Quim. Nova, Vol. 35, No.

2, 435-437, 2012 REDUO ENZIMTICA DO 4-(DIMETILAMINO)BENZALDEDO COM PEDAOS DE CENOURA (Daucus carota): UM EXPERIMENTO SIMPLES NA COMPREENSO DA BIOCATLISE lvaro Takeo Omori*, Viviane Barbosa Portas e Camila de Souza de Oliveira Centro de Cincias Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, R. Santa Adlia, 166, 09210-170 Santo Andr - SP, Brasil Recebido em 19/5/11; aceito em 8/8/11; publicado na web em 26/9/11

ENZYMATIC REDUCTION OF 4-(DIMETHYLAMINO)BENZALDEHYDE WITH CARROT BITS (Daucus carota): A SIMPLE EXPERIMENT FOR UNDERSTADING BIOCATALYSIS. The present paper describes a simple, low-costly and environmentally friendly procedure for reduction of 4-(dimethylamino)benzaldehyde using carrot bits in water. This interdisciplinary experiment can be used to introduce the concepts of biocatalysis and green chemistry to undergraduate students. Keywords: biocatalysis; reduction of carbonyl compounds; green chemistry.

INTRODUO
NaBH4

OH

A abordagem interdisciplinar na gerao do conhecimento um dos grandes desafios na educao em todas as reas das Cincias Naturais. Porm, na qumica orgnica, por exemplo, grande parte dos experimentos aplicados em laboratrios didticos para alunos de graduao no consegue integrar conhecimentos de outras disciplinas. Alm disso, existe tambm a dificuldade de aquisio de reagentes qumicos especficos em um laboratrio didtico de qumica orgnica. O alto custo, as taxas de importao e a possibilidade de atrasos so alguns entraves que podem prejudicar o sucesso da disciplina experimental. Desta maneira, torna-se bastante atrativa a aplicao de experimentos com materiais de baixo custo e de alta disponibilidade.1 De forma simplificada, apresentado um experimento de baixo custo, facilmente executvel e contextualizado em diversas reas, como Bioqumica, Qumica Orgnica e Qumica Verde. Consiste basicamente em uma reao de reduo de um aldedo a um lcool utilizando enzimas provenientes de uma leguminosa altamente disponvel (Daucus carota), cenoura. Esta prtica visa familiarizao dos alunos com os conceitos da biocatlise.2 A biocatlise consiste no uso de catalisadores naturais as enzimas para realizar transformaes qumicas em compostos orgnicos. uma ferramenta bastante verstil e est cada vez mais presente na indstria qumica.3 A princpio, todos os seres vivos so fontes de biocatalisadores e as enzimas presentes podem ser utilizadas nos mais diversos tipos de reaes orgnicas.4 Os biocatalisadores apresentam caractersticas que os diferenciam dos catalisadores qumicos, e esto intrinsecamente ligados aos princpios da Qumica Verde.5 Dentre estas caractersticas podem-se citar como exemplos: condies brandas de reao, pois o solvente utilizado geralmente a gua; o uso de reagentes degradveis, uma vez que os catalisadores so enzimas de plantas, animais, ou so micro-organismos e podem ser decompostos no ambiente aps o uso. Alm disso, a biocatlise oferece uma grande seletividade do ponto de vista estereoqumico.6 Por exemplo, analisando a reao de reduo de cetonas pr-quirais (que levam a produtos contendo centros quirais). Um dos agentes redutores mais utilizados na reduo de cetonas o boro-hidreto de sdio (NaBH4). A Figura 1 ilustra a reduo da acetofenona ao 1-feniletanol por dois mtodos.

MeOH, t.a.

R+S
1-feniletanol racmico

OH
Acetofenona (pr-quiral) Daucus carota (cenoura) H2O, t.a., 2 dias

(S)-(-)

1-feniletanol opticamente ativo 99% e.e.

