UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE BIOFSICA CARLOS CHAGAS FILHO

DISCIPLINA BMB163 - BIOFSICA PARA BIOLOGIA

BLOCO MUTAGNESE
APOSTILA

Ana Beatriz Furlanetto Pacheco

Wanda M. Von Krger
Luis Carlos S. Ferreira

NDICE
Mutaes Conceito e introduo

Classificaes das Mutaes

A origem das mutaes (mutaes espontneas e induzidas)

Mutaes espontneas

Mutaes induzidas

10

Mutagnese mediada por elementos de transposio

13

O que so elementos de transposio

13

Tipos de mutao gerados por elementos de transposio

16

Aplicaes experimentais da mutagnese

18

Como gerar e detectar mutantes em laboratrio

18

Sistemas para detectar mutantes

18

Tcnicas para gerar mutaes

19

Mutagnese generalizada

19

Mutagnese stio especfica ou dirigida

20

Tcnicas de mutao dirigida

Engenharia de protenas

21
23

Alterao da estabilidade da protena

23

Alterao da atividade enzimtica

25

Bibliografia

26

Estudos dirigidos

27

Mutaes Conceito e introduo

Mutaes so alteraes hereditrias no genoma, o material gentico de um
organismo. Neste mdulo vamos estudar alguns aspectos relacionados s mutaes.
Inicialmente discutiremos o conceito, classificaes e a terminologia empregada. Em seguida
sero apresentados os principais mecanismos de gerao de mutaes: espontneas e
induzidas; causas fsicas, qumicas e biolgicas. Tambm vamos exemplificar de que forma o
uso de mutantes um tema central em estudos de gentica, biologia molecular e
bioqumica. Finalmente, esperamos transmitir a importncia das mutaes como fonte de
variabilidade e matria-prima para a evoluo.
Todo ser vivo possui um genoma caracterstico, formado por genes estruturais e
seqncias no transcritas, que deve ser preservado e transmitido para as geraes futuras.
Falhas ocorridas durante a replicao do material gentico ou o surgimento de leses,
espontneas ou induzidas, podem resultar em mutaes e estas, por sua vez, podem causar
uma srie de conseqncias danosas s clulas e aos organismos. Entre os efeitos
prejudiciais para o homem, associados s mutaes esto: mal-formaes congnitas;
anomalias e distrbios metablicos de origem gentica, como o cncer; resistncia a
medicamentos em bactrias, vrus e parasitas; pragas capazes de resistir ao de
inseticidas.
Por outro lado, as mutaes representam a principal fonte de diversidade gentica
que, em conjunto com a seleo natural, permite que os organismos se adaptem s
contnuas mudanas no ambiente, sendo portanto um elemento benfico e fundamental para
o qualquer espcie viva na natureza.
Pergunta 1: Por que a maioria das mutaes traz efeitos prejudiciais ao organismo?

A gerao e o estudo de mutantes em laboratrio representam ferramentas

fundamentais na rea de gentica e biologia molecular. A comparao de organismos
mutantes e selvagens permite desvendar vias metablicas e funes de determinados
produtos gnicos, por exemplo. Na rea de biotecnologia, a manipulao de genomas
permite a produo de medicamentos e vacinas.
Pergunta 2: D um exemplo de como as mutaes auxiliam pesquisadores a esclarecer detalhes sobre
a gentica ou o metabolismo de um ser vivo.
Pergunta 3: Como voc diferenciaria um indivduo dito selvagem de um indivduo mutante? E um alelo
selvagem de um alelo mutante?

Classificaes das Mutaes

Uma mutao qualquer alterao no contedo informacional de uma clula, isto ,
na seqncia de bases do material gentico. Mutaes podem ter efeitos diversos no
organismo em funo de sua natureza e do local onde ocorrem. Seu efeito pode ser
observvel no fentipo ou no. As alteraes fenotpicas causadas pelas mutaes podem
variar desde a ausncia de efeito mensurvel at a inviabilidade do indivduo.
Por convenincia as mutaes so classificadas em funo de determinados
parmetros. Alguns destes parmetros envolvem, por exemplo, a conseqncia da mutao
para o organismo em questo, o tipo de fentipo resultante, o tipo de clula afetada.
Pergunta 4: Voc seria capaz de explicar os critrios em que se baseiam as seguintes classificaes de
mutaes e o que significam os seguintes termos? mutao (i) somtica x germinativa; (ii) letal x no
letal; (iii) dominante x recessiva; (iv) gnica x cromossmica; (v) condicional x no condicional; (vi)
adaptativa x no adaptativa. Voc pode sugerir algum outro parmetro para classificar mutaes?
Pergunta 5: Que conseqncias voc espera para uma mutao presente em uma clula somtica ou
em uma clula germinativa?

Outros parmetros de classificao de mutaes se baseiam na natureza da alterao

no genoma em termos da extenso de pares de base envolvidos. Por este critrio as
mutaes podem ser divididas em dois grupos: mutaes pontuais e rearranjos. As
mutaes pontuais envolvem modificaes de uma nica ou um pequeno nmero de bases
nitrogenadas. Os rearranjos resultam em alterao de um grande nmero de bases, em
alguns casos todo o genoma da clula, como no caso de poliploidias.
As mutaes pontuais podem envolver
a substituio de uma base nitrogenada
por outra. Estas substituies podem
ser transies (troca de uma pirimidina
por outra pirimidina ou uma purina por
outra purina) ou transverses (troca de
uma pirimidina por uma purina e vice e
Figura 1 - Mutaes do tipo troca de bases podem
ser classificadas como transies e transverses

versa) (Fig. 1).

No caso de mutaes pontuais que incidam em genes estruturais, a troca de um par

de bases nitrogenadas ir significar a troca de um cdon, o que pode vir a alterar um
aminocido na respectiva protena. Assim, de acordo com o efeito que a mutao ter na
seqncia de aminocidos da protena codificada, usa-se a seguinte classificao (Fig. 2):
. mutaes de sentido trocado troca de um aminocido na protena com comprometimento
de sua funo na clula,

. mutaes sem sentido troca de um cdon que codifica um aminocido por um cdon de
parada (UAG, UAA, UGA),
. mutaes neutras troca de um aminocido por outro de propriedades semelhantes sem
comprometimento da funo da protena codificada;
. mutaes silenciosas - troca de bases sem uma correspondente troca de aminocido.

Figura 2 - Mutaes pontuais

que ocorram em um gene
estrutural podem ser
classificadas de acordo com o
efeito sobre a protena
sintetizada

sem sentido

sentido trocado neutra

silenciosa

Pergunta 6: O genoma de qualquer organismo formado por regies transcritas e no transcritas. Que
efeitos podem ter as mutaes que incidam nestes locais?
Pergunta 7: Que efeito as mutaes de troca de base que incidam sobre regies no transcritas podem
trazer sobre a sntese de protenas especficas?

