecanismos de transduo de sinal ativados por ATP que inibem cRaf-1 e que ativam ERK se bifurcam em um ponto acima da ativao da PKC por ATP (Figura 22).

6.3.3.2. O mecanismo de inibio no foi especfico para cRaf-1 ativada por FGF-2.
Considerando que outros fatores de crescimento tambm ativam a cascata da ERK em astrcitos e que a homologia entre os receptores destes fatores de crescimento no muito elevada, o estudo do efeito do ATP sobre a cRaf-1 estimulada por vrios fatores de crescimento pode fornecer informaes sobre o mecanismo de inibio, sempre considerando que um efeito compartilhado por diversas vias de sinalizao mais provavelmente atua sobre um componente que estas vias possuem em comum, ao invs de atuar sobre componentes que so especficos de uma determinada via sinalizadora. Os fatores de crescimento ativam a cascata das MAPK por mecanismos que diferem no nvel do receptor e as vezes no nvel da protena acopladora (como o caso do FRS2 para o FGFR, Shc para a TrkA e GRB2 para o EGFR) (Huang et al. 1995), sendo que os demais componentes, isto , Grb2, Sos e Ras, podem ser usados de forma compartilhada. Como visto na Figura 18, tanto cRaf-1 estimulada por FGF-2, EGF como PDGF foi inibida por ATP, indicando que algum dos componentes compartilhados das vias de sinalizao ativadas por estes fatores de crescimento seja o componente atingido pelo sinal inibitrio, tornando pouco provvel o envolvimento de protenas acopladoras especficas para um dos RTKs.

6.3.3.3. Evidncias de outros agonistas de GPCR

Alm do ATP, a NA tambm inibiu a atividade de cRaf-1, mas considerando que NA aumentou a concentrao de cAMP (Tabela 12) provavelmente atuando em receptores -adrenrgicos (Balsz et al. 1998) e que a elevao de cAMP 116

inibe a atividade de cRaf-1 em culturas de astrcitos (Kurino et al. 1996), muito provvel que NA iniba cRaf-1 atravs de cAMP/PKA (Wu et al. 1993). Por outro lado, serotonina ativou ERK de forma independente de cRaf-1, mas no inibiu cRaf-1 ativada por FGF-2. Dados da literatura indicam que os principais receptores 5-HT funcionalmente expressos em culturas de astrcitos corticais de rato so os subtipos 2, 5, 6 e 7 (Hirst et al. 1998), sendo os subtipos 5-HT2 so acoplados ao aumento de Ca2+ intracelular e cascata da ERK (Launay et al. 1996), o subtipo 5-HT5 acoplado inibio da AC (Carson et al. 1996) e os subtipos 5-HT6 e 5-HT7 acoplados estimulao da AC (Shimizu et al. 1998). Considerando que dados preliminares indicam para a ausncia de efeito observado sobre a produo de cAMP com o tratamento com serotonina, pode ser sugerido que os receptores 5-HT6 e 5-HT7 apesar de serem encontrados em astrcitos e de ativarem a produo de cAMP em culturas de astrcitos do crtex frontal (Shimizu et al. 1998), muito provavelmente no sejam expressos nos astrcitos utilizados no presente estudo, ou o seu efeito bloqueado pela ativao do receptor 5-HT5, negativamente acoplado AC. interessante observar que serotonina possui vrias semelhanas com ATP nos efeitos produzidos sobre vias de sinalizao em astrcitos, tais como: ativao da cascata da ERK de forma independente da cRaf-1 (Tabela 14 e Figura 12); diminuio da concentrao de cAMP; estimulao da entrada de Ca2+ com caractersticas semelhantes caracterizado por um pico inicial dependente de Ca2+ intracelular e uma fase sustentada dependente de Ca2+ extracelular (Neary et al. 1991 e Hagberg et al. 1998). No entanto, enquanto ATP inibe a atividade de cRaf-1, serotonina no produz nenhum efeito sobre a atividade da cRaf-1 induzida por FGF-2, indicando a existncia de mecanismos que diferenciam estes dois sinalizadores. Isto significa que, muito provavelmente, nem a inibio da AC nem o aumento do Ca2+ intracelular estejam envolvidos na inibio da cRaf-1, uma vez que estes dois processos so compartilhados por serotonina e ATP, enquanto que a inibio de cRaf-1 no compartilhada. No entanto, principalmente considerando que os

117

dados referentes ao aumento de Ca2+ intracelular estimulada por serotonina no foi testado no presente trabalho, estas evidncias so circunstanciais e merecem ser testados.

