Enzimas

Catlise fundamental para a vida

Enzimas catalisadores biolgicos Reduzem a energia de ativao das reaes Alta especificidade

Importncia clnica e industrial

Cintica enzimtica
Estudo da velocidade das reaes Pode ser medida por:

- Quantidade de produto formado

- Quantidade de substrato transformado (por unidade de tempo) - Mtodos de deteco geralmente espectroscpicos

Cintica enzimtica
Fatores que afetam a velocidade das reaes:

- Concentrao da enzima
- Estrutura da enzima - Concentrao de substrato - Moduladores (inibidores, ativadores)

Cintica enzimtica
Importncia dos estudos cinticos:

- Informaes sobre o mecanismo enzimtico

- Prever a atividade da enzima em diferentes [S] - Mecanismos de regulao e inibio

- Comparar eficincias de catlise

Efeito do pH e temperatura
Pepsina

Amilase

Fosfatase alqualina

Aminocidos stio ativo

Enzima desnaturada Stio ativo

Enzima nativa

Temperatura

Efeito da concentrao de substrato

Enzima simples 1 stio, 1 substrato
k1
E + S ES

k2
k-2
E + P

k-1

Como estudar o efeito da [S] se S consumido na reao? Determinao da velocidade inicial (Vo) Tempos curtos de reao e [S] >> [E] [S] constante

Efeito da Concentrao de Substrato

k1
E + S ES

k2
E + P

k-1

Em Vo k-2 insignificante e pode ser neglignciada

Vo Vmax

[S] V0 = k2 [ES], passo limitante

Conceito do Estado Estacionrio

k1
E + S ES

k2
E + P

k-1

No estado estacionrio [ES] constante

Determinao de Vo = cintica do estado estacionrio
Cintica Michaelis-Menten
Vo = Vmax[S] Km + [S]

Relao [S] vs velocidade de reao

Cintica Michaelis-Menten

Vo =

Vmax[S]

Km + [S]

Note que quando, Vo = Vmax/2, Km = [S]

O grfico duplo-recproco
Vo = Vmax[S] Km + [S] 1 = Km 1 + 1 Vo Vmax [S] Vmax

Inclinao

Quando x = 0
1/Vo = 1/Vmax

Quando y = 0 1/[S] = -1/Km

O significado de Km e Vmax
k1
E + S ES

k2
E + P

k-1
K-1 + K2 K1

Km =

Se K2 << K-1 , Km = K-1/K1

Em algumas situaes K2 importante !!!

Se k2 limitante, Vmax = k2[Et]

O significado de Km e Vmax
Para algumas enzimas outros passos podem ser limitantes k1
E + S ES

k2
EP

k3
E+P

k-1

k-2

Se k3 limitante, Vmax = k3[Et]

Constante cataltica (Kcat) Kcat = constante do passo limitante, se K2 limitante Kcat = K2

Constante cataltica Kcat

Nmero de renovao
Nmero de S transformado em P por 1 molcula de enzima

Enzima Catalase Anidrase carbnica Fumarase Protena RecA (ATPase)

Substrato H 2 O2 HCO3Fumarato ATP

Kcat (s-1) 40.000.000 400.000 800 0,4

Constante cataltica Kcat

CConstante especfica: Relao Kcat / Km

Enzima

Substrato

Kcat (s-1) 1,4 x 104 1 x 106 4 x 105 8 x 108 9 x 102 2,0 x 103

Km (M) 9 x 10-5 1,2 x 10-2

Kcat/Km (M-1s-1) 1,6 x 108 8,3 x 107 1,5 x 107 1,6 x 108 3,6 x 107 1 x 108

Acetilcolinesterase Anidrase carbnica Fumarase

Aceticolina HCO3CO2 Fumarato Malato Benzilpenicilina

2,6 x 10-2
5 x 10-6

2,5 x 10-5
2 x 10-5

-Lactamase

Cintica de enzimas com mais de um substrato

hexoquinase

ATP + Glucose

ADP + glucose-6P

Enzima
Hexoquinase (crebro)

Substrato
ATP D-Glucose
D-Glucose

Km (mM)
0,4 0,05 10

Hexoquinase IV (fgado)

Concentrao de glucose no plasma 4-5mM

Cintica de enzimas com mais de um substrato

a) Reao enzimtica envolvendo um complexo ternrio Ordem ao acaso:

Ordenado:

b) Reao enzimtica na qual no se forma o complexo ternrio

Grfico duplo recproco para complexo ternrio

Diferentes [S2] em resposta a variaes na [S1]

Aumentando

A interseco das linhas indica que um complexo ternrio est sendo formado.

Grfico duplo recproco para mecanismo ping-pong

Diferentes [S2] em resposta a variaes na [S1]

Aumentando

As linhas paralelas indicam um mecanismo pingue-pongue

Inibio enzimtica
Inibidores : reduzem velocidade de reao

- Grande importncia prtica

- Grupos de inibidores : - Irreversveis - Reversveis (competitivo, incompetitivo, misto)

Inibio competitiva

Vmax, Et = ES, se [S] >> [I], toda enzima ES, Vmax no altera Vo = Vmax[S] Km + [S] Km aparente

=1+

[I]
Ki

Grfico duplo-recproco para inibio competitiva

Sem inibidor Inclinao

Uso prtico da inibio competitiva

cegueria

Intoxicao por Metanol

Causa leso tecidual URINA

Metanol

/ lcool
desidrogenase

formaldedo acetaldedo

Etanol

Inibio incompetitiva
Vmax[S]

Vo =

Km + [S]
[I]

= 1 +

Ki

Vmax, Et = ES, mesmo se [S] >> [I], Vmax altera pois parte da enzima est na forma improdutiva ESI Note que quando Km >> [S], o inibidor pouco efetivo

Grfico duplo-recproco para inibio incompetitiva

Inibio mista

Vo =

Vmax[S] Km + [S]

Este tipo de inibidor eficaz em qualquer [S]

Grfico duplo-recproco para inibio mista

Sem inibidor

Enzimas regulatrias
Enzimas chave do metabolismo so controladas
- Enzimas regulatrias, cintica distinta

Principais mecanismos: - Alostrica (homotrpica ou heterotrpica) - Covalente - Localizao celular

- Protelise

Enzimas alostricas homotrpicas

Homotrpicas - O substrato o modulador A ligao de um substrato altera a conformao de outro stio ativo

Cintica de enzimas alostricas homotrpicas

Vmax Vo ( [P] / tempo )

Baixa afinidade

Ligao de substrato aumenta a afinidade dos outros stios

K0,5

[S]

Enzimas alostricas heterotrpicas

Heterotrpicas: - Outro composto age como modulador
Substrato Modulador positivo

Enzima menos ativa

Enzima mais ativa

Complexo enzima-substrato ativo

Cintica de enzimas alostricas heterotrpicas

K0,5 alterado

Vmax alterada

Pontos importantes da aula !!!

Enzimas simples apresentam uma cintica padro Alguns fatores podem alterar a velocidade de reaes Cintica como ferramenta no estudo de enzimas

Enzimas regulatrias apresentam cintica complexa