Alterações histopatológicas, imuno-histoquímicas e

bioquímicas no tecido hepático após exposição ao

fungicida-mancozebe em ratos Wistar albinos

Introdução
A intoxicação é um dos campos de estudo da medicina legal, e os agrotóxicos são agentes
que levam à intoxicação. Em todo o mundo, os pesticidas são amplamente utilizados na
agricultura para a produção de alimentos. Como resultado deste uso extensivo de
pesticidas, os seres humanos são regularmente expostos a pesticidas e aos seus resíduos.
A ingestão de alimentos e água potável são as principais fontes de contaminação da
população em geral através do acúmulo persistente de resíduos de pesticidas no meio
ambiente1,2.

Um desses pesticidas é o mancozebe, um fungicida. É um fungicida de amplo espectro

comumente usado que controla um número significativo de doenças fúngicas na agricultura
e na horticultura3-5. É um fungicida etileno-bis-ditiocarbamato de manganês/zinco e, ao
reagir com grupos sulfidrila de aminoácidos e enzimas, inativa esses aminoácidos e
enzimas nas células fúngicas2. Como resultado dessa inativação, ocorrem perturbações no
metabolismo lipídico, na respiração e na produção de trifosfato de adenosina6.

A exposição ao mancozebe é frequente entre trabalhadores da indústria química e agrícolas

após inalação de poeira ou sprays, contato dérmico ou ingestão acidental/incidental2. O
corpo metaboliza o mancozebe rapidamente e estudos em animais mostram toxicidade
baixa e aguda. No entanto, experiências em roedores demonstraram que o mancozeb e o
seu metabolito, a etileno tioureia (ETU), podem atravessar a barreira placentária e perturbar
o desempenho reprodutivo, causar danos no DNA e também iniciar tumores nas células
fetais2,7-9. O mancozebe é um carcinógeno multipotente com exposição prolongada em
animais de laboratório10. Em roedores, tem potencial para causar câncer de tireoide e
fígado11. Além disso, por induzir redução nos níveis de T4 em ratas, o que pode prejudicar
o cérebro em desenvolvimento, é conhecido como desregulador do sistema endócrino
associado ao hipotireoidismo e hipertireoidismo12,13.

Experimentos realizados in vitro demonstraram que as enzimas mitocondriais são os

principais alvos dos fungicidas14,15. Além disso, a formação de espécies reativas de
oxigênio é estimulada por fungicidas em fibroblastos de ratos16. Humanos expostos ao
mancozebe exibiram uma série de problemas de saúde, como efeitos neurotóxicos e
sintomas semelhantes aos de Parkinson e sensibilidade em crianças e mulheres, como
interrupção do hormônio tireoidiano e desregulação no desenvolvimento do cérebro fetal -
defeitos do tubo neural13,17,18. Alterações neoplásicas são observadas in vitro e na pele
de camundongos in vivo19. O mancozebe provoca alterações em diversas enzimas
bioquímicas20. Essas alterações enzimáticas podem estar associadas a alterações
patomorfológicas no fígado, nos rins e no cérebro. Acredita-se que o dano hepatocelular,
como a necrose, esteja relacionado a alterações nos tecidos e nas enzimas séricas, como a
fosfatase alcalina. A administração de mancozebe pode causar uma diminuição da atividade
da colinesterase sérica e levar à lentidão da síntese enzimática no fígado danificado, e
também a inibição das oxigenases microssomais produz danos ao fígado. O tratamento
subcrônico com mancozebe leva à toxicidade hepática em ratas Wistar21. A morte celular
no fígado é resultado de apoptose ou necrose.

Para isolar células danificadas ou infectadas para preservar a integridade do tecido e ao

mesmo tempo prevenir a inflamação e danificar outras formações, este processo é seguido
por apoptose. Tanto o aumento da permeabilidade lisossômica mitocondrial quanto a
formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) medeiam a apoptose induzida pelo
receptor de morte; assim, os hepatócitos promovem apoptose em resposta a substâncias
tóxicas22,23. Foi relatado que a hipóxia hepática causa ativações da caspase-3 nos
hepatócitos24. O fator de necrose tumoral-α é uma citocina pró-inflamatória multifuncional
que controla uma ampla gama de metabolismo, sensibilidade à insulina, inflamação,
apoptose celular, coagulação, crescimento e invasão tumoral e funções vasculares25,26. O
objetivo desta investigação foi mostrar os efeitos histopatológicos, imuno-histoquímicos e
bioquímicos no fígado após a administração de mancozebe.