6.3.3.4. O mecanismo de sinalizao ativado por ATP no foi especfico para a inibio de cRaf-1.
A cascata da ERK pode ser ativada tanto pela famlia das Rafs como pela famlia das MEKKs, entre outros. Como visto no item 2.1.2.3.3.2, as MEKKs possuem diferenas considerveis nas suas regies regulatrias quando comparadas com as Rafs, indicando mecanismos de regulao diferenciados. Embora tanto as Rafs como as MEKKs possam ser ativadas por fatores de crescimento atravs da interao com Ras, as diversas regulaes observadas sobre a famlia das Rafs, como inibio ou ativao por PKA ou PKG e ativao por PKC, no foram descritas para as MEKKs. Por exemplo, MEKK1, 2 e 3 no possuem o stio de fosforilao relativo a Ser621 da cRaf-1, descrito como sendo um dos responsveis pela inibio por PKA. Quanto ao stio Ser43, que parece ser o principal ponto de regulao inibitria sobre a cRaf-1, somente MEKK3 possui uma seqncia similar a cRaf-1 nesta posio (NRQS43 e RRAS43 respectivamente), enquanto que na MEKK2 a serina est substituda por uma asparagina (Swiss Prot.). Embora nenhum trabalho tenha sido encontrado na literatura sobre a regulao das MEKKs por mecanismos que regulam as Rafs, como PKA e PKC, a pouca similaridade na seqncia indica que estes mecanismos provavelmente sejam diferentes. Considerando que ATP induziu uma diminuio da atividade de cRaf-1, MEKK1 e MEKK2/3 (Figura 19) e as diferenas anteriormente mencionadas, pode ser sugerido que: 1. ATP regula um mecanismo de sinalizao que atua sobre um componente sinalizador que atua sobre as partes conservadas destas trs (quatro) enzimas, inibindo-as separadamente; 2. ATP ativa um mecanismo de sinalizao que inibe um componente compartilhado por estas MAPKKKs, como Ras, Sos, Grb2 ou as protenas 14-3-3. 118

Considerando que a ativao da cRaf-1 e MEKK1 por Ras tem sido descrita (Marais et al. 1995, Russel et al. 1995) a possibilidade de um mecanismo atuando sobre um componente compartilhado dos mecanismos de ativao da cRaf-1 e da MEKK1, 2 e 3 parece mais plausvel do que uma atuao direta sobre estas quatro protenas independentemente, considerando principalmente a sua baixa homologia (Figura 22). No entanto importante que seja mencionado que os dados apresentados so evidncias circunstanciais e no indicam de forma definitiva para um destas duas possibilidades.

6.3.3.5. Provveis candidatos envolvidos no mecanismo de inibio

A Figura 22 mostra um resumo dos resultados discutidos anteriormente, isto , o mecanismo inibitrio sobre a cRaf-1 por ATP se bifurca antes da ativao de PKC, uma vez que inibidores destas enzimas no afetaram a inibio de cRaf-1. Quanto ao componente da via de sinalizao do FGF-2 que inibido pelo tratamento com ATP, evidncias indicam que seja um componente compartilhado pelas sinalizaes ativadas por FGF-2, EGF e PDGF e que possa ativar cRaf-1, MEKK1 e 2, portanto Grb2, Sos, Ras ou protenas associadas a estas.

P2Y
PLD

EGFR

FGFR

PDGFR

Grb2 Sos Ras

PKC

Ativador de MEK

cRaf-1

MEKK1

MEKK2/3

MEK

ERK Figura 22. Esquema da interao entre as vias de sinalizao ativadas por ATP e FGF-2. 119

Poucos candidatos com as caractersticas acima foram encontrados na literatura. Recentemente, Casci et al. (1999), estudando o desenvolvimento de drosophila, demonstraram que uma protena denominada sprouty inibe a sinalizao mediada por receptores de EGF e FGF-2 e outras RTK, translocando Gap1 para a membrana e com isto inibindo Ras. Alm desta interao, sprouty tambm se liga Drk (homlogo da drosofila da Grb2), podendo representar outro mecanismo de inibio da sinalizao de vrios tipos de sinais. Contudo, este estudo no apresentou nenhum resultado referente regulao da sprouty. A outra possibilidade, como j extensivamente discutido anteriormente, a ativao de uma fosfatase como por exemplo PP1 ou PP2A e que precisa ser testada experimentalmente.

