TEXTO 1: OUTROS MARCADORES MOLECULARES

SNP's

Os Polimorfismos de Base Única (SNP – Single Nucleotide Polymorphism ) estão surgindo como
novos marcadores de interesse para a comunidade forense devido à sua abundância no genoma
humano (já foram identificados e mapeados no genoma humano mais de 10 milhões de SNPs);
ao seu baixo índice de mutação; por permitirem a análise de pequenos fragmentos de DNA e à
possibilidade de automatizar as análises com altas tecnologias. Muitas das novas tecnologias
para genotipar SNP's têm sido desenvolvidas nos últimos anos.

A vantagem dos SNP's em testes de paternidade é que eles podem ser estudados em produtos
de amplificação muito curtos (50 pares de base ou menos) e, por isso, apresentam distintas
vantagens sobre os microssatélites no estudo de DNA extremamente degradado (como no caso
de cadáveres em estado muito avançado de decomposição ou carbonizados). Porém, a tipagem
de SNP's é relativamente complexa.

Para analisar o genoma do SNP deve ser hibridizado o alelo específico, extensão do primer ,
ligação do oligonucleotídeo e clivagem. Existem vários métodos para a análise final como
fluorescência, luminescência, etc.

Estudos populacionais

Os locos de STR devem ser analisados em cada laboratório para conhecimento da freqüência na
população. Cerca de 40 STR, entre os milhares existentes, são utilizados na prática forense.
Além da sensibilidade, devemos identificar aqueles com maior polimorfismo, elevado índice de
discriminação e de heterozigose, assim como de baixa freqüência de mutações. Essas
freqüências serão importantes na estatística de investigação de paternidade e de identificação
de pessoas ou manchas de sangue.

O poder de exclusão indica qual o percentual de exclusão alcançado por cada loco. Quanto
maior o poder de exclusão, mais informativa será a análise. Na Tabela 1 identificamos a
frequência de cada alelo dos principais locos de STRs em nossa população, além do poder de
exclusão e frequência de heterozigotos (Jobim, 2003).

STR do Cromossomo Y

Recentemente foram descritos STR no cromossomo masculino Y. Algumas características desse

cromossomo fazem com que seus microssatélites sejam importantes na análise forense do DNA.
Devido à falta de um cromossomo homólogo, não existe recombinação durante a meiose. Sendo
assim, só identificamos alelos de origem masculina, herdados em bloco dos antepassados
masculinos. A herança em bloco de alelos de diferentes STR do mesmo cromossomo é
denominada herança haplotípica, e o conjunto dos alelos chama-se haplótipos.

Dessa maneira, é possível a identificação de diversos locos de STR em um homem, sendo os

mesmos alelos encontrados em seu pai, irmãos, tios, primos, avô e demais antepassados
masculinos. Estudos apontam um baixo índice de mutação, podendo os mesmos haplótipos

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serem encontrados em várias gerações de homens, alcançando talvez algumas centenas de
anos.

Cada alelo ou marcador do Y de determinado local do DNA apresenta uma freqüência na

população, existindo bancos de dados especializados ( http://www.ystr.org/index.html).

Se examinarmos sete ou mais locais do DNA do Y, poderemos conhecer matematicamente a

existência ou não de uma relação genética entre indivíduos.

Os STR do cromossomo Y permitem reconhecer a exclusão de paternidade quando o possível

pai é falecido, analisando-se o pretenso filho e homens aparentados com o suposto pai. Esses
locos são também importantes na identificação em casos de estupro. Nos últimos, é possível a
análise desses marcadores, presentes nos espermatozóides da secreção vaginal da vítima, sem
que o seu DNA possa confundir-nos, pois somente o do agressor estará sendo identificado.

Os principais locos de STR do Y são: YGATAH4, DYS437, DYS438, DYS448, DYS458, DYS19,
DYS385, DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389II, DYS393, DYS391, DYS439, DYS635,
DYS392.

Um estudo realizado pelo Prof. Chris Tyler-Smith, da Universidade de Oxford, permitiu a provável
identificação do conjunto de genes do cromossomo Y de Gengis Khan (Fig. 7). As amostras
utilizadas foram da população masculina da Mongólia, levando-se em conta que o guerreiro
mongol teve mais de cem filhos, os quais, por sua vez, tiveram outros milhares de filhos, todos
com o mesmo perfil genético do cromossomo Y. Esse perfil é encontrado, na atualidade, em
grande número de indivíduos mongóis do sexo masculino.

Figura 7- Gengis Khan

Cromossomo X

Um interesse recente na utilização dos loci de STRs do cromossomo X em casos forenses e em

casos de teste de paternidade tem aumentado o desenvolvimento de novos loci de STRs do X
apropriados para estes fins.

