RELATÓRIO SOBRE AS

TÉCNICAS
PCR E ELETROFORESE

Artur Santos – 1231129

Gonçalo Tavares – 1230841

João Oliveira – 1230951

Simão Almeida – 1230913

Turma B , Grupo 3

Professores: Marlene Santos e Eduarda Pereira

Março de 2024
Ano letivo 23/24
Índice

RESUMO.......................................................................................................................................3
INTRODUÇÃO TEÓRICA................................................................................................................4
PARTE EXPERIMENTAL / MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................5
RESULTADOS / TRATAMENTO DE RESULTADOS...........................................................................6
DISCUSSÃO...................................................................................................................................7
CONCLUSÃO.................................................................................................................................8
BIBLIOGRAFIA...............................................................................................................................9
RESUMO

O DNA é uma molécula muito complexa, visto que é constituída por diversos elementos que
juntos codificam o código genético.

Este trabalho consistiu na realização de um PCR e de uma Eletroforese com o objetivo de

analisar os diferentes fragmentos do DNA e de poder, desta forma, estudá-los.

Para a realização do PCR, precisámos de medir antecipadamente concentrações e volumes

dos diferentes componentes desta molécula. Para isso foram feitos cálculos utilizando a
fórmula da diluição de soluções (Ci x Vi = Cf x Vf). Depois de medidos, estes valores foram
pipetados para o tubo que continha o DNA, finalizando assim a preparação da amostra
necessária para o PCR. Depois disso metemo-la no termociclador. Para a Eletroforese apenas
misturamos solução tampão com a amostra de DNA e colocamos essa solução no aparelho de
Eletroforese. A parte inicial foi toda feita pela professora antes da aula. Depois foi-nos enviada
uma foto dos resultados do gel no transiluminador UV.

Os resultados obtidos consistem na foto tirada no transiluminador.

As discussões baseiam-se na fidelidade da substância obtida no final da experiência, isto é, nos

erros que podemos ou não ter cometido e que podem ou não ser corrigidos.

Na conclusão damos a nossa opinião acerca das técnicas usadas e realçamos a sua
importância.
INTRODUÇÃO TEÓRICA

O DNA, ou ácido desoxirribonucleico, é a molécula mais importante de todos os seres vivos

pois contém a informação genética necessária para a sua sobrevivência e para a continuidade
da sua espécie. A molécula é constituída por duas cadeias polinucleotídicas que, como diz o
nome, são formadas por nucleótidos (estas estruturas contêm um ácido fosfórico, uma
desoxirribose e uma base azotada – citosina, guanina, adenina e timina), e que se enrolam
umas nas outras, formando uma estrutura de dupla hélice.

O problema central da experiência envolvendo a amplificação eletiva de um fragmento por

PCR e subsequente análise por eletroforese em gel de sacarose é a migração das bandas dos
diferentes fragmentos de DNA previamente amplificados. A intensidade das bandas do gel de
eletroforese pode servir como uma mediada aproximada da quantidade relativa de DNA
amplificado naquele fragmento em particular e pode ser extremamente útil para comparar o
que acontece com a eficiência de amplificação em diferentes amostras ou condições
experimentais

Na conclusão de uma experiência envolvendo a migração de vários fragmentos de DNA em

um gel de eletroforese, após a amplificação por PCR, muitas teorias e princípios são
observados e aplicados para entender e interpretar os resultados. A teoria básica da
eletroforese é que os fragmentos de DNA se movem através do gel com base nos seus
tamanhos. Os fragmentos menores movem-se mais rápido e para a direção do campo elétrico,
enquanto os fragmentos maiores movem-se mais devagar e possuem menos probabilidade de
migração.

A migração dos vários fragmentos de DNA baseia-se na teoria do campo elétrico (criada por
Michael Faraday) onde os fragmentos de DNA carregados negativamente movem-se em
direção ao polo positivo.

