• Pesar precisamente os componentes do
meio e em equipamento adequado;
Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Campus Campo Mourão
Coordenação de Alimentos
Disciplina de Microbiologia
Profa. Márcia R. F. G. Perdoncini
AULA PRÁTICA n°
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
Introdução
Os meios de cultura destinam-se ao
cultivo artificial dos microrganismos e fornecem
os princípios indispensáveis ao seu crescimento.
As exigências nutritivas estão relacionadas a
uma fonte de carbono, de nitrogênio, de energia
e de sais minerais. Alguns microrganismos
também necessitam de fatores de crescimento,
substâncias que eles não podem sintetizar, tais
como vitaminas, aminoácidos, entre outras. Além
disso, alguns meios podem ser formados por
preparados de sangue, de carne, de leite e de
vários outros produtos.
O ágar, agente solidificante largamente
usado, formado por extrato de algas marinhas,
funde-se em torno do ponto de ebulição da água,
formando uma solução transparente que
permanece no estado líquido até em torno de
40°C. Uma vez eu a maioria dos microrganismos
não é morta a 45°C, eles podem ser adicionados
a um meio com Agar ainda liquefeito em tubos de
ensaio ou placas de Petri. Depois que o meio
com Agar se resfria e se solidifica, ele
permanecerá solidificado a temperaturas de
incubação e pode ser inoculado com
microrganismos. O Agar não serve como
nutriente para a maioria dos microrganismos e
não é metabolizado durante o crescimento.
Existem algumas observações
importantes no preparo de meios de cultura:
• Não se pode manter o meio de cultura à
temperatura ambiente em uma solução
não-esterilizada por mais de uma hora,
devido à possibilidade de evaporação da
água e de crescimento microbiano.
• Frascos de meios de cultura desidratados
são altamente higroscópicos, portanto
mantê-los em ambientes secos e o menor
tempo possível abertos.
• Seguir sempre as orientações do
fabricante;
• Utilizar sempre o frasco mais antigo do
estoque;
• Proteger os frascos da luz;
• Desprezar meios que apresentem sinais
de hidratação;
• Observar data de validade;
• Utilizar somente água destilada, ou
deionizada, ou tratada por osmose
reversa;
• Afrouxar as tampas dos frascos e tubos
para autoclavação;
• Respeitar o máximo de material a ser
esterilizado;
• Verificar após esterilização (quando
necessário) o valor de pH da preparação,
cor, estabilidade e consistência.
• Incubar amostra representativa do lote;
• Incubação de controle branco a cada
inoculação;
• Armazenamento após preparo longe da
luz, em local limpo e evitar perda de
umidade;
• Descartar se apresentar perda de
umidade, mudança de cor ou crescimento
microbiano;
• Registrar SEMPRE a data de preparação.
Validades:
• Distribuídos em placas, armazenar de 4 a
12°C por uma semana;
• Suplementos/reagentes estéreis- 3 meses
de validade sob refrigeração;
• Meios completos e basais ainda não
suplementados- 3 meses sob
refrigeração; 1 mês a temperatura
ambiente.
Fusão do ágar
• Banho-maria ou processo que seja
efetivo;
• Aquecimento o tempo mínimo necessário;
• Armazenamento de 45-49°C por no
máximo 4 horas;
• Não fundir novamente se solidificado.
Adição de suplementos
• Meio resfriado a 45-49°C;
• Se retirados do refrigerador aguardar
atingir temperatura ambiente;
• Não reaquecer.
Distribuição em placas
• Camadas de aproximadamente 2mm;
• Superfície fria e plana para solidificação.
MATERIAIS
• Agar (tubos inclinados) e caldo nutriente;
• Caldo EC;
• Agar batata dextrose (PDA);
• Ácido tartárico 10%;
• Água destilada.
 com técnica asséptica;
PROCEDIMENTO • Deixar a placa em posição horizontal
Prática até que o meio de cultura se
Preparo de meio líquido: caldo EC e caldo AN solidifique completamente;
• Pesar o meio de cultura em papel • Armazenar as placas em posição
alumínio e, a seguir, transferi-lo para um invertida na geladeira.
balão de fundo chato;
• Verter sobre o papel de filtro uma EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO
pequena quantidade de água para
arrastar todo o meio; 1. Por que os microbiologistas utilizam meios
• Adicionar água deionizada ou destilada ao quimicamente definidos?
meio de cultura; 2. Por que o Agar é o agente solidificante
• Colocar a boneca nos balões e a coifa de ideal para uso em microbiologia?
papel com o nome do meio e a data; 3. Qual é a constituição do Agar? Qual a
• Autoclavar a 121°C por 15 minutos; finalidade da sua incorporação nos meios
• Distribuir em tubos esterilizados a de cultura?
quantidade necessária para análise. 4. Quando um microbiologista utiliza um
OBS.: ACOMPANHAR O PROCESSO DE meio de enriquecimento para o cultivo de
ESTERILIZAÇÃO!!!! microrganismos?
5. Qual a composição dos meios EC, PDA e
Prática Agar nutriente? Quais as suas
Preparo de meio sólido (Agar nutriente e PDA) finalidades?
• Pesar o meio de cultura em papel 6. Por que tem que abaixar o pH do meio
alumínio e, a seguir, transferi-lo para PDA após a esterilização para sua
um balão de fundo chato; posterior utilização?
• Verter sobre o papel de filtro uma
pequena quantidade de água para
arrastar todo o meio; REFERÊNCIAS
• Adicionar água deionizada ou água
OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologia-
destilada ao meio de cultura;
roteiros de aulas práticas. São Paulo: Tecmedd,
• Levar o balão com o meio para um
2008.
banho-maria a 60°C durante
20minutos. A cada 3 minutos,
homogeneizar para a dissolução do
meio de cultura;
1. Para o PDA
• Colocar a boneca nos balões e a coifa
de papel com o nome do meio e a
data;
• Autoclavar a 121°C por 15 minutos;
• Após a autoclavagem, levar o meio
para um banho-maria a 50°C até o
momento do uso.
2. Para o Agar nutriente:
• Distribuir em tubos e autoclavar a
121°C por 15 minutos;
• Após a autoclavagem, inclinar tubos.

OBS.:Plaqueamento: Agar PDA

• Destampar o balão na zona estéril de
um bico de Bunsen, flambando a
boca para impedir a entrada de
eventuais microrganismos;
• Resfriar até a 46-48°C. Adicionar
cerca de 1,5 mL de solucão aquosa
de ácido tartárico 10% para cada 100
mL, de forma a baixar o pH até 3,5.
• Verter entre 18mL e 20mL do meio de
cultura em placas de Petri estéreis