Figura 1. Reduo da acetofenona utilizando boro-hidreto de sdio e com cenoura

O NaBH4 um agente redutor aquiral e, quando reage com cetonas pr-quirais, leva formao de um lcool racmico (dois ismeros com 50% cada). No entanto, a mesma transformao qumica, utilizando pedaos de cenoura (Daucus carota) leva formao majoritria de um dos produtos.6 A cenoura tem sido usada com sucesso nas redues de cetonas pr-quirais, apresentando como resultados, em alguns casos, uma converso de 97% e um excesso enantiomrico (e.e.) acima de 99%, sendo um dos biocatalisadores conhecidos mais eficientes.7 (Nota: as enzimas que catalisam estas reaes so chamadas de desidrogenases, pertencentes a uma subclasse das oxidorredutases, enzimas responsveis pelas reaes de oxidao-reduo).8 O crescente interesse no uso das plantas em biocatlise pode ser demonstrado no recente artigo de reviso de Cordell e colaboradores.1 Em resumo, proposta uma prtica que visa avaliar qualitativamente a atividade cataltica da cenoura na reduo do reagente de Ehrlich (CAS [100-10-7]). Esta deteco pode ser feita atravs de uma anlise de CCD (cromatografia em camada delgada) ou at mesmo atravs de tcnicas espectroscpicas (RMN). No fim da reao o produto pode ser isolado atravs de uma extrao lquido-lquido, seguida de uma purificao por cromatografia em coluna. PARTE EXPERIMENTAL O 4-(dimetilamino)benzaldedo (ACS 99%, Sigma-Aldrich) e os solventes empregados (hexano, acetato de etila e metanol padro P.A. Vetec) foram utilizados sem prvia purificao. As anlises de

*e-mail: alvaro.omori@ufabc.edu.br

Educao

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Omori et al.

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CCD foram efetuadas em cromatofolhas de alumnio (gel de slica 60), com espessura de 0,2 mm, contendo indicador para 254 nm. Reduo do 4-(dimetilamino)benzaldedo O reagente 4-(dimetilamino)benzaldedo comumente utilizado na determinao espectrofotomtrica de hidrazinas9 e, tambm, na deteco de urobilinognio na urina.10 Outras aplicaes incluem seu uso como bloco de construo de molculas mais complexas, por exemplo, na sntese da tricostatina A feita por Fleming e colaboradores.11 J o produto obtido da reduo, o lcool 4-(dimetilamino)benzlico, tambm bastante utilizado como bloco de construo de molculas mais complexas.12 Procedimento para a reao biocataltica Este procedimento est ilustrado na Figura 2.
O
Daucus carota (cenoura)

ser feita manualmente, sem necessidade de vortex e/ou centrfuga. Uma alquota tambm foi retirada e os componentes orgnicos extrados aps 24 h de reao. Estes tubos contendo as fases orgnicas foram diretamente utilizados para a anlise de CCD junto com o produto padro preparado durante o perodo de agitao. Procedimento para a sntese qumica do produto (padro) Durante o intervalo de 3 h de agitao da reao com a cenoura, foi feita a sntese qumica do produto (padro). Aproximadamente 10 mg do reagente de Ehrlich foram adicionados a um balo de 15 mL munido com barra magntica. Metanol foi adicionado (5 mL) ao balo e o sistema foi resfriado sob agitao a 0 C. Uma pequena quantidade de boro-hidreto de sdio (ponta de esptula) foi adicionada reao e o sistema foi agitado por mais 15 min de 0 C temperatura ambiente. Aps este tempo, j foi possvel retirar uma alquota para servir como padro para anlise de CCD. Anlise de cromatografia em camada delgada (CCD)

OH
H2O, t.a., 3 horas

N
p-dimetilamino benzaldedo (reagente de Ehrlich)

N
lcool p-dimetilamino benzlico

Para anlise de CCD, foi utilizada uma soluo de hexano e acetato de etila na proporo 1:4 como fase mvel. Foram aplicados quatro pontos (Reagente, produto da sntese qumica e as alquotas de 3 e 24 h de reao). Aps marcao da distncia percorrida pelo eluente, foram marcadas sob luz UV as distncias percorridas pelas amostras e, em seguida, foram calculados os Rf do reagente e do produto. Isolamento do produto (opcional)

Figura 2. Reduo do reagente de Ehrlich utilizando pedaos de cenoura

Uma cenoura fresca foi adquirida em um mercado local, lavada com gua corrente e, em seguida, cortada em fatias de aproximadamente 0.5 cm (no necessrio descascar). Os pedaos foram pesados em um Erlenmeyer de 125 mL com uma balana semianaltica at obter-se aproximadamente 10 g de catalisador. Em seguida, foram adicionados 40 mL de gua destilada e 50 mg do para-(dimetilamino) benzaldedo (Figura 3).