O uso de marcadores autossômicos (STRs) disponíveis nos kits comerciais é freqüentemente

insuficiente para resolver casos de parentesco quando somente dois sujeitos estão disponíveis

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para a análise e por isso os STRs do cromossomo X são muito úteis em casos complexos de
paternidade por serem herdados de maneira diferente do pai e da mãe.

Sendo assim, esses STRs do X tem o potencial para complementar eficientemente a análise de
outros marcadores genéticos como os autossômicos, do cromossomo Y ou mitocondrial,
permitindo que probabilidades de paternidade mais elevadas sejam alcançadas além de
aumentar a capacidade de discriminação dos STRs autossômicos nas análises de parentesco
que envolvem pares de indivíduos fornecendo um poder estatístico mais elevado nesses casos
especiais. Estas probabilidades são expressas em uma relação de probabilidade que dependem
das combinações dos genótipos testados para ser calculada.

Os haplótipos do cromossomo X têm mostrado serem úteis nos testes de paternidade onde o
possível pai é ausente e somente parentes próximos estão disponíveis para o teste como
relações entre possíveis pares de irmãs e de meio-irmãs e mãe/filha/avó paterna ou para duos
de pai-filha e de mãe-filho, entre outros casos.

7.1. Exclusão de Paternidade pela Avaliação do DNA do Cromossomo X

Devemos lembrar que o suposto pai tem a composição XY, logo ele só poderá passar um alelo
do cromossomo X para sua prole. Já a mãe tem a composição XX, logo poderá passar um dos
dois alelos X para suas filhas e um para seus filhos.

Um caso recente foi esclarecido em nosso laboratório pela análise de microssatélites (STRs) do
DNA do cromossomo X, sendo que o suposto pai era falecido, analisando-se a viúva e suas
filhas com o falecido, além da autora e sua mãe.

Dessa maneira, procuramos identificar os alelos maternos herdados pelas filhas de sua mãe
(viúva), sendo que os demais alelos serão de origem paterna (suposto pai).

Deveremos também identificar os alelos da autora de herança materna, sendo que o outro alelo
certamente será o alelo X proveniente do pai biológico.

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Tabela 2 – Exclusão de paternidade utilizando STRs do cromossomo X.

No presente caso, analisamos diversos locos do cromossomo X. No loco DXS10011, a autora

herdou o alelo 35 de sua mãe, sendo que o alelo 36 obrigatoriamente é de origem paterna.

As filhas 1, 2 e 3 herdaram os alelos 29 ou 41 de sua mãe, viúva do suposto pai da autora. Em

todas elas também encontramos o alelo 43 que obrigatoriamente é de origem paterna e não
existente na autora, indicando uma exclusão de paternidade.

O mesmo resultado foi observado nos locos ARA, DXS7424, DXS6807 e DXS101. No primeiro
(ARA), a autora herdou o alelo 26 de sua mãe, sendo o alelo 20 é de origem paterna. As filhas
do falecido herdaram, ora o alelo 24, ora o 15 de sua mãe (viúva), sendo que todas
apresentaram o alelo 28 paterno e inexistente na autora.

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CÁLCULOS ESTATÍSTICOS

Os marcadores genéticos, incluindo DNA e marcadores sorológicos, não identificam

positivamente um indivíduo. Ao contrário, são utilizados ou na exclusão positiva de um indivíduo
ou no estabelecimento de uma provável origem.

O DNA pode ser exclusivo de um indivíduo, mas a gama total de polimorfismos não é testada e
consequentemente existe uma certa probabilidade estatística de que dois indivíduos, escolhidos
ao acaso, venham a ter um perfil semelhante de DNA.

Os cálculos desta probabilidade baseiam-se em dados de freqüência de populações e são

analisados com conceitos estatísticos de genética de populações. O princípio de Hardy-
Weinberg, uma expressão matemática para sistemas dialélicos:

p2 + 2pq + q2 = 1, utilizada para calcular a frequência de um alelo em uma população, indica que
a frequência dos alelos permanece constante em uma população ao longo do tempo,
pressupondo cruzamentos ao acaso na população.

Uma vez identificados os alelos para os loci estudados, deverá ser feita a interpretação, para
cada lócus, em termos de inclusão ou exclusão do indivíduo pela comparação de seus alelos
com os da amostra ou amostras questionadas.

Em casos de estudos de, por exemplo, comparação entre manchas de sangue encontradas na
vestimenta de um suspeito e material biológico pertencente à vítima, deverá haver, caso a
mancha de sangue realmente pertencer à vítima, coincidência, ou seja, inclusão de todos os
alelos, para todos os loci analisados.

