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Biologia Celular, 1 Semestre, 2009/2010

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Via da secreo
1 - A sntese de protenas com um sinal para o RE completada

no RER e as novas cadeias polipeptdicas ou so inseridas na membrana do RE ou atravessam a membrana dirigindo-se para o lmen do RE. Algumas protenas permanecem no RE.

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Via da secreo
2 As protenas que no pertencem ao RE so movidas em vesculas de transporte que brotam do RE e que se fundem para formar novas cisternas do Complexo de Golgi-cis transporte para diante ou dianteiro (antergrado)

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Via da secreo
3 Protenas do lmen do RE que foram erradamente endereadas ou protenas das membranas das vesculas que tm que ser reusadas (reciclagem proteica) so devolvidas ao RE atravs de vesculas de transporte transporte para trs ou retrgrado (G (Golgi-RE). )

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Via da secreo
4 Cada cisterna do cisGolgi, com o seu contedo proteico, movese da face cis para a face trans do complexo de Golgi, por um processo no vesicular designado de maturao das cisternas. 5 Vesculas do transporte retrgrado (trans-Golgi medialGolgi cis-Golgi) movem as protenas residentes no Complexo de Golgi para o compartimento adequado neste complexo.

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Via da secreo
6 Em todas as clulas, algumas protenas solveis movem-se para a superfcie celular em vesculas de transporte e so continuamente secretadas secreo constitutiva. 7 Em certos tipos de clulas, algumas protenas solveis so armazenadas em vesculas secretoras e so s libertadas depois da clula receber um sinal hormonal ou um sinal nervoso apropriado secreo regulada.

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Via da secreo
8 Protenas solveis ou membranares endereadas para os lisossomas so movidas li id em vesculas transportadoras que brotam do transComplexo de Golgi. No entanto, primeiro movem-se para o endossoma tardio e s depois para o lisossoma. lisossoma

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Via da secreo
9 As protenas solveis ou membranares extracelulares so absorvidas por vesculas b id l que brotam da membrana plasmtica endocitose As vesculas de transporte movem-se depois para os lisossomas onde so degradadas, passando primeiro pelos endossomas tardios.

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Via de secreo
Transporte de VSVG (glicoprotena viral) ligada GFP (green fluorescent protein) atravs da via de secreo microscopia de fluorescncia aps transfeco de cultura de clulas com protenas. um gene hbrido que codifica ambas as protenas

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Biologia Celular, 1 Semestre, 2009/2010

Introduo

Todas as clulas necessitam de se alimentar, comunicar e responder rapidamente a mudanas no seu ambiente. Para completar esta tarefa as clulas ajustam continuamente a composio da membrana plasmtica (essencialmente as protenas). As clulas usam um elaborado sistema membranar interno para adicionar ou remover protenas da superfcie celular como:
Receptores Canais inicos Transportadores

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Introduo

Atravs de um processo designado de exocitose, a via de secreo entrega p protenas, hidratos de , carbono e lpidos na membrana plasmtica ou no espao extracelular. Pelo processo de endocitose, as clulas removem componentes da membrana plasmtica e entregam-nos a compartimentos internos endossomas onde podem ser reciclados (voltando membrana plasmtica) ou dirigidos para os lisossomas para degradao.

As clulas tambm usam a endocitose para capturar nutrientes importantes (vitaminas, lpidos, p ( , p , colesterol e ferro). Estes nutrientes so importados juntamente com as macromolculas s quais esto aderidos.

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Introduo

As protenas viajam no espao celular sem terem que atravessar as membranas transportadas de um compartimento a outro atravs de contentores de transporte envolvidos por membranas vesculas de transporte. Numa clula eucaritica, as vesculas de transporte esto continuamente a brotarem de uma membrana e a fundirem-se com outra, transportando componentes membranares e molculas solveis carga.