6.3.4. Efeitos sobre ERK

ATP inibiu a atividade de cRaf-1 induzida por FGF-2 de forma rpida e intensa (Figura 18). J MEK e ERK foram afetados menos intensamente, principalmente porque o prprio ATP ativa estas duas enzimas independentemente de cRaf-1. As seguintes questes podem ser formuladas sobre os traados das curvas de tempo apresentadas para MEK e ERK na Figura 20 (pg, 100). 1. Quais as diferenas entre a atividade de ERK estimulada por A+F em relao a ATP ou FGF-2 isoladamente? 2. Como seria a atividade ERK induzida por A+F se a interao inibitria entre estas duas vias no ocorresse? Para responder estas questes o ideal seria um inibidor (ou dominante negativo) especfico que pudesse bloquear o efeito inibitrio do ATP sobre a cRaf1, sem, no entanto, interferir na via de sinalizao que ativa ERK. Como isto no foi possvel, a segunda opo simplesmente adicionar as atividades de ERK induzidas por ATP e FGF-2 isoladamente (Figura 23), assumindo que as atividades somadas no atingissem o mximo limitante de atividade.

120

3.5

Medida Calculada

Atividade Relativa

3 2.5 2 1.5 1 0 5 10 15 20 60 25

Tempo / min
Figura 23. Atividade da ERK induzida por A+F (medida) e a soma da atividade de ERK induzida por ATP e FGF-2 isoladamente(calculada). A Figura 23 mostra o grfico da curva de tempo da soma das atividades da ERK induzidas por ATP e FGF-2 isoladamente (isto , a simples adio dos valores de ativao) juntamente com a atividade observada com o cotratamento de A+F. Com a ajuda do grfico fica claro que a partir dos cinco minutos, a atividade observada com o cotratamento consideravelmente reduzida em relao soma das atividades (2,5 e 3,5, aos 5 min, respectivamente). Testes estatsticos ajudam a ver outras diferenas entre as curvas de tempo da atividade de ERK induzida por ATP, FGF-2 e A+F. Com indicado na legenda da Figura 20, a atividade de ERK estimulada por A+F foi significativamente diferente da atividade estimulada por FGF-2 nos primeiros dois minutos enquanto que aps os 15 min a atividade de ERK estimulada por A+F foi significativamente diferente da atividade induzida por ATP. Resumindo, a atividade de ERK induzida por A+F acompanha primeiramente a atividade induzida por ATP e depois por FGF-2. Isto pode ser ainda melhor visualizado na curva de tempo de MEK. interessante chamar a ateno para a atividade de MEK e ERK aps os 15 min com A+F. Apesar da completa inibio de cRaf-1 (e provavelmente de 121

MEKK1 e MEKK2/3) em tempos posteriores a 5 min, a atividade de MEK e ERK permanece elevada e com intensidade comparvel induzida por FGF-2. Qual ento a origem da atividade de MEK e ERK observada aos 15 e 60 min com A+F se os ativadores de MEK no apresentam nenhuma atividade? As curvas de tempo indicam que alguma sinalizao ativada de FGF-2, responsvel pela atividade de MEK e ERK em tempos mais longos no est sendo inibida pelos mecanismos de sinalizao ativados por ATP. Entre os candidatos para mediar este efeito est PP2A, pois esta fosfatase parece ser a principal desativadora de MEK1 (item 2.1.2.2.8). Hrich et al. (1997) mostraram que casena quinase 2 (CK2) fosforila e ativa PP2A, que por sua vez desativa MEK1, sendo que o tratamento das clulas com PDGF bloqueou a ativao de PP2A atravs da CK2, desta forma bloqueando a desativao da cascata da ERK. Como o PDGF compartilha alguns mecanismos de sinalizao com o FGF-2, possvel que o FGF-2 tambm esteja inibindo alguma via de desativao da cascata, que seja responsvel pela ativao sustentada da mesma e que no inibida pelo tratamento com ATP. A outra possibilidade leva em considerao que em muitos casos os mecanismos de sinalizao responsveis pela sinalizao rpida so diferentes dos mecanismos responsveis pela ativao em um tempo mais longo. Por exemplo, a ativao de cRaf1/MEK/ERK por integrinas independente de PKC nos primeiros 10 min, completamente dependente de PKC aps este tempo (Howe, Juliano, 1998), ou a ativao de ERK por NGF em PC12, que dependente de Ras/cRaf-1 no incio e depois passa a ser dependente de Rap1/B-Raf (York et al. 1998). possvel que ATP esteja bloqueando a ativao de cRaf-1, mas no esteja bloqueando mecanismos alternativos, como por exemplo, a inativao de PP2A.