Aps o trmino da reao, a fase lquida foi transferida para dois tubos tipo Falcon de 50 mL e, em seguida, foram adicionados 15 mL de acetato de etila. Os tubos foram agitados em vortex por alguns minutos e, ento, levados centrfuga por 10 min, a aproximadamente 2500 rpm. A fase orgnica foi separada e transferida a um Erlenmeyer de 125 mL e, em seguida, foi adicionado sulfato de sdio (Na2SO4) anidro. A fase foi filtrada em um balo de fundo redondo de 50 mL e levado para a destilao sob presso reduzida. O resduo foi purificado atravs de cromatografia em coluna em slica, utilizando uma mistura gradiente de hexano:acetato de etila (2:1 a 1:4) como eluente. RESULTADOS E DISCUSSO A Figura 4 mostra a cromatografia de camada fina aps contato com o eluente (hexano:acetato 1:4) com as amostras de reagente, produto da reduo qumica, reao com cenoura aps 3 e 24 h, nesta ordem. Pela figura, observa-se a formao de um produto da reduo enzimtica com o mesmo Rf do produto da reduo qumica. Observou-se uma baixa converso em 3 h de reao apesar de que, neste tempo de reao, j foi possvel visualizar a formao do produto por CCD. A alquota de 24 h de reao j mostrou uma melhor converso, apesar de ainda haver reagente. Esta observao corrobora com o trabalho de Yang e colaboradores em que, aps o estudo mais aprofundado desta reao com acetofenona, foi observado que o tempo ideal para a reao de reduo com pedaos de cenoura de aproximadamente 48 h.13 A fim de avaliar a repetibilidade desta reao, aplicou-se este experimento em uma disciplina de Prticas de Qumica Verde e foi observado que, em 12 experimentos, apenas dois deles apontaram a no formao do produto, provavelmente devido inatividade do catalisador empregado, no qual vrios fatores como mtodo de cultivo, espcie utilizada, procedncia e validade da cenoura podem estar associados.

Figura 3. Sistema reacional usando pedaos de cenoura

O Erlenmeyer foi levado ao agitador rotativo (temperatura ambiente, 200 rpm), onde permaneceu pelo tempo disponvel de aula (no nosso caso, 3 h). Decorrido este tempo, uma alquota de 2 mL foi retirada da reao e transferida para um tubo tipo Falcon de 15 mL. A este tubo foi adicionado 1 mL de acetato de etila (AcOEt). O tubo foi agitado em um vortex e levado para centrfuga por 5 min, a aproximadamente 2500 rpm. Esta extrao tambm pode

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Reduo enzimtica do 4-(dimetilamino)benzaldedo com pedaos de cenoura