As mutaes pontuais podem envolver perda ou ganho de um ou poucos pares de

base na seqncia do genoma. Quando esse tipo de mutao ocorre em um gene estrutural
e gera a insero ou deleo de pares der bases nitrogenadas em nmero diferente de trs
ou mltiplo de trs, temos as chamadas mutaes de troca de referencial de leitura ou
frameshift. A mudana no referencial de leitura gerada a partir do ponto em que ocorreu
a mutao, resultando em uma seqncia de aminocidos diferente da original na protena
correspondente (Fig. 3).

menos

que

mutao

ocorra

prximo ao final da regio codificante

do gene, de se esperar que a
protena resultante perca a sua funo,
j que sua seqncia ser em grande
parte alterada. Tambm pode ocorrer
que

uma

mutao

de

troca

de

referencial gere um cdon de trmino

prematuro
Figura 3 -Efeito de mutao do tipo troca de
referencial de leitura na sntese da protena
codificada.

e,

portanto,

protena

mutante ter um tamanho bem menor

que a original e provavelmente no
ter funo.

Pergunta 8: O que ocorreria nos casos em que ocorre adio ou deleo de bases em nmero de trs
ou mltiplo de trs?

Os rearranjos envolvem um grande nmero de bases e, freqentemente, vrios

genes. Os rearranjos mais comuns so as inseres (adio de material gentico como
transposons e seqncias de insero), delees (perda de fragmentos contnuos de DNA),
amplificaes (duplicaes ou multiplicaes de genes) e translocaes (transposio de um
gene ou genes para locais diferentes no genoma). Como os rearranjos afetam muitos genes,
podem interferir na expresso de varias protenas.
Pergunta 10: Em que situao a inverso de um gene estrutural pode levar interrupo da produo
da protena codificada?

A origem das mutaes (mutaes espontneas e induzidas)

Mutaes espontneas
As mutaes podem ser classificadas quanto origem em: mutaes espontneas e
mutaes induzidas.
Em uma populao de clulas, mutaes aparecem espontaneamente numa taxa que
varia de 10-6 a 10-8 por gerao, dependendo do organismo e do gene estudado. A taxa de
mutao um parmetro calculado como o numero de mutaes observado a cada nova
gerao - no caso de organismos unicelulares, a cada duplicao celular.
Por que essas mutaes aparecem? Mutaes espontneas surgem a partir de erros
no processo de replicao do DNA ou a partir de leses espontneas no material gentico.
Em bactrias, a enzima DNA polimerase III, responsvel pela replicao do DNA, incorpora
um nucleotdeo errado com uma freqncia de 10-4/ base/ clula/ gerao. A fonte desses
erros pode ser o fenmeno de tautomerizao (modificao na localizao de eltrons) de
bases nitrogenadas. Formas raras tautomricas possuem propriedades de pareamento
diferentes da base original e resultam em mutaes quando incorporadas no DNA ou quando
so usadas como molde durante a replicao (Fig. 4).
Pergunta 11: Por que a taxa de mutao (medida pela freqncia de mutaes) observada sempre
menor do que a taxa de erros durante o processo de replicao do DNA?

Figura 4 Formas
tautomricas das bases
nitrogenadas possuem
propriedades de
pareamento diferenres
das originais.
(A) formas comuns
ceto e amino - das
bases nitrogenadas e
seu pareamento.
(B, C) Formas raras enol e imino das
bases nitrogenadas e
seu pareamento
alterado.

Error!

A DNA polimearse III possui tambm

uma atividade de edio (correo) de
erros, retirando da molcula nova de
DNA

nucleotdeos

errados

recm

incorporados (Fig. 5). Isso faz com que

Um nuclotideo incorreto incorporado

a taxa de erro baixe para 10-7 a 10-6 /

base/clula/gerao. Erros de replicao
ainda podem ser corrigidos a seguir por
mecanismos de reparo de bases mal
pareadas (mismatch repair), o que faz
com que a taxa de erro baixe ainda
mais para 10-10 a 10-9 /base/clula/

a enzima avana uma posio

a presena de um par imperfeito causa a

remoo do nucleotdeo errado, a enzima
retorna uma posio

gerao.

Figura 5 A atividade de edio da DNA

polimerase permite retirar da nova cadeia
de DNA um nucleotdeo incorporado
erroneamente.

Mutaes tambm podem ser originadas a partir de leses espontneas no DNA. Uma
leso uma alterao na estrutura qumica do DNA, pode incidir sobre uma base
nitrogenada, fosfato ou desoxiribose. Essas leses podem ser eliminadas por mecanismos de
reparo mas, caso persistam at o momento da replicao, podem gerar mutaes ou mesmo
impedir a replicao, levando morte da clula.
Os casos mais freqentes de leses espontneas no DNA so a depurinizao e a
desaminao de bases nitrogenadas.

Bases

nitrogenadas

podem

sofrer

espontaneamente ruptura da ligao Nglicosdica que liga a base desoxiribose.

A guanina est mais sujeita a esta ruptura
do que as outras bases. A perda da base
nitrogenada gera um vazio, o chamado
stio apurnico (stio AP). O stio AP
mutagnico pois, caso no seja reparado,
no momento da replicao do DNA vir a
servir de molde sem oferecer qualquer
informao quanto base nova a ser
pareada. Nesse caso uma base qualquer
incorporada, o que poder levar a uma
Figura 6 Uma leso do
tipo depurinao gera
um stio apurinico

mutao pontual (Fig. 6).

As desaminaes da citosina e da adenina geram uracil e hipoxantina, respectivamente (Fig.

7). Existem mecanismos de reparo especficos que retiram essas bases lesionadas da
molcula de DNA. Porm, caso persistam at o momento da replicao, essas leses so
mutagnicas pois os produtos da desaminacao tm propriedades de pareamento diferentes
das bases originais e portanto, ao servir de molde, iro alterar a seqncia de bases no
DNA, gerando uma mutao pontual. Assim, nos dois casos ocorrem transies, fixadas aps
a replicao, caso no sejam reparadas.

Figura 7 Uma leso do tipo

desaminao em uma citosina.
Enquanto C pareia normalmente com G,
U passa a parear com A.