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Introduo

A via de secreo comea no retculo endoplasmtico (RE), segue para o Complexo de Golgi e chega superfcie celular. f Existe ainda uma via lateral dirigida para os lisossomas. A via endoctica segue no sentido oposto, da membrana plasmtica para o interior da clula. O fluxo de membranas equilibrado pelo transporte retrgrado, que desloca algumas protenas de volta ao compartimento de origem.
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Introduo

Via de secreo (transporte para diante ou dianteiro) vermelho Via endoctica verde Via retrgrada (transporte para trs) azul

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Transporte vesicular grandes questes

Qual o mecanismo de formao de uma vescula transportadora? De que so formadas as vesculas transportadoras? Como se explica o transporte selectivo de protenas solveis e protenas membranares integrais atravs das vesculas? Porque razo uma determinada vescula se funde apenas com um determinado compartimento alvo?

Que caractersticas definem cada compartimento? Alguma combinao especfica de marcadores moleculares existentes na face citoslica das membranas?

Qual o mecanismo de fuso duma vescula com o seu compartimento alvo?

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Vesculas transportadoras

A maior parte das vesculas transportadores formam-se de regies especializadas das membranas. Libertam-se como vesculas franjadas (coated vesicles), uma vez que apresentam uma cobertura distinta de protenas na superfcie citoslica. Antes de se fundirem com a membrana alvo, esta cobertura descartada necessrio que a superfcie citoslica de ambas as membranas interaja directamente.

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Vesculas franjadas

A cobertura apresenta duas funes principais:

Concentrar protenas

membranares especficas num agregado especializado, que origina a membrana da vescula selecciona as molculas que tm que ser transportadas. numa poro da membrana, que molda a formao da vescula garante um tamanho e forma uniforme de cada tipo de vescula.

Induo de uma curvatura

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Vesculas franjadas

Esto caracterizados trs tipos de vesculas franjadas, de acordo com as protenas existentes na cobertura:
Vesculas de clatrina Vesculas COPI COP refere se a protena de revestimento ( COat Protein) refere-se (COat Protein ) Vesculas COPII

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Vesculas franjadas

Cada tipo de vesculas franjadas usado em passos distintos do transporte:

Contudo existe uma grande variedade de vesculas franjadas e de

funes. funes

Exemplo: Diversos tipos de vesculas de clatrina cada uma

especializada num passo especfico do transporte vesicular.

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Vesculas franjadas

Em geral:
As vesculas COPII transportam protenas secretoras do RE para o

compartimento intermedirio RE-Golgi, e entre as vrias cisternas do Complexo de Golgi. responsveis pelo transporte retrgrado.

As vesculas COPI surgem do compartimento intermedirio RE-Golgi e so As vesculas de clatrina so responsveis pelo transporte em ambas as

direces entre o trans-Complexo de Golgi, endossomas, lisossomas e membrana plasmtica.

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Vesculas de clatrina

O componente proteico principal destas vesculas a prpria clatrina. Cada subunidade de clatrina consiste de trs cadeias polipeptdicas grandes (pesadas) e trs pequenas (leves) formam uma estrutura com trs pernas designada de triskelion trmeros individuais. Os vrios triskelion juntam-se numa estrutura hexagonal e pentagonal em forma de cesto convexo originam os poos revestidos (coated pits) na superfcie celular das membranas. Os trmeros individuais determinam a geometria da cobertura de clatrina.
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Estrutura da cobertura de clatrina

Exemplo: Cobertura de clatrina composta por 36 trmeros individuais organizados numa rede de 12 pentgonos e 6 hexgonos, com as respectivas cadeias pesadas (C) e leves (D). Os domnios do terminal-N dos trmeros individuais esto expostos, formando um camada interna, visvel em cada poo/abertura e onde se ligam outras protenas. Esta cobertura demasiado pequena para albergar uma vescula membranar, mas todas as vesculas de clatrina so construdas de forma similar, com 12 pentgonos e um nmero muito maior de hexgonos (similar a uma bola de futebol).
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Estrutura da cobertura de clatrina

As protenas adaptadoras so o outro componente principal das vesculas de clatrina. Estas protenas formam um segunda camada discreta da cobertura, posicionada entre a camada de clatrina e a membrana. A funo das protenas adaptadoras :
Ligar a cobertura de clatrina membrana da vescula

Polimerizao da cobertura das vesculas.

Capturar vrias protenas transmembranares, incluindo receptores

transmembranares (receptores cargo) que por sua vez capturam molculas cargo solveis no interior da vescula Recrutamento selectivo de molculas cargo.

