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ARTIGO
Rev Inst Adolfo Lutz, 64(2):155-161,2005.
DE REVISO/ REVIEW ARTICLE
1
* Endereo para correspondncia: Laboratrio de Bacteriologia e Epidemiologia Molecular, Departamento de Anlises
Clnicas, Toxicolgicas e Bromatolgicas, Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So
Paulo (Ribeiro Preto SP) Brasil
1
Laboratrio de Bacteriologia e Epidemiologia Molecular, Departamento de Anlises Clnicas, Toxicolgicas e
Bromatolgicas, Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo (Ribeiro Preto SP)
Brasil
2
Curso de Farmcia, Instituto de Cincias Biolgicas, Universidade de Passo Fundo (Passo Fundo RS) Brasil
3
Centro de Pesquisa Experimental do Instituto de Ensino e Pesquisa Albert Einstein (So Paulo SP) Brasil
Recebido: 22/10/2004 Aceito para publicao: 01/08/2005
RESUMO
PFGE (pulsed field gel eletrophoresis) a sigla usada para indicar qualquer tcnica de eletroforese
apropriada para separar grandes fragmentos de DNA, por meio da reorientao do DNA em gel pela ao
de campos eltricos alternados. Esta tcnica reconhecida como padro ouro para identificao de linhagens
bacterianas, fngicas e de protozorios. O principal objetivo deste estudo de reviso o da elucidao dos
fundamentos da tcnica de PFGE ou eletroforese de campo pulsante aplicada em estudo com bactria. Sua
resoluo depende de uma srie de fatores como: voltagem, concentrao de agarose, temperatura, soluo
tamponante, tempo de pulso e de corrida eletrofortica. A compreenso dos mecanismos moleculares
envolvidos nesse tipo de eletroforese fundamental para a otimizao e obteno dos resultados
apropriados.
Palavras-Chaves. epidemiologia molecular, mtodos moleculares, genotipagem bacteriana, PFGE.
ABSTRACT
PFGE (pulsed field gel electrophoresis) is an electrophoresis technique suitable for separating large
fragments of DNA by means of DNA reorientation in agarose gel from the effects of alternated electric
fields. This technique is considered as gold standard for performing bacteria, yeast and protozoa strains
identification. The main objective of the present review is to update the PFGE technical basis for being
suitable for bacteria studies. Its resolution depends on a series of factors such as agarose concentration,
temperature, buffer solution, pulse time, and running time. Understanding the involved molecular
mechanisms in this type of electrophoresis technique is fundamental for maximizing and attaining accurate
analysis results.
Key Words. molecular epidemiology, molecular methods, bacterial genotyping, PFGE.
SUMRIO
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com o aparelho empregado), a temperatura de corrida (Figura 1) Pulsos eltricos de diferentes duraes favorecem a
e ainda, a integridade do DNA tambm podem afetar o limite de reorientao de molculas de DNA de diferentes tamanhos. A
resoluo da tcnica2,12. durao do tempo de pulso o fator mais importante para
Nos estudos iniciais, Schwartz e Cantor3 utilizaram determinao da faixa de tamanho de fragmentos a serem
gradientes de campo de fora (no homogneo), o que resultava separados 14 . A durao do pulso dever possibilitar a
em trajetrias curvas das molculas de DNA. Em 1986, com o reorientao e a migrao do polmero para uma nova direo.
desenvolvimento, da tcnica de campo eltrico homogneo com Pulsos mais longos possibilitam a reorientao de molculas
eletrodos hexagonais, se tornou possvel a separao de bandas grandes; pulsos curtos reorientam to somente as pequenas
das diferentes amostras de DNA o que facilitou sua comparao13. molculas de DNA2. Alm disso, a ordem pela qual os diferentes
pulsos so aplicados, tambm altera a resoluo dos fragmentos
Tabela 1. Parmetros gerais de corrida eletrofortica para identificados no gel (Figura 2).
separao de diferentes tamanhos de DNA A fora do campo eltrico aplicado deve ser inversamente
proporcional ao tamanho das molculas de DNA que se deseja
DNA (kb) 10 a 50 <100 100 a 2000 a separar, ou seja, quanto maior o fragmento, menor dever ser a
2000 6000 tenso. Voltagem ou correntes altas podem diminuir a resoluo.
% agarose 1,2 1,2 1,2 0,6 Alteraes na tenso devero ser compensadas com alteraes
TBE (X) 0,15 0,15 a 0,5 0,5 0,5 no tempo de pulso para que os resultados sejam satisfatrios.