Erros espontneos durante a replicao podem resultar numa freqncia maior de

mutaes do tipo frameshift (troca de referencial) em regies de seqncias repetitivas de
DNA, em comparacao com outras regies do genoma. Dizemos que essas regies de
seqncia repetitiva so pontos quentes ou hot spots (Fig. 8) para mutaes desse tipo.
Ocorre que as repeties de seqncia favorecem o escorregamento de bases: durante a
replicao do DNA, quando as duas fitas se separam, podem voltar a parear deslocadas por
algumas poucas bases e esse pareamento incorreto pode ser estabilizado justamente devido
repetio de seqncia (Fig. 9). Este processo pode envolver uma ou mais bases repetidas
e resulta em adio ou deleo, de acordo com a fita que sofre o escorregamento.
8

Figura 8 Conceito de
ponto quente ou hot spot
representado pela
freqncia de mutaes
em cada posio do gene
lacI de Escherichia coli

Figura 9 Regies de seqncia

repetitiva no DNA so pontos quentes
para mutaes do tipo troca de
referencial de leitura, uma vez que
deslocamentos no pareamento das fitas
de DNA podem ser estabilizados e a
replicao prossegue.
Pergunta 12: Na gerao de mutaes
espontneas do tipo troca de referencial,
a duplicao de seqncias decorre do
dobramento de uma das fitas do DNA.
Qual delas estaria envolvida neste
dobramento no caso de uma insero, a
fita molde ou a recm sintetizada? E no
caso de deleo?

Rearranjos espontneos tambem so mais frequentes em regies de seqncias

repetitivas curtas de DNA, com alguma homologia. Este processo envolve o sistema de
recombinao da clula, com a participao do produto do gene recA e pode causar
delees ou inverses. Em bactrias observa-se duplicao e amplificao (aumento do
nmero de copias) de genes em condies em que a produo aumentada do produto gnico
vantajosa.
Pergunta 13: Alguns rearranjos do tipo inverses podem ocorrer em regies especficas do genoma de
bactrias e resultar no desligamento de um gene e desaparecimento do seu produto. Na bactria
Salmonella este tipo de ocorrncia controla a expresso de diferentes tipos de flagelo. Voc pode
imaginar como?

Mutaes induzidas
Mutaes podem ser geradas por agentes fsicos, qumicos e biolgicos que, quando
em contato com clulas, levam ao aumento na freqncia de mutao em relao s taxas
espontneas. Toda substncia capaz de aumentar a taxa de mutaes denominada agente
mutagnico. Os agentes mutagnicos qumicos e fsicos podem ser classificados em trs
grandes grupos de acordo com o tipo de interao ou leso que promovem no DNA: (i) os
anlogos de bases; (ii) os agentes alquilantes; e (iii) os agentes que geram leses no
replicativas e ativam o sistema SOS de reparo.
Anlogos de bases: os compostos como 2-aminopurina (2-AP) e 5-bromouracil (5BU) apresentam estrutura semelhante e se comportam como as bases adenina e timina,
respectivamente. Estes agentes so incorporados ao DNA durante a replicacao e, em
condies

normais,

possuem

as

mesmas

propriedades

de

pareamento

das

bases

nitrogenadas. Entretanto, tanto o 2-AP como o 5-BU sofrem ionizaes em altas freqncias
e alteram suas propriedades de pareamento passando a se comportar como guanina e
citosina, respectivamente. Em suas formas ionizadas 2-AP e 5-BU geram transies durante
a replicao do DNA. O 2-AP pode gerar transies do tipo AT-GC ou GC-AT dependendo de
onde se localiza durante a replicao (na fita molde ou como nucleotdeo a ser incorporado)
(Fig. 10).

5BrU A

5BrU

5BrU ionizado

2AP

2AP

2AP ionizado

Figura 10 Os anlogos de base5BrU e 2AP e como seus pareamentos se alteram

nas formas normais e ionizadas

Pergunta 14: Voc pode deduzir o processo de gerao de mutaes induzidas pelo 5-BU? Que tipo de
transies podem ocorrer?

Agentes alquilantes: Um segundo grupo de agentes mutagnicos so substncias

com propriedades alquilantes, isto , transferem grupamentos metil e etil a determinadas

10

posies de bases nitrogenadas, gerando modificaoes covalentes. Substncias como o Nmetil-N-nitro-nitrosoguanidina (MNNG) e o metil metano sulfonato (MMS) metilam a
guanina e a timina na posio O6 e O4, respectivamente. Essas modificacoes quimicas
alteram as propriedades de pareamento das bases, a guanina metilada na posio O6 pareia
erroneamente com a timina e gera transies do tipo GC-AT, enquanto a timina alquilada
causa transies do tipo TA-CG (Fig. 11).

Figura 11
Pareamento
alterado de
timina e
guanina
metiladas e
tipos de
mutaes
induzidas

Pergunta 15: A alquilao de outras bases ou em posies diferentes de O6 e O4 da guanina e timina,

respectivamente, no levam ao surgimento de mutaes. Por qu?

Agentes indutores do sistema SOS: Certos agentes mutagnicos sao capazes de

gerar leses que bloqueiam a replicao do DNA. Nesses casos, o complexo de replicao
fica impedido de continuar a partir do ponto da leso, a qual impede a leitura da informao
na forma de seqncia de bases na fita molde. Nestas condies ativado o sistema SOS de
reparo, com uma polimerase que atua permitindo a continuao da replicao custa da
incorporao de bases erradas na nova fita de DNA. Estas leses levam, portanto, fixao
de mutaes do tipo troca de bases na fita recm sintetizada (Fig. 12). Os agentes
mutagnicos que induzem o sistema SOS englobam uma srie de substncias qumicas com
propriedades cancergenas comprovadas, como as aflatoxinas (toxina

produzida por um

fungo) e benzopirenos (presente no cigarro), os quais intercalam-se na cadeia de DNA entre

os pares de base gerando adutos que impedem a replicao. A ativao do sistema SOS
pode gerar tambm mutaes do tipo troca de referencial. Outro mutagnico que ativa o
sistema SOS a radiao ultravioleta, que forma leses do tipo adutos no DNA, entre duas
pirimidinas vizinhas na mesma fita (dmeros de pirimidina) (Fig.13). Em bactrias como E.

11

coli, a mutagnese induzida por estes agentes depende da presena dos produtos dos genes
recA e lexA e umuCD.

leso

Complexo de
replicao bloqueado

Figura 12: Representao do

bloqueio da replicao causado por
uma leso no replicativa. Aps a
ativao do sistema SOS, a sntese
de DNA transpe a leso, o que
pode dar origem a mutaes do
tipo troca de base.