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Estrutura da cobertura de clatrina

Desta forma, um conjunto especfico de protenas transmembranares, juntamente com protenas solveis que elas, interagem com elas so empacotadas em cada nova vescula de clatrina. Existem vrios tipos de protenas adaptadoras. As que at agora foram melhor caracterizadas apresentam quatro subunidades proteicas distintas; outras so protenas com uma nica cadeia cadeia. Cada tipo de protena adaptadora especfico para um conjunto especfico de protenas receptoras formao de vesculas de clatrina distintas.
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Estrutura da cobertura de clatrina

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Estrutura das vesculas COPII

A estrutura das vesculas COP similar s vesculas de clatrina mas com uma cobertura com composio proteica distinta. No caso das vesculas COPII a parte externa da cobertura composta por protenas Sec13/31 que se organizam numa estrutura simtrica esfrica. esfrica A parte interna apresenta as protenas Sec23/24. A protena Sec24 apresenta alguns locais de ligao a receptores cargo.
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Retrmeros - estrutura

Nem todas as estruturas de revestimento so do tipo cesto. p Algumas coberturas retrmeros so conjuntos de protenas bem mais complexos. Os retrmeros so montados nos endossomas e formam vesculas que devolvem receptores especficos do cido hidrolase ao Complexo de Golgi.

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Montagem e desmontagem da cobertura de clatrina

O primeiro passo a montagem da cobertura e consequente seleco das molculas cargo a transportar na vescula A montagem da cobertura introduz uma curvatura na membrana, que leva formao de vesculas revestidas e com um tamanho uniforme. Aps a formao da vescula revestida a cobertura de clatrina desmontada vescula de transporte nua

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Montagem e desmontagem da cobertura de clatrina

Microfotografias TEM da formao de vesculas franjadas (vesculas revestidas)

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Controlo da montagem das vesculas franjadas

Para equilibrar o trfego vesicular de um outro, compartimento para outro as protenas da cobertura tm que ser montadas apenas quando necessrio efectuar o transporte. Muita deste controlo efectuado por GTPases de recrutamento da cobertura:
Exemplos:
Controlo da montagem da cobertura de clatrina nos

endossomas

Controlo da montagem das coberturas COPI e COPII nas

membranas do complexo de Golgi e RE.

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Controlo da montagem das vesculas franjadas

Muitos passos do transporte vesicular dependem de uma variedade de protenas de ligao ao GTP. Estas protenas funcionam como interruptores moleculares activas quando ligadas ao GTP e inactivas quando ligadas ao GDP.

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Controlo da montagem das vesculas franjadas

Existem duas classes principais de protenas que regulam esta mudana:

GEF factores de troca

da guanina (guanine nucleotide exchange factors) que catalisam a troca de GDP por GTP
GAP protenas

activadoras da GTPase (GTPase-activating proteins) que inactivam as protenas por hidrlise do GTP em GDP.

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Controlo da montagem das vesculas franjadas

As GTPases de recrutamento da cobertura so membros da famlia de GTPases monomricas e incluem:

Protenas ARF responsveis pela montagem das coberturas COPI

e clatrina nas membranas do complexo de Golgi

Protenas Sar1 responsveis pela montagem da cobertura COPII

na membrana do RE.

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Formao de vesculas de clatrina

A formao de vesculas de clatrina requere clatrina, protenas de ligao ao GTP ARF1, ARF1 e pelo menos d i ti l dois tipos de protenas adaptadoras. A formao efectua-se do seguinte modo:
A ARF/GDP liga-se a protenas

da membrana de Golgi.

Um GEF-ARF da membrana

estimula a troca de GDP por ti l t d GTP.