Voltagem 450 300 165 a 200 40 a 100 Para separar molculas de DNA bacteriano de at 1,5 Mb
Tempo de 0,3 a 1 s 1 a 10 s 10 a 120 s 3a geralmente utiliza-se 6 V/cm (medida entre dois eletrodos
pulso 75min. opostos). Para separar cromossomos de Neurospora crassa,
Tempo de 1a4h 1a6h 17 a 24 h 1 a 3 dias por exemplo, utilizada um campo de 1,5 V/cm14.
corrida O ngulo mais freqentemente utilizado em PFGE o de
(adaptao do manual do Gene Navigator Amershan Biosciences) 120, que o ngulo do aparelho CHEF-DRII (Bio-Rad) e do
Kb: Kilobase; TBE: Tampo Tris cido Brico EDTA; s: segundos; h: Gene Navigator (Amersham Biosciences), amplamente utilizados
horas.
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pelos laboratrios de pesquisa. Nesses aparelhos as distncias porm com concentrao mais baixa a separao dos fragmentos
entre os eletrodos so distintas, e a tenso adaptada de acordo pode no ocorrer satisfatoriamente. Na prtica, a concentrao
com o equipamento empregado. ngulos maiores reduzem a mxima de agarose usada varia de 1,2 a 2%.
velocidade de migrao, enquanto que ngulos menores Alteraes na temperatura de corrida interferem na
possibilitam um substancial aumento na velocidade de migrao resoluo, pois quanto maior a temperatura, mais rpida ser a
de fragmentos maiores14. A forma de migrao de fragmentos de migrao das molculas14. Temperaturas de 8 at 15C so as
DNA dependente dos ngulos formados entre os campos mais utilizadas.
eltricos que se alternam, como ficou evidenciado por A qualidade do DNA preparado para a corrida
experimentos de microscopia11. eletrofortica de fundamental importncia. Como o objetivo
A condutividade da soluo tamponante depende de a separao de fragmentos de alto peso molecular,
sua concentrao e volume. Assim, quanto maior a quantidade imprescindvel assegurar sua integridade. Molculas grandes
de soluo tamponante usada, maior ser a corrente eltrica, de DNA em soluo, normalmente utilizadas nas preparaes
alterando a resoluo da corrida eletrofortica. Se a concentrao convencionais sofrem danos proporcionais ao quadrado de
da soluo tamponante for aumentada, a resoluo da corrida seu peso molecular2. Assim, a extrao de DNA cromossmico
tambm ser alterada, dificultando a separao dos fragmentos a ser usado em PFGE feita com a incorporao das clulas
maiores, aumentando a corrente eltrica e a gerao de calor. bacterianas a serem lisadas em blocos de agarose, que
Neste caso, a temperatura de refrigerao dever ser diminuda, proporciona proteo mecnica s molculas de DNA. Durante
para que este parmetro no altere a eletroforese. Uma soluo o preparo dos blocos, a proporo entre as clulas bacterianas
tamponante inadequada poder resultar em baixa resoluo na e a agarose, low melting ou ultra pura, deve ser 1:1, pois o
separao de fragmentos (Figura 3). Rotineiramente usada excesso de agarose produz blocos rgidos, que dificultam a
soluo tamponante TBE (Tris, cido Brico, EDTA) com posterior digesto do DNA, bem como, nas etapas de lavagem,
concentrao de 0,5X. Entretanto, o Tris foi relatado como agente a remoo dos interferentes (protenas, DNAses, etc.) 5.
de degradao do DNA, e alguns autores obtiveram melhores Contrariamente, se a concentrao de agarose for menor, o bloco
resultados com o uso de outra soluo tamponante, como o ter consistncia mole e pode ser destrudo durante o processo
HEPES (N-[2-Hydroxyethyl] piperazine N-[2-ethanesulfonic de lavagem. A agarose low melting facilita o trabalho de
acid])15,16,17. confeco dos blocos, pois possibilita trabalhar com
Melhor resoluo na separao dos fragmentos temperatura em torno de 37C, entretanto, possvel
eletroforticos obtida com o aumento da concentrao de confecciona-los utilizando agarose ultra pura (Gibco), mas a
agarose, como na eletroforese horizontal, o que tambm interfere temperatura na preparao dos blocos deve ser mantida em
no tempo necessrio para separao dos fragmentos. Com o torno de 45C. Este procedimento requer grande quantidade de
uso de gel mais concentrado necessrio maior tempo de corrida, enzimas lticas e/ou de restrio e maior tempo de digesto que
os usados em metodologias convencionais, pois preciso que
as enzimas atravessem as barreiras impostas pela agarose. So
tambm necessrias lavagens exaustivas para se eliminar traos
das enzimas lticas que podero afetar as etapas subseqentes.