Ativao do SOS
altera complexo
de replicao

Replicao retomada

Figura 13 Dmero
de pirimidina e a
leso causada na
fita dupla de DNA

12

Mutagnese mediada por elementos de transposio

O que so elementos de transposio
Elementos de transposio so seqncias de DNA capazes de se mover de um local
para outro dentro de um mesmo genoma, ou mesmo entre diferentes genomas. Eles no
existem como elementos independentes (tal como vrus), mas sempre esto associados a
um genoma e por isso podem ser chamados de parasitas moleculares.
Os elementos de transposio mais simples so as seqncias de insero (IS). Em
geral seu tamanho varia entre 1000 e 2000 pares de base e contm as funes mnimas
necessrias

para

transposio:

gene

da

enzima

transposase,

responsvel

pela

transposio, e extremidades constitudas por seqncias curtas de cerca de 20 pares de

base repetidas e invertidas, isto , seqncias idnticas ou muito parecidas presentes em
orientaes opostas em cada extremidade da molcula. Cada IS difere do outro em
seqncia, mas eles possuem algumas caractersticas comuns quanto organizao (Fig.
14).
seqncias repetidas e invertidas nas extremidades

Figura 14 organizao
bsica de um elemento
de transposio do tipo
IS

gene da transposase

Como o elemento de transposio se move? A partir de um stio original onde se

encontra (stio doador) o elemento de transposio se move para um novo stio (stio alvo).
Esse movimento mutagnico, pois envolve a alterao da seqncia de bases de ambos os
stios no genoma do hospedeiro. A transposase corta o DNA no stio doador, em cada
extremidade do IS, liberando-o, e corta tambm o DNA no stio alvo. Na fita dupla do DNA,
cada uma das fitas no clivada exatamente no mesmo ponto, mas sim a alguns pares de
base de distncia, o que gera pontas de fitas simples. O IS se insere no stio alvo (Fig. 15) e
as fitas simples so completadas pela DNA polimerase I (enzima celular) e os fragmentos
ligados pela DNA ligase (enzima celular). Logo, quando um IS se transpe, a seqncia do
DNA do hospedeiro no stio alvo duplicada (mutao) de modo que o elemento IS fica
flanqueado por pequenas seqncias diretamente repetidas (isto , duas cpias de uma
determinada

seqncia

repetida

na

mesma

orientao)

(Fig.

16).

Esta

seqncia

diretamente repetida varia de tamanho de IS para IS, mas constante para um mesmo IS.
Portanto, um IS no stio alvo apresenta uma estrutura caracterstica com extremidades
invertidas e repetidas (do prprio IS) enquanto que as seqncias adjacentes ao DNA do
hospedeiro so diretamente repetidas. A maioria dos IS se inserem em stios aleatrios
dentro do DNA hospedeiro, mas h stios preferenciais de insero (hot spots).

13

stio doador

stio alvo
9 pares de base

Figura 15 Movimento de um
IS saindo de um stio doador
para o stio alvo.

Transposase cliva o stio doador e o

stio alvo

Stio alvo fica com

extremidades de
fita simples

Transposase liga IS s extremidades do stio alvo

DNA polimerase completa a fita de DNA e ligase
junta as extremidades do stio alvo e do IS

Figura 16 - Quando o IS se
transpe, a seqncia do DNA
do hospedeiro no stio alvo
duplicada (mutao) de modo
que o elemento IS fica
flanqueado por pequenas
seqncias diretamente
repetidas.

Transposons (Tn) so elementos de transposio que contm, alm das funes

envolvidas na transposio, genes cujos produtos conferem resistncia a antibiticos.
Diferentes Tn so distinguidos por nmeros. Certos Tn tem uma regio central contendo
genes de resistncia a drogas e elementos IS nas extremidades (ISL e ISR)(Fig. 17).

14

Em alguns casos ISL e ISR so

idnticos

orientao,

esto

na

como

mesma

no

Tn9

(seqncias repetidas diretas) ou,

no caso de Tn903, em orientaes
inversas

(seqncias

repetidas

invertidas); em outros casos os ISL

e ISR no so idnticos (Fig 17).
gene de resistncia a antibitico

Elementos IS e a maioria dos

transposons se movem por um
mecanismo no replicativo, pelo
qual

elemento

se

move

diretamente do stio doador para o

alvo. Transposons mais complexos
se movem por uma mecanismo
que envolve replicao: neste caso,
Figura 17 Tns so elementos se transposio
compostos, com diferentes combinaes de IS nas
extremidades

uma

cpia

permanece

no

stio

doador e uma nova surge no stio

alvo (Fig 18).

stio doador

clivagem

do stio doador

clivagem

do stio alvo

stio alvo

clivagem

ligao

Polimerizao

ligao

do DNA
replicao

transposio no replicativa
Figura 18 Tipos de transposio

transposio replicativa

15

Pergunta 16: Voc consegue imaginar como um elemento de transposio mais complexo como um Tn
pode ter evoludo a partir de elementos do tipo IS?

Tipos de mutao gerados por elementos de transposio

Alm da duplicao do sitio alvo, que ocorre sempre na transposio, o movimento
dos elementos de transposio pode causar duplicaes extra ou delees quando, ao sair
do sitio doador, a seqncia original no refeita perfeitamente. Mutaes ocorrem tambm
no stio alvo, pela simples presena do elemento; o elemento pode inativar um gene se for
inserido dentro dele ou ao sair de onde estava (Fig. 19).
A presena de IS no genoma pode gerar rearranjos. Partes do genoma entre duas
cpias de IS prximas podem ser deletadas caso ocorra recombinao entre os IS. Inverses
e outros rearranjos tambm podem ocorrer gerando inclusive novos genes (Fig. 19) e
podem alterar funes de seqncias pr-existentes por coloc-las sob um novo sistema de
regulao.
Transposons podem se transpor facilmente de um cromossoma bacteriano para outra
unidade de replicao, como o genoma de um bacterifago (vrus) ou plasmdeo, e assim
podem se espalhar para outras bactrias. O espalhamento de resistncia a antibiticos entre
populaes bacterianas uma conseqncia da transposio de genes de resistncia para
plasmdeos (que se replicam dentro das clulas bacterianas) e do fato de transposons
cruzarem barreiras entre espcies.
Elementos de transposio constituem cerca de 10% do genoma de eucariotos superiores.
Ainda que a maioria destes se mova raramente, eles so tantos que seu movimento tem um
grande efeito na variabilidade de uma espcie. Um genoma pode conter elementos de
transposio funcionais e no funcionais (incapazes de se mover por no codificar uma
transposase funcional). Esses perderam a capacidade de se transpor independentemente,
mas podem ser reconhecidos como substratos para transposio pelas enzimas produzidas
por elementos funcionais.
Elementos de transposio permanecem em silncio por longos perodos (durante este
tempo eles ocupam posies fixas no genoma). H perodos de grande intensidade de
transposio. Esta atividade de transposio e, portanto, esta ao mutagnica ativada de
tempos em tempos em alguns poucos indivduos na populao. Isto causa profundas
alteraes no genoma, porque envolve transposies simultneas de vrios tipos de
elementos de transposio. Em vrios organismos estas exploses de transposio so
ativadas por condies de estresse, gerando uma variedade de organismos modificados,
alguns dos quais podem ser mais adaptados que cepas parentais para sobreviver nas novas
condies ambientais. Portanto, elementos de transposio no so necessariamente
parasitas ou DNAs egostas como tm sido chamados, mas podem ocasionalmente agir como
simbiontes teis que favorecem, a longo termo, a sobrevivncia das espcies cujos genomas
habitam. Deste modo, os elementos de transposio contribuem para a gerao da
diversidade biolgica.