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Como o tempo reacional relativamente longo, este experimento pode ser feito em etapas sucessivas. possvel discutir durante o experimento vrios aspectos da teoria de cromatografia. Por exemplo, diversos eluentes poderm ser empregados e ser abordada uma possvel discusso sobre a influncia da polaridade. Outros aspectos importantes incluem mecanismos de reao qumica e bioqumica, identificao de compostos por RMN, espectrometria de massas e estereoqumica. No final, os pontos positivos desta reao podem ser amplamente discutidos e correlacionados com os princpios da Qumica Verde e Biocatlise. MATERIAL SUPLEMENTAR No material suplementar, disponvel gratuitamente em arquivo PDF em http://quimicanova.sbq.org.br, encontram-se os espectros de ressonncia magntica nuclear dos produtos obtidos por via qumica e por via enzimtica e os espectros de massas do reagente e do produto dimerizado. AGRADECIMENTOS Central Analtica do Instituto de Qumica da USP pelas anlises de RMN e CG-EM, UFABC pela estrutura ao CNPq e FAPESP pelo apoio financeiro. REFERNCIAS
1. Cordell, G. A.; Lemos, T. L. G.; Monte, F. J. Q.; Mattos, M. C.; J. Nat. Prod. 2007, 70, 478. Este foi o 3 artigo mais acessado deste peridico em 2007. 2. Marsaioli, A. J.; Porto, A. L. M.; Biocatlise e Biotransformao Fundamentos e Aplicaes, Schoba: Salto, 2010, vol. 1. 3. Liese, A.; Seelbach, K.; Wandrey, C.; Industrial Biotransformations, 1st ed., Wiley-VCH: Weinheim, 2000. 4. Faber, K.; Biotransformations in Organic chemistry, 4th ed., SpringerVerlag: Berlin, 2000. 5. Lenardo, E. J.; Freitag, R. A.; Dabdoub, M. J.; Batista, A. C. F.; Silveira, C. C.; Quim. Nova 2003, 26, 123; Prado, A. G. S.; Quim. Nova 2003, 26, 738. 6. Zuin, V. G.; Correa, A. G.; Qumica verde Fundamentos e Aplicaes, 1 ed., Edufscar: So Carlos, 2009. 7. Yadav, J. S.; Nanda, S.; Reddy, P. T.; Rao, A. B.; J. Org. Chem. 2002, 67, 3900; Comasseto, J. V.; Omori, A. T.; Porto, A. L. M.; Andrade, L. H.; Tetrahedron Lett. 2004, 45, 473; Lacheretz, R.; Pardo, D. G.; Cossy, J.; Org. Lett. 2009, 11, 1245; Blanchard, N.; van de Weghe, P.; Org. Biomol. Chem. 2006, 4, 2348. 8. Voet, D.; Voet, J. G.; Biochemistry, 2nd ed.; Wiley, 1995, cap. 12; Matsuda, T.; Yamanaka, R.; Nakamura, K.; Tetrahedron: Asymmetry 2009, 20, 513. 9. Watt, G. W.; Chrisp, J. D.; Anal. Chem.1952, 24, 2006. 10. Wilson, T. M.; Davidson, L. S. P.; Br. Med. J. 1949, 884. 11. Fleming, I.; Iqbal, J.; Krebs, E. P.; Tetrahedron 1983, 39, 841. 12. Enomoto, H.; Morikawa, Y.; Miyake, Y.; Tsuji, F.; Mizuchi, M.; Suhara, H.; Fujimura, K.; Horiuchi, M.; Ban, M.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 442; Chou, S. P.; Yeh, Y.; Tetrahedron Lett. 2001, 42, 1309. 13. Chang, X.; Yang, Z. H.; Zeng, R.; Yang, G.; Yan, J. B.; Chin. J. Chem. Eng. 2010, 18, 1029. 14. Rodrguez, P.; Barton, M.; Aldabalde, V.; Onetto, S.; Panizza, P.; Menndez, P.; Gonzalez, D.; Rodrguez, S. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2007, 49, 11. 15. Shaikh, N. S.; Junge, K.; Beller, M.; Org. Lett. 2007, 9, 5429. 16. Takahashi, H.; Kashiwa, N.; Kobayashi, H.; Hashimoto, Y.; Nagasawa, K.; Tetrahedron Lett. 2002, 43, 5751.

Figura 4. Placa de CCD contendo amostras sob luz UV: 1. reagente (Rf = 0,7), 2. produto padro (Rf = 0,4), 3. reao enzimtica aps 3 h, 4. reao enzimtica aps 24 h

Um dos grandes questionamentos sobre esta reao de reduo de grupos carbonilcos mediada por cenoura se refere fonte enzimtica. Gonzalez e colaboradores levantaram a hiptese de que as enzimas contidas em micro-organismos endofticos da cenoura seriam os principais responsveis pela atividade biocataltica.14 Esta hiptese foi investigada, isolando estes micro-organismos e submetendo-os s mesmas reaes. No caso, foi observada a mesma reatividade da cenoura; alm disso, o uso de fungicidas e bactericidas nos pedaos de cenoura praticamente inibiu a atividade cataltica. A caracterizao do produto foi feita atravs da anlise de RMN de 1H e est de acordo com o publicado na literatura.15 Curiosamente, a anlise do produto por cromatografia gasosa acoplada ao espectrmetro de massas apresentou um nico pico com on molecular de m/z = 254. Este valor difere do produto esperado (m/z = 151) provavelmente devido dimerizao do reagente no injetor do cromatgrafo atravs de um mecanismo de condensao do tipo Mannich,16 como mostra a Figura 5.
OH N m/z = 151 HO N OH -OHN

N - H2CO - H+

N HO +

N N m/z = 254 N

Figura 5. Mecanismo proposto para a formao do dmero de m/z = 254 a partir do lcool 4-(dimetilamino)benzlico

CONCLUSO A reduo do 4-(dimetilamino)benzaldedo utilizando pedaos de cenoura levou ao lcool correspondente e o monitoramento desta reao pode ser feito utilizando cromatografia de camada delgada. Esta prtica de fcil execuo, possui custo baixo e interdisciplinar.