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Formao de vesculas de clatrina

A ARF/GTP inicia o processo,

recrutando protenas adaptadoras, que servem de locais de ligao dos receptores transmembranares (GGA e AP1) e da clatrina. durante o transporte, o GTP ligado ARF hidrolisado em GDP e o ARF1/GDP libertado da membrana da vescula. determinadas enzimas enfraquece a ligao do complexo de clatrina permite que chaperonas citoslicas dissociem a cobertura.
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Aps o destacamento da vescula e

A perda do ARF1 e a aco de

Formao de vesculas COPII

As GTPases de recrutamento da cobertura so usualmente encontradas em elevadas concentraes no citosol num estado inactivo (ligado ao GDP). Quando necessrio formar uma vescula COPII, uma Sar1-GEF (ou Sec12) embebida na membrana do RE liga-se ao Sar1 citoslico libertao do GDP e ligao do GTP. No estado ligado ao GTP, a Sar1 expe uma hlice anfiflica (mudana de conformao), que se insere no folheto citoplasmtico da bicamada lipdica da membrana do RE.
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Formao de vesculas COPII

A Sar1 ligada membrana recruta subunidades das protenas da cobertura e inicia o processo de curvatura:
A GTP-Sar1 liga-se a um

complexo de duas protenas da cobertura de COPII, Sec24/23. distintos de ligao das caudas dos receptores de cargo.

A Sec24 apresenta alguns locais

Outras GEFs e GTPases de recrutamento da cobertura funcionam de forma similar noutras membranas.

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Formao de vesculas COPII

A GTP-Sar1 tambm recruta as subunidades da cobertura da COPII propriamente dita (Sec13/31) para a membrana. Este recrutamento leva formao de um gomo que incluem protenas transmembranares especficas que entretanto se ligaram. ligaram Um evento de destacamento liberta a vescula franjada.

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Fosfoinositdeos (PIP)

O fosfoinositol (fosfolpido membranar) apresenta importantes funes reguladoras:

Pode sofrer rpidos ciclos de

fosforilao e desfosforilao em posies especficas do inositol (cabea polar) produzindo vrios tipos de fosfoinositdeos (phosphoinositides, PIPs). compartimentalizada:

lt t E t i t Esta interconverso altamente

Organelos diferentes

apresentam cinases PI e PIP e fosfatases PIP especficas.

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Fosfoinositdeos (PIP)
Muitas protenas envolvidas em passos distintos do transporte vesicular contm domnios que se ligam com elevada especificidade cabea polar de PIPs particulares. A produo de um tipo particular de PIP recruta protenas contendo o domnio de encaixe correspondente. As protenas que se ligam ao PIP de seguida regulam a formao de vesculas assim como outros passos do transporte membranar.

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Regulao do destacamento das vesculas franjadas

medida que a cobertura de clatrina (igual para COPI e COPII) cresce protenas cresce, citoplasmticas solveis, incluindo a dinamina, juntam-se numa estrutura tipo anel volta do pescoo da vescula. A dinamina contm um domnio de ligao a fosfoinositdeos que amarra a protena membrana, e um domnio GTPase que regula a taxa de destacamento das vesculas franjadas.

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Regulao do destacamento das vesculas franjadas

O processo de destacamento junta os dois folhetos no citoslicos, levando sua fuso. fuso Para a execuo desta tarefa a dinamina recruta outras protenas que conjuntamente com a dinamina, ajudam a dobrar a membrana:
Por distoro directa da

bicamada lipdica

Por mudanas na composio

lipdica atravs do recrutamento de enzimas modificadoras de lpidos.

A fuso resulta no destacamento das vesculas franjadas.

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Libertao da cobertura de clatrina

Depois da libertao da membrana, a vescula perde rapidamente a cobertura de clatrina. Aps o destacamento da vescula e durante o transporte, o GTP ligado ARF hidrolisado em GDP e o ARF1/GDP libertado da membrana da vescula. Tambm, uma fosfatase do PIP remove o PIP da membrana, enfraquecendo a ligao s protenas adaptadoras. Adicionalmente, Adicionalmente uma chaperona Hsp70 citoslica funciona como uma ATPase (activada por uma auxilina), usando a energia da hidrlise do ATP para remover a cobertura de clatrina.

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Libertao da cobertura COPII

Aps a libertao das vesculas COPII, a GTPase Sar1 com a ajuda de uma das subunidades da cobertura hidrolisa a Sar1 GTP em Sar1 GDP. Esta hidrlise modifica a conformao da Sar1 a cauda hidrofbica sai da membrana e consequentemente inicia-se a desmontagem da cobertura COPII.