Outro aspecto importante no preparo das molculas de DNA
cromossmico de alto peso molecular a proteo do material
contra DNAses que so ativadas pela lise celular. Com este
intuito usada uma soluo contendo um agente quelante em
alta concentrao (EDTA 0,5 M), que seqestra os ons de
magnsio que atuam como co-fatores das DNAses. Uma outra
vantagem com a incorporao do DNA em gel de agarose a
estabilidade das amostras durante meses, quando mantidas em
temperatura ambiente e durante um tempo indefinido quando
conservadas em temperatura de 4C. Este fato possibilita a
reprodutibilidade de experimentos ou troca de amostras entre
grupos de pesquisa2.
A variao entre os pulsos pode ocorrer de forma
Figura 3. DNA cromossmico de amostras de S. aureus aps
contnua, numa abordagem dita INTERPOLATED ou de forma
macrorestrio com Sma I. Foram utilizadas as mesmas amostras abrupta (STEPPING). A variao contnua entre os pulsos de
bacterianas (S. aureus 6 17), a mesma temperatura de 13C e a 5 e 10 segundos por 2 horas, por exemplo significa que o tempo
mesma voltagem de 180V na corrida eletrofortica. A soluo tamponante de pulso do campo eltrico em cada direo ir aumentar de 5
utilizada foi TBE 0,5 X nos dois gis, mas a utilizada na corrida para 10 segundos, paulatinamente, ao longo de duas horas. No
eletrofortica B apresentava-se precipitada. As mesmas amostras
so correspondentes em ambos os gis.
formato de STEPPING, pulsos de 5 segundos em direes
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alternadas ocorrem por duas horas seguidas e, numa segunda (cariotipagem) eram desconhecidas, para a maioria das espcies.
fase, os campos eltricos passam a trocar de direo a cada 10 A tcnica de PFGE permitiu a construo de bibliotecas
segundos (Figura 4). genmicas destas regies que, de outra forma, no poderiam
ser analisadas20.
A caracterizao de linhagens patognicas
fundamental para fins epidemiolgicos. Nas ltimas dcadas, a
identificao de linhagens bacterianas baseada em
caractersticas fenotpicas cedeu espao para as abordagens
genotpicas por tcnicas de biologia molecular e, entre elas o
PFGE uma das mais aceitas e utilizadas21,22. Para estudos
epidemiolgicos de Staphylococcus aureus, por exemplo,
embora a fagotipagem ainda seja utilizada, a eletroforese de
campo pulsante considerada o padro-ouro. Foi utilizando
esta tcnica que Kreiswirth et al.23 mostraram que a maioria de
S. aureus resistentes meticilina (MRSA) isolados ao redor do
mundo possuam uma origem comum. Tambm foi estudada
atravs de PFGE a epidemiologia de enterococos resistentes
vancomicina (VRE), que difere quanto origem em hospitais
americanos e europeus24,25, a rota de transmisso de bactrias
Gram-negativas como Burkholderia cepacia e Pseudomonas
aeruginosa entre pacientes de fibrose cstica envolvidas em
infeces nosocomiais intra e inter-hospitalar 26,27 . A
cariotipagem de vrias espcies da levedura Candida, por
exemplo, revelou variabilidade intra-especfica que tambm foi
utilizada para estudos de transmisso entre pacientes
imunodeprimidos28,29.
PFGE utilizada tanto para estudos de surtos
hospitalares de pequenas propores30,31, quanto na comparao
Figura 4. DNA cromossmico de amostras de Staphylococcus aureus, de populaes bacterianas, envolvendo microrganismos de
aps macrorestrio com enzima Sma I em duas condies diferentes diferentes pases, ampliando o escopo epidemiolgico da
de pulsos especificadas em, A e B. A voltagem utilizada foi de 180V e tcnica32 .
a temperatura 13C em ambos os gis. As amostras so corresponden-
tes em ambos os gis.