Métodos
Animais experimentais e desenho do estudo

A pesquisa foi realizada de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de
Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA em 2011. Todos os
procedimentos realizados neste experimento foram aprovados pelo Comitê de Ética para o
Tratamento de Animais Experimentais (Dicle University , Turquia, número de protocolo:
2021/03). Os ratos foram fornecidos pela Dicle University, Centro de Pesquisa e Aplicação
do Departamento de Ciências Médicas.

Os animais tiveram um período de aclimatação de 72 horas antes da utilização no estudo.

Dois grupos foram formados por 14 ratas albinas Wistar, adultas jovens (60 dias), pesando
entre 180 e 210 g, e mantidas em condições laboratoriais padrão; Período claro/escuro de
12/12 horas, com 50–70% de umidade, a 23±2°C em gaiolas de aço padrão em temperatura
ambiente. Os ratos foram alimentados ad libitum com ração padrão para ratos e água. Os
ratos apresentaram alterações comportamentais após a administração de mancozeb
durante quatro semanas. Foram observadas desnutrição e diminuição na ingestão de
alimentos e água.

Os ratos do grupo mancozebe (n=7) receberam 500 mg/kg de mancozebe dissolvido em

óleo de milho diariamente durante quatro semanas, administrado por via oral por sonda
orogástrica27,28.

Os animais de controlo (n=7) receberam a mesma quantidade diária de óleo de milho da

mesma maneira sem mancozeb que os animais tratados.
A seguir, sob anestesia com éter, os animais foram eutanasiados por exsanguinação
cardíaca. Amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca.

Análises bioquímicas

Amostras de sangue foram colocadas nos tubos e em seguida foi feita a centrifugação. Os
valores séricos de aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT)
foram determinados em U/L usando o Abbott Architect c16.000 Autoanalyzer.

Método histopatológico

As amostras foram colocadas em formaldeído a 10% e desidratadas em série de etanol

70-100%. A seguir, para inclusão em parafina, foram colocados em banhos de parafina a
58°C. Um micrótomo rotativo foi usado para preparar cortes de 4 a 6 µm a partir de blocos
de parafina, que foram posteriormente corados com hematoxilina-eosina.

Método imunohistoquímico

Primeiramente, por 5 min e depois por 4 min, o processo de recuperação antigênica foi
conduzido nos cortes que permaneceram em solução tampão citrato (pH=6) fervida em
forno de micro-ondas a 700 W (Bosch®). Posteriormente, foram resfriados até a
temperatura ambiente por 20 minutos e lavados duas vezes por 5 minutos em água
destilada. Durante 10 min, a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada em peróxido
de hidrogênio a 0,1% [peróxido de hidrogênio K-40677109,64271 (H2O2), Merck,
Alemanha] (3 mL de peróxido de hidrogênio a 30% (H2O2) + 27 mL de metanol). Antes de
aplicar anticorpos primários, caspase-3 de camundongo monoclonal, 1/100, e fator de
necrose tumoral alfa de camundongo monoclonal, 1/100 para bloqueio ultra V durante a
noite (kit Hisstain-Plus, Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos da América) foi realizado
por 8 min. Em seguida, o anticorpo secundário (kit Hisstain-Plus, Invitrogen, Carlsbad, CA,
Estados Unidos da América) foi aplicado por 20 min. A seguir, durante 25 min, foi aplicada
estreptavidina-peroxidase nas lâminas. Para o cromógeno foi utilizada diaminobenzidina
(DAB, Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos da América, lote: HD36221).