122

6.4. Efeitos do ATP e FGF-2 sobre o ciclo celular Possvel mecanismo para explicar o sinergismo na proliferao.
Como mencionado anteriormente, Neary et al. (1994) observaram que o cotratamento de ATP e FGF-2 induz a um aumento sinergstico na proliferao de astrcitos quando comparado com a proliferao induzida por cada um destes agentes isoladamente. A existncia do sinergismo implica em interaes entre as vias de sinalizao diferentes da simples utilizao de uma via comum, o que provavelmente levaria somao dos efeitos. Considerando o exposto acima, torna-se bvio perguntar se a interao entre as vias de sinalizao ativadas por ATP e FGF-2 observada no presente trabalho pode estar envolvida no sinergismo na proliferao. Para discutir isto, faz-se necessrio algumas informaes sobre o papel da cascata da ERK sobre os componentes reguladores do ciclo celular. O nome MAPK (Mitogen associated protein kinase) indica a relao positiva que esta cascata de sinalizao possui com a induo da proliferao. Inmeros estudos confirmaram que a ativao da ERK estimula a proliferao celular (Lavoie et al. 1996). Porm, a cascata da ERK tambm est envolvida em muitos outros processos celulares, como por exemplo, diferenciao, memria celular, transcrio gnica entre outros (item 2.1.2.1). Quais so, ento, as caractersticas da ativao da ERK que est envolvida na induo de um determinado evento celular quando comparado com a induo de outro evento celular? Em clulas precursoras neuronais PC12, o tratamento com NGF leva a diferenciao enquanto que EGF produz proliferao, sendo ambos os efeitos mediados pela cascata da ERK. Marshall, (1995) sugeriu que a principal diferena entre a sinalizao indutora de proliferao e de diferenciao a cintica de ativao e desativao da ERK, rpida e transitria para sinais indutores de proliferao e lenta e sustentada para sinais indutores de diferenciao.

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Estudos posteriores mostraram que o efeito estimulatrio da cascata da ERK sobre a proliferao era principalmente mediado pela induo da ciclina D1, hiperfosforilao de pRb e conseqente passagem da fase G1 para a fase S (Lavoie et al. 1996). Por outro lado, sinais indutores de diferenciao inibem completamente a proliferao, o que parece ser mediado principalmente pela induo da expresso da protena supressora de ciclo celular denominada p21WafCip1 (Decker, 1995). Dois trabalhos elucidaram alguns mecanismos moleculares que podem estar envolvidos na produo de eventos celulares to distintos como proliferao e diferenciao. Utilizando vrias isoformas ativveis de Raf, Sewing et al. (1997) e independentemente Wood et al. (1997), demonstraram que uma pequena atividade de cRaf-1 induz a expresso de ciclina D1 (e em menor quantidade, ciclina E) e progresso no CC, enquanto que uma alta atividade da Raf induz a expresso da p21WafCip1 e o bloqueio do CC. Embora seja pouco provvel que a pequena reduo na atividade da ERK com A+F em relao a FGF-2 seja o nico responsvel pelo sinergismo, os trabalhos mencionados acima mostram que no existe uma relao direta entre a ativao da cascata da ERK e a induo da proliferao. Por outro lado, considerando que EGF e PDGF no produziram nenhum sinergismo na proliferao com ATP (Neary et al. 1994) e que o efeito inibitrio do ATP sobre cRaf-1 ativados por fatores de crescimento similar ao encontrado com FGF-2 parece indicar que a interao descrita no presente trabalho no seja o nico responsvel pelo sinergismo, no excluindo, contudo, o seu envolvimento.

6.5. Complexidade dos mecanismos de transduo de sinal

Os mecanismos de transduo de sinal foram promovidos de simples fios de transmisso para complexos computadores biolgicos durante a presente dcada. As vias de sinalizao da dcada passada, formadas por receptores, segundos mensageiros e efetores, dificilmente podem ser reconhecidos nas vias