Após todo este processo a primeira pergunta que se procura responder é se primeiramente a
amplificação por PCR foi eficiente na produção de múltiplas cópias do fragmento de DNA
desejado. Outra pergunta que podemos colocar é se a técnica de coloração e visualização foi
adequada, ou seja, se a aplicação de corantes e se a visualização das bandas no gel foi bem
efetuada.
PARTE EXPERIMENTAL / MATERIAIS E MÉTODOS

Para a realização da PCR, foram utilizados reagentes de alta pureza, incluindo Taq Buffer,
dNTPs, MgCl2, primers forward e reverse, Taq DNA polimerase, e água ultrapura. O
procedimento iniciou-se com a preparação da mistura principal, combinando os reagentes
mencionados para atingir um volume total de 250 μL, dos quais se vai retirar 24 μL para se
juntar a 1 μL da nossa amostra de DNA. Para esta parte do processo usaram-se 2 tipos
diferentes de pipetas, uma com intervalo de medições entre 0 μL -20μL e outra entre 20 μL -
200 μL.

A amostra final foi submetida a ciclos de desnaturação inicial a 95°C, seguidos por ciclos de
desnaturação a 95°C, hibridação dos primers a 50-65°C e extensão a 72°C, utilizando um
termociclador padrão.

Para a eletroforese, o tampão TAE 10x foi diluído para 1x, e agarose foi dissolvida em tampão
TAE 1x. Após solidificação do gel, amostras de DNA foram aplicadas nos poços, seguido de uma
eletroforese a 100 V por tempo determinado. Após a corrida, o gel foi incubado em tampão
TAE 1x e corado com Green Safe Premium, seguido de visualização em um transiluminador UV
para análise dos fragmentos de DNA. O material utilizado incluiu equipamentos de laboratório
padrão e reagentes de grau molecular adequado.

Figura 1 - Aparelho de
Eletroforese
Figura 2 –
Transiluminador UV
Figura 3 - Termociclador

Figura 4 – Eppendorfs com

Taq Buffer, dNTPs, MgCl2,
primers forward e reverse,
Taq DNA polimerase, e
água.
RESULTADOS / TRATAMENTO DE RESULTADOS

Taq Buffer – Solução Tampão

Taq – DNA Polimerase

Primer Forward – 5’ ATAGCTGGGGCTATGCGATT 3’

Primer Reverse – 5’ CATTTGACTGGGCTGTCCAT 3’

V1 (microlitros) V2 (microlitros)
Tap Buffer 5 25
dNTPs 1 5
MgCl2 4 20
Primer Forward 2,5 12,5
Primer Reverse 2,5 12,5
Taq 0,2 1
H2O 34,8 174,0
Volume Final 50 250,0

Para o cálculo do dos volumes necessários de cada uma das soluções utilizou-se uma
expressão que permite relacionar as soluções inicias para um volume que as dilua.

C inicial∗V inicial =C final∗V final

Como podemos observar na figura 5, na

coluna do nosso grupo (G3), encontramos
duas riscas, uma nos 700 bp e outra mais
acentuada nos 50 bp. Comprovamos assim a
teoria desta técnica visto que, graças à
diferença de potencial na eletroforese, os
fragmentos mais pesados (700 bp) da cadeia
se separaram dos mais leves (50 bp).

Figura 5 – Foto retirada ao gel no

transiluminador UV
DISCUSSÃO

Nos diferentes passos da reação em cadeia da polimerase (PCR) os diferentes resultados

esperam-se a cada etapa devido as condições específicas de temperatura e aos processos
bioquímicos envolvidos. Posteriormente à respetiva introdução, deverá ser efetuada a
desnaturação das duas cadeias de nucleótidos. O primer emparelha-se seletivamente com a
região de duplex do DNA que se deseja amplificar.

Após esta operação é também esperado novas sínteses de novas cadeias de DNA
complementares ao molde original.

Neste processo a DNA polimerase utiliza os vários primers como indicadores para
complementar os nucleótidos complementares ao molde de DNA, sintetizando assim novas
cadeias de DNA.

À medida que repetimos esses ciclos de temperatura, espera-se uma amplificação exponencial
do fragmento DNA alvo presente na amostra final. O número de cópias do fragmento de DNA
aumenta significativamente a cada ciclo, permitindo a análise do DNA.