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Formao e destacamento das vesculas COPI

Papel da ARF na montagem e desmontagem da cobertura COPI

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Vesculas franjadas - resumo

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Endereamento das vesculas e dos seus componentes

De forma a que as vesculas de transporte movam p protenas especficas de um p compartimento para outro, as vesculas tm que discriminar entre as protenas membranares e entre as solveis, aceitando apenas as protenas cargo que devem avanar para o prximo compartimento No processo de c r at ra da curvatura membrana dadora, a cobertura da vescula tambm selecciona as protenas a serem transportadas.
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Endereamento das vesculas e dos seus componentes

O primeiro mecanismo de seleco pela ligao directa de sequncias especfica sinais de seriao na poro citoslica de protenas cargo membranares. Protenas solveis no lmen dos organelos so seleccionadas por ligao aos domnios luminais de certas protenas cargo membranares.

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Endereamento das vesculas e dos seus componentes

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Endereamento das vesculas e dos seus componentes

Um segundo conjunto de protenas (pequenas protenas que ligam GTP), protenas Rab, participam no endereamento das vesculas para a membrana alvo apropriada. As A protenas R b pertencem mesma superfamlia d GTP t Rab t f li de GTPases (t l (tal como a Sar1 e a ARF) e apresentam cerca de 60 membros, em que cada protena Rab est associada com uma ou mais membranas da via de secreo ou endoctica e em que cada organelo apresenta pelo menos uma protena Rab na superfcie citoslica.

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Endereamento das vesculas e dos seus componentes

No estado inactivo (Rab-GDP) a protena encontra-se ligada a outra p protena ( (inibidor de dissociao da Rab-GDP, GDI) que a mantm solvel no citosol. No estado activo (Rab-GTP) a protena encontra-se associada com a membrana de um organelo ou de uma vescula de transporte. Na membrana a GDI libertada da Rab GDPs Rab-GDPs por factores de deslocao da GPI. De seguida por aco das Rab-GEFs a Rab-GDP transformada em Rab-GTP.

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Endereamento das vesculas e dos seus componentes

Como as GEFs esto localizadas em membranas especficas e actuam em membros especficos da famlia Rab, Rab so em parte responsveis pela formao de complexos Rab-GTP nos locais correctos da membrana. A insero na membrana resulta de uma mudana de conformao que permite a interaco com a superfcie proteica de uma vescula transportadora particular e a insero da ncora isoprenoide (lipdica) hidroflica na membrana da vescula.

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Endereamento das vesculas e dos seus componentes

Na membrana as protenas Rab ligam-se a outras protenas efectores Rab, que facilitam o transporte vesicular, a acostagem ao compartimento alvo e a fuso, e ainda a v-SNAREs essenciais na fuso. A estrutura dos efectores Rab varia grandemente devido s diferentes funes que desempenham. Uma protena Rab diferente organiza outras protenas efectoras e t-SNAREs na membrana alvo.

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Endereamento das vesculas e dos seus componentes

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Endereamento das vesculas e dos seus componentes

A mesma protena Rab pode ligar efectores mltiplos. A montagem das protenas Rab e seus efectores numa membrana cooperativa e resulta na formao de pores membranares especializadas.

Exemplo: Rab5, que se encontra na membrana endossomal e que medeia a captura de vesculas de clatrina que chegam da membrana plasmtica.

A Rab5 recruta protenas de acostagem filamentosas para apanharem as vesculas.

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Fuso membranar

Aps a ancoragem na membrana alvo, a vescula descarrega a sua carga atravs de fuso membranar. A fuso membranar requer um aproximar das duas membranas (at 1,5 nm de distncia) que resulta num fluxo de lpidos de uma camada lipdica para outra. Protenas SNARE (ou SNAREs) catalisam as reaces de fuso membranar no transporte vesicular.
Estas protenas fornecem igualmente um local adicional

de especificidade no transporte, ajudando a assegurar que apenas as vesculas correctamente endereadas que se fundem.

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Fuso membranar

Existem pelo menos 35 SNAREs diferentes numa clula animal, cada uma associada a um organelo particular das vias de secreo e endocticas. Estas E t protenas t t transmembranares existem em conjuntos b i t j t complementares v-SNAREs encontrados nas membranas vesiculares e t-SNAREs nas membranas alvo.