16

Stio alvo

IS
Figura 19 Tipos de mutao geradas
por elementos de transposio

Insero do IS
alvo

Sada do IS

causa duplicao do

deixa duplicao

(A) ao se inserir dentro de um gene o

elemento o inativa e a seqncia do
stio alvo duplicada
(B) ao se inserir o elemento duplica a
seqncia do stio alvo e ao sair
incorretamente pode gerar vrios tipos
de mutao
(C ) quando dois elementos sofrem
recombinao, geram rearranjos no
genoma

sada imprecisa
deixa parte do IS

sada precisa
causa duplicao

cpias na mesma orientao

sada precisa
causa inverso

sada imprecisa
causa deleo

e em orientaes invertidas

Recombinao

causa deleo

causa inverso

Pergunta 17: Por que a transposio um evento raro?

Pergunta 18: Que tipo de caractersticas dos elementos de transposio o classificariam como DNA
egosta? E quais o definiriam como benfico para o hospedeiro?

17

Aplicaes experimentais da mutagnese

Como gerar e detectar mutantes em laboratrio
O estudo de mutantes foi fundamental para a compreenso de princpios bsicos de
gentica, como a natureza do cdigo gentico, a definio de gene, o mecanismo de
recombinao etc. e continua sendo uma ferramenta essencial para desvendar vias
metablicas e tipos de controle da expresso de genes e de protenas, por exemplo.
Portanto, as aplicaes da mutagnese no laboratrio de pesquisa so muito amplas. Neste
campo foi desenvolvida uma srie de tcnicas para criar mutantes, alm de sistemas
experimentais para detectar mutaes e agentes mutagnicos, assim como para o estudo de
sistemas de reparo. A seguir descreveremos algumas tcnicas usadas para criar e avaliar
mutaes no laboratrio.
Sistemas para detectar mutantes
A forma mais precisa de se detectar uma mutao o seqenciamento de DNA.
Conhecendo-se a seqncia de bases original, qualquer alterao pode ser caracterizada.
Porm, nem sempre essa a tcnica utilizada. S recentemente a tecnologia de
seqenciamento automtico de DNA se tornou disponvel em maior escala, at ento esta
era uma tcnica cara, muito trabalhosa e demorada. Alm disso, essa no a forma mais
adequada de detectar mutaes para todas as aplicaes experimentais. Muitas vezes, como
no caso de agentes mutagnicos qumicos, as mutaes ocorrem em todo o genoma e,
portanto, no se quer procurar por uma alterao em um gene especifico. Existem situaes
em que se deseja partir de um certo fentipo mutante que indique alguma funo celular
afetada e s ento caracterizar o gene mutado.
De fato grande parte do estudo de mutaes se baseia na capacidade de selecionar
algum fentipo facilmente reconhecvel que por isso pode ser diferenciado do organismo
selvagem. Este fentipo distinto pode ser atribudo ao produto de um gene marcador, isto ,
um gene cuja funo resulta em uma alterao bioqumica facilmente observvel em
condies de laboratrio. Devido facilidade de cultivo, tempo de gerao curto, grande
nmero de indivduos em uma populao e extenso conhecimento de sua gentica e
bioqumica, as bactrias tm sido o sistema biolgico escolhido em experimentos de
mutagnese. Diversas caractersticas fenotpicas podem ser usadas como marcadores nesses
organismos, constituindo sistemas de teste para a ao de muatgnicos. Por exemplo, uma
linhagem de bactria selvagem pode ser capaz de sobreviver um em meio de cultivo mnimo
contendo apenas nutrientes essenciais enquanto que o mutante s sobrevive se um
determinado nutriente for adicionado (depende de um aminocido, por exemplo). O clssico
sistema de Ames (1973) para detectar ao de mutagnicos utiliza linhagens mutantes de
bactria deficientes na sntese de histidina e, portanto, incapazes de crescer em meio
mnimo, a menos que este aminocido seja adicionado. O teste inclui vrias linhagens, cada
uma com uma mutao diferente nos genes de sntese de histidina. Aps a exposio a

18

agentes mutagncios, recupera-se bactrias revertentes, isto , com fentipo selvagem,

capazes de crescer em meio mnimo. Este teste amplamente usado para avaliar o
potencial mutagnico de diversos agentes e seus resultados podem ser correlacionados com
o efeito cancergeno desses compostos em animais. Neste caso, a capacidade de sintetizar
histidina o fentipo marcador. Outros exemplos de marcadores usados so a resistncia a
antibiticos ou a resistncia infeco por vrus.
Mutantes supressores so um outro tipo de sistema de teste para detectar mutaes.
Nesses casos uma mutao ao ocorrer suprime o efeito de uma mutao anterior e se
recupera o fentipo selvagem. A mutao supressora pode ocorrer no mesmo gene
originalmente mutado ou no. Um desses sistemas consiste no uso de linhagens mutantes
da bactria Escherichia coli incapazes de produzir a enzima beta-galactosidase, o que gera
um fentipo facilmente reconhecvel no laboratrio. Usa-se uma coleo de linhagens de
bactrias com mutaes do tipo sem sentido em diferentes locais do gene correspondente.
Todas impedem sua expresso, pois geram codons de parada. Quando essas linhagens so
expostas a agentes muatagnicos, algumas mutaes do tipo substituio de bases
restabelecem o fentipo selvagem de produo da enzima. So mutantes supressores de
cdigos sem sentido. Alguns tipos de mutaes supressoras restauram totalmente a
atividade original da enzima, outros parcialmente.
Pergunta 19: Por que alguns tipos de mutaes supressoras recobram totalmente o fentipo selvagem
e outras no?
Pergunta 20: No gene que codifica a beta-galactosidase, para cada tipo de agente mutagnico as
mutaes supressoras apresentam determinados hot spots, por que?