O sucesso na expansão do fragmento de DNA alvo é essencial para identificar genes

específicos e marcadores genéticos, algo que é fundamental em estudos de genética e
pesquisa biomédica.

Outra medida bastante impactante é a utilização de fragmentos amplificados por PCR para
procurar possíveis mutações, variações genéticas e características moleculares.

Um ponto fraco presente em testes PCR é a contaminação dos seus reagentes, que pode levar
a expansão de produtos indesejados.

Outro ponto fraco presente é, por vezes, a eficiência e confiabilidade do PCR, como a
amplificação não específica, a falta de amplificação ou a amplificação não linear. Estes erros
podem acontecer devido a diversos fatores, como a qualidade dos reagentes, design dos
primers e temperatura do ambiente.

De modo a melhorar as técnicas ou procedimentos podemos realizar técnicas como

otimização dos parâmetros do PCR, como temperatura de desnaturação, a temperatura de
annealing e tempo de extensão. Poderíamos também usar diversos softwares de design de
primers de modo a garantir a seleção dos primers específicos e com as melhores condições
para a amplificação do fragmento desejado.

Se durante todo o processo algo corresse mal poderíamos utilizar reagentes armazenados
adequadamente e verificar a integridade e pureza do DNA molde.

Se mesmo com estas medidas, alguns resultados não fossem fiáveis, poderíamos otimizar o
design dos primers e os parâmetros do PCR, como a temperatura e tempos de incubação.

Outro erro que pode ser facilmente solucionado é a contaminação de amostras durante a
preparação das amostras de PCR. Para combater este erro utilizam-se pontas de pipeta
diferentes.
 Foi esperado que o DNA extraído das células migrasse para o outro polo (do negativo para o
positivo), pois foi lhe submetida uma tensão constante, assim as moléculas foram sendo
separadas por diferentes quantidades de pares de bases por uma malha de agarose que vai
filtrando as moléculas maiores das menores. Por isso, observa-se uma maior quantidade de
DNA no polo positivo com cerca de 50 bp apesar de se ter uma pequena fração do mesmo na
escala dos 700-800 bp. A partir destes resultados pode-se concluir que foram fidedignos
cumprindo com todo o protocolo referido em aula. A partir de considerações prévias deste
sistema de análise de DNA os resultados foram os esperados, e em relação a outros valores já
experienciados, o valor ilustrado foi também bom pois apresentava maior concentração de
DNA no polo positivo. Ao observar-se o que o DNA está concentrado no polo positivo pode-se
inferir que realmente houve uma translocação das moléculas que maior parte delas continham
por volta dos 50 bp.

Em relação ao trabalho, houveram alguns pontos fracos, por exemplo não se esteve presente
durante toda a experiência devido ao tempo de alguns procedimentos que estavam
previamente concluídos para que fosse possível fazer todo protocolo na aula com os
resultados, a nível da eletroforese em si, não se aplica a todos os tipos de compostos, como:
Voláteis, apolares e/ou de baixa massa molar. E apenas polímeros iônicos de massa molar alta
devem ser utilizados.

Para melhorar esta técnica pode-se utilizar aparelhos mais exatos, ter mais experiência neste
método e ainda ter mais atenção ao próprio procedimento e aprofundá-lo mais.
CONCLUSÃO

Apesar do ISEP não possuir o equipamento necessário para a realização destas experiências,
consideramos que as técnicas PCR e Eletroforese são técnicas simples e de fácil aprendizagem
para a avaliação do código genético. Contudo, devemos ter em conta que muitos dos
processos são demorados. Devemos ter cuidado com os aparelhos e com as substâncias (de
modo a não haver contaminação e, consequentemente, ocorrência de erros) que estamos a
usar.

Desta forma, alcançamos o nosso objetivo de observar os fragmentos de DNA e, assim,

estudá-los. Percebemos agora o porquê destas técnicas serem usadas e a sua importância no
ramo da engenharia biomédica.
BIBLIOGRAFIA