Com a exclusão dos anticorpos primários, foram preparadas lâminas de controle, conforme
já mencionado. Seguindo os procedimentos de contrastação com hematoxilina (produto
número: HHS32 SIGMA, solução de hematoxilina, Harris Modified, Sigma-Aldrich, Estados
Unidos da América), e lavagem com água da torneira por 3 min e com água destilada por 2
× 3 min, Entellan® (lote: 107961, Sigma-Aldrich, Estados Unidos da América) foi utilizado
para montar as lâminas.
Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Statistical Package for
the Social Sciences (SPSS) versão 24.0 (IBM, Estados Unidos da América). Os dados
bioquímicos dos grupos controle e mancozebe foram comparados. O teste de
Kolmogorov-Smirnov foi utilizado como teste de normalidade. Como resultado da análise,
observou-se que os dados não estavam distribuídos normalmente. Por esse motivo, a
avaliação estatística foi realizada com teste não paramétrico U de Mann-Whitney, e p<0,05
foi considerado estatisticamente significativo. Os resultados foram expressos como mediana
(IQR) e gráficos boxplot foram utilizados para demonstração.

Resultados
Verificou-se que houve diferenças significativas entre os grupos controle e mancozebe em
termos de níveis de AST e ALT, dilatação venosa, inflamação, degeneração de hepatócitos,
escores de expressão de TNF-α e caspase-3 (Tabela 1). Os animais foram analisados
estatisticamente medindo seus pesos antes e depois do experimento. A perda de peso
devido à administração de mancozeb foi significativa (p<0,001).

tabela 1

Efeito do mancozebe nos testes de função hepática e no tecido hepático. Os dados

representam os valores da mediana do grupo (25-75%). A significância estatística está
presente entre o grupo controle e o grupo mancozebe em termos de todos os parâmetros
(AST, ALT e TNF-α).

Os valores de ALT e AST dos grupos controle e mancozebe são mostrados com gráficos
boxplot na Fig. 1. Ambos os valores de ALT e AST do grupo mancozebe são
significativamente maiores que os de controle.

figura 1

Gráfico Boxplot dos valores de AST e ALT nos grupos controle e mancozebe.

Resultados histopatológicos
No corte transversal do grupo controle, a veia central era regular no centro do lóbulo
hepático e os hepatócitos hepáticos estavam dispostos radialmente ao redor do núcleo (fig.
2a). O corte histopatológico do fígado do grupo tratado com mancozebe mostrou dilatação
sinusoidal, necrose focal, obstrução significativa e hemorragia causada por alterações do
parênquima hepático, bem como dano hepatocelular significativo causado por degeneração
hidrópica e oclusão vascular central (fig. 2b).

Figura 2
(a) Veia central regular e células de hepatócitos com aspecto radial no grupo controle,
coloração com hematoxilina-eosina. (b) Dilatação em estruturas sinusoidais (seta fina),
degeneração em células de hepatócitos (seta grossa) no grupo tratado com mancozebe,
coloração com hematoxilina-eosina.

Resultados de imuno-histoquímica
Nas seções do grupo controle, atividade imune de caspase-3, expressão negativa de
caspase-3 foi observada em núcleos de células hepáticas e células de Kupffer. Nos
intervalos periportal e portal, algumas células do tecido conjuntivo apresentaram expressão
positiva de caspase-3 (Fig. 3a). No grupo mancozebe, no centro do lóbulo do fígado, foi
observada intensa expressão de caspase-3 nas células dos hepatócitos ao redor da veia
central (fig. 3b).

Figura 3

(a) Expressão negativa de caspase-3 em hepatócitos e células de Kupffer (seta) no grupo

controle, coloração imune de caspase-3. (b) Um aumento na expressão de caspase-3 em
células de hepatócitos ao redor da veia central (seta grossa) no grupo tratado com
mancozeb, coloração imune de caspase-3.

No grupo controle, em algumas células de hepatócitos do fígado e células de Kupffer, foi

observada expressão positiva de TNF-α (Fig. 4a). Nas células inflamatórias ao redor da veia
central aumentada e nas células de Kupffer e nas células apoptóticas dos hepatócitos do
grupo mancozeb, foi observada expressão aumentada de TNF-α (Fig. 4b).