Para casos como estes, far-se-ão cálculos para mensuração da razão de verossimilhança
entre as amostras analisadas. Este grau de semelhança é medido pela frequência de incidência
que representa o número de vezes em que determinado perfil genético ocorre na população. Ou
seja duas hipóteses são testadas: a da acusação e a da defesa.

Na análise forense de DNA é corriqueiro o emprego do cálculo da razão de verossimilhança,

como, por exemplo, em casos de determinação de autoria de estupro ou comparação de
manchas colhidas em local de crime e amostras de sangue de suspeitos ou vítimas.

Os resultados dos cálculos da frequência de incidência de um determinado perfil genético em

uma população são normalmente expressos com notações que indicam o número de vezes em
que o perfil se repete na população, por exemplo, 1 em 5 bilhões de pessoas ou 1 em 20
quintilhões de pessoas.

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Se se tratar de um caso de paternidade, para cada lócus, deverá haver coincidência entre um
dos alelos da criança com um dos presentes em sua mãe. O outro alelo da criança, não
coincidente com a mãe, deverá estar presente no pai e este alelo recebe o nome de alelo
paterno-obrigatório.

Analisando-se os alelos do suposto pai, dir-se-á que existe inclusão deste para o lócus se ele
possuir o alelo presente na criança, dito, alelo paterno-obrigatório. Caso contrário existirá sua
exclusão para este lócus.

A exclusão de paternidade é declarada quando o suposto pai não apresenta em seu material
genético três alelos ou mais dos alelos paterno-obrigatórios, definidos para o investigante
(SOCIEDADE BRASILEIRA DE MEDICINA LEGAL, 1999).

IMPORTANTE: Na análise forense de DNA, recomenda-se o estudo de loci com grande

polimorfismo, mas com baixa freqüência de mutação, e também com elevado índice de
heterozigose e poder de discriminação. Quanto mais raro for um alelo na população, maior a
evidência em favor da inclusão. Se este alelo for comum na população, a evidência torna-se
significativamente menor.

Nos estudos de paternidade que se dão através da análise de amostras de sangue colhidas da
mãe, da criança e do suposto pai, mormente voltadas para esclarecimentos de causas cíveis de
direitos sucessórios ou de alimentos, o número recomendável de loci a serem analisados, para
obtenção de resultados seguros, dependerá da técnica empregada. No caso de sondas, por
serem mais informativas, é aceito um número entre 4 e 6. Já para as análises efetuadas com o
emprego de STRs, o número de loci analisados deverá ser maior que 12 (PENA, 1997;
SOCIEDADE BRASILEIRA DE MEDICINA LEGAL, 1999). [S1] Comentário: REFERÊNCIA ANTIGA

Nas análises forenses de DNA, voltadas à elucidação de crimes ou à identificação de pessoas,

que na grande maioria das vezes emprega STRs, o número de loci utilizados para obtenção de
resultados poderá ser menor, uma vez que, dada a baixa qualidade dos materiais biológicos que
são analisados, nem sempre se obtém sucesso na amplificação para muitos loci.

A probabilidade de paternidade é calculada a partir do índice de paternidade e representa a

possibilidade de o suposto pai ser o pai biológico.

O índice de paternidade é verificado por meio da razão entre a probabilidade das bandas,
pertinentes ao perfil genético do filho ou filha e que estejam em coincidência com o perfil do
suposto pai, serem oriundas deste suposto pai e a probabilidade delas serem oriundas de
qualquer indivíduo da população.

A análise de DNA voltada à determinação da paternidade leva ainda em conta a probabilidade

de exclusão. Este cálculo indica a probabilidade de não encontrarmos um outro indivíduo,

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selecionado ao acaso na população, que possua o mesmo perfil genético do pai biológico da
criança. Nesta análise são considerados somente os alelos da mãe e da criança.

Os resultados dos cálculos de probabilidade de paternidade e probabilidade de exclusão são

normalmente expressos em valores percentuais, geralmente com índices próximos a 99,99%. [S2] Comentário: EM DESUSO POR
FAVORECER A ACUSAÇÃO. FALSA
SENSAÇÃO DE CERTEZA.
As frequências alélicas utilizadas para os cálculos estatísticos da análise de DNA variam entre
as populações. Vários pesquisadores vêm formando um banco de dados representativo da
população brasileira, o que vem contribuindo para o aprimoramento das estimativas de
probabilidade.

Pode-se, entretanto, minorar os riscos das imprecisões oriundas de cálculos probabilísticos

efetuados com dados de populações estrangeiras através da utilização de um método
denominado frequência teta, onde é considerado o limite máximo de ocorrências de um alelo,
qualquer que seja a origem étnica de uma pessoa (FRANÇA, 2000).

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