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de sinalizao como a conhecemos atualmente. Integraes, retroalimentaes, sinergismos tornam o estudo da sinalizao celular uma aventura arriscada, na qual a ativao de um determinado componente pode ser mediado por diversos mecanismos e ter os mais diferentes efeitos, dependendo de detalhes como a sua cintica de ativao e desativao, a sua localizao celular, sem mencionar o histrico celular obviamente diferente para cada tipo celular e para cada clula em um determinado tipo celular. O presente trabalho mostrou dois tipos de complexidades, uma no nvel do receptor e a outra nas vias de sinalizao. A grande maioria das molculas transmissoras pode ativar vrios subtipos de receptores, acoplados s vias de transduo de sinal de formas diferenciadas. Com isto, um dado transmissor, como o ATP, pode desempenhar diversos efeitos, dependendo do conjunto de receptores responsivos a ele que estiverem sendo expressos em uma determinada clula e um determinado momento. A outra observao importante do presente trabalho a interao entre as vias de sinalizao ativadas por ATP e FGF-2. Esta interao parece mais um exemplo entre muitas interaes entre vias de sinalizao, sendo que o prprio conceito de vias de sinalizao (como por exemplo a via cAMP/PKA, ou das MAPK), est se tornando ultrapassado, uma vez que nenhuma destas vias pode ser considerada individualmente. Talvez um termo melhor seja redes de sinalizao, sendo que poderamos falar de uma rede de sinalizao da qual, por exemplo, PLC/PKC, cAMP/PKA e a cascata da ERK fazem parte. Esta alterao de conceito, no entanto, forja uma alterao nos estudos de transduo de sinal. Enquanto que uma via de sinalizao pode ser analisada pelo estudo de um nico componente (digamos, para estudar a via cAMP/PKA, suficiente quantificar cAMP ou PKA), redes de sinalizaes somente podem ser estudadas atravs da anlise, de preferncia simultnea, de vrios componentes, como por exemplo PKA, PKC, ERK, cRaf-1, MEKK1 etc. Como mostrado anteriormente, o estudo da ativao de ERK por ATP e UTP forneceu uma idia errnea de que ATP e UTP ativavam ERK por um mesmo receptor e somente o estudo de outros ns na rede de sinalizao que revelaram o contrrio. Esta

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viso de redes de sinalizao indicam que clulas compreendem o meio no qual elas esto inseridas e no simplesmente entendem um sinal em forma de um grande aumento na concentrao de um determinado sinalizador.

6.5.1. Esperanas metodolgicas para a obteno de dados em transduo de sinal.

Ser que existem restries tcnicas ou tericas para o detalhado estudo de redes de sinalizao celular em clulas funcionais? Certamente este um sonho que ainda parece distante, mas alguns avanos metodolgicos trazem boas esperanas. Um deles parece ser anticorpos que reconhecem especificamente protenas modificadas, principalmente protenas fosforiladas. Por exemplo, as MAPKs so fosforiladas em T e Y sendo que a fosforilao nestes dois resduos correlaciona com a atividade. Anticorpos especficos contra T e Y fosforilados podem diferenciar as trs isoformas das MAPKs (ERK, JNK e p38, item 2.1.2.3.5). A atividade de outras enzimas, como por exemplo a PKC, tambm podem ser medidas atravs de anticorpos que reconhecem stios especficos (Ng et al. 1999). Infelizmente, em muitos casos no existe uma correlao direta entre a atividade e a fosforilao em um determinado stio, como o caso da cRaf-1 (item 2.1.2.2.4), tornando esta tcnica impossvel. Considerando a imensa quantidade de componentes e a complexidade com que estes componentes se relacionam, a anlise de um ou alguns poucos componentes em um lisado, ou em clulas fixadas, certamente no o mtodo ideal para compreender o conjunto (mesmo que seja um subconjunto) de sinalizao. O mtodo ideal teria que mostrar a sinalizao acontecendo na clula viva, interferindo o mnimo possvel e de preferncia possibilitando a anlise de inmeras molculas sinalizadoras simultaneamente, possibilitando a obteno de um mapa multidimensional de atividade de todos estes componentes no tempo e no espao. Pelo menos com as tcnicas atuais, parece impossvel medir a atividade de 100 quinases ao mesmo tempo em uma clula perfeitamente funcional no momento da sua ativao por um fator de crescimento.

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No entanto, uma certa esperana tem advindo de avanos reportados recentemente. Fambrough et al. (1999) quantificaram a expresso de 5938 genes utilizando chips de DNA, entre os quais foram identificados 66 IEGs, que tiveram a sua expresso ativada por fatores de crescimento mais do que 100%. Embora estes chips conseguissem avaliar somente (sic!) de 5 a 10% do genoma, eles parecem possuir o potencial de analisar o genoma completo e com isto identificar variaes de um determinado grupo de genes em resposta um determinado sinal. Quanto ao estudo de vias de sinalizao em clulas funcionais, vrios mtodos fluorimtricos tm sido descritos recentemente, com um potencial muito grande. Miyawaki et al. (1999) e Tsien, Miyawaki (1998) mostraram que duas protenas fluorescentes do tipo protena fluorescente verde (Green Fluorescent Protein GFP) acopladas atravs da CaM e um espaador podem ser bons detectores de Ca2+, com a grande vantagem de poderem ser acoplados a outras protenas, incluindo protenas que se localizam em regies especficas da clula, com isto sendo possvel a identificao da concentrao de Ca2+ em um determinado local na clula. Outro avano importante foi reportado por Ng et al. (1999). Neste trabalho a atividade da PKC foi medida em clulas intactas e funcionantes atravs de tcnicas espectroscpicas. A idia a seguinte: ligar uma molcula fluorescente ao anticorpo que reconhece a PKC e outra molcula fluorescente ao anticorpo que reconhece um stio de fosforilao que fundamental para a ativao desta quinase, a Thr250. Estas molculas fluorescentes so escolhidas de tal forma que a emisso de fluorescncia de uma molcula no interfira com a outra, exceto se elas estiverem muito prximas (alguns poucos nanmetros). Deste forma, acompanha-se a emisso da molcula fluorescente ligada ao anticorpo que reconhece a PKC, sendo que esta fluorescncia vai sofrer alterao somente quando o anticorpo especfico para a Thr250 se ligar no seu stio (ou seja, a PKC for ativada) e aproximar as molculas fluorescentes ligadas nos dois anticorpos. O mais fabuloso desta tcnica que estes anticorpos podem ser injeta-