Figura 4

(a) Reação positiva ao TNF-α em alguns hepatócitos e células de Kupffer (seta) no grupo
controle, coloração imune ao TNF-α. (b) Aumento significativo na expressão de TNF-α em
hepatócitos e células de Kupffer ao redor da veia central (seta) no grupo tratado com
mancozeb, coloração imune de TNF-α.

Discussão
O presente estudo mostrou que o mancozebe tem efeitos hepatotóxicos por análise
histopatológica, bioquímica e imuno-histoquímica.

O mancozebe foi previamente classificado como produto de baixo risco agudo de toxicidade
em humanos e sem efeito hepatotóxico em ratos29,30. Contudo, em muitos estudos
realizados em humanos e animais, foi demonstrado que o mancozebe causa efeitos
adversos à saúde31. Kistinger e Hardej32 relataram que o mancozebe, uma forma fúngica
de etileno bisditiocarbamato, causou acúmulo de cobre nos rins, mas nenhum acúmulo no
fígado. De acordo com os dados do estudo, eles afirmaram que a estrutura principal do
etileno bisditiocarbamato do mankozebe, e não as porções de zinco ou manganês, foi
responsável pelas alterações no status da glutationa e na homeostase dos metais
essenciais no fígado e nos rins de ratos.

Da mesma forma, a eficácia da curcumina na redução da hepatotoxicidade e

genotoxicidade induzida por mancozeb em ratos foi investigada num estudo experimental.
Em conclusão, o tratamento concomitante com curcumina e mancozeb pareceu minimizar
os níveis aumentados de marcadores de função hepática no soro, peroxidação lipídica,
mediadores pró-inflamatórios e parâmetros de dano ao DNA no fígado33. O objetivo deles
foi determinar o potencial de melhoria do óleo de Nigella sativa contra a hepatotoxicidade
induzida por carbendazim e/ou mancozebe em ratas. Seus resultados mostraram que o
pré-tratamento com óleo de Nigella sativa reduziu significativamente a anemia hipocrômica
macrocítica induzida por carbendazim e mancozebe, leucocitose, linfocitose, eosinofilia e
neutropenia. Também minimizou a incidência de enzimas hepáticas elevadas, peroxidação
lipídica, incidência de micronúcleos, danos ao DNA e aberrações cromossômicas 34. Foi
sugerido que a exposição diária ao fungicida-mancozebe em coelhos resultou em
mortalidade materna, aborto espontâneo, efeitos na tireoide, diminuição do ganho de peso
corporal materno e diminuição do peso corporal35. Em ratos e coelhos expostos a um
metabólito mancozeb-ETU, foram verificadas malformações fetais visíveis, incluindo
hidrocefalia e cabeça abaulada (mancozeb). Riscos disruptivos, teratogênicos,
mutagênicos, carcinogênicos e endócrinos estão associados à toxicidade a longo prazo do
mancozeb 7,9. Alterações genotóxicas e pré-malignas nas células ovarianas e imunológicas
humanas após a exposição ao mancozebe foram demonstradas em estudos recentes. Em
humanos expostos ao mancozeb, o aumento do potencial de cancro e riscos para a saúde
reprodutiva também foram confirmados por investigadores 2,36.

Yahia et al.37 utilizaram 250 mg/kg de mancozebe dissolvido em óleo de milho administrado
duas vezes por semana durante sete semanas e indicaram que a exposição ao mancozebe
causou aumento nos triglicerídeos e o colesterol total também diminuiu os níveis de glicose,
resultando em danos ao DNA no fígado e cólon com alterações patológicas no estômago,
cólon e fígado. À luz deste estudo, utilizamos dose única de 500 mg/kg de mancozebe
dissolvido em óleo de milho. No presente estudo, as alterações na atividade de ALT e AST
entre os marcadores de dano hepático causaram dano oxidativo induzido por lipídios e
aumentaram a degeneração celular. No exame histopatológico do fígado na aplicação de
mancozebe, constatou-se dano hepatocelular significativo devido à dilatação sinusoidal,
necrose focal, obstrução e sangramento significativos, parênquima hepático, bem como
degeneração hidrópica e oclusão vascular central.