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Fuso membranar

Uma v-SNARE uma nica cadeia polipeptdica, enquanto uma t-SNARE composta por 2 ou 3 protenas. As v-SNAREs e t-SNAREs apresentam domnios helicais caractersticos, caractersticos e quando uma v-SNARE interage com uma tSNARE, os domnios helicais de uma protena enrolam-se nos das outra protena, formando um feixe estvel com4 hlices complexo trans-SNARE que aproxima as duas membranas.

As SNAREs foram bem caracterizadas em neurnios, onde medeiam a ancoragem e fuso das vesculas sinpticas na p membrana plasmtica dos nervos terminais durante o processo de libertao de neurotransmissores.

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Fuso membranar

Julga-se que os complexos trans-SNARE catalisam a fuso membranar usando a energia libertada aquando do entrelaar das cadeias em hlice. O complexo transSNARE aproxima as duas membranas, ao mesmo tempo que expele molculas de gua da interface entre as duas membranas.

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Fuso membranar

As molculas lipdicas nos dois folhetos fluem entre as membranas para formar conectora. uma haste conectora Os lpidos dos outros dois folhetos contactam uns com os outros e formam uma nova bicamada lipdica, que alarga a zona de fuso (hemifuso, ou meia fuso). A ruptura da nova bicamada lipdica completa a reaco de fuso.

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Exocistos
Alguns tipos especficos de fuso podem envolver locais especializados na membrana plasmtica exocitose. Muitos tipos de exocitose ocorrem em complexos proteicos especficos exocistos. A estrutura dos exocistos ainda no bem conhecida, mas a sua montagem necessita a interaco sequencial entre oito protenas localizadas quer na vescula transportadora quer na membrana alvo. Algumas protenas de ligao ao GTP (e.g. Rab) tambm esto associadas aos exocistos.

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Controlo da fuso membranar

As protenas Rab regulam a disponibilidade das protenas SNARE e por isso exercem mais um nvel de controlo.
As t-SNAREs das membranas alvo esto muitas vezes

associadas a protenas inibidoras que tm que ser libertadas para que as t-SNARE funcionem.

As protenas Rab e os seus efectores accionam a

libertao das protenas inibidoras SNARE esto concentradas e so activadas na localizao correcta da membrana membrana. as vesculas tm que incorporar as protenas SNARE e Rab apropriadas.

Para o transporte vesicular funcionar correctamente,

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Reciclagem das SNARE

Para que as protenas SNARE possam voltar a funcionar, os complexos que formam tm que ser desmontados, antes que se inicie uma nova ronda de transporte. U a protena designada S Uma p ote a des g ada NSF mais duas p ote as acess as (as protenas acessrias ( SNAP uma delas) catalisam o processo de desmontagem.
A NSF uma ATPase que usa a energia da hidrlise do ATP para

desenlaar os domnios helicais entre as protenas SNARE emparelhadas. as membranas de se fundirem indiscriminadamente.

Esta necessidade de reactivao mediada pelo NSF ajuda a prevenir que Ainda no se sabe como que controlada a actividade das NSF, mas

provvel que os efectores Rab estejam envolvidos no processo.

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Vesculas transportadoras

Constituio de uma vescula transportadora durante o seu processo de formao no compartimento dador (a) e fuso com o compartimento alvo (b)

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Fuso membranar

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Fuso das vesculas transportadoras

1 - Uma protena Rab ligada por uma ncora lipdica a uma vescula p secretora liga-se a um efector Rab na membrana plasmtica atraca a vescula transportadora no membrana alvo apropriada

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Fuso das vesculas transportadoras

2 Uma protena v-SNARE (neste caso VAMP) interage com os domnios citoslicos da tSNARE (neste caso sintaxina e SNAP 25) f SNAP-25) forma-se um complexo trans-SNARE muito estvel, que aproxima ambas as membranas; 3 As duas membranas fundemse. 4 A NSF conjuntamente com a protena -SNAP liga-se ao complexo trans-SNARE, trans SNARE, levando sua dissociao. Nesta altura a Rab-GTP hidrolisada em Rab-GDP e dissocia-se do efector Rab.

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