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dos em uma clula viva e as alteraes na atividade da PKC pode ser literalmente visualisadas em um microscpio fluorescente. Teoricamente seria possvel conseguir medir simultaneamente a ativao de outras enzimas, sendo necessrio para isto conseguir outros pares de fluorforos, que interajam entre si mas no com os demais e que o equipamento de medio possa detectar vrios comprimentos de onda simultaneamente, sendo a restrio a largura (pequena) do espectro visvel. Certamente existem imperfeies: a ligao de um AC a um stio fosforilado parece impedir com que ele seja defosforilado, interferindo diretamente com o funcionamento do sistema23 e tambm esta tcnica ainda extremamente dispendiosa e difcil, mas ao menos ela nos fornece a esperana de que um dia seremos capazes de medir muitas enzimas sinalizadoras em uma clula funcionante e possamos visualizar redes de sinalizao compostas de milhares de protenas em uma clula funcional, quem sabe at dentro de um organismo.

23

Talvez o correlato da incerteza de Heisenberg da biologia.

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7. Concluses
7.1. Especficas
1. Os agonistas purinrgicos testados no presente trabalho ativaram ERK e MEK, enquanto que UTP, 2-MeSATP e ADP ativaram cRaf-1, sendo que ATP no ativou cRaf-1. FGF-2 ativou fortemente estas trs quinases; 2. MEKK1 foi ativada por UTP e 2-MeSATP, enquanto MEKK2/3 foi ativada somente por UTP. Nenhum destes ativadores de MEK1 foram ativados por ATP. Ambos foram ativados por FGF-2; 3. ATP diminuiu a concentrao basal de cAMP, enquanto que na presena de forscolina sinergisticamente aumentou a concentrao de cAMP; 4. ATP bloqueou a ativao de cRaf-1 induzida por FGF-2 de forma dose dependente e com um IC50 semelhante ao EC50 da ativao de ERK por ATP; 5. A cintica de inibio foi rpida, iniciando entre 1 e 2 min, atingindo o mximo aos 5 minutos e permanecendo por pelo menos 60 min; 6. O mecanismo de inibio do ATP no parece envolver cAMP/PKA, pois ATP no induziu nenhum aumento de cAMP. Alm disto, PKC tambm parece no estar envolvida, uma vez que inibidores PKC no tiveram efeito sobre a inibio; 7. A ativao de cRaf-1 por outros fatores de crescimento, como EGF e PDGF, tambm foi inibida por ATP; 8. ATP tambm inibiu a ativao de MEKK1 e MEKK2/3 induzida por FGF2; 9. Noradrenalina aumentou a concentrao de cAMP e bloqueou cRaf-1, provavelmente pelo mecanismo cAMP/PKA; 10. Serotonina diminui a concentrao basal de cAMP e no afetou a ativao de cRaf-1. Considerando que tanto serotonina como ATP induzem

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a um aumento na concentrao de Ca2+ intracelular, pode indicar que este mensageiro no esteja envolvido na inibio de cRaf-1; 11. MEK e ERK so menos afetadas pela inibio de cRaf-1, uma vez que ATP tambm ativa MEK e ERK. No entanto, uma reduo considervel na atividade mxima de MEK e ERK pode ser sugerida se for considerada a somatria das atividades de MEK e ERK induzidas por ATP e FGF-2 isoladamente.