Um estudo foi conduzido em timócitos de ratos tratados com mancozebe (0,01 mg/mL) para
uma incubação de 24 horas examinou os níveis de viabilidade celular, apoptose, potencial
de membrana mitocondrial (MMP), Bcl-2, expressão da proteína Bax, caspase-3 e -9 e
envolvimento de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno p38 (MAPK).
Aumento da toxicidade celular, células hipodiplóides, atividade de caspase-3 e -9,
expressão da proteína Bax, seguida de diminuição da expressão da proteína MMP e Bcl-2,
foram encontrados em células tratadas com mancozeb. Nos timócitos expostos ao
mancozebe, a taxa de apoptose e a atividade da caspase-3 foram significativamente
reduzidas através da inibição da via de sinalização p38 MAPK35. Em nosso estudo,
descobriu-se que a atividade da caspase-3 estava aumentada nas células dos hepatócitos
ao redor da veia central no lóbulo do fígado e nas células do tecido conjuntivo na área
periportal no grupo tratado com mancozeb. Observou-se que a alteração apoptótica
iniciou-se do centro do lóbulo do fígado para a periferia, e a densidade celular degenerativa
ficou evidente ao redor do vaso.

Uma vez que o mancozebe leva a um número significativo de efeitos tóxicos no

metabolismo das células hepáticas, outro estudo foi realizado com o mancozebe no modelo
de células HepG2 humanas. Verificou-se que o mancozebe causou doença hepática
gordurosa não alcoólica no modelo de células HepG2 humanas, e o teste do corante
brometo de 3-(4,5-di-2-il)-2,5-ditetrazólio (MTT) foi usado para avaliar células totais morte.
Foi demonstrado que a esteatose induzida por ácidos graxos foi estimulada através de um
aumento na quantidade de gotículas lipídicas intracelulares. Assim, verificou-se que o
mancozeb alterou o metabolismo celular e causou a morte celular através da regulação
positiva da lactato desidrogenase e do citocromo C38.

Um estudo sobre o consumo de vegetais tratados com mancozebe e seus efeitos no fígado
de ratos verificou que o mancozebe contribui para a ocorrência de doenças hepáticas39.
Ksheerasagar e Kaliwal40 observaram que o peso do fígado e a quantidade de proteínas
diminuíram quando camundongos foram expostos diariamente ao mancozebe por 30 dias.
Na presença de algumas substâncias naturais (uréia, glicina, ácido oxálico e imidazolina), o
mancozebe se degrada3. No caso da reação com o mancozebe, essas moléculas afetam
enzimas solúveis no sangue e indicadores de condições de estresse, levando a uma
situação de alteração de diversas vias celulares37. Assim, ocorre aumento de parâmetros
inflamatórios que alteram o metabolismo de proteínas e gorduras, incluindo uréia,
creatinina, hipoalbuminemia, distúrbios eletrolíticos e algumas enzimas hepáticas41.

O TNF-α é uma importante citocina pró-inflamatória com uma ampla gama de estudos. Foi
relatado que o TNF-α desempenha um papel como citocina, contribuindo para a formação e
desenvolvimento de danos hepáticos18. Foi relatado que citocinas pró-inflamatórias, como
TNF-α, IL6, IL-1 e quimiocinas, são produzidas e liberadas pelas células de Kupffer
juntamente com células não parenquimatosas adjacentes, como resultado de danos e
necrose . Neste estudo, foi avaliada a atividade do TNF-α na lesão hepática do TNF-α
induzida por mancozebe. Devido ao aumento da apoptose, o aumento da inflamação no
fígado levou a um aumento no nível de TNF-α.

Conclusões
A administração subaguda de mancozebe em ratos com insuficiência hepática aumentou a
inflamação nos tecidos e o aumento da apoptose devido a danos celulares pode levar a
toxicidade elevada no fígado e diminuição da capacidade de regeneração do fígado devido
à congestão e degeneração dos vasos sanguíneos. Como pesticida, especialmente
inconscientemente, altas doses e uso subagudo de mancozebe podem causar sérios danos
ao tecido hepático. Os médicos devem estar cientes da toxicidade do mancozebe nesses
casos de intoxicação.