Tcnicas para gerar mutaes

Mutagnese generalizada
Agentes

qumicos

ou

irradiao

so

mutagnicos

podem

ser

usados

experimentalmente. A tabela 1 cita alguns agentes muatgnicos, vantagens e desvantagens

de uso. Nesses casos as mutaes iro incidir sobre todo o genoma do organismo e para
cada agente um tipo de mutao ser predominantemente gerado. Por exemplo, MNNG gera
transies GC para AT e, portanto, substituies de base. sempre necessria uma etapa
posterior que selecione os mutantes desejados e caracterize o tipo de mutao ocorrido.
Linhagens de bactria com alta freqncia de mutao foram desenvolvidas em
laboratrio. Nestas linhagens a taxa de mutao espontnea mais alta que a das
selvagens, devido a defeitos em mecanismos de reparo. De acordo com o tipo de linhagem,
um determinado mecanismo afetado e o resultado o aumento de certo tipo de mutao,
um exemplo citado na tabela 1. Nesses casos, o gene que se deseja mutar transferido
para a linhagem mutadora e, ao longo de poucas geraes, sofrer alguma mutao. S
que, mesmo depois que a mutao for conseguida, outras mutaes iro se acumular, por

19

isso necessrio retirar o gene da linhagem de teste e transfer-lo para uma bactria
selvagem para estudar sua funo.
Elementos de transposio podem ser usados em experimentos de biologia molecular
para criar inseres dentro de genes e, portanto, inativ-los (nocaute gnico). A vantagem
deste tipo de estratgia a certeza de que o produto deixa de ser gerado e, assim, pode-se
estudar o efeito dessa deficincia no metabolismo do organismo e adquirir noes sobre sua
funo. Junto com o elemento de transposio pode-se inserir genes que conferem
resistncia a antibitico, marcadores que facilitam seleo dos mutantes.

Pergunta 21: Entre as tcnicas citadas acima qual voc apontaria como mais apropriada para obter
mutantes em genes letais ou essenciais, por que?
Mutagnese stio especfica ou dirigida
Mutagnese dirigida um conjunto de tcnicas usadas para gerar mutantes por meio
da alterao precisa de determinados pares de base em uma seqncia de DNA. Um objetivo
comum deste tipo de estratgia alterar as propriedades bioqumicas de uma protena com
o intuito de us-la em processos biotecnolgicos, ou ento gerar um conjunto de mutantes,
cada um com um ou poucos aminocidos alterados, e realizar um mapeamento detalhado da
importncia que cada regio da protena tem para sua funo. Portanto, neste tipo de
estudo se manipula a informao gentica em laboratrio de uma forma planejada.
De incio seleciona-se a seqncia do gene a ser estudada, em seguida escolhe-se as
alteraes a serem feitas e finalmente avalia-se o resultado em termos da funo da
protena mutante em comparao com a selvagem. Logo, o ponto de partida conhecer a
seqncia de nucleotdeos na regio do DNA, ou do gene, que codifica a protena de
interesse. Com o avano dos projetos genoma, que vm disponibilizando na rede mundial de
computadores dados de seqenciamento do genoma de diversos organismos, cada vez um
numero maior de genes conhecido. Embora para a maioria deles no se consiga atribuir a
funo da protena correspondente, no caso de protenas cuja funo ou seqncia so
evolutivamente conservadas, passa-se assim a dispor da seqncia do gene.
Dispondo da seqncia e da molcula de DNA em si, como decidir qual o cdon a ser
alterado? Se a estrutura tri-dimensional da protena j caracterizada, torna-se mais fcil
determinar que aminocido(s) deve(m) ser trocado(s) para que a protena adquira uma
propriedade especfica. Para a maioria das protenas esta informao no conhecida.
Nestes casos, a estratgia para a introduo de uma alterao especfica na protena a de
tentativa e erro. Assim gerado um painel de protenas mutantes entre as quais pode se
encontrar aquela com a atividade procurada. Naturalmente, cada uma destas protenas tem
que ser testada pra se verificar se a mutao realmente produziu a alterao desejada.

20

Pergunta 22: Alm da alterao de aminocidos em uma protena, que tipo de concluses poderiam ser
tiradas no caso de se utilizar a mutagnese dirigida em regies que controlam a expresso de um
gene?

Tcnicas de mutao dirigida

Vrias estratgias j foram desenvolvidas para introduzir mutaes dirigidas em genes
clonados. Alguns dos mtodos visam trocar nucleotdeos especficos no gene, outros
introduzem alteraes ao acaso ao longo de um pequeno fragmento do gene, gerando,
assim, um grupo de protenas mutantes. Tcnicas de biologia molecular so utilizadas para
cada passo dos procedimentos experimentais. Inicialmente obtm-se, a partir de um
genoma, vrias cpias do fragmento de DNA cuja seqncia ser mutada e para tal usa-se a
tcnica de reao em cadeia da polimerase, PCR. Em seguida essa seqncia inserida
(clonada) em pequenas unidades replicativas de DNA (vetores, plasmdeos) que podem ser
mantidas e multiplicadas em bactrias no laboratrio e ento purificadas.
As vrias tcnicas de mutagnese tiram partido das propriedades de pareamento entre
duas fitas de DNA com seqncias complementares (Fig. 20). Em algum passo do
procedimento de mutagnese obtm-se o DNA a ser mutado no estado de fita simples que
ento misturado a um fragmento de DNA pequeno, de poucas bases (oligonucleotdeo
sinttico) que tem seqncia complementar a uma regio do gene clonado, exceto por um
ou poucos nucleotdeos. Este nucleotdeo no complementar coincide precisamente com o
nucleotdeo que o alvo da troca (Fig. 20). O oligonucleotdeo se combina com a regio
complementar do gene e sua extremidade 3 vai agir como um iniciador da sntese do DNA,
que usa a fita do DNA original como molde. A replicao se d em presena dos quatro
desoxiribonucleotdeos (dNTPs) e da enzima DNA polimerase. O DNA fita dupla resultante
contendo o(s) nucleotdeo(s) no complementar(es) de novo introduzido em clulas de
bactria. O DNA na forma de plasmdeo se replica e as clulas produzem molculas que
carregam o gene selvagem e outras que contm o gene mutado. possvel selecionar
aquelas que tm a verso mutante do gene. Este ento isolado e transferido para outro
vetor (plasmdeo), cujas caractersticas permitem que a protena que ele codifica seja
expressa em um organismo diferente do original (transgnico). A protena alterada
expressa em grandes quantidades e purificada para futuros estudos.

21

Figura 20 Esquema das etapas experimentais de um protocolo de mutao stio

dirigida baseado em PCR

objetivo: inserir uma mutao pontual aqui

ocorrer pareamento
imperfeito entre
oligo 2 (e oligo 3) e a
sequncia molde
oligo 1 + oligo 2 vo gerar a
metade da esquerda contendo
a mutao *

oligo 3 + oligo 4 vo gerar a

metade da direita contendo a
mutao *

*
*
*

Em prxima PCR usa-se apenas oligos 1 + 4 e a

seqncia completa estendida a partir de cada
metade mutada

22

Tabela 1 - alguns mutagnicos usados experimentalmente

Agente
mutagnico

tipo de mutao
gerada

mecanismo de
ao

vantagem

MMNG (N-metil-Nnitro-N nitrosoguanidina)

BPDE
(benzopireno)

transies GC- AT

agente alquilante

transverses GC-TA,
troca de referencial

Ativa o sistema
SOS

radiao UV

troca de referencial,
substituies de
base, delees
rearranjos
transies

Ativa o sistema
SOS
anlogo de base

uso seguro

Mutagnico fraco

substituio de
bases, troca de
referencial

defeito na
capacidade de
edio da DNA
polimerase

no requer
tratamento
qumico, apenas
cultivo da
linhagem

inseres e
rearranjos

elementos
genticos mveis

mutaes tudo
ou nada,
associadas com
fentipo de
resistncia a
antibiticos
facilitam
seleo