7.2. Gerais
1. Existem pelo menos dois (grupos de) receptores funcionalmente acoplados ativao de ERK em culturas de astrcitos: 1.a. Um (grupo de) receptor(es) responsivo(s) a ATP, ativando ERK por um mecanismo independente de cRaf-1; 1.b. Um (grupos de) receptor(es) responsivo(s) a UTP, ativando ERK por um mecanismo que envolve a ativao de cRaf-1; 2. ATP, provavelmente atuando em um receptor P2Y, bloqueiou de forma rpida e total a ativao de cRaf-1 induzida por FGF-2. Este bloqueio no envolve PKC, o aumento de cAMP e o aumento de Ca2+ intracelular, atingindo a via de sinalizao ativada por FGF-2 acima do ativador de MEK1 e abaixo do receptor de fator de crescimento.

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8. Perspectivas
8.1. Mecanismo de sinalizao ativados por purinoceptores
8.1.1. Mecanismo de ativao da cascata da ERK por ATP e UTP.
Uma possibilidade de identificao do ativador de MEK ativado por ATP atravs da separao cromatogrfica de lisados celulares tratados com ATP, utilizando o ensaio acoplado para detectar a atividade do ativador de MEK, cuja identidade poderia ser identificada por seqenciamento; O mecanismo de ativao da cascata por UTP dependente de Ca2+ em clulas PC12, envolvendo a ativao do EGFR. Estudos utilizando quelantes de Ca2+ intracelular, como BAPTA-AM, ou a quantificao de fosforilao de EGFR poderiam esclarecer se o mesmo mecanismo est presente em astrcitos.

8.1.2. Mecanismo de inibio da cRaf-1 por ATP.

Como os resultados deste estudo indicam que um componente acima de cRaf-1 esteja sendo inibido, importante dosar algum destes componentes. Talvez o melhor candidato seja Ras, que pode ser dosada por um mtodo que envolve a ligao da Ras ativada ao domnio CR1 da cRaf-1, denominado Ras binding domain (RBD). A utilizao de uma RBD ligada a GST permite com que o complexo Ras(ativa)/RBD/GST seja precipitado com glutationa-agarose, sendo que a quantidade de Ras pode ser detectado por imunodeteco (Rooij, Bos, 1997 e item 4.7 expresso e purificao da GST-RBD). Se a Ras tambm for inibida, medidas de acoplamento de Grb2/Sos, utilizando co-imunoprecipitao podem indicar se estes componentes so inibidos pela sinalizao ativada por ATP. Quanto origem do sinal na via de sinalizao ativada por ATP, testes com inibidores de PLD (D609) ou protenas G, bem como testes visando determinar o

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envolvimento das fosfatases PP2A e PP1 no mecanismo de inibio so fundamentais. Isto pode ser conseguido tanto pela utilizao de inibidores bem como de quelantes de Ca2+ intracelular, no caso do envolvimento da PP2B/PP1.

8.1.3. Possibilidade do envolvimento da inibio de cRaf-1 por ATP na ativao da cascata da ERK por agonistas purinrgicos.
O Figura 24 mostra uma hiptese de trabalho para testar a possibilidade de que as integraes nos mecanismos de transduo de sinal observadas no presente trabalho passam estar envolvidas no perfil farmacolgico observado para a ativao da cascata da ERK. importante mencionar que, embora no tenhamos dados suficientes para propor este esquema baseado nos dados apresentados no presente trabalho, estes permitem esta interpretao, pois: 1. Foi demonstrado que ATP inibe a ativao de cRaf-1 aps o primeiro minuto; 2. Neste tempo, a estimulao observada sobre cRaf-1 foi semelhante para ATP, UTP e 2-MeSATP, com visto na Figura 15. (nenhum destes agonistas ativou cRaf-1 significativamente no primeiro minuto e eles no apresentaram nenhuma diferena na atividade quando analisados por ANOVA); 3. ATP foi o nico agonista purinrgico a no ativar cRaf-1, embora ele seja descrito como agonista para os receptores P2Y2 e P2Y4 cuja presena foi confirmada em culturas de astrcitos; Portanto, possvel que os dados farmacolgicos estejam indicando a presena de um receptor ativado somente por ATP, e que este receptor esteja mediando o efeito inibidor sobre a cRaf-1 ativada por FGF-2, e talvez tambm ativada por UTP, 2-MeSATP, ADP, e porque no, por ATP, atuando, neste caso, sobre outros receptores. No entanto, considerando que esta hiptese de trabalho no foi testada, os seguites experimentos podero esclarescer a sua presena.

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ATP

UTP

2-MeSATP, ADP

P2Yi
PLD

P2Y2

P2Y4

P2Y1

PKC

MEK activator

cRaf-1

MEK

ERK Figura 24. Possvel envolvimento da inibio da cRaf-1 por ATP na ativao da cascata da ERK pelos agonistas purinrgicos.