A interpretao de PFGE para identificao de linhagens
bacterianas
Com o intuito de se discriminar linhagens bacterianas de
Aplicaes uma mesma espcie, o DNA bacteriano total, incorporado em
Em seu trabalho de 1984, Schwartz e Cantor3 descreveram bloco de agarose, digerido com enzimas de restrio que clivam
um novo mtodo de separao de cromossomos da levedura o cromossomo em grandes fragmentos. Em PFGE so
Saccharomyces cerevisae que facilitava a designao de genes necessrias de 30 a 40U de enzima para cada bloco de agarose e
especficos a determinados cromossomos por tcnicas de o tempo de incubao pode variar de 18 a 24 horas. Os fragmentos
hibridizao. Aps a separao dos cromossomos (cariotipagem) gerados so, ento separados por eletroforese de campo
os mesmos foram transferidos para uma membrana e hibridados pulsante. A abordagem, apesar de simples, suscita uma srie de
com uma sonda radioativa para indicar a localizao do gene de dvidas: Qual enzima utilizar com determinada espcie
interesse (Southern blot). bacteriana? O que acontece com o padro de bandas se houver
A clonagem de fragmentos de alto peso molecular em uma mutao no stio de reconhecimento da enzima? Pequenas
vetores do tipo YAC (yeast artifical chromosomes) com diferenas, uma ou duas bandas, entre os perfis obtidos de
capacidade de receber insertos de at 2 Mb de forma estvel foi duas bactrias testadas so suficientes para identific-las como
possibilitada pela tcnica de PFGE18,19. linhagens diferentes? Em 1995, Tenover e colaboradores22
Algumas informaes sobre a organizao genmica de publicaram critrios de interpretao de resultados de PFGE em
protozorios foram adquiridas atravs da tcnica de PFGE. Estes um esforo para difundir e tornar mais homogneo o uso desta
organismos no apresentam condensao de cromossomos tcnica para fins epidemiolgicos. Assim, se existe uma relao
durante a metfase e possuem um grande nmero de repeties epidemiolgica entre bactrias idnticas, provavelmente trata-
in tanden de genes codificadores de protenas. Informaes se de um surto. Por outro lado, bactrias de mesma espcie e
bsicas como a ploidia, nmero e tamanho dos cromossomos mesmo gentipo, isoladas de pacientes que no possuem uma
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ligao epidemiolgica detectvel, podem representar linhagens pelo surto. Se ocorrer uma insero de um transposon, por
endmicas. Assume-se tambm que, bactrias no relacionadas exemplo, e se o novo elemento no possuir um stio reconhecvel
epidemiologicamente, devem possuir gentipos diferentes. pela enzima usada, o resultado ser um aumento de tamanho de
Segundo Tenover et al.22, bactrias envolvidas em um surto uma das bandas. Se o fragmento de DNA introduzido possuir
e/ou epidemia devem apresentar padres indistinguveis, um stio de restrio, uma banda poder desaparecer em relao
enquanto que, aquelas no envolvidas com a epidemia devem linhagem epidmica, e duas novas bandas surgiro. Uma
apresentar padres distintos. importante, portanto, a utilizao deleo, por outro lado, pode fazer com que o fragmento diminua
de linhagens-controle, no relacionadas epidemiologicamente. de tamanho. Qualquer um destes eventos altera o padro da
Os autores chamam a ateno para o fato de que antes de se linhagem epidmica em duas ou trs bandas. Uma bactria
realizar a tcnica para estudos epidemiolgicos, a combinao considerada possivelmente relacionada quando as mudanas
enzima de restrio/espcie bacteriana deve ter sido testada e de padro de restrio forem compatveis com dois eventos
validada. Considera-se que um mnimo de 10 fragmentos de genticos, resultando em alteraes envolvendo entre 4 e 6
DNA, conseqentemente 10 bandas no gel, devem ser obtidos bandas. Quando o padro da linhagem epidmica possuir mais
por bactrias para que a tcnica tenha poder discriminatrio da metade das bandas diferentes em relao ao padro de outras
relevante. Uma linhagem considerada semelhante outra bactrias, estas devem ser consideradas no relacionadas
quando ocorre um nico evento gentico como uma mutao, geneticamente. Tenover31 tambm sugere que o padro da
uma insero ou deleo, que altere o padro de bandas (Figura linhagem responsvel pelo surto deve ser chamado A; aqueles
5). Uma mutao tanto pode criar quanto suprimir um stio de semelhantes ou possivelmente relacionados de A1, A2, A3 e
reconhecimento de enzima de restrio. Se um novo stio criado, assim por diante. Os no relacionados devem ser designados
o padro apresentar uma banda a menos em relao linhagem tipo B, tipo C, etc.
epidmica e duas bandas menores surgiro. Se um stio PFGE uma tcnica bastante complexa com um poder
desaparece, o padro alterado ter uma banda nova de tamanho discriminatrio muito elevado. considerado padro ouro em
maior que duas que desaparecero na linhagem responsvel epidemiologia molecular, mas importante ressaltar que mtodos
de tipagem no substituem dados epidemiolgicos, somente
auxiliam e, se utilizados isoladamente, podem levar a concluses
equivocadas.
Abreviaes
pb pares de bases; kb quilobases (= 1.000 bases); Mb
megabases (= 1.000.000 bases); CHEF contour-clamped
homogeneous electric field; FIGE field-inversion gel
electrophoresis; OFAGE orthogonal-field-alternation gel
electrophoresis; PACE programmable autonomously
controlled electrode; PHOGE pulsed homogeneous
orthogonal-fields; ROFE rotating-field electrophoresis; TAFE
transverse-alternating field electrophoresis; ZIFE zero-
integrated field electrophoresis.
REFERNCIAS
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