Requer transferncia
do gene para a
linhagem mutadora
e posterior
passagem para
outra linhagem,
selvagem
Requer manipulao
gentica, algumas
mutaes so letais

2AP (2
aminopurina)
Linhagem de
bactria mutadora
mutD

Elementos de
transposio

potente, alta
taxa de
mutao
potente, alta
taxa de
mutao

desvantagem
perigoso, altamente
txico
perigoso, altamente
txico
para gerar
mutantes, a maioria
da populao morre

23

Engenharia de protenas
Mutaes especficas podem alterar a estabilidade de uma protena em temperaturas
extremas ou diferentes pH, podem alterar a especificidade ou a afinidade de uma enzima por
seu substrato, podem alterar as propriedades de regulao alostrica, ou requerimentos de
co-fatores por exemplo, facilitando seu uso em processos industriais.
Apenas dezenas entre as milhares de enzimas que j foram estudadas e
caracterizadas bioquimicamente so usadas industrialmente. Na Tabela 2 esto listadas as
mais importantes e seus usos industriais. A principal razo para que um nmero maior de
enzimas ainda no seja utilizado que essas moleculas foram naturalmente selecionadas
para desempenhar suas funcoes nas condies naturais, no interior da clula ou organismo
em que sao produzidas, e essas condicoes em geral nao coincidem com aquelas usadas nos
processos industriais. Entretanto, com a disponibilidade de tcnicas de mutagnese e
producao em larga escala de protenas a partir de organismos geneticamente modificados,
algumas dificuldades tm sido superadas. A seguir sao citados alguns exemplos.
Tabela 2 enzimas e seus usos industriais
enzima

uso industrial

alfa-amilase

produo de lcool, cervejaria

catalase

antioxidante para alimentos

protease

detergentes

glicose oxidase

antioxidante para alimentos

lipase

fabricao de queijo, aromatizante

papana

amaciante de carne

Alterao da estabilidade da protena

Adio de pontes de sulfeto (S-S)
A estabilidade trmica de uma protena pode ser aumentada por adio de pontes S-S na
molcula, gerando uma molcula que no se desnatura facilmente em altas temperaturas.
Enzimas termo-estveis so em geral resistentes tambm desnaturao por solventes
orgnicos e a condies no fisiolgicas tais como pHs extremos.
Ex: A enzima lisozima do bacterifago (vrus que infecta bactrias) T4. Seis variantes
foram construdas por mutagnese dirigida (Tab.3). Foram inseridas cistenas que permitem
a formao de pontes S-S intramoleculares (Fig.21). Dois, quatro ou seis resduos de
aminocidos foram trocados por cistena gerando variantes com uma, duas ou trs pontes SS, respectivamente. Os resduos de aminocidos que foram trocados por cistena eram
espacialmente prximos uns dos outros na enzima ativa, isto , na sua estrutura tridimensional (Fig. 21). Esta proximidade assegurou que a conformao da molcula como um
todo no fosse afetada pela formao das novas pontes de sulfeto. Os aminocidos trocados
no faziam parte do stio ativo da enzima, que a poro da molcula mais sensvel a

24

pequenas alteraes de conformao. Aps a mutagnese, as verses mutantes foram

expressas em bactria; as protenas foram purificadas e suas atividades enzimticas e
estabilidades (definidas como a temperatura em que 50% da estrutura da molcula como
um todo foi desnaturada) foram determinadas.

Analise os dados da tabela 3 e verifique qual(is) o(s) efeito(s) da presena das pontes SS na estabilidade da protena.

Figura 21 - Estratgia de
engenharia da enzima lisozima do
fago T4 visando aumentar a
estabilidade. Na estrutura terciria
da protena, trs pontes de S so
mostradas. Os nmeros indicam as
posies das cistenas. A cistena 54
foi trocada por treonina para que
no interfrisse com a formao das
outras pontes.

Tabela 3 Propriedades das verses selvagem e mutantes da lisozima do fago T4

wt selvagem; pwt pseudoselvagem, A a F variantes construdas, Tm temperatura em que a
enzima retm 50% de sua atividade.
posio do aminocido
enzima

no. de
pontes

atividade
relativa

Tm

Troca de aminocidos
Quando protenas so submetidas a altas temperaturas, resduos de asparagina e
glutamina sofrem desaminao, uma reao de liberao de amnia, originando cido
asprtico e cido glutmico, respectivamente. Estas alteraes podem mudar a conformao
da protena e acarretar perda da sua atividade.
A enzima triosefosfato isomerase de Saccharomyces cerevisae (levedura) consiste de
duas subunidades idnticas, cada uma com dois resduos de asparagina. Estes resduos
25

podem estar envolvidos na sensibilidade da enzima temperatura por se encontrarem na

superfcie de contato entre as subunidades na enzima ativa. Por meio de mutagnese
dirigida, os resduos de asparagina nas posies 14 e 78 foram trocados e a estabilidade das
protenas mutantes foi determinada (Tab. 4).

Interprete os dados da Tabela 4

As protenas mutantes tambm foram testadas quanto sensibilidade digesto

proteoltica e verificou-se uma correlao positiva entre a estabilidade e a resistncia

digesto. Estes resultados mostram que possvel obter formas termo-estveis de uma
enzima por mutao de cdons de asparaginas no essenciais.
Tabela 4 Estabilidade das verses selvagem e mutantes da enzima triosefosfato isomerase a 100oC.
A estabilidade expressa como meia-vida ou taxa de inativao a 100oC. Uma maia-vida mais longa
indica que a enzima mais estvel.

enzima

posio do aminocido
14
78

meia-vida (min)

Alterao da atividade enzimtica

A mutagnese dirigida pode ser utilizada para modificar a atividade cataltica de uma
enzima.
Reduo de pontes S-S
Quando uma protena expressa em um organismo diferente do original, pode ser menos
ativa que o esperado. Mas sua atividade pode ser alterada por mutagnese dirigida.
O gene do interferon (IFN) humano foi clonado e expresso na bactria Escherichia coli
e sua atividade antiviral foi detrminada. A protena produzida reteve apenas 10% da
atividade da forma original produzida em clulas humanas. Observou-se que a maior parte
do IFN sintetizado em E. coli se encontrava agregado, na forma de dmeros e oligmeros,
que so inativos. A anlise da sequncia do DNA do gene do IFN revelou que a protena
correspondente tem trs resduos de cistena, que poderiam estar envolvidos na formao
de pontes S-S intermoleculares, favorecendo a formao de dmeros e oligmeros. Os
resduos de cistena foram trocados por serina. (Por que serina e no outro aminocido?) A
troca de um dos resduos de cistena (Cis-17) pela serina produziu uma proteina que no
formava agregados e com atividade semelhante a da autntica IFN, alm de ser mais
estvel quando estocada por longos perodos.