Primeiramente, necessrio estabelecer se ATP realmente tambm inibe cRaf-1 ativada por agonistas purinrgicos, o que muito provvel, uma vez que no se tem conhecimento de pools de cRaf-1 regulados de forma diferencial. Se este esquema estiver certo, a curva de tempo do co-tratamento de ATP e UTP deveria se sobrepor curva de tempo do ATP vista na Figura 15; Para que resultados mais diretos pudessem ser obtidos fundamental a utilizao de inibidores que pudessem bloquear o efeito do P2Yi (i de inibitrio) mostrado na Figura 24. Uma inibio deste receptor levaria a uma ativao de cRaf-1 por ATP aos 5 min e, obviamente, uma reverso da inibio sobre cRaf-1 ativada por FGF-2. A caracterizao da ao destes inibidores poderia ser feito atravs de um ensaio de cRaf-1 com o tratamento de ATP por 5 min. Desta forma ser possvel realizar uma avaliao para vrios inibidores, como inibidores 133

de receptores P2Y responsivos purinas (como o P2Y ) ou inibidores de meca1 nismos de transduo de sinal como protena G ou fosfolipases.

8.2. Efeitos regulatrios do ciclo celular

8.2.1. Mecanismo do sinergismo
O presente estudo mostrou uma interao entre as vias de sinalizao ativadas por FGF-2 e ATP, mas no estabeleceu uma clara relao entre esta inibio e o efeito sinergstico observado na proliferao de astrcitos. Algumas estratgias podem ser utilizadas para esclarecer este ponto, como a dosagem da expresso da ciclina D1, o principal sinalizador positivo entre a cascata da ERK e a progresso atravs do ciclo celular e da CKI p21WafCip1, aparentemente o principal sinalizador negativo, cuja expresso induzida por altas atividade da cascata da ERK.

8.2.2. Estudo do sinergismo em linhagens de astrocitomas.

O sinergismo na proliferao, pela sua grande intensidade, pode estar envolvido no alto ndice de proliferao de gliomas humanos, uma vez que tanto FGF-2 como ATP esto aumentados em locais com morte celular no CNS. Desta forma, tratamentos que podero acabar com este sinergismo possuem um bom potencial para o combate a tumores cerebrais.

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162

10. Anexos
10.1. Manuscrito dos artigos referentes tese
Y., Neary, J. T., P2Y Purinergic Receptor Subtypes Recruit Different MEK Activators In Astrocytes. Br. J. Pharmacol. In press Lenz, G., Gonalves, D., Luo, Z., Avruch, J., Rodnight, R., Nie, W. J., Kang, Y., Neary, J. T., Cross-Talk Between The MAP Kinase Pathways Activated By FGF-2 and Extracellular ATP. Submetido ao J. Neurochem. Lenz, G., Gottfried, C., Luo, Z., Avruch, J., Rodnight, R., Nie, W. J., Kang,

163

10.2.

Outros trabalhos realizados durante o

doutorado (no anexado)

Walz, R., Lenz, G., Roesler, R., Vianna, M. M. R., Martins, V., Brentani, R., Rodnight, R., Izquierdo, I., Posttraining Infusion Of Nerve Growth Factor into the Hippocampus Activates Mitogen-Activated Protein Kinase and Enhances Inhibitory Avoidance Retention of Adult Rats. Submetido ao Europ. J. Neurosci. Gonalves, D. S., Lenz, G., Karl, J. D., Gonalves, C. A., Rodnight, R., Extracellular S100B Protein Modulates ERK in Astrocyte Cultures, Neuroreport, in press. Wink, M. R., Lenz, G., Rodnight, R., Sarkis, J. J., Battastini, A. M. O., Identification of ecto-apyrase from rat brain as a phosphoprotein. Submetido ao Mol. Cell. Biochem. Walz, R., Roesler, R., Quevedo, J., Rockenbach, I. C., Amaral, O. B., Vianna, M. R. M., Lenz, G., Medina, J. H., Izquierdo, I., (1999) Dose-dependent impairment of inhibitory avoidance retention in rats by immediate posttraining infusion of a mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor into cortical structures Behav. Brain Res. 105, 219-223. da Rocha, A., Mans, D.R.A. Lenz, G., Rodnight, R., Fernandes, A., de Lima, C., Gonalves, D., Ruschel, C., Moreira, J.C.F. Brunetto, A. L., Schwartsmann, G., Induction of Ornithine Decarboxylase Expression in Human Glioblastoma Cell Lines through the activation of the Epidermal Growth Factor Receptor, Protein Kinase C, And Mitogen-Activated Protein Kinase/Extracellular-Signal-Regulated Kinase. Submetido ao Biochim. Biophys. Acta.

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