26

Bibliografia
B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts e J. D Watson. Molecular Biology of the Cell, Garland
Publishing Inc., 1994.
B. R. Glick e J. J. Pasternak. Molecular Biology, Principles and Aplications of Recombinant DNA.
American Society for Microbiology, 1994.
B. Lewin. Genes VI. Oxford University Press. 1997.
J.H. Miller. A short course in bacterial genetics - a laboratory manual and handbook for Escherichia coli
and related bacteria. Cols Spring Harbor Laboratory Press, 1992.
P. C. Turner, G. McLennan, A D. Bates e M. R. H. White. Instant Notes in Molecular Biology. Bios
Scientific Publishers, 1998.
J. Watson, M. Gilman, J. Witkowski, M. Zoller. Recombinant DNA. Scientific American Books, 1996.
T. S. Walker. Microbiology. W.B. Saunders Company, 1998.
A. Zaha. Biologia Molecular Bsica. Ed. Mercado Aberto Ltda., 1996.
Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology. F.C. Neidhart, ASM Press, 1997.

27

BIOFSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGNESE

Estudo dirigido I - MUTAO CONCEITO E CLASSIFICAES

1) Descreva as consequncias de uma mutao segundo ocorra em:

a) Clula somtica x Clula germinativa
b) Regies codificantes para protenas no genoma ou no
2) Explique as diferenas entre:
a) Letal x no letal
b) Dominante x recessiva
c) Gnica x cromossmica
d) Adaptativa x no adaptaviva
3) Partindo da sequncia abaixo representando uma regio de um gene estrutural (sequncia 1) que
codifica determinada protena (sequncia 2). Consultando a tabela do cdigo gentico, descreva que tipo
de mutao ocorreu em cada caso.
Seqncia 2
Seqncia 1

Met Gly Ser Asp Val Gln Trp

ATG GGG AGC GAT GTC CAA TGG TGA
C

TIPO DE MUTAO
4) Partindo da sequncia abaixo representado uma regio de um gene estrutural que codifica determinada
protena, e consultando o cdigo gentico, descreva o que ocorre em cada caso.
GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

PARTE DO CDIGO GENTICO

AUG

Insero (+)
GCU GCU AGC UGC UGC UGC UGC UGC
Ala Ala
G
Deleo (-)
GCU GCU GCU GCU GCU CUG CUG CUG
Ala Ala Ala Ala Ala
G
Duplo mutante (+-)
GCU GCU AGC UGC UGC UCU GCU GCU
Ala Ala

ACG
ACU
ACA
ACC
AGC
AGU
AUC
AUA
AUU

MET

UGC
UGU

THR

CUG
CUA
CUC
CUU

CYS

LEU

SER

ILE

CAA
CAG

GLN

CAU
CAC

HIS

UAA
UAG
UGA

STOP

UCU
UCC SER
UCA
UCG

28

BIOFSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGNESE

Estudo dirigido II Origem das mutaes mutaes espontneas
1- Diferencie lesode mutao.
2- A taxa de erro estimada no processo de replicao do DNA de uma bactria pela DNA polimerase III
de cerca de 10-4/base/clula/gerao, entretanto a taxa de mutao medida varia entre 10-10 e 10-12 .
Que processos devem levar a esta diminuio da taxa de erros?
3- A desaminao da Citosina (C) transforma-a em Uracil.(U). Em uma clula animal cerca de 100
eventos destes ocorrem espontaneamente a cada 24 horas:
a- baseando-se nas informaes acima sugira porque o DNA possuI Timinas (T) e no Uracilas (U).
b- se no houvesse sistema de reparo para remover os U do DNA, qual seriam, a longo prazo, as
conseqncias da presena do U no DNA, para o cdigo gentico?
4- Na gerao de mutaes espontneas tipo troca de referencial, a duplicao de seqncias decorre do
dobramento de uma das fitas do DNA durante o processo de replicao. Qual delas estaria dobrada no
caso de insero e de deleo?

BIOFSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGNESE

Estudo dirigido III Origem das mutaes mutaes induzidas
1. Como se d o processo de gerao de mutaes induzidas pelo 5 Br Uridina?
Que tipo de transies podem ocorrer?
2. A alquilao da guanina na posio O6 e da timina na posio O4 levam a que transies?
Porque a alquilao em outros tomos nestas bases no levam a mutaes?
3. Um grande nmero de agentes mutagnicos so capazes de gerar leses que bloqueiam a replicao do
DNA. Nestas condies o sistema SOS ativado levando freqentemente fixao de mutaes.
Explique como isto ocorre.
4. Bacillus subtilis uma bactria de solo que forma esporos quando h falta de nutrientes no meio onde
se encontra. Esporos so estruturas metabolicamente dormentes que podem sobreviver por mais de mil
anos. Eles tambm apresentam um contedo de gua muito reduzido. Sugira como que os esporos
evitam o acmulo de mutaes potencialmente letais no seu DNA durante seus longos perodos de
dormncia.

BIOFSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGNESE

Estudo dirigido IV Mutaes mediadas por elementos de transposio
12345-

Por que a atividade de elementos de transposio pode ser mutagnica?

Cite alteraes no genoma que sejam conseqncias de transposio destes elementos.
Por que elementos de trasnposio so as vezes chamados de DNA egosta?
Quais os componentes mnimos necessrios para a existncia de um elemento de transposio?
Quais as diferenas entre uma seqncia de insero e transposon?

BIOFSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGNESE

Estudo dirigido V Aplicaes experimentais da mutagnese
1. Cite algum motivo de interesse para se gerar um organismo mutante em laboratrio.
2. O que um gene marcador?
3. O que um organismo transgnico? Imagine um organismo desse tipo que voc queira construir e sua
utilidade.
4. Cite uma forma de gerar mutaes generalizadas em todo o genoma, a vantagem e a desvantagem do
mtodo.
5. O que e que utilidade pode ter a mutagnese dirigida?

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BIOFSICA PARA BIOLOGIA BLOCO MUTAGNESE

Estudo dirigido VI Engenharia de protenas
1- A engenharia de protenas visa obter variantes de protenas que apresentem determinadas propriedades
importantes para uso teraputico ou industrial. Cite algumas dessas propriedades.
2- Que cuidados voc teria ao alterar um aminocido em uma protena?
3- Por que mais fcil realizar engenharia de protena e melhoria em protenas cujas estruturas
tridimensionais so conhecidas?
4- Como um engenheiro de protenas que tipo de produto voc gostaria de desenvolver e com que